间充质基质细胞外排体及其用途的制作方法

间充质基质细胞外排体及其用途
[0001]
相关申请
[0002]
本申请根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2018年4月30日提交的并且标题为“mesenchymal stromal cell exosomes and uses thereof”的美国临时申请no.62/664696的权益，其全部内容通过引用并入本文。


背景技术：

[0003]
已描述了不同器官中的间充质干细胞/基质细胞(mesenchymal stem/stromal cell，msc)的治疗能力。还已经报道了msc外排体治疗在许多疾病模型包括心肌梗死、肾损伤和神经病症中的有益特性。


技术实现要素：

[0004]
在一些方面中，本公开内容描述了msc外排体在治疗胸腺功能障碍中的治疗作用。在一些实施方案中，对象是婴儿或新生儿(例如，人婴儿或新生儿)。还提供了治疗与胸腺功能障碍相关的疾病的方法。
[0005]
本公开内容的一些方面提供了治疗与胸腺功能障碍相关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的间充质干细胞(msc)外排体。
[0006]
在一些实施方案中，分离的msc外排体从msc条件培养基中分离。在一些实施例中，msc来自脐带胶质(warton’s jelly)或骨髓。
[0007]
在一些实施方案中，对象是人对象。在一些实施方案中，人对象是新生儿、婴儿或成人。在一些实施方案中，人对象小于四周龄。在一些实施方案中，人对象为四周龄至3岁。在一些实施方案中，人对象为3至18岁。在一些实施方案中，人对象是成人。
[0008]
在一些实施方案中，人对象是早产的。在一些实施方案中，人对象在妊娠37周之前出生。在一些实施方案中，人对象在妊娠26周之前出生。
[0009]
在一些实施方案中，人对象在出生时应激。在一些实施方案中，对象已施用氧或已上呼吸机。在一些实施方案中，对象患有氧诱导的胸腺退化。在一些实施方案中，对象具有受损的固有免疫和/或适应性免疫。
[0010]
在一些实施方案中，msc外排体在出生之后立即施用。在一些实施方案中，msc外排体在出生一小时内施用。在一些实施方案中，分离的msc外排体在出生一个月内施用。在一些实施方案中，分离的msc外排体静脉内施用。
[0011]
在一些实施方案中，msc外排体恢复胸腺结构。在一些实施方案中，mcs外排体提高胸腺细胞计数。在一些实施方案中，msc外排体降低胸腺细胞凋亡。在一些实施方案中，msc外排体促进髓质胸腺上皮细胞的成熟。在一些实施方案中，msc外排体恢复胸腺中的胸腺细胞祖细胞群。
[0012]
在一些实施方案中，与胸腺功能障碍相关的疾病是免疫病症。在一些实施方案中，所述免疫病症选自：自身免疫病、新生儿狼疮、类风湿性关节炎和i型糖尿病。在一些实施方案中，与胸腺功能障碍相关的疾病是感染；先天性心脏病，尤其在迪格奥尔格综合征的情况
下的先天性心脏病；心脏手术术后，其中进行胸腺切除术以进入心脏进行手术修复；出生创伤(birth trauma)；或缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy，hie)。
[0013]
在一些实施方案中，对象是啮齿动物。在一些实施方案中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。在一些实施方案中，对象是伴生动物。
[0014]
本文中还提供了间充质干细胞(msc)外排体在有此需要的对象中治疗与胸腺功能障碍相关的疾病的用途。
[0015]
以上发明内容意在以非限制性方式举例说明本文中所公开技术的一些实施方案、优点、特征和用途。通过详细描述、附图、实施例和权利要求书，本文中所公开技术的另一些实施方案、优点、特征和用途将是明显的。
附图说明
[0016]
附图不旨在按比例绘制。在附图中，在多个附图中示出的每个相同或几乎相同的组件由相同的数字表示。为了清楚起见，并非在每个附图中都标记了每个组件。在附图中：
[0017]
图1a至1d：msc外排体将胸腺结构和胸腺细胞计数恢复至对照水平。(图1a)将新生fvb小鼠暴露于hyrx(75％o2)持续7天。将经hyrx暴露的小鼠在pn4时经静脉内(iv)用msc外排体进行处理。将经处理和未经处理的hyrx小鼠的结果与保持在nrmx(室内空气)的小鼠进行比较。将收获的胸腺切片在pn14时进行苏木精和伊红(hematoxylin&eosin，h&e)染色。(图1b)通过测量整个皮质和髓质区域(在放大率4
×
下的显微照片)来评估经受nrmx(左)、hyrx(中)和hyrx+msc-exo(右)的小鼠的胸腺结构。(图1c)与nrmx对照相比，hyrx组的胸腺结构显示出胸腺的髓质区域的退化，其转化为提高的皮质-髓质比率。msc-外排体处理恢复胸腺结构，如与nrmx对照水平相似的皮质-髓质比率所例证的。(图1d)使用countbright珠通过流式细胞术分析确定胸腺细胞数目。与nrmx水平相比，hyrx组表现出胸腺细胞损失。通过msc-外排体处理，胸腺细胞数目恢复至nrmx水平。数据表示来自2项独立研究的结果。n＝4至10的平均值
±
sem且*p＜0.05。
[0018]
图2a至2d：msc外排体处理降低氧诱导的胸腺细胞凋亡，并促进髓质tec的正常成熟。将来自三个研究组的胸腺机械破坏成胸腺细胞单细胞悬液。将胸腺细胞用annexin v和pi进行标记，并分析凋亡水平。确定凋亡细胞为annv+pi-细胞。(图2a)来自经受nrmx(左)、hyrx(中)和hyrx+msc-外排体(右)的小鼠的胸腺细胞的代表性图显示了在pn14时每组中凋亡细胞的总百分比的差异。(图2b)与nrmx来源的胸腺细胞相比，hyrx胸腺细胞显示出更高的凋亡水平(分别为50.74％
±
1.74与27.24％
±
1.64)。尽管未达到nrmx对照水平，但msc外排体处理仍诱导胸腺细胞凋亡水平降低(44.4％
±
1.74)。(图2c)在nrmx、hyrx和hyrx+msc-exo组的胸腺髓质中aire(自身免疫调节因子转录因子)表达的代表性显微照片。与nrmx对照相比，hyrx诱导胸腺髓质区域中aire表达降低。msc外排体处理恢复了aire的髓质表达。(图2d)nrmx、hyrx和hyrx+msc-exo组中的aire表达的累积数据。数据表示来自2项独立研究的结果。n＝4至8的平均值
±
sem且*p＜0.05，***p＜0.001。
[0019]
图3a至3d：msc外排体处理恢复胸腺中的胸腺细胞祖细胞群。(图3a)胸腺中t细胞发育阶段的表型的示意性表示。从骨髓中迁移的迁徙型胸腺细胞祖细胞为cd44
+
cd25-，并且对于cd4和cd8 t细胞标志物的表达呈阴性。在整个胸腺细胞发育中，祖细胞丧失cd44的表达并获得cd25的表达(dn阶段1至3)。在该阶段，胸腺细胞在胸腺皮质区域进行阳性选择，并
开始表达cd4和cd8(dp)。这些胸腺细胞迁移至胸腺的髓质区域，在此它们与抗原呈递细胞(单核细胞、树突细胞、巨噬细胞和表达aire的tec)相互作用，在此它们经历阴性选择(自身反应性t细胞的消除)变为原初cd4
+
(sp4)和cd8
+
(sp8)t细胞，其然后将迁移出胸腺。(图3b)与nrmx相比，pn7时的胸腺细胞的流式细胞术分析显示，hyrx胸腺中的双阴性祖细胞的比例降低(分别为9.14％
±
0.97与11.7％
±
1.06)。msc外排体使双阴性祖细胞的比例恢复至对照水平(13.8％
±
1.03)。结果表示如通过流式细胞术获得的dn1、dn2和dn3的比例的和。(图3c)在pn14时的双阴性祖细胞的比例无差异。(图3d)使用cd44和cd25表达进行的双阴性祖细胞分析的代表性流式细胞术图。数据表示来自2项独立研究的结果。n＝4至10的平均值
±
sem且*p＜0.05以及**p＜0.01。
[0020]
图4a至4g：msc外排体处理促进胸腺中cd4
+ t细胞的发育，但抑制cd8
+ t细胞的发育。对胸腺细胞的cd4和cd8的表达进行分析。在双阳性群体的比例中未检测到差异(未示出)。对单阳性细胞(sp4＝cd4
+
cd8-和sp8＝cd8
+
cd4-)的分析显示，在pn7时(图4a)和pn14时(图4b)的三个分析组之间，sp4的总体比例无差异。然而，尽管在pn7时的sp8群体中未检测到变化(图4c)，但是在pn14时在msc-外排体处理之后，sp8群体显著减少(图4d)。(图4e)代表性流式细胞术图示出了在pn7和pn14时胸腺中sp4、sp8和dp细胞的比例的差异。在pn7时的三个分析组之间未检测到cd4/cd8比率的变化(图4f)。然而，由于在pn14时cd8+群体的丢失，msc-外排体处理诱导了高胸腺cd4/cd8比率(图4g)。数据表示来自2项独立研究的结果。n＝4至12的平均值
±
sem且*p＜0.05。
[0021]
图5a至5c：mex防止暴露于高氧的小鼠胸腺中的细胞凋亡。通过流式细胞术使用countbright珠评估在产后第14天收获的小鼠的胸腺的总体胸腺细胞计数，并且对经常氧和高氧暴露的小鼠(
±
mex)的胸腺玻片进行tunel染色以检测凋亡细胞。图5a示出了与常氧组和经mex处理组相比，经高氧暴露的小鼠的胸腺具有较低的胸腺细胞计数。图5b示出了代表性tunel染色显微照片，以及图5c示出了凋亡细胞的数目/mm2，这表明暴露于高氧的小鼠表现出提高的tunel
+
细胞水平，其在mex处理之后恢复至常氧水平。代表性显微照片在600
×
的放大率下采集，并且比例尺表示20μm。数据示出为n≥6的平均值
±
sem。*p≤0.05，****p≤0.0001。
[0022]
图6a至6c：在高氧损伤之后mex恢复髓质抗原呈递细胞的表型。图。图6a是示出了胸腺髓质区域的作用的示意图。在胸腺的皮质区域中进行阳性选择之后，表达cd4或cd8(sp)的t细胞祖细胞迁移至髓质区域，在此它们与髓质胸腺上皮细胞(medullary thymic epithelial cell，mtec)和树突细胞(cd11c
+
dc)相互作用。在髓质中，mtec表达导致大量组织限制性自身抗原(tissue restricted self-antigen，tra)的表达的自身免疫调节因子(aire)。aire
+
mtec与sp直接相互作用或与cd11c
+
dc紧密协作以删除自身反应性t细胞并诱导原初调节性t细胞的产生。为了评估高氧和mex处理对髓细胞的这两个亚类的作用，用aire和cd11c对在产后第14天收获的小鼠的胸腺切片进行染色。mex处理在暴露于高氧的小鼠的髓质区域中恢复mtec中的aire表达(图6b)并恢复cd11c
+
dc表型(图6c)。代表性免疫荧光染色和累积平均荧光强度示出于图6b和6c中。箭头突出显示了经cd11c染色的dc。代表性显微照片在400
×
(图6b)和600
×
(图6c)的放大率下采集，并且比例尺＝50μm。数据示出为n≥6的平均值
±
sem。*p≤0.05，**p≤0.01，****p≤0.0001。
[0023]
图7a至7d：mex在多器官水平上恢复调节性t细胞表型。为了研究mex处理是否对调
节性t细胞的产生具有作用，用调节性t细胞标志物，即cd4、cd25和foxp3(胸腺)或cd3、cd4、cd25和foxp3(肺和脾)对在产后第14天收获的小鼠的胸腺、肺和脾的细胞悬液进行染色并通过细胞计数分析进行评估。图7a至7b示出了指示暴露于高氧的小鼠中的mex处理使调节性t细胞表型恢复至近似常氧的水平的胸腺cd4
+
cd25
+
单阳性t细胞群内cd25和foxp3表达的代表性图(图7a)和累积数据(图7b)。图7c至7d示出了表明mex在暴露于高氧的小鼠的脾和肺中诱导cd4 t细胞的调节性表型的cd3
+
cd4
+
t细胞设门内的cd25和foxp3表达的代表性图(图7c)和累积数据(图7d)。数据示出为n≥5的平均值
±
sem。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。
具体实施方式
[0024]
氧诱导的损伤可导致多种疾病。在需要氧补充的新生儿(例如婴儿或新生儿)中，氧损伤导致限制性的肺生长以及肺泡和血管发育，从而导致受损的肺功能。先前已经表明，间充质干细胞(msc)外排体可用于治疗肺疾病，包括由高氧诱导的肺功能的损伤(例如，如willis等，american journal of respiratory and critical care medicine，doi：10.1164/rccm.201705-0925oc(2017)中所述，其通过引用并入本文)。在新生儿高氧的实验模型中，msc外排体可显著改善肺形态，降低肺纤维化并促进血管重塑。这些作用主要通过对肺中巨噬细胞表型的调节而抑制高氧诱导的炎症来发挥1。
[0025]
长期高氧对胸腺(适应性免疫细胞发育的必要器官)的作用尚未探索。在新生儿中，适应性免疫系统相对未充分发育。在一些方面中，本公开内容评估了高氧对胸腺结构和功能的作用，尤其是在其适应性免疫系统相对未充分发育的新生儿中。胸腺微环境是由指导t细胞的发育和库组成(repertoire)的胸腺上皮细胞(thymic epithelial cell，tec)集合构成的三维细胞结构2。如本文中所述，在新生儿高氧的实验模型中，显示胸腺退化并促进自身反应性t细胞的成熟。表明氧诱导的胸腺退化是由于提高的胸腺细胞凋亡所致，其引起双阳性和双阴性胸腺细胞的计数和增殖显著降低
3，4
。本文中还提供了msc外排体对功能障碍的胸腺的治疗作用，这在先前未被探索过。msc外排体恢复胸腺的结构和功能、降低胸腺细胞的凋亡，并促进髓质tec的正常成熟。
[0026]
因此，本公开内容的一些方面提供了治疗与胸腺功能障碍相关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的间充质干细胞(msc)外排体。胸腺是位于脊椎动物的颈中一种淋巴器官，其为免疫系统产生t细胞。
[0027]
胸腺是免疫系统的专门的初级淋巴器官。t细胞在胸腺内成熟。t细胞对于适应性免疫系统至关重要，在所述系统中，身体专门适应外来侵入物。胸腺由两个相同的叶构成，并在解剖学上位于前上纵隔(在心脏之前与胸骨之后)中。在组织学上，胸腺的每个叶均可分为中央髓质和被外囊包围的外周皮质。皮质和髓质在t细胞的发育中发挥不同的作用。胸腺中的细胞可分为胸腺基质细胞和造血来源(来源于驻留骨髓的造血干细胞)的细胞。发育中的t细胞被称为胸腺细胞，并且是造血来源的。基质细胞包括胸腺皮质和髓质的上皮细胞，以及树突细胞。
[0028]
胸腺为从造血祖细胞发育的t细胞提供了诱导环境。另外，胸腺基质细胞允许对功能性和自身耐受性的t细胞库的选择。因此，胸腺的最重要的作用之一是对中枢耐受(central tolerance)的诱导。在新生儿和青春期之前时期期间，胸腺最大且最活跃。到了
青少年早期，胸腺开始萎缩，并且胸腺基质大部分被脂肪(脂肪)组织替代。尽管如此，残余的t淋巴细胞产生仍在整个成年生活中持续。
[0029]
本文中使用的“胸腺功能障碍”是指在待治疗的对象中胸腺的结构和功能的损伤。在一些实施方案中，胸腺功能障碍是胸腺微环境的功能障碍，包括但不限于胸腺上皮细胞(tec)和树突细胞的缺陷，t细胞发育的缺陷和胸腺退化。不希望受科学理论的束缚，胸腺的主要生物学功能之一是产生多样化的t细胞库，以发展适应性免疫并保持宿主免疫与自身耐受性之间的平衡。因此，在一些实施方案中，胸腺功能障碍涵盖对象的适应性免疫系统和/或自身耐受性建立的功能障碍。
[0030]
胸腺功能障碍可由多种原因引起。在一些实施方案中，患有胸腺功能障碍的对象在出生时应激。导致对象出生时将应激的因素包括但不限于：早产、宫内生长受限(intrauterine growth restriction，iugr)、绒毛膜羊膜炎、感染、呼吸窘迫、心脏病、缺氧缺血性脑病(hie)、胎盘失血或需要加强监护治疗并与母亲分离的任何新生儿病症。例如，对象可以是早产的。在一些实施方案中，对象已施用氧或已上呼吸机(例如，根据对象可患有的任何病症的治疗的需要)。在一些实施方案中，对象患有氧诱导的胸腺退化。暴露于高氧状态可导致氧诱导的胸腺退化，其是胸腺的逐渐萎缩。胸腺退化通常与t细胞(例如原初t细胞(t cell))发育的衰退、免疫耐受性的损伤和免疫系统的衰退相关。
[0031]
在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象具有减小尺寸的胸腺。例如，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象可具有其尺寸减小了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的胸腺。在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象具有其尺寸减小了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的胸腺。
[0032]
在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象具有数目降低(例如，降低至少20％)的胸腺细胞。例如，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象可具有降低了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的胸腺细胞数目。在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象具有降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的胸腺细胞数目。“胸腺细胞”是存在于胸腺中的造血祖细胞。胸腺细胞的主要功能是产生t淋巴细胞(t细胞)。基于细胞表面标志物的表达，胸腺细胞被分类为许多独特的成熟阶段。最早的胸腺细胞阶段是双阴性阶段(对于cd4和cd8二者均呈阴性，在本文中也称为“胸腺细胞祖细胞”)，其最近被更好地描述为谱系阴性，并且其可分为四个子阶段。下一个主要阶段是双阳性阶段(对于cd4和cd8二者均呈阳性)。成熟的最后阶段是单阳性阶段(对于cd4或cd8呈阳性)。
[0033]
在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象具有数目降低(例如，降低至少20％)的胸腺细胞祖细胞。例如，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象可具有降低了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的胸腺细胞祖细胞数目。在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)
相比，患有胸腺功能障碍的对象具有降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的胸腺细胞祖细胞数目。
[0034]
在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象产生数目降低(例如，降低至少20％)的cd4和/或cd8阳性t细胞。例如，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象可产生降低了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的cd4和/或cd8阳性t细胞数目。在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象产生降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的cd4和/或cd8阳性t细胞数目。在一些实施方案中，未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象具有异常的cd4/cd8 t细胞比率。在一些实施方案中，患有胸腺功能障碍的对象具有受损的固有免疫系统和/或适应性免疫系统。例如，患有胸腺功能障碍的对象可具有对侵入的病原体具有降低的活性(例如，引起感染)或对自身具有提高的活性(例如，引起自身免疫病)的适应性免疫系统。
[0035]
在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象具有数目降低(例如，降低至少20％)的成熟髓质胸腺上皮细胞。例如，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象可具有降低了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的成熟髓质胸腺上皮细胞数目。在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象具有降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的成熟髓质胸腺上皮细胞数目。
[0036]
在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象具有提高(例如，提高至少20％)的胸腺细胞凋亡。例如，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象中的胸腺细胞凋亡可提高至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或更多。在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象中的胸腺细胞凋亡提高了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍或更多。
[0037]
胸腺功能障碍与许多疾病，包括胸腺肿瘤、感染性疾病和免疫病症相关(例如，如sun等，biomed res int.2014；2014：206929中所述，其通过引用并入)。患有胸腺功能障碍的对象具有或处于发展与胸腺功能障碍相关的疾病的风险。在一些实施方案中，与未患有胸腺功能障碍的对象(例如，健康对象)相比，患有胸腺功能障碍的对象具有受损的固有免疫和/或适应性免疫。
[0038]
在一些实施方案中，与胸腺功能障碍相关的疾病是免疫病症。“免疫病症”是指引起过度活跃的免疫系统的异常低活性的病症。在免疫系统过度活跃的情况下，身体会攻击并损坏其自身的组织(自身免疫病)。免疫缺陷病降低身体的抵抗侵入物的能力，从而导致对感染的脆弱性。在一些实施方案中，所述免疫病症选自：自身免疫病、新生儿狼疮、类风湿性关节炎和i型糖尿病。在一些实施方案中，免疫病症是自身免疫病。自身免疫病的一些非限制性实例包括：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，ra)、系统性红斑狼疮
perfringens)、破伤风梭菌(clostridium tetani))；棒状杆菌属(例如，白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae))；肠球菌属(enterococcus spp.)(例如粪肠球菌(enterococcus faecalis)、屎肠球菌(enterococcus faecium))；埃希菌属(escherichia spp.)(例如，大肠杆菌(escherichia coli)、肠产毒性大肠杆菌(enterotoxic e.coli)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic e.coli)；大肠杆菌o157：h7(e.coli o157：h7))；弗朗西斯菌属(francisella spp.)(例如，土拉热弗朗西斯菌(francisella tularensis))；嗜血杆菌属(haemophilus spp.)(例如流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae))；螺杆菌属(例如幽门螺杆菌)；军团菌属(例如，嗜肺军团菌)；钩端螺旋体属(leptospira spp.)(例如肾脏钩端螺旋体(leptospira interrogans))；李斯特菌属(例如单核细胞增多性李斯特菌(listeria monocytogenes))；分枝杆菌属(mycobacterium spp.)(例如，麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(mycobacterium ulcerans))；支原体属(mycoplasma spp.)(例如肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae))；奈瑟菌属(例如淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌)；假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌)；立克次体属(rickettsia spp.)(例如立立克次体(rickettsia rickettsii))；沙门菌属(例如伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium))；志贺菌属(shigella spp.)(例如宋内志贺菌(shigella sonnei))；葡萄球菌属(staphylococcus spp.)(例如，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophyticus))；链球菌属(streptococcus spp.)(例如无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(streptococcus pyogenes))；密螺旋体属(treponema spp.)(例如，梅毒螺旋体(treponema pallidum))；pseudodiomarina spp.(例如p.maritima)；海杆菌属(marinobacter spp.)(例如，除烃海杆菌(marinobacter hydrocarbonoclasticus)、强酒海杆菌(marinobacter vinifirmus))，食烷菌属(alcanivorax spp.)(例如柴油食烷菌(alcanivorax dieselolei))；不动杆菌属(acetinobacter spp.)(例如威尼斯不动杆菌(a.venetianus))；盐单胞菌属(halomonas spp.)(例如，胜利油田盐单胞菌(h.shengliensis))；拉布伦茨菌属(labrenzia spp.)；产微球茎菌属(microbulbifer spp.)(例如，m.schleiferi)；希瓦菌属(shewanella spp.)(例如，和海藻希瓦菌(s.algae))；弧菌属(例如霍乱弧菌、溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)、肝炎弧菌(vibrio hepatarius))；和耶尔森菌属(yersinia spp.)(例如鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis))。
[0040]
在一些实施方案中，细菌是炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)(引起炭疽)、百日咳鲍特菌(bordetella pertussis)(引起百日咳)、白喉杆菌(corynebacterium diphtheriae)(引起白喉)、破伤风梭菌(clostridium tetani)(引起破伤风)、b型流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae type b)、肺炎球菌(pneumococcus)(引起肺炎球菌感染)、葡萄球菌属(staphylococci spp.)(包含a组或b组链球菌)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、脑膜炎奈瑟菌(neiserria meningitidis)(引起脑膜炎球菌疾病)、伤寒沙门菌(salmonella typhi)(引起伤寒)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)(引起霍乱)或鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)(引起鼠疫)。
[0041]
在一些实施方案中，细菌是革兰阴性菌。革兰阴性菌物种的一些非限制性实例包
virus)、甲型肝炎病毒(hepatitis a virus)、肠病毒(enterovirus)、人柯萨奇病毒(human coxsackie virus)、鼻病毒(rhinovirus)、艾柯病毒(echovirus)、卡西病毒(calcivirus)、披膜病毒(togavirus)、马脑炎病毒(equine encephalitis virus)、风疹病毒(rubella virus)、黄病毒(flavirus)、登革热病毒(dengue virus)、脑炎病毒(encephalitis virus)、黄热病病毒(yellow fever virus)、冠状病毒(coronavirus)、棒状病毒(rhabdovirus)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、狂犬病病毒(rabies virus)、丝状病毒(filovirus)、埃博拉病毒(ebola virus)、副黏病毒(paramyxovirus)、副流感病毒(parainfluenza virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)、正黏病毒(orthomyxovirus)、流感病毒(infuenza virus)、bunga病毒、汉坦病毒(hantaan virus)、白蛉病毒(phlebovirus)和nairo病毒(nairo virus)、arena病毒(arena virus)、出血热病毒(hemorrhagic fever virus)、呼肠孤病毒(reovirus)、环状病毒(orbivirus)、轮状病毒(rotavirus)、rna病毒(birnavirus)、嗜肝dna病毒(hepadnavirus)、乙型肝炎病毒(hepatitis b virus)、细小病毒(parvovirus)、乳多空病毒科(papovaviridae)、乳头瘤病毒(papilloma virus)、多瘤病毒(polyoma virus)、腺病毒(adenovirus)、包含单纯疱疹病毒1和2的疱疹病毒(herpesvirus)、水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus)、痘病毒(poxvirus)、天花病毒(variola virus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、虹彩病毒(irido virus)、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus)、丁型肝炎病毒(delta hepatitis virus)、非甲型肝炎病毒(non-a hepatitis virus)、非乙型肝炎病毒(non-b hepatitis virus)、丙型肝炎(hepatitis c)、诺沃克病毒(norwalk virus)、星状病毒(astrovirus)和未分类的病毒。在一些实施方案中，病毒是腺病毒、肠病毒，例如脊髓灰质炎(脊髓灰质炎)、埃博拉病毒、疱疹病毒例如单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、巨细胞病毒和水痘-带状疱疹(水痘和带状疱疹)、麻疹(measle)、腮腺炎(mump)、风疹(rubella)、甲型肝炎、乙型肝炎、或丙型肝炎、人乳头瘤病毒(human papilloma virus)、流感病毒、狂犬病(rabies)、日本脑炎(japanese encephalitis)、轮状病毒、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，hiv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、天花、黄热病、寨卡病毒(zika virus)或登革热病毒。
[0045]
在一些实施方案中，感染是由真菌引起的。真菌的一些实例包括但不限于：包含新型隐球菌(crytococcus neoformans)的隐球菌(cryptococcus)种；包含荚膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)的组织胞浆菌(histoplasma)种；包含粗球孢子菌(coccidiodes immitis)的球孢子菌(coccidioides)种；包含巴西副球孢子菌(paracoccidioides brasiliensis)的副球孢子菌(paracoccidioides)种；包含皮炎芽生菌(blastomyces dermatitidis)的芽生菌(blastomyces)种；包含沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)的衣原体(chlamydia)种；包含白色念珠菌(candida albicans)的念珠菌种；包含申克孢子丝菌(sporothrix schenckii)的孢子丝菌(sporothrix)种；曲霉(aspergillus)种和毛霉病(mucormycosis)的真菌。在一些实施方案中，真菌是念珠菌属(candida spp.)、曲霉属(aspergillus spp.)、隐球菌属(cryptococcus spp.)、毛霉菌、皮炎芽生菌(引起芽生菌病)或者引起地方性真菌病的真菌，例如荚膜组织胞浆菌(引起组织胞浆菌病)或申克孢子丝菌(引起孢子丝菌病)。
[0046]
可在患有胸腺功能障碍的对象中引起感染的其他感染性生物包括但不限于：寄生虫。寄生虫包含疟原虫(plasmodium)种，例如疟原虫种，包含恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、三日疟原虫(plasmodium malariae)、卵形疟原虫(plasmodium ovale)和间日疟原虫(plasmodium vivax)以及岗地弓弓形虫(toxoplasma gondii)。血液传播寄生虫和/或组织寄生虫包括疟原虫种；包含微小巴贝虫(babesia microti)和分离巴贝虫(babesia divergens)的巴贝虫(babesia)种；包含热带利什曼原虫(leishmania tropica)、利什曼原虫种、巴西利什曼原虫(leishmania braziliensis)、杜利什曼原虫(leishmania donovani)的利什曼原虫(leishmania)种；包含冈比亚锥虫(trypanosoma gambiense)、罗德西亚锥虫(trypanosoma rhodesiense)(非洲睡眠病(african sleeping sickness))和克锥虫(trypanosoma cruzi)(恰加斯病(chagas’disease))的锥虫(trypanosoma)种。在一些实施方案中，寄生虫是疟原虫属(plasmodium spp.)、利什曼原虫或蠕虫(helminth)。
[0047]
其他医学上相关的微生物已在文献例如，参见c.g.a thomas，medical microbiology，bailliere tindall，great britain 1983(通过引用并入本文)中进行了广泛的描述。
[0048]
在一些实施方案中，与胸腺功能障碍相关的疾病是癌症。可使用本文中公开的方法治疗的癌症的类型包括但不限于：赘生物、恶性肿瘤、转移瘤或以不受控制的细胞生长为特征使得将其认为癌性的任何疾病或障碍。癌症可以是原发性癌症或转移癌。癌症包括但不限于胆管癌；膀胱癌；脑癌，包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；血液系统肿瘤(hematological neoplasm)，包括急性淋巴细胞和髓性白血病；多发性骨髓瘤；aids相关白血病和成人t细胞白血病淋巴瘤；上皮内肿瘤，包括鲍恩病(bowen’s disease)和佩吉特病(paget’s disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金病(hodgkin’s disease)和淋巴细胞性淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌，包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞产生的那些；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包括黑素瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌，包括生殖肿瘤(germinal tumor)，例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤、畸胎瘤、绒毛膜癌；间质瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓样癌；以及肾癌，包括腺癌和肾母细胞瘤(wilm’s tumor)。常见的癌症包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌和脑癌。在一些实施方案中，癌症是转移性的。
[0049]
在本文中发现msc外排体对与胸腺功能障碍相关的疾病具有治疗作用。“外排体”是从细胞(例如，任何真核细胞)释放的膜(例如，脂双层)囊泡。外排体存在于真核生物的流体包括血液、尿和细胞培养的培养基中。本公开内容的外排体从间充质干细胞(msc)释放并且可互换地称为“间充质干细胞外排体”或“msc外排体”。
[0050]“间充质干细胞(msc)”是具有分化为神经元细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、心脏组织和其他内皮或上皮细胞的能力的祖细胞。(参见例如wang，stem cells 2004；22(7)；1330-7；mcelreavey；1991biochem soc trans(1)；29s；takechi，placenta 1993年3月/4月；14(2)；235-45；takechi，1993；kobayashi；early human development；1998；7月10日；51(3)；223-33；yen；stem cells；2005；23(1)3-9.)。这些细胞可通过基因或
蛋白质表达在表型上定义。这些细胞的特征在于表达以下中的一种或更多种(并因此对其呈阳性)：cd13，cd29，cd44，cd49a、b、c、e、f，cd51，cd54，cd58，cd71，cd73，cd90，cd102，cd105，cd106，cdw119，cd120a，cd120b，cd123，cd124，cd126，cd127，cd140a，cd166，p75，tgf-bir，tgf-biir，hla-a、b、c，ssea-3，ssea-4，d7和pd-l1。这些细胞的特征还在于不表达cd3，cd5，cd6，cd9，cd10，cd11a，cd14，cd15，cd18，cd21，cd25，cd31，cd34，cd36，cd38，cd45，cd49d，cd50，cd62e、l、s，cd80，cd86，cd95，cd117，cd133，ssea-1和abo(并因此对其呈阴性)。因此，可根据msc的分化潜能在表型和/或功能上对其进行表征。
[0051]
msc可从许多来源收获，这些来源包括但不限于骨髓、血液、骨膜、真皮、脐带血和/或基质(例如，脐带胶质(wharton’s jelly))和胎盘。用于收获msc的方法在本领域中例如，在美国专利no.5486359中描述，其通过引用并入本文。
[0052]
msc可基于其对组织培养塑料的黏附性而从多种来源，例如，骨髓单个核细胞、脐带血、脂肪组织、胎盘组织分离。例如，msc可从市售骨髓抽吸物分离。msc在细胞群内的富集可使用本领域中已知的方法包括但不限于荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，facs)来实现。
[0053]
市售培养基可用于msc的生长、培养和维持。这样的培养基包括但不限于dulbecco改良eagle培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium，dmem)。在这样的培养基中可用于msc、成纤维细胞和巨噬细胞的生长、培养和维持的组分包括但不限于氨基酸、维生素、碳源(天然和非天然)、盐、糖、植物来源的水解物、丙酮酸钠、表面活性物质、氨、脂质、激素或生长因子、缓冲剂、非天然氨基酸、糖前体、指示剂、核苷和/或核苷酸、丁酸酯或有机物、dmso、动物来源的产品、基因诱导物、非天然糖、细胞内ph的调节物、甜菜碱或渗透保护剂、痕量元素、矿物质、非天然维生素。可用于补充市售组织培养基的另外的组分包括例如，动物血清(例如，胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)、胎牛血清(fetal calf serum，fcs)、马血清(hs))、抗生素(例如，包括但不限于青霉素、链霉素、硫酸新霉素、两性霉素b、杀稻瘟素、氯霉素、阿莫西林、杆菌肽、博来霉素、头孢菌素、金霉素、吉欧霉素(zeocin)和嘌呤霉素)和谷氨酰胺(例如，l-谷氨酰胺)。间充质干细胞的存活和生长还取决于适当的有氧环境、ph和温度的维持。msc可使用本领域中已知的，例如如pittenger等，science，284：143-147(1999)中所述的方法来维持，该文献通过引用并入本文。
[0054]
在一些实施方案中，用于治疗与胸腺功能障碍相关的疾病的msc外排体是分离的外排体。如本文中使用的，“分离的外排体”是与其天然环境物理分离的外排体。分离的外排体可从其天然存在的组织或细胞(包括msc、成纤维细胞和巨噬细胞)全部或部分地物理分离。在一些实施方案中，分离的外排体是msc外排体。在一些实施方案中，msc外排体从来自人骨髓或脐带脐带胶质的msc的培养基分离。这样的培养基在本文中称为“msc条件培养基”。在一些实施方案中，分离的外排体可不含细胞例如msc，或者其可不含或基本上不含条件培养基，或者其可不含任何生物污染物例如蛋白质。通常，与在未经操纵的条件培养基中存在的外排体相比，分离的外排体以更高的浓度提供。
[0055]
在一些实施方案中，分离的msc外排体基本上不含污染物(例如，蛋白质污染物)。当分离的msc外排体的制剂中包含少于20％、15％、10％、5％、2％、1％、或少于1％的任何其他物质(例如，蛋白质)时，分离的msc外排体“基本上不含污染物”。在一些实施方案中，当分离的msc外排体的制剂为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至
少99.9％纯(相对于污染物(例如，蛋白质))时，分离的msc“基本上不含污染物”。
[0056]“蛋白质污染物”是指与分离的外排体不相关并且对外排体的生物学活性没有贡献的蛋白质。蛋白质污染物在本文中也称为“非外排体蛋白质污染物”。
[0057]
本文中所述的msc外排体的直径为约30至150nm。例如，msc外排体的直径可以为30至150、30至140、30至130、30至120、30至110、30至100、30至90、30至80、30至70、30至60、30至50、30至40、40至150、40至140、40至130、40至120、40至110、40至100、40至90、40至80、40至70、40至60，40至50、50至150nm、50至140nm、50至130nm、50至120nm、50至110nm、50至100nm、50至90nm、50至80nm、50至70nm、50至60nm、60至150nm、60至140nm、60至130nm、60至120nm、60至110nm、60至100nm、60至90nm、60至80nm、60至70nm、70至150nm、70至140nm、70至130nm、70至120nm、70至110nm、70至100nm、70至90nm、70至80nm、80至150nm、80至140nm、80至130nm、80至120nm、80至110nm、80至100nm、80至90nm、90至150nm、90至140nm、90至130nm、90至120nm、90至110nm、90至100nm、100至150nm、100至140nm、100至130nm、100至120nm、100至110nm、110至150nm、110至140nm、110至130nm、110至120nm、120至150nm、120至140nm、120至130nm、130至150nm、130至140nm或140至150nm。在一些实施方案中，msc外排体的直径可以为约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm或150nm。在一些实施方案中，msc外排体表现出双凹形态。
[0058]
msc外排体(例如，分离的msc外排体)可用于治疗与胸腺功能障碍相关的疾病。在一些实施方案中，将msc外排体(例如，分离的msc外排体)配制成组合物。在一些实施方案中，组合物还包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和/或其他(即，第二)治疗剂。
[0059]
可药用载体是可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与携带或运输预防性或治疗性活性剂。每种载体必须是从与制剂的其他成分相容且对对象无害的意义说的“可接受的”。可用作可药用载体的材料的一些实例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；无热原水；等张盐水；林格溶液(ringer
′
s solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。
[0060]
为了治疗与胸腺功能障碍相关的疾病，向患有胸腺功能障碍的对象施用有效量的msc外排体或包含msc外排体的组合物。“有效量”是实现期望结果的药剂的量。绝对量将取决于多种因素，包括选择用于施用的材料、以单剂量还是多剂量施用，以及个体患者参数，包括年龄、身体状况、身材大小、体重和疾病阶段。这些因素是本领域普通技术人员公知的并且可仅通过常规实验即可解决。
[0061]
在一些实施方案中，有效量是不引起对于对象的毒性的药剂剂量。在一些实施方案中，有效量是引起对于对象的毒性降低的药剂剂量。用于测量毒性的方法是本领域公知的(例如，肝、脾和/或肾的活检/组织学；用于肝毒性的丙氨酸转移酶、碱性磷酸酶和胆红素测定；以及用于肾毒性的肌酐水平)。
[0062]“治疗”包括但不限于预防、降低或停止肺疾病的发生、减轻或消除肺疾病的症状、或者预防肺疾病。
[0063]
对象应意指人或脊椎动物或哺乳动物，包括但不限于啮齿动物(例如啮齿动物，例
如大鼠或小鼠)、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡和灵长类动物(例如猴)。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是伴侣动物。如本文中使用的，“伴侣动物”是指宠物和其他家养动物。伴侣动物的一些非限制性实例包括狗和猫；家畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。本公开内容的方法可用于治疗有此需要的对象。有此需要的对象可以是患有与胸腺功能障碍相关的疾病的对象或具有发生与胸腺功能障碍相关的疾病之风险的对象。
[0064]
对象可以是患有适合使用本公开内容中所述的外排体进行治疗的本文中所述之疾病的那些，或者其可以是处于发生这样的疾病之风险中的对象。在一些实施方案中，对象是人对象。在一些实施方案中，对象是人婴儿。例如，对象可以是新生儿并且特别是在低孕龄出生的新生儿。如本文中使用的，人新生儿是指从出生至约4周龄的人。如本文中使用的，人婴儿是指约4周龄至约3岁的人。如本文中使用的，低孕龄是指给定物种在正常妊娠期(gestational term)之前发生的出生(或分娩)。在人中，完整的妊娠期为约40周并且可从37周至多于40周。在人中，类似于早产的低孕龄被定义为在妊娠37周之前发生的出生。因此，本公开内容考虑了预防和/或治疗在妊娠37周之前出生的对象，包括以甚至更短的妊娠期(例如，在妊娠36周之前、35周之前、34周之前、33周之前、32周之前、31周之前、30周之前、29周之前、28周之前、27周之前、26周之前或25周之前)出生的那些。
[0065]
对于婴儿或新生儿，甚至超过新生儿阶段以及进入儿童期和/或成年期，本公开内容考虑了其治疗。例如，在一些实施方案中，使用本公开内容的方法治疗的对象为3至18岁。在一些实施方案中，使用本公开内容的方法治疗的对象可以为3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、6至9、6至8、6至7、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、7至9、7至8、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、8至11、8至10、8至9、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、9至13、9至12、9至11、9至10、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、10至13、10至12、10至11、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、11至13、11至12、12至18、12至17、12至16、12至15、12至14、12至13、13至18、13至17、13至16、13至15、13至14、14至18、14至17、14至16、14至15、15至18、15至17、15至16、16至18、16至17或17至18岁。在一些实施方案中，对象是成人，例如18岁或大于18岁。
[0066]
某些对象可对本文中所述的某些形式的疾病(或病症)(例如，自身免疫疾病或癌症)具有遗传易感性，并且那些对象也可根据本公开内容进行治疗。
[0067]
对于新生儿并且特别是低孕龄的新生儿，本公开内容考虑了在出生1年、11个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、6小时、3小时或1小时内施用分离的msc外排体。在一些实施方案中，分离的msc外排体在出生1小时内(例如，1小时内、55分钟内、50分钟内、45分钟内、40分钟内、35分钟内、30分钟内、25分钟内、20分钟内、15分钟内、10分钟内、5分钟内或1分钟内)施用。在一些实施方案中，在出生之后立即向对象施用msc外排体。
[0068]
本公开还考虑了即使在不存在指示如本文中所述的疾病或障碍的症状的情况下施用msc外排体。
[0069]
在一些实施方案中，将msc外排体或包含分离的外排体的组合物向对象(例如，新生儿)施用一次。在一些实施方案中，考虑了重复施用msc外排体，包括两次、三次、四次、五次或更多次施用msc外排体。在一些情况下，msc外排体可持续施用。取决于所治疗病症的严重程度，重复或持续施用可在数小时(例如，1至2、1至3、1至6、1至12、1至18或1至24小时)、数天(例如，1至2、1至3、1至4、1至5、1至6天或1至7天)或数周(例如，1至2周、1至3周或1至4周)的时间内进行。如果重复但不持续施用，则施用之间的时间可以为数小时(例如，4小时、6小时或12小时)、数天(例如，1天、2天、3天、4天、5天或6天)或数周(例如，1周、2周、3周或4周)。施用之间的时间可相同或者其可不同。例如，如果疾病的症状显示出会恶化，则可更频繁地施用a型外排体，并随后一旦症状稳定或减轻，就可不那么频繁地施用a型外排体。
[0070]
在一些实施方案中，msc外排体在出生24小时内施用至少一次并随后在出生1周内再施用至少一次。在一些实施方案中，msc外排体在出生1小时内施用至少一次并随后在出生3至4天内再施用至少一次。
[0071]
msc外排体可通过影响向胸腺递送的任何途径来施用。全身性施用途径例如静脉内注射或持续输注是合适的。
[0072]
可将msc外排体配制成用于通过注射(包括例如通过推注注射或持续输注)进行肠胃外施用。用于注射的制剂可在有或没有添加防腐剂的情况下以例如安瓿中或多剂量容器中的单位剂型存在。组合物可采取如在油性或水性载剂中的水溶性混悬剂、溶液剂或乳剂这样的形式，并且可包含配制剂(formulatory agent)，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油例如芝麻油，或者合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射混悬剂可包含提高混悬剂黏度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮剂还可包含合适的稳定剂或提高溶解度的试剂。作为替代地，外排体可以是冻干的或其他粉末或固体形式以用于在使用之前与合适的载剂例如无菌的无热原水一起配制。
[0073]
应理解的是，根据本公开内容向所治疗对象施用的其他药剂可通过任何合适的途径施用，包括经口施用、鼻内施用、气管内施用、吸入、静脉内施用等。本领域普通技术人员将知晓这样的第二药剂的习惯性施用途径。
[0074]
在一些实施方案中，当将msc外排体或包含msc外排体的组合物施用于对象时，其改善了胸腺功能。在本文中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺的功能(例如，如通过技术人员已知的任何方法测量的)改善了至少20％时，认为胸腺功能得到“改善”。例如，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺的功能(例如，如通过技术人员已知的任何方法测量的)改善了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100或更多时，可认为胸腺功能得到改善。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺的功能(例如，如通过技术人员已知的任何方法测量的)改善了20％、30％、40％、50％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多时，认为胸腺功能得到改善。
[0075]
评价胸腺功能的方法是本领域技术人员已知的。这样的方法的一些非限制性实例包括测量尺寸和/或皮质-髓质比、胸腺成像、评估胸腺产生t细胞的能力和/或评价对象的免疫能力(例如，抗感染)。评价胸腺功能的方法在本领域中也有描述，例如，如在lorenzi
等，j immunol methods.2008dec 31；339(2)：185-194；harris等，clin immunol.2005may；115(2)：138-46；saidakova等，klin lab diagn.2011nov；(11)：45-9；和frush等，pediatric chest imaging第215至240页中所述，其通过引用并入本文。例如，用于评估胸腺功能的常规测试是通过分析存在于离开胸腺的胸腺细胞中的外周血中的t细胞受体切除环(t cell receptor excision circle，trec)(例如，如在lorenzi等，j immunol methods.2008dec 31；339(2)中所述，其通过引用并入本文)。
[0076]
在一些实施方案中，当将msc外排体或包含msc外排体的组合物施用于对象时，其恢复了胸腺结构。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺的结构(例如，如由胸腺的皮质-髓质比所指示的(参见图1e))提高了至少20％时，认为胸腺结构是“恢复的”。例如，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺的结构(例如，如由胸腺的皮质-髓质比所指示的(参见图1e))提高了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或更多时，可认为胸腺结构是“恢复的”。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺的结构(例如，如由胸腺的皮质-髓质比所指示的(参见图1e))提高了20％、30％、40％、50％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多时，认为胸腺结构是“恢复的”。
[0077]
在一些实施方案中，当将msc外排体或包含msc外排体的组合物施用于对象时，其恢复了胸腺发育。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺细胞的数目(也称为“胸腺细胞计数”)提高了至少20％时，认为胸腺发育是“恢复的”。例如，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺细胞的数目提高了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或更多时，可认为胸腺发育是“恢复的”。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺细胞的数目提高了20％、30％、40％、50％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多时，认为胸腺发育是“恢复的”。
[0078]
在一些实施方案中，当将msc外排体或包含msc外排体的组合物施用于对象时，其恢复了胸腺中的胸腺细胞祖群。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺细胞祖细胞的数目提高了至少20％时，认为胸腺中的胸腺细胞祖群是“恢复的”。例如，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺细胞祖细胞的数目提高了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或更多时，认为胸腺中的胸腺细胞祖群是“恢复的”。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺细胞祖细胞的数目提高了20％、30％、40％、50％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多时，认为胸腺中的胸腺细胞祖群是“恢复的”。
[0079]
在一些实施方案中，当将msc外排体或包含msc外排体的组合物施用于对象时，其降低了胸腺细胞凋亡(例如，由暴露于高氧诱导的)。“凋亡”是指作为生物体的生长或发育的正常和受控制部分而发生的细胞死亡。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象
中相比，在已施用msc外排体的对象中当经历凋亡的胸腺细胞的数目降低了至少20％时，认为胸腺细胞凋亡“降低”。例如，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当经历凋亡的胸腺细胞的数目降低了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％时，可认为胸腺细胞凋亡“降低”。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当经历凋亡的胸腺细胞的数目降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％时，认为胸腺细胞凋亡“降低”。
[0080]
在一些实施方案中，当将msc外排体或包含msc外排体的组合物施用于对象时，其恢复了胸腺髓质上皮细胞的成熟。“胸腺髓质上皮细胞”代表胸腺的独特基质细胞群，其在建立中枢耐受性中起着至关重要的作用并且与功能性哺乳动物免疫系统的发展相关。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺髓质上皮细胞的数目(例如，如通过评价自身免疫调节子(aire，例如参见图2e)的表达水平所指示的)提高了至少20％时，认为胸腺髓质上皮细胞的成熟是“恢复的”。例如，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺髓质上皮细胞的数目(例如，如通过评价自身免疫调节子(aire，例如参见图2e)的表达水平所指示的)提高了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或更多时，可认为胸腺髓质上皮细胞的成熟是“恢复的”。在一些实施方案中，与在未施用msc外排体的对象中相比，在已施用msc外排体的对象中当胸腺髓质上皮细胞的数目(例如，如通过评价自身免疫调节子(aire，例如参见图2e)的表达水平所指示的)提高了20％、30％、40％、50％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多时，认为胸腺髓质上皮细胞的成熟是“恢复的”。
[0081]
在一些实施方案中，将msc外排体或包含msc外排体的组合物与其他药剂一起使用以用于治疗本文中所述的任何疾病。在一些实施方案中，将msc外排体和其他药剂配制在相同的组合物中。在一些实施方案中，将msc外排体和其他药剂配制在单独的组合物中。在一些实施方案中，将msc外排体和其他药剂同时施用于对象。在一些实施方案中，将msc外排体和其他药剂单独施用。在一些实施方案中，在其他药剂之前施用msc外排体。在一些实施方案中，在其他药剂之后施用msc外排体。
[0082]
例如，对于治疗自身免疫疾病，可将msc外排体与已知对自身免疫疾病具有治疗作用的药剂一起使用。这样的药剂包括但不限于非甾体抗炎药、糖皮质激素、甲氨蝶呤、来氟米特、抗tnf生物制剂(例如抗体，例如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golinumab)或赛妥珠单抗聚乙二醇)。用于治疗自身免疫疾病的药物是本领域已知的，例如，如在li等，front pharmacol.2017；8：460中所述，其通过引用并入本文。
[0083]
在一些实施方案中，对于治疗感染，将msc外排体与其他抗感染剂一起施用。抗感染剂的一些非限制性实例包括抗细菌剂(例如，抗生素)、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂。
[0084]
在一些实施方案中，对于治疗癌症，将msc外排体与其他抗癌剂一起施用。在一些实施方案中，抗癌剂选自：小分子、寡核苷酸、多肽及其组合。在一些实施方案中，抗癌剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，化学治疗剂选自：放线菌素、全反式视黄酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红
霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、埃博霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
[0085]
通过以下实施例，将更充分地理解本文中所公开技术的一些实施方案、优点、特征和用途。实施例旨在举例说明本公开内容的一些益处并描述一些特定实施方案，但不旨在示例本公开内容的全部范围，并因此，不限制本公开内容的范围。
[0086]
实施例
[0087]
支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，bpd)是影响需氧供应的早产新生儿的多因素慢性肺疾病。其特征在于限制肺生长以及肺泡和血管发育，导致肺功能受损。迄今为止，bpd缺乏用于预防或治疗氧诱导损伤的有效治疗方法。先前的工作表明，单剂量的msc外排体在新生儿高氧的实验模型中显著改善了肺形态，降低了肺纤维化并促进了血管重塑。这些作用主要是通过调节肺中的巨噬细胞表型来抑制高氧诱导的炎症1。
[0088]
在新生儿中，适应性免疫系统相对不发达，并且对胸腺(适应性免疫细胞发育的重要器官)长期高氧的效果尚未探索。胸腺微环境是由一组胸腺上皮细胞(tec)构成的三维细胞结构，所述胸腺上皮细胞指导t细胞的发育和保留
[2]
。在新生儿高氧的实验模型中，已显示胸腺内卷并促进自身反应性t细胞的成熟。氧诱导的胸腺内卷被证明是由于胸腺细胞凋亡提高，从而诱导双阳性胸腺细胞和双阴性胸腺细胞的计数和增殖显著降低
3，4
。
[0089]
鉴于在实验bpd模型中用msc-外排体获得的结果，本文中探究了msc-外排体治疗是否可恢复胸腺结构和胸腺细胞发育。
[0090]
从人脐带胶质来源的msc的条件培养基中纯化外排体。将新生小鼠在出生后第4天(postnatal day 4，pn4)暴露于高氧(75％o2)，用msc外排体处理，并在pn7时返回至室内。在pn7和pn14时收获经处理的动物和适当的对照。通过胸腺结构的组织病理学对胸腺结构进行分析。分析髓质上皮细胞的aire的表达，所述aire是充当“自身免疫调节子”以防止免疫系统攻击自身的转录因子。使用以下抗体通过免疫荧光和通过流式细胞术分析的胸腺细胞计数来检测aire蛋白水平：cd44-pe、cd25-fitc、cd3-bv510、cd4-pecy7和cd8-percpcy5.5。
[0091]
已表明msc-外排体使胸腺结构和胸腺细胞计数恢复至对照水平(图1a至1d)。msc-外排体处理还降低了氧诱导的胸腺细胞凋亡并促进了髓质tec的正常成熟(图2a至2d)。此外，msc-外排体处理恢复了胸腺中的胸腺细胞祖群(图3a至3d)。最后，msc-外排体处理促进了胸腺中cd4+ t细胞的发育，但抑制了cd8+ t细胞的发育(图4a至4g)。
[0092]
数据还表明，msc-外排体阻止了暴露于高氧的小鼠胸腺中的细胞凋亡(图5a至5c)，在高氧损伤之后恢复了髓质抗原呈递细胞的表型(图6a至6c)，并在多器官水平上恢复了调节性t细胞表型(7a至7d)。
[0093]
参考文献
[0094]
1 willis，g.r.et al.mesenchymal stromal cell exosomes ameliorate experimental bronchopulmonary dysplasia and restore lung function through macrophage immunomodulaion.american journal of respiratory and critical care medicine，doi：10.1164/rccm.201705-0925oc(2017).
[0095]
2 takahama，y.，ohigashi，i.，baik，s.&anderson，g.generation of diversity in thymic epithelial cells.nature reviews.immunology 17，295-305，doi：10.1038/nri.2017.12(2017).
[0096]
3 rosen，d.et al.accelerated thymic mauration and autoreactive t cells in bronchopulmonary dysplasia.american journal of respiratory and critical care medicine 174，75-83，doi：10.1164/rccm，200511-1784oc(2006).
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4 angusamy，s.et al.altered thymocyte and t cell development in neonatal mice with hyperoxia-induced lung injury.journal of perinatal medicine，doi：10.1515/jpm-2016-0234(2017).
[0098]
本文中(例如，在背景技术、发明内容、具体实施方式、实施例和/或参考文献部分中)提及的所有出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目(例如，序列数据库条目)均通过引用在此整体并入如同每个单独的出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目都是通过引用特别地并且单独地并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
[0099]
等同方案和范围
[0100]
本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文中所述的一些实施方案的许多等同方案。本公开内容的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述的那样。
[0101]
除非相反地指出或者以其他方式从上下文中显而易见，否则没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。除非相反地指出或以其他方式从上下文中显而易见，否则如果存在一个、多于一个或全部组成员，则在组的两个或更多个成员之间包含“或/或者”的权利要求或描述应被认为符合要求。在两个或更多个组成员之间包括“或/或者”的组的公开内容提供了其中存在恰好一个组成员的实施方案，其中存在多于一个组成员的实施方案以及其中存在全部组成员的实施方案。为了简洁起见，在本文中这些实施方案没有被单独地详细说明，但是应理解的是，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。
[0102]
应当理解的是，本公开内容涵盖其中将来自一个或更多个权利要求或者来自说明书的一个或更多个相关部分的一个或更多个限制、要素、条款或描述性术语引入到另一个权利要求的所有改变、组合和排列。例如，引用另一权利要求的权利要求可被修改为包含在引用相同基础权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或更多个限制。此外，在权利要求中记载组合物的情况下，应理解的是，除非另有说明或者除非对于本领域普通技术人员明显的是将出现矛盾或不一致，否则包括根据本文中公开的任何制备或使用方法或者根据本领域已知方法制备或使用组合物的方法(如果有的话)。
[0103]
在要素以列表(例如，以马库什组格式)表示的情况下，应理解的是，还公开了要素的每个可能的亚组，并且任何要素或要素的亚组都可从该组中移除。还应注意的是，术语“包含/括”意在为开放性的，并且允许包含另外的要素或步骤。应当理解的是，一般来说，在实施方案、产品或方法被称为包含特定要素、特征或步骤的情况下，还提供了由这样的要素、特征或步骤组成或基本上由其组成的一些实施方案、产品或方法。为了简洁起见，在本文中这些实施方案没有被单独地详细说明，但是应理解的是，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。
[0104]
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解的是，除非另有说明或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另外明显的，否则表示为范围的值在一些实施方案中可采用所述范围内的任何特定值至该范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。为了简洁起见，每个范围内的值没有在本文中被单独地详细说明，但是应理解的是，这些值中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。还应理解的是，除非另有说明或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另外明显的，否则表示为范围的值可假定给定范围内的任何子范围，其中该子范围的端点为以与该范围下限的单位的十分之一相同的精确度表示。
[0105]
在提供网站的情况下，url地址提供为非浏览器可执行的代码，括号中带有相应网址的句点。实际的网址不包含括号。
[0106]
另外，应当理解的是，本公开内容的任何特定实施方案可明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。在给出范围的情况下，该范围内的任何值可明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。本公开内容的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可从任何一个或更多个权利要求中排除。为了简洁起见，本文中未明确阐述其中排除了一个或更多个要素、特征、目的或方面的所有实施方案。