专利名称：包含至少一种toll样受体7或toll样受体8激动剂以及toll样受体4激动剂的免疫刺激组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫刺激组合物领域，所述免疫刺激组合物包含至少一种Toll样受体7或Toll样受体8激动剂，所述受体在抗原呈递细胞上呈递。更具体地说，本发明涉及额外包含Toll样受体4激动剂的组合物，以及特别是额外包含疫苗抗原的上述组合物。
现有技术中已知需要用选自各种不同种类免疫刺激物的佐剂来增加或定向(orienter)存在于疫苗中的抗原所诱导的免疫应答。这可能是人们所期望的，因为当单独给予时，抗原并不足以产生免疫原性，特别是因为其十分高的纯度，或因为期望减少存在于疫苗中的抗原数量或要进行的强化次数，或因为期望延长疫苗所给予的保护时间。有时，与其将目标瞄准于从数量上改变诱导的应答，倒不如从质量上来改变。
业已描述了许多关于其佐剂特性的分子；但是，目前疫苗用的主要市售佐剂是基于铝或乳剂的佐剂。
因此，在已知的现有技术中，具体提到的是专利EP636031，其披露了在豚鼠中1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺作为单纯疱疹病毒2糖蛋白疫苗的佐剂的用途。在该文献中，在用HSV2病毒激发动物的过程中，所给予的疫苗并不能完全阻止疾病的发展，但有可能减少损害、病毒的阴道分泌物以及疾病复发现象。
根据Vasilakos等的标题为“Adjuvant activities of ImmuneResponse Modifier R848Comparison with CpG ODN”，CellularImmunology 204，64-74(2000)的出版物，咪唑并喹啉衍生物R-848被描述为是一种在试验中使用的作为给予小鼠的抗原—卵白蛋白的TH1型佐剂。该出版物也描述了另一种由寡核苷酸组成的疫苗佐剂类型，所述寡核苷酸包括二核苷酸CG，其中胞嘧啶没被甲基化。
在包括Jurk等的标题为“Human TLR7 or TLR8 independentlyconfer responsiveness to the antiviral compound R-848”，NatureImmunology，June 2002，Vol.3，No.6，p 499的出版物的其它现有技术文献中，陈述了在病原体的免疫应答中Toll样受体扮演着重要的角色，Toll样受体9为具有非甲基化CpG单位的细菌DNA所活化，同时R-848通过Toll样受体7和Toll样受体8活化细胞。在Przetak等的标题为“Novel synthetic LPS receptor agonists boost systemic and mucosalantibody responses in mice”，Vaccine 21(2003)p961-970的出版物中，描述了带有脂肪酸链的化合物，该化合物没有糖环，但具有破伤风毒素或卵白蛋白形成的抗原的佐剂活性。已知这些化合物能起动与Toll样受体4相关的作用机理。
取决于给药情况，已知这些化合物全都分别具有不同程度的免疫刺激特性；然而，还是期望能获得可以加强这些免疫刺激特性的组合物，特别是在给予疫苗抗原情况下。
为达到该目的，本发明的主题是提供一种免疫刺激组合物，其包含至少一种Toll样受体7或Toll样受体8激动剂，还额外包含Toll样受体4激动剂。因此，获得了免疫刺激应答的增强。
根据本发明一个特定的实施方案，Toll样受体7或Toll样受体8激动剂是不同于Toll样受体4激动剂的化合物。
根据一个特定的实施方案，免疫刺激组合物额外包含至少一种疫苗抗原。因此，增强了所诱导的抗抗原的免疫应答。
根据本发明一个特定的实施方案，Toll样受体7或Toll样受体8激动剂是咪唑并喹啉胺衍生物。这样的激动剂可通过纯化学合成获得，因此保证了制药应用所必须的再现性和安全性。
根据一个特定的实施方案，所述咪唑并喹啉胺衍生物是4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇。
根据一个实施方案，Toll样受体4激动剂是申请WO0044758中，特别是ER804057中描述的化合物；这样的化合物，可通过纯化学合成获得，也保证了制药应用所必须的再现性和安全性。
鉴于以下详述的内容，参考图解说明实施例5所获得结果的
图1-4，还发现了本发明的众多其它优点。
本发明涉及免疫刺激组合物；措辞免疫刺激组合物理解为意指能诱导诸如树突细胞的免疫系统细胞成熟或活化，然后导致某些可被检测的标记物(CD25、CD80、CD83等)在细胞上表达，或导致可被分析的细胞因子(IL6、IL12p70、TNF-α等)分泌的组合物。
根据一个特定的实施方案，本发明的免疫刺激组合物包含至少一种疫苗抗原。措辞疫苗抗原理解为意指当将其给予人或动物时，能诱导免疫系统应答的抗原。免疫系统应答可通过抗体的产生或某些细胞的活化，特别是抗原呈递细胞(如树突细胞)、T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化来证实。
疫苗组合物可以是预防应用或治疗应用或两者皆有的组合物。
可以通过任何疫苗常用或推荐的途径进行给药肠胃外途径、粘膜途径，并可以各种剂型提供可注射的或可粉化的液体、冻干或喷雾干燥或风干的制剂等等。可通过注射器或无针头注射器进行肌内、皮下或皮内注射给药。也可通过能递送干粉或液体喷雾的喷雾器在粘膜层面上给药，而不管它们是鼻、肺、阴道或直肠粘膜。
根据本发明在疫苗组合物中使用的疫苗抗原是“直接”抗原，更确切地说不是编码这些抗原的DNA，而是抗原自身；可以是全微生物或仅仅是该微生物的一部分；因此，在疫苗常用的抗原中，可提到的具体是-多糖，不管它们是单独的还是缀合有诸如载体蛋白的载体元件的，-减毒的活的全微生物，-灭活微生物，-重组肽和蛋白，-糖蛋白、糖脂、脂肽，-合成肽，-在疫苗称为“片段”疫苗情况下的裂解微生物。
这些抗原是用于或能被用于治疗或预防各种疾病的抗原，所述疾病例如白喉、破伤风、脊髓灰质炎、狂犬病、百日咳、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、黄热病、伤寒、水痘、麻疹、腮腺炎、风疹、日本脑炎、脑膜炎、肺炎球菌感染、轮状病毒感染、AIDS、癌症、肺结核、莱姆病、RSV感染、疱疹、衣原体、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、粘膜炎莫拉菌或B型流感嗜血菌引起的细菌病、疟疾、利什曼病、李斯特菌病等等。
本发明的疫苗组合物可以是供免疫抗单种病原体或癌之用的组合物，更确切地说是其包含一种或多种来自单种病原体或癌的抗原，或者可以是供抗几种病原体或癌症免疫之用的组合物(参考疫苗联合体)。
对于本发明目的来说，措辞Toll样受体7和Toll样受体8激动剂理解为意指能结合这些受体任一或两者且能触发与这些受体相关的信号级联的化合物，特别是能激活编码任一这些受体或两者的cDNA转染的细胞中NF-κB易位的化合物。
在适用于本发明目的的激动剂中，具体提到的是取代的咪唑并喹啉胺，特别是专利US 5389640中描述的那些。使用4-氨基-2-乙氧基-甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇，也称为R-848，获得了特别好的结果，USP5389640的实施例99和101中描述了制备该化合物的方法。
对于本发明目的来说，措辞Toll样受体4激动剂理解为意指能与该受体结合且触发相关的信号级联的化合物，特别是能激活编码该受体的cDNA转染的细胞中NF-κB易位的化合物。
在适用于本发明目的的激动剂中，可提到的是革兰氏阴性细菌的LPS或，更恰当地，这些LPS的脂质A的单磷酸化衍生物，且尤其是在3-位脱酰基的单磷酸化脂质A或3D-MPL，描述于RIBI的UK专利号2211502和USP 4436727及其再颁发专利4912094中。诸如那些描述于CORIXA的申请WO98/50399中的产品类似物，特别是RC-529，或者是那些描述于申请WO02/12258中的这些产品的合成类似物也适用于本发明。同样地，OM Pharma的申请WO95/14026、WO00/00462、WO01/46126和WO01/46127的主题化合物也可适用于本发明。
优选使用没有糖环的纯化学合成产品，例如那些描述于EISAI CO的专利USP 6290973中的，特别是称为ER 112066的产品，或更优选使用称为ER804057的产品。该产品是(1R，6R，22R，27R)-1，27-二庚基-1，27-双十二烷酰基-9，19-二羟基-9，19-二氧桥-14-氧代-6，22-双[(1，3-二氧代十四烷基)氨基]-4，8，10，18，20，24-六氧杂-13，15-二氮杂-9，19-二磷酸二十七烷的二钠盐，其可根据专利申请WO0044758中描述的第50号化合物的制备方法，即描述于第32页的方法而获得，前提是在产物39至产物41合成的步骤中在EDC(即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)存在下肉豆蔻酰氯预先为β-酮肉豆蔻酸所取代，其描述于该专利申请的第28页中。
无论是Toll样受体4激动剂还是Toll样受体7和8激动剂，都已知这些激动剂均有免疫刺激特性。本发明的价值在于在本发明上下文中所观察到的应答是增强的应答。虽然对于不熟悉免疫学领域的人而言，获得这样增强作用最初认为显而易见的，但正相反在本发明特定领域中反应当认为是令人惊奇的；实际上，试验业已表明当两种或更多种免疫刺激物存在于同一组合物中时，经常发生其中一种免疫刺激物抑制其它免疫刺激物的情况，或无论如何当产品发挥免疫刺激效应时，很难进一步增加已获得的应答。
在体外免疫刺激试验中，观察到与免疫系统细胞接触的免疫刺激物所带来的协同效应，其诱导了完全预料不到的细胞活化水平，无法从分别使用每种免疫刺激物所诱导的活化水平来预见。
同样地，当免疫刺激组合物包含疫苗抗原时，在所获得的应答中观察到了协同效应，特别是就应答物数量来说，应答水平十分好，这是完全预料不到的，也根本无法从单独使用的每种佐剂所获得的应答中得出该结论。
使用这些Toll样受体7，8和4激动剂所获得的结果更加令人惊奇，因为与单独使用每种激动剂相比，通过组合几种其它受体激动剂进行的试验并没有带来任何观察到的增强效应。
本发明Toll样受体4，7和8激动剂具有被给予的疫苗抗原的佐剂特性，这就意味着与它们不存在情况下所获得的应答相比，它们通常能增加或改变给予该疫苗组合物的生物体的免疫系统应答。特别是，其可包括体液应答或细胞应答或两者的增加。在应答中效应或许不会增加，但所诱导的应答产生了不同的定向例如定向于细胞应答而不是体液应答，产生了某些细胞因子而不是其它的细胞因子，产生了某些类型或亚型的抗体而不是其它的抗体，某些细胞受刺激而不是其它的细胞，等等。佐剂的效应也可以是随着时间过去而增加免疫应答的持续时间。也包括减少为使免疫个体获得保护所必须的给药量，或减少给药剂量中所含有的抗原的量。
就本发明来说，根据所获得结果离差的减少，基本上证实了所观察到的协同效应，特别是在Th1应答方面。
在本发明激动剂给药过程中，当它们与疫苗组合物的抗原组合时，即当它们直接存在于疫苗组合物中时，或当它们与期望改变免疫原性的抗原分别给予时，可获得本发明激动剂的佐剂效应。然而，更可取的是在与待给予的抗原相同的疫苗组合物中使用它们。
下列实施例举例说明了本发明的特定实施方案。
1.制备Toll样受体7和8激动剂的储备悬浮液从Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)购得二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，InVivogen公司提供了4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇(R-848)。
这些化合物以粉末形式提供。
将补充有150μg R-848(0.51μmol)的342μg DPPC(0.46μmol)溶于984μl的氯仿/甲醇4∶1(v/v)混合液中。通过旋转式蒸发器在园底玻璃烧瓶中蒸干溶液，使得在园底烧瓶壁上形成均匀的脂膜。在高真空下进一步干燥该膜以便完全除去痕量的残留溶剂，然后取出在60℃下溶于3ml的水中。通过涡旋均质所产生的脂质体悬浮液，在超声浴中进行超声处理，然后在50℃恒温下通过Lipex挤出机穿过0.8μm孔隙率的聚碳酸酯膜，接着穿过0.4μm孔隙率的膜，最后穿过0.2μm孔隙率的膜顺序挤出。
如此，获得了DPPC/R-848(0.9∶1mol/mol)脂质体，在水中浓度分别为DPPC 114μg/ml和R-848 50μg/ml。
2.制备Toll样受体4激动剂的储备悬浮液从Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)购得二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，Eisai公司提供了ER804057。
这些化合物以粉末形式提供。
将补充有150μg ER804057(0.092μmol)的273μg DPPC(0.37μmol)溶于760μl的氯仿/甲醇4∶1(v/v)混合液中。通过旋转式蒸发器在园底玻璃烧瓶中蒸干溶液，使得在园底烧瓶壁上形成均匀的脂膜。在高真空下进一步干燥该膜以便完全除去痕量的残留溶剂，然后取出在60℃下溶于3ml的水中。通过涡旋均质所产生的脂质体悬浮液，在超声浴中进行超声处理，然后在50℃恒温下通过Lipex挤出机穿过0.8μm孔隙率的聚碳酸酯膜，接着穿过0.4μm孔隙率的膜，最后穿过0.2μm孔隙率的膜顺序挤出。
如此，获得了DPPC/ER804057(4∶1mol/mol)脂质体，在水中浓度分别为DPPC 91μg/ml和ER804057 50μg/ml。
3.制备Toll样受体4激动剂和Toll样受体7和8激动剂的储备悬浮液从Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)购得二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，InVivogen公司提供了4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇(R-848)，Eisai公司提供了ER804057。
这些化合物以粉末形式提供。
将补充有150μg TLA4(0.092μmol)和150μg R-848(0.51μmol)的273μg DPPC(0.37μmol)溶于1.06ml的氯仿/甲醇4∶1(v/v)混合液中。通过旋转式蒸发器在园底玻璃烧瓶中蒸干溶液，使得在园底烧瓶壁上形成均匀的脂膜。在高真空下进一步干燥该膜以便完全除去痕量的残留溶剂，然后取出在60℃下溶于3ml的水中。通过涡旋均质所产生的脂质体悬浮液，在超声浴中进行超声处理，然后在50℃恒温下通过Lipex挤出机穿过0.8μm孔隙率的聚碳酸酯膜，接着穿过0.4μm孔隙率的膜，最后穿过0.2μm孔隙率的膜顺序挤出。
如此，获得了DPPC/ER804057R-848(4∶1∶5.5mol/mol/mol)脂质体，在水中浓度分别为DPPC 91μg/ml、ER80405750μg/ml以及R-84850μg/ml。
4.制备疫苗组合物制备疫苗组合物包括，能用于抗AIDS疫苗的重组蛋白作为疫苗抗原；其是去毒的TAT III B蛋白，是通过在大肠杆菌中表达并通过多个层析步骤纯化，接着如专利申请WO99/33346中所述的进行化学钝化而获得的，在此其被鉴定为羧甲基化的Tat。
该组合物制备方法描述如下。
将实施例1-3制备的脂质体悬浮液与浓缩的Tat溶液等体积(0.9ml+0.9ml)混合，该Tat溶液浓度为200μg/ml，溶于含有200mM NaCl，pH 7.4的100mM Tris缓冲液中，以便获得成分标示如下的制剂(终体积1.8ml)，其中抗原和佐剂标示的是每200μl剂量的量。
1)Tat(20μg)2)Tat(20μg)+ER804057/DPPC(5μg/9.1μg，即3.1nmol/12.4nmol)
3)Tat(20μg)+ER804057/DPPC R-848(5μg/9.1μg/5μg，即3.1nmol/12.4nmol/16.7nmol)4)Tat(20μg)+R-848/DPPC(5μg/11.4μg，即16.7nmol/15.5nmol)5.对小鼠进行免疫测试对购买的4组，每组6只8周龄的雌性BALB/c小鼠皮下注射实施例4中制备的一种组合物，每只小鼠的注射剂量为200μl；在D0和D21进行注射。
在D14于眶窦后收集血样用于评估初次应答，在D32进行二次应答的评估。利用标准的ELISA测定特异性IgG1和IgG2a的水平。
在D37处死小鼠；取出脾并分离脾细胞。
关于体液应答所获得的结果概述于下表和图1-4中，其中IgG水平表示为任意的ELISA单位(log10)。
对于每组小鼠而言，表中标示的值是每组小鼠所获得值的几何平均滴度。
IgG1/IgG2a比值可用于评估所诱导的免疫应答的定向。实际上，小鼠的Th1型应答是出现较高比例的IgG2a，而Th2型应答是出现较高比例的IgG1。因此可以看到，与单独使用每种免疫刺激物相比，使用本发明组合物应答更多地定向为Th1型。
通过图1-4可见每组小鼠所获得的应答，因此可用于评估或大或小的结果离差。在强化注射后所获得的IgG2a应答水平上，本发明组合物的特性是值得特别注意的；实际上，当使用具有单个免疫刺激物R-848或ER804057的组合物时，所获得的应答水平满意度一般，注意的是在这些情况下结果是相对离散的；而使用本发明化合物的所有小鼠都产生了高的IgG2a水平。在接种疫苗领域该特性是十分重要的，在接种疫苗领域中总是期望着能保护所有的接种对象，但是在不同个体之间经常观察到易变性，因此无法保证进行接种的每一个体都能有相同的效果。
在包含Toll样受体4激动剂以及Toll样受体7和8激动剂的佐剂所存在的相同疫苗组合物中，观察到的这些结果更令人惊奇，因为与单独使用每种化合物作为佐剂所获得的应答相比，通过将Toll样受体7和8激动剂与其它也呈递到抗原呈递细胞上的受体激动剂组合所进行的测试并没有改善应答。
为评估本发明药物组合物对细胞应答的效果，对ELISPOT测定中能产生γ-干扰素的脾细胞计数。对有活力的细胞(fresh cells)和再刺激的细胞都进行该测试。
为进行该测试，在仅有培养基或添加重组TAT抗原条件下，将脾细胞以200000个细胞/孔的密度在细胞培养平板上培养。培养16小时后，目测ELISPOT，即对相应于分泌γ-干扰素的细胞的斑点进行计数。所获得的结果概述于下表中；标示的值是平均值(每组小鼠)，该平均值是对每只小鼠进行添加重组TAT的孔中每百万细胞的斑点数与仅有培养基的孔中每百万细胞的斑点数之间的差值计算得到的平均值。
下表概述了对有活力的细胞所获得的结果。
下表概述了对体外再刺激7天的细胞所获得的结果，条件是存在IL2，使用完整覆盖TAT蛋白序列的重叠肽库。
此外，使用ELISA对包括在重组TAT存在或不存在下培养5天的脾细胞的培养物上清液中IL5细胞因子和γ-干扰素的分泌进行平行测定。所获得的结果表示为pg/ml，概述于下表中
这些结果表明使用本发明组合物获得了对TH1应答特别有利的效果。
6.制备用于人细胞刺激测试的脂质体悬浮液从Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)购得二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，InVivogen公司提供了4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇(R-848)。
这些化合物以粉末形式提供。
将补充有1mg R-848(3.38μmol)的9.92mg DPPC(13.5μmol)溶于2ml的氯仿/甲醇4∶1(v/v)混合液中。通过旋转式蒸发器在园底玻璃烧瓶中蒸干溶液，使得在园底烧瓶壁上形成均匀的脂膜。在高真空下进一步干燥该膜以便完全除去痕量的残留溶剂，然后取出在60℃下溶于4ml的水中。通过涡旋均质所产生的脂质体悬浮液，在超声浴中进行超声处理，然后在50℃恒温下通过Lipex挤出机穿过0.8μm孔隙率的聚碳酸酯膜，接着穿过0.4μm孔隙率的膜，最后穿过0.2μm孔隙率的膜顺序挤出。
如此，获得了DPPC/R-848(4∶1mol/mol)脂质体，在水中浓度分别为DPPC 2.48mg/ml和R-848250μg/ml。
从Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)购得二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，Eisai公司提供了ER804057。
这些化合物以粉末形式提供。
将补充有11mg ER804057(6.7μmol)的19mg DPPC(25μmol)溶于5ml的氯仿/甲醇4∶1(v/v)混合液中。通过旋转式蒸发器在园底玻璃烧瓶中蒸干溶液，使得在园底烧瓶壁上形成均匀的脂膜。在高真空下进一步干燥该膜以便完全除去痕量的残留溶剂，然后取出在60℃下溶于11ml的水中。通过涡旋均质所产生的脂质体悬浮液，在超声浴中进行超声处理，然后在50℃恒温下通过Lipex挤出机穿过0.8μm孔隙率的聚碳酸酯膜，接着穿过0.4μm孔隙率的膜，最后穿过0.2μm孔隙率的膜顺序挤出。
如此，获得了DPPC/ER804057(4∶1mol/mol)脂质体，在水中浓度分别为DPPC 1.72mg/ml和ER804057 1mg/ml。
7.体外人细胞刺激测试对4个独立供体评估本发明组合物体外诱导来源自人单核细胞的树突细胞成熟的能力。单核细胞获得自外周血单核细胞并在IL4和GM-CSF存在下培养5-6天。
然后在下列组合物之一存在下培养这些细胞2天-仅有培养基，作为阴性对照，-根据实施例6制备R-848/DPPC脂质体并稀释以得到2.96μg/ml的R-848，-根据实施例6制备的ER804057/DPPC脂质体，浓度为0.1μg/ml，-2种脂质体制剂的组合物。
然后使用流式细胞仪进行表型分析，可以测定成熟标记物CD25、CD80和CD83的表达，并使用ELISA测定这些细胞分泌的细胞因子(TNF-α、IL6和IL12p70)。
示于下表的结果代表对4个供体计算得到的平均值
所获得的结果表明本发明组合物诱导标志TH1定向应答的细胞因子例如IL12p70分泌的高能力；通过组合2种产品所获得的协同效应是显著的。因此，在所有寻求获得Th1定向免疫系统应答的处理方法中，特别是在期望诱导下列细胞因子TNF-α、IL-6或IL12p70之一分泌的情况下，特别推荐使用本发明组合物。
权利要求
1.一种包含至少一种Toll样受体7或Toll样受体8激动剂的免疫刺激组合物，其特征在于额外包含Toll样受体4的激动剂。
2.如前述权利要求所述的免疫刺激组合物，其特征在于Toll样受体7或Toll样受体8激动剂是不同于Toll样受体4激动剂的化合物。
3.如权利要求1或2所述的免疫刺激组合物，其特征在于额外包含至少一种疫苗抗原。
4.如前述权利要求之一所述的免疫刺激组合物，其特征在于Toll样受体7激动剂是咪唑并喹啉胺衍生物。
5.如前述权利要求所述的免疫刺激组合物，其特征在于咪唑并喹啉胺衍生物是4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇。
6.如前述权利要求之一所述的免疫刺激组合物，其特征在于Toll样受体4激动剂是ER804057。
7.如前述权利要求之一所述的免疫刺激组合物在制备药物中的应用。
8.权利要求1-6之一所述的免疫刺激组合物在制备能诱导TH1型免疫应答的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及包含至少一种Toll样受体7或Toll样受体8激动剂和Toll样受体4激动剂的免疫刺激组合物。本发明组合物也可包含疫苗抗原。
文档编号A61P37/04GK1921862SQ200480041947
公开日2007年2月28日 申请日期2004年12月20日 优先权日2003年12月19日
发明者N·布尔丁, J·亨斯勒 申请人:赛诺菲巴斯德有限公司