经由CD14和ToII样受体4信号传导途径调节细胞的组合物和方法

专利名称：经由CD14和ToII样受体4信号传导途径调节细胞的组合物和方法
技术领域：
本发明一般性地涉及分子免疫学和人类疾病的治疗。本发明涉及基于经 由CD14和配体进行信号传导的Toll样受体4 (TLR4)途径的特性筛选和鉴定 化合物的方法。本发明还提供了治疗哺乳动物受治疗者中各种疾病状态例如 感染性疾病、炎症和自身免疫疾病的方法。本发明还涉及转基因非人类动物 和用于研发在CD14基因中含有功能缺失突变(loss-of-fimction mutation)的转 基因非人类动物的方法。
背景技术：
脂多糖(LPS)负责格兰氏阴性菌的许多致病作用，但它也诱导保护性的 免疫应答。O'Brien等，J /mww"o/. 124: 20-24, 1980; Rosenstreich等，0 CO^. Wev. /mm""o/. 3: 263-330， 1982。 LPS由脂质A部分、核心多醣和各种长度(通 常多于50个单糖单位)的0-多糖组成。菌落形态("光滑"和"粗糙")指示O-多糖的状态。具有长O-多糖链的微生物突变体形成光滑的菌落；缺少O-多糖链的那些形成粗糙的菌落；因此称为光滑和粗糙LPS。因为根本不具有附加的糖的脂质A是LPS的生物活性部分，因此认为 糖链在内毒性中起辅助性的作用，并且没有宿主区分光滑和粗糙LPS化学 型的明显i正才居。Galanos等,c/owrwa/ o/140: 221-227, 1984; Galanos等，版 /历0c/2亂148: 1-5， 1985。另夕卜，推想所有的LPS分子由血浆LPS结合蛋白(LBP)连接并转移至CD14 (---种在单核的吞噬细胞上大量表达的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白集中LPS信号的事件。 Tobias等， /所o/. CT^w. 263: 13479-13481, 1988; Tobias等， /所o/. C&肌264: 10867-10781, 1989; Schumann等，5We"ce 249: 1429-1431, 1990; Wright等， 5We"ce248: 1431-1433, 19卯。所有的LPS应答也依赖于Toll样受体4 (TLR4) 和MD-2所形成的跨膜复合物，通过该复合物，信号得以传播。Poltorak等， 5We"ce 282: 2085-2088; Nagai等，/附mw"o/. 3: 667-672, 2002。 TLR4以4 种衔接子(adapter)蛋白的方式进行信号传导，所述衔接子蛋白似乎以功能对 (flinctional pairs) (MyD88和Mal(也称为TIRAP),以及TRIF和TRAM)形式 起作用。Hoebe等，Atow" 424: 743-748, 2003; Yamamoto等，<SWe"ce 301: 604-643， 2003; Yamamoto等，Ato. /m淤w"o/. 4: 1144-1150， 2003; Beutler， Ato脏430: 257-263, 2004。本领域目前的状态表明在患有自身免疫病或感染性疾病的哺乳动物受 治疗者中，LPS受体复合物当被激活时利用所有的这些衔接子(MyD88和 Mal(也称为TIRAP)，以及TRIF和TRAM);并且当静止时，不利用它们。在本领域中存在改进"^断和治疗疾病例如自身免疫病和感染性疾病的需要， 包括调节或控制哺乳动物受治疗者中先天免疫系统的LPS受体复合物的因 子。发明内容提供了筛选和鉴定化合物的组合物和方法，所述化合物经由CD14和配 体调节Toll样受体4 (TLR4)途径的信号传导。提供了通过经由CD14和配体 调节Toll样受体4(TLR4)途径的信号传导，来治疗哺乳动物受治疗者中各种疾病状态例如感染性疾病、炎症或自身免疫病的方法。提供了用于治疗哺乳动物受治疗者中纟奉状病毒感染例如狂犬病感染(rabies infection)或水泡性口 炎病毒感染(vesicular stomatitis virus infections)的方法。提供了用于筛选和鉴 定用于治疗棒状病毒感染例如狂犬病感染或水泡性口炎病毒感染的化合物 的方法。提供了转基因非人类动物和研发转基因非人类动物的方法，其中所 述转基因非人类动物在CD14基因中含有功能缺失突变。提供了一种用于治疗怀疑患有感染的哺乳动物受治疗者中棒状病毒感 染的方法，所述方法包括以有效减轻或消除棒状病毒感染或防止其发生或复 发的量，将经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的调节剂施用于所述受 治疗者。 一方面，所述调节剂是经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的 拮抗剂(antagonist)。另一方面，所述调节剂是CD14活性或Toll样受体4信 号传导活性的抑制剂。所述抑制剂包括但不限于CD14或TLR-4的干扰 RNA、短发夹RNA、核酶或反义寡核苷酸。在另一方面，所述抑制剂为CD14 或TLR-4的单克隆抗体、多克隆抗体、肽、拟肽或小化学抑制剂。所述抑 制剂可以为例如CD14的抗体或TLR4的抗体。在一个详细的方面中，所述 棒状病毒是狂犬病病毒或水泡性口炎病毒。4是供了一种用于治疗哺乳动物受治疗者中自身免疫病的方法，所述方法 包括以有效减轻或消除自身免疫病或防止其发生或复发的量，将经由CD14 的Toll样受体信号传导活性的调节剂施用于所述哺乳动物受治疗者。 一方 面,所述调节剂是经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的拮抗剂。在另 一方面，所述调节剂是CD14活性或Toll样受体4信号传导活性的抑制剂。 所述抑制剂包括但不限于CD14或TLR-4的干扰RNA、短发夹RNA、核酶 或反义寡核苦酸。在另一方面，所述抑制剂为CD14或TLR-4的单克隆抗体、 多克隆抗体、肽、拟肽或小化学抑制剂。所述抑制剂可以为例如CD14的抗 体或TLR4的抗体。提供了一种用于治疗哺乳动物受治疗者炎症的方法，所述方法包括以有 效减轻或消除炎症或防止其发生或复发的量，将经由CD14的Toll样受体4 信号传导活性的调节剂施用于所述哺乳动物受治疗者。 一方面，所述调节剂 是经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的拮抗剂。在另一方面，所述调节剂是CD14活性或Toll样受体4信号传导活性的抑制剂。所述抑制剂包括 但不限于CD14或TLR-4的干扰RNA、短发夹RNA、核酶或反义寡核苷酸。 在另一方面，所述抑制剂为CD14或TLR-4的单克隆抗体、多克隆抗体、肽、 拟肽或小化学抑制剂。所述抑制剂可以为例如CD14的抗体或TLR4的抗体。提供了 一种用于鉴定化合物的方法，所述化合物经由Toll样受体4途径 调节细胞中的信号传导，所述方法包括将试验化合物与基于细胞的测定体系 接触，所述测定体系包括表达能将对配体的应答进行信号传导的Toll样受 体4的细胞，以选择的有效激活Toll样受体4信号传导的量向所述测定体系 提供CD14和配体，并检测在所述测定体系中所述试验化合物对Toll样受体 4信号传导的作用，测定中所述试—睑化合物的功效指示调节。所述用于鉴定 经由Toll样受体4途径调节细胞中信号传导的化合物的方法还包括在所述 细胞中共表达CD14和Toll样受体4。在另一方面，所述方法包括向所述测 定体系提供Toll样受体4,并检测在所述测定体系中所述试验化合物对 CD14/To11样受体4信号传导的作用，所述测定中所述试验化合物的功效指 示调节。在所述方法的一个实施方案中，所述配体是内源性配体或外源性配体。 所述外源性配体包括但不限于脂多糖、脂质A、 二酰化脂肽、三酰化脂肽、 S-MALP-2、 R-MALP-2、细菌脂肽、Pam2CSK4、脂磷壁质或酵母聚糖A。 在一个详细的方面，所述外源性配体是来自明尼苏达沙门氏菌(5Wmo"d/a m/"^oto)的粗糙脂多糖、光滑脂多糖或脂质A。所述内源性配体包括但不限 于脂质。在另一个实施方案中，所述检测步骤包括测量对细胞中肿瘤坏死因 子产生的作用，其中在对来自明尼苏达沙门氏菌的粗糙脂多糖的响应中TNF 的产生发生改变，而在对来自明尼苏达沙门氏菌的光滑脂多糖或脂质A的 响应中TNF的产生不发生改变。在另一个实施方案中，所述方法包括通过所述化合物实现配体与CD14 结合的减少的检测步骤。在所述方法的另 一个实施方案中，所述检测步骤包括通过所述化合物实 现CD14与Toll样受体4结合的减少。 一方面，所述化合物是Toll样受体4 途径信号传导的拮抗剂。另一方面，所述检测步骤包括在细胞测定中测量肺瘤坏死因子的减少。在所述方法的另 一个实施方案中，所述检测步骤包括通过所述化合物实现配体与CD14结合的增加。鉴定经由Toll样受体4途径调节细胞中信号传导的化合物的方法还包 括检测步骤，所述检测步骤包括通过所述化合物实现CD14与Toll样受体4 结合的增加。 一方面，所述化合物是Toll样受体4途径信号传导的激动剂。 在所述方法的另 一方面，所述检测步骤还包括在细胞测定中测量肿瘤坏死因 子的增加。细胞测定还包括巨噬细胞。鉴定经由Toll样受体4途径调节细胞中信号传导的化合物的方法还包 括检测步骤，该检测步骤包括测量与配体结合的标记的CD14或与Toll样受 体4结合的标记的CD14。标记包括但不限于放射性标记或荧光标记。在另 一个实施方案中，提供了鉴定经由Toll样受体4途径调节细胞中信 号传导的化合物的方法，其中所述细胞表达能将对配体的应答进行信号传导 的TRAM-Trif，所述方法还以选一奪的有效激活TRAM-Trif信号传导的量向 所述测定体系提供CD14和配体，以及检测在所述测定体系中所述试验化合 物对TRAM-Trif信号传导的作用，测定中所述试验化合物的功效指示调节。一方面，所述方法还包括在细胞中共表达CD14、 Toll样受体4和 TRAM-Trif。所述方法还包括向所述测定体系提供Toll样受体4，和检测在 所述测定体系中所述试验化合物对CD14/ Toll样受体4/TRAM-Trif信号传导 的作用，测定中所述试验化合物的功效指示调节。在所述方法的一方面，所 述检测步骤还包括通过所述化合物实现配体与Toll样受体4结合的减少。 在所述方法的一方面，所述检测步骤还包括通过所述化合物实现Toll样受 体4与TRAM-Trif结合的减少。在所述方法的一方面，所述检测步骤还包 括通过所述化合物实现配体与CD14结合的增加。在所述方法的一方面，所 述检测步骤还包括通过所述化合物实现Toll样受体4与TRAM-Trif结合的 增力口。在所述方法的一方面中，所述化合物是TRAM-Trif途径信号传导的激 动剂。在所述方法的另一方面中，所述化合物是TRAM-Trif途径信号传导 的拮抗剂。在另一方面中，所述配体是内源性配体或外源性配体。所述外源性配体包括但不限于脂多糖。所述内源性配体包括但不限于脂质。在所述方法的另一方面中，所述细胞测定包括巨噬细胞。在所述方法的另一方面中，所述检测步骤包括测量与配体结合的标记的CD14或与TLR4 或TRAM-Trif结合的标记的CD14。所述标记包括但不限于放射性标记或荧 光标记。在所述方法的另一方面中，所述化合物是TRAM-Trif途径信号传导的 激动剂。所述方法还包括;险测步骤，所述4全测步骤包括在细胞测定中测量 IRF-3磷酸化的增加。在另一方面，所述检测步骤包括在细胞测定中测量p-干扰素(interferon-p)的增加。在另一方面，所述检测步骤包括在细胞测定中 测量对病毒感染的易感性的减少。在所述方法的另一方面中，所述化合物是TRAM-Trif途径信号传导的 拮抗剂。所述方法还包括检测步骤，所述检测步骤包括在细胞测定中测量 IRF-3磷酸化的减少。在另一方面，所述检测步骤包括在细胞测定中测量卩-干扰素的减少。在另一方面，所述检测步骤包括在细胞测定中测量对病毒感 染的易感性的增加。提供了一种含有异源核酸的转基因非人类动物，其中所述核酸和动物显 示了相对于野生表型的表型，该表型包括抑制巨噬细胞的激活、对病毒或细 菌感染的易感性、TNF-a产生的减少的特性，或其任何两个或多个的组合。 一方面，动物的表型的特征是对脂多糖诱导的IRF-3的磷酸化和二聚化的减 少、对脂多糖诱导的非应答IFN-卩的产生或巨噬细胞对水泡性口炎病毒或狂 犬病病毒诱导的细胞溶解的高敏感性。在另一方面，CD14基因中功能缺失 等位基因是Q284X处的早期终止密码子(premature stop codon)。在一个详细 的方面中，所述动物是小鼠或大鼠。细胞或细胞系可以来自含有CD14基因 的功能缺失等位基因的转基因非人类动物。提供了 一种筛选Toll样受体4或TRAM-Trif信号传导活性的调节剂的 体外方法，其中所述方法包括将细胞或细胞系与试验化合物接触，其中所述 细胞或细胞系来自转基因非人类动物，并检测TNF-a产生量、对病毒或细 菌感染的易感性或Toll样受体4或TRAM-Trif诱导的巨噬细胞激活活性的 增加或减少，由此将所述试一验化合物鉴定为Toll样受体4或TRAM-Trif诱导的巨噬细胞激活活性的调节剂。提供了 一种筛选Toll样受体4或TRAM-Trif信号传导活性的调节剂的 体内方法，其中所述方法包括将细胞或细胞系与试验化合物接触，所述细胞 或细胞系来自转基因非人类动物，并检测TNF-a产生量、对病毒或细菌感 染的易感性，或Toll样受体4或TRAM-Trif诱导的巨噬细胞激活活性的增 加或减少，由此将所述试验化合物鉴定为Toll样受体4或TRAM-Trif诱导 的巨噬细胞激活活性的调节剂。提供了 一种用于篩选调节自身免疫病的化合物的方法，所述方法包括将 试验化合物与基于细胞的测定体系接触，所述测定体系含有表达能将对配体 的应答进行信号传导的Toll样受体4的细胞，以选择的能有效激活Toll样 受体4信号传导的量向所述测定体系提供CD14和配体，并检测在所述测定 体系中所述试验化合物对Toll样受体4的作用，测定中所述试验化合物的 功效指示对自身免疫病的调节。在另一实施方案中，所述方法包括表达能将 对配体的应答进行信号传导的TRAM-Trif的细胞，以选择的有效激活 TRAM-Trif信号传导的量向所述测定体系提供CD14和配体，并检测在所述 测定体系中所述试验化合物对TRAM-Trif信号传导的作用，测定中所述试 验化合物的功效指示对自身免疫病的调节。在一个详细的方面中，所述自身免疫病是胰岛素依赖型糖尿病、多发性 硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎、风湿性关节炎、实验性自身免疫性关 节炎、重症肌无力、曱状腺炎、葡萄膜视网膜炎的实验形式、桥本曱状腺炎、 原发性粘液水肿、甲状&i毒症、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、艾迪生 病、提前绝经、男性不育、儿童糖尿病、古德帕斯丘综合症、寻常性天疱疮、 类天疱疮、交感性眼炎、水晶体源性葡萄膜炎(phacogenic uveitis)、自身 免疫性溶血性贫血、特发性白血病、原发性胆汁性肝硬化、活动性'隄性肝炎 HBs-ve 、隐原性肝硬化、溃疡性结肠炎、斯约格伦综合症、硬皮病、韦格 纳肉芽肺病、多发性皮肌炎/皮肌炎(poly/dermatomyositis)、盘状红斑狼疮 或系统性红斑狼瘠。提供了一种用于筛选调节感染性疾病的化合物的方法，所述方法包括将 试验化合物与基于细胞的测定体系接触，所述测定体系含有表达能将对配体的应答进行信号传导的Toll样受体的细胞，以选择的有效激活Toll样受体4 信号传导的量向测定体系提供CD14和配体，并检测在所述测定体系中所述 试验化合物对Toll样受体4信号传导的作用，测定中所述试验化合物的功 效指示对感染性疾病的调节。在另一个实施方案中，所述方法包括表达能将 对配体的应答进行信号传导的TRAM-Rrif的细胞，以选择的有效激活 TRAM-Trif信号传导的量向所述测定体系提供CD14和配体，并4企测在所述 测定体系中所述试验化合物对TRAM-Trif信号传导的作用，测定中所述试 验化合物的功效指示对感染性疾病的调节。
所述感染性疾病可以是细菌或病毒疾病。在一个详细的方面中，所述感 染性疾病是HIV感染、AIDS、细胞肥大病毒感染或金黄色葡萄J求菌


图la、 lb、 lc、 ld、 le、 lf、 lg、 lh、 li、 lj、 lk和11表示Heedless 突变的粗糙LPS和TLR2-6的特异性。
图2a、 2b、 2c、 2d、 2e、 2f、 2g、 2h、 2i和2j表示Heedless防止LPS 对IFN-p的i秀导。
图3a、 3b、 3c、 3d、 3e和3f表示Heedless巨噬细胞对VSV诱导的细 胞溶解的高敏感性。
图4表示通过限制性内切核酸酶切割检测的Heedless, Cdl4中的突变。
图5a、 5b和5c表示通过重组mCD14拯救Cdl4纯合突变细胞中光滑 LPS反应性。
图6a和6b表示通过测序构建图镨和鉴定的Heedless突变。
图7表示总结粗糙和光滑LPS、TLR4/MD-2复合物和CD14之间相互作 用的示意图。
图8a和8b表示推测的机制，由此CD14可允许来自TLR4复合物的不 依赖于MyD88的信号传导。详细描述提供了鉴定化合物的组合物和方法，所述化合物经由Toll样受体4途径 调节细胞中的信号传导。CD14蛋白在经由脂多糖(LPS)传感 (lipopolysaccharide sensing)的Toll样受体信号传导和激活中起作用。在本研 究中，CD14基因中的突变已提出了 LPS传感的观点，其是如何发生的以及 CD14-MD-2-TLR4复合物的特异性的限制。提供了 一种鉴定化合物的方法， 所述化合物经由Toll样受体4途径调节细胞中的信号传导，所述方法包括 将试验化合物与基于细胞的测定体系接触，所述测定体系含有表达能将对配 体的应答进行信号传导的Toll样受体4的细胞，以选择的有效激活Toll样 受体4信号传导的量为所述测定体系提供CD14和配体，并检测所述测定体 系中所述试验化合物对Toll样受体4信号传导的作用，测定中所述试验化 合物的功效指示调节。在鉴定所有负责脂多糖传感的蛋白质和了解它们的特异性和相互作用 的努力中，种系突变和筛选的方案，其中用不同的TLR激活剂(包括LPS) 体外刺激来自第三代(G3)突变C57BL/6小鼠的巨噬细胞。监控肿瘤坏死因子 (TNF)的产生，作为表型分析的基本终点。提供了组合物和方法，其中 CD4基因中的突变提出了 LPS传感的观点，其如何产生，和 CD14-MD-2-TLR4复合物的特异性的限制。在第三代(G3)N-乙基N-亚硝基脲突变小鼠中检测隐性突变"Heedless "， 显示对微生物诱导物的缺陷应答。来自Heedless纯合子的巨噬细胞应答粗糙 LPS和脂质A而经由依赖MyD88的途径进行信号传导，但不应答光滑LPS。 而且，应答所有的LPS化学型，Heedless突变防止依赖于TRAM-TRIF的信 号传导。Heedless也破坏了巨噬细胞对水泡性口炎病毒(VSV)的应答，并且 基本上抑制了对Toll样受体2(TLR2)- TLR 6异型二聚体的特异性配体的应 答。Heedless表型从位置上归于Cdl4中的早期终止密码子。Ferrero和Goyert， TW^/e/c16: 4173, 1988; NCBI GenBank P08571。我们的数据表明 TLR4-MD-2复合物区分LPS化学型，但CD14使此区分无效。因此， TLR4-MD-2复合物受体能以两种单独的模式起作用；其中一种能发生完全 的信号传导， 一种发生受限于依赖MyD88的信号传导。应理解，本发明并未限制于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物 体系，当然它们可以变化。也应理解，本文中所用的术语仅出于描述具体实 施方案的目的，并非意在限制。如在本说明书和附加的权利要求中所用的，
除非文中内容清晰指明，否则单数形式包括复数指代物(referent)。因此，例 如，提到细胞(acell)包括两个或更多个细胞的组合，等等。
如本文所用的"约"，当指测量值如数量、时间持续等时，意指包括指定 值的± 20%或± 10%、更优选± 5%、甚至更优选± 1%、甚至还更优选± 0.1% 的变化，只要此类变化适于实施所公开的方法。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属的技术领 域的普通技术人员通常所理解的具有相同的意思。尽管在试验本发明的实践 中，可以使用与本文所描述的那些相似或等同的任何方法或材料，但本文描 述了优选的材料和方法。在描述本发明和主张本发明的权利中，将使用下列 术语。
"自身免疫病"指由免疫系统不能区分外源分子和自身分子以及对自身 抗原免疫耐受性丧失而引起的疾病，其导致自身分子的破坏。自身免疫病包 括但不限于胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、多发性硬化症、实验性自身免疫 性脑脊髓炎(多发性硬化症的动物模型)、风湿性关节炎、实验性自身免疫性 关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、葡萄膜视网膜炎的实验形式、桥本曱状腺 炎、原发性粘液水肿、曱状腺毒症、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、艾 迪生病、提前绝经、男性不育、儿童糖尿病、古德帕斯丘综合症、寻常性天 疱疮、类天疱掩、交感性眼炎、水晶体源性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫 血、特发性白血病、原发性胆汁性肝硬化、活动性慢性肝炎HBs-ve、隐原 性肝硬化、溃疡性结肠炎、斯约格伦综合症、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、多 发性皮肌炎/皮肌炎、盘状红斑狼痴和系统性红斑狼疮。
"自身抗原(autoantigen)"指自体抗原(self-antigen),也就是说，通常发现 于哺乳动物内并通常被自身识别的物质，由于自身免疫病，被哺乳动物错误 地识别为外源物质。即，自身抗原不被哺乳动物的淋巴细胞或抗体认为是其 自身的一部分，并错误地遭到该哺乳动物免疫调节系统的攻击，好像此类自 身抗原是外源物质。因此自身抗原充当负调节免疫系统的分支(arm)的作用，所述分支负责引起具体的自身免疫病。如本文所用的，"自身抗原"也指自 身抗原性物质，当施用于哺乳动物时其诱导具有自身免疫病症状的病症。依 据本发明的自身抗原也包括来自自身抗原的表位或表位的组合，所述自身抗原。 — 、；、 " '、 、依据本发明的有利的自身抗原包括但不限于与T细胞介导的自身免疫 病抑制有关的那些自身抗原。自身抗原指激发免疫应答或诱导免疫耐受性状态的分子，包括但不限于 单链或双链DNA;抗体或其片段，包括相应核酸的遗传信息的合成肽；y 球蛋白或其片段，包括合成肽或相应核酸的遗传信息；移植抗原或其片段， 包括合成肽或相应核酸的遗传信息。依据本发明的自身抗原也包括来自所述 自身抗原的表位或表位的组合。"T细胞介导的自身免疫病"指自身免疫病，其中，疾病的效应由TH1 介导的淋巴细胞炎症细胞因子产生的刺激而诱导。T细胞介导的自身免疫病 包括但不限于实验性自身免疫性脑脊髓炎、多发性硬化症、风湿性关节炎、 重症肌无力、曱状腺炎、实验性葡萄膜视网膜炎和adioi disease of the氨酸脱羧酶、胰岛素、髓磷脂碱性蛋白、II型胶原质、烟碱型乙酰胆碱受体、 曱状腺球蛋白、曱状腺过氧化物酶、视紫红质糖蛋白S-抗原、IRBP视网膜 蛋白以及恢复蛋白(recoverin)。"巨噬细胞激活的抑制"指应答诱导物如脂多糖在巨噬细胞中TLR4-诱导的共剌激分子(CD14)表达的抑制。可通过FACS分析在巨噬细胞上 CD14的表达。"对病毒或细菌感染的易感性"指对感染性病毒如小鼠细胞肥大病毒 (MCMV)或感染性细菌如单核细胞增多性李斯特菌(丄/Wen'a mo"oc^oge"^s) 的易感性。将对MCMV感染的易感性作为由MCMV感染导致的小鼠死亡 时间来测量。将对单核细胞增多性李斯特菌的感染的易感性作为在感染单核 细胞增多性李斯特菌的小鼠的巨噬细胞中TNF和IL-12 p40 mRNA的产生来 测量。将对金黄色葡萄球菌感染的易感性作为由金黄色葡萄球菌感染导致的小鼠死亡时间来测量。
"TNF-a产生的减少"指来自哺乳动物受治疗者的巨噬细胞，其应答脂 多糖(TLR4选择性刺激物)不能产生正常数量的TNF-a。
"免疫细胞应答"指免疫系统细胞对外部或内部刺激物(例如抗原、细 胞因子、化学因子和其他的细胞)的应答，在免疫细胞内产生的生物化学变 化，该变化导致免疫细胞迁移、杀伤耙细胞、吞噬作用、产生抗体、其他可 溶的免疫应答效应物等。
本文可交换使用的"T淋巴细胞应答"和"T淋巴细胞活性"指依赖T 淋巴细胞的免疫应答组成部分(即T淋巴细胞增殖和/或分化成辅助T淋巴细 胞、细胞毒性杀伤T淋巴细胞或抑制T淋巴细胞，由辅助T淋巴细胞向B 淋巴细胞供应信号，引起或防止抗体的产生，由细胞毒性T淋巴细胞杀伤特 异的靶细胞，并且释放调节其他免疫细胞功能的可溶的因子如细胞因子)。
"免疫应答"指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细 胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的协调作用，其 导致选择性损害、破坏或从人体消除侵入的病原菌、感染病原的细胞或组织、 癌细胞，或在自身免疫或病理炎症的情况下，导致损害、破坏或从人体消除 正常的人细胞或组织。
"炎症"或"炎症应答(inflammatory response)"指当组织受到细菌、损 伤、毒素、热或任何其他原因伤害时发生的先天免疫应答。受损的组织释放 化合物，包括组胺、緩激肽和5-羟色胺。炎症指急性应答(即其中炎症过程 是主动的应答)和慢性应答(即特征为緩慢的进行应答并形成新的结締组织 的反应)两者。可通过有关的细胞类型区分急性和慢性炎症。急性炎症通常 涉及多型核嗜中性粒细胞；而慢性炎症的特征通常是淋巴组织细胞和/或肉 芽肿性应答。炎症包括特异性和非特异性防御系统两者的反应。特异性防御 系统反应是指对抗原(可能包括自身抗原)的特异性免疫系统反应的应答。非 特异性防御系统反应是指由无免疫记忆能力的白细胞介导的炎症应答。此类 细胞包括粒细胞、巨嗟细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。炎症特异性类型 的实例是弥漫性炎症、灶性炎症、格鲁布性炎症、间质性炎症、闭塞性炎症、 实质性炎症、反应性炎症、特异性炎症、中毒性炎症和创伤性炎症。"患者，，、"受治疗者，，或"哺乳动物，，可交换使用并指哺乳动物如人 类患者和非人类灵长类动物，以及实验性动物如家兔、大鼠和小鼠以及其他 的动物。动物包括所有的脊推动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如绵羊、 犬、牛、鸡、两栖类动物和爬行类动物。"治疗"或"疗治"包括施用本发明的组合物、化合物或制剂防止或延 迟疾病的症状、并发症或生物化学指征的发作，减轻或緩解症状或阻止或抑 制疾病、病症或疾患(例如感染性疾病、炎症或自身免疫病)的进一步发展。"治疗"还涉及在治疗或緩解或预防疾病、病症或疾患(例如感染性疾病、 炎症或自身免疫病)中任何成功的指征，包括任何客观或主观的参数，如减 轻、緩解、减弱症状或使患者能对疾病的状况具有更好的耐受性、降低恶化 或衰弱的速率或使恶化的终点变得较不衰弱。治疗或緩解症状可基于客观或 主观的参数，包括医师检查的结果。因此，术语"治疗"包括施用本发明的 化合物或制剂防止、延迟、减轻或阻止或抑制与感染性疾病、炎症或自身免疫病有关的症状的发展。术语"治疗作用(therapeutic effect)"指减轻、消除 或防止受治疗者的疾病、疾病的症状或疾病的副作用。使用本发明的方法的 "治疗"或"疗治"包括防止处于感染疾病、炎症或自然免疫病的增加的风 险中^f旦还未经历或表现症状的受治疗者的症状的发作，抑制感染性疾病、炎 症或自身免疫病的症状(减緩或阻止其发展)，提供感染性疾病、炎症或自身 免疫病的症状或副作用的减轻(包括减轻的治疗)，解除感染性疾病、炎症或 自身免疫病的症状(引起衰退)。治疗可以是预防性的(防止或延迟疾病的发 作，或防止显示其临床或亚临床症状)或在显示疾病或病症后症状的治疗抑 制或减轻。提供了一种用于治疗怀疑患有感染的哺乳动物受治疗者的感染性疾病 的方法，所述方法包括以有效减少或消除棒状病毒感染或防止其发生或复发 的量，将经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的调节剂施用于受治疗者。 一方面，经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的抑制剂可用于治疗感染 性病毒疾病，例如棒状病毒感染性疾病。另外，可用抑制剂治疗革兰氏阳性 和革兰氏阴性细菌感染以及真菌感染两者，所述抑制剂抑制经由TLR4(在革 兰氏阴性疾病的情况下)和TLR2(在革兰氏阳性或真菌疾病的情况下)的信号传导。
提供了一种用于治疗哺乳动物受治疗者自身免疫病或炎症的方法，所述 方法包括以有效减少或消除自身免疫病或炎症或防止其发生或复发的量，将
经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的调节剂施用于哺乳动物受治疗 者。 一方面，所述调节剂是经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的拮抗 剂或抑制剂。最近的研究表明在炎症过程中产生的透明质酸片段刺激TLR4。 这表明用拮抗剂或抑制剂阻抑经由CD14的Toll样受体4信号传导活性将削 弱炎症。Jiang， D.,等，Ato 11: 1173-1179， 2005; Taylorr, KR，等，J所o/ C72ew. 279: 17079-84， 2004; Termeer， C.等，/Exp 195: 99-111, 2002。
细胞中Toll样受体的"抑制剂"、"激活剂"和"调节剂"分别用于指 抑制性、激活性或调节性分子，使用Toll样受体结合或信号传导的体外和 体内测定鉴定，所述分子例如配体、激动剂、拮抗剂和它们的同源物和模拟 物(mimetic)。
"调节剂"包括抑制剂和激活剂。抑制剂是如与刺激物结合、部分或完 全阻断刺激，减少、防止、延迟激活，使Toll样受体失活、减敏或下调节 Toll样受体活性的制剂，如拮抗剂。激活剂为例如结合、刺激、增加、开放、 激活、促进Toll样受体，增加其激活，增敏或上调节其活性的制剂，例如 激动剂。调节剂包括这样一种制剂，即其例如改变Toll样受体与下列物质 的相互作用结合激活剂或抑制剂的蛋白，受体，包括蛋白、肽、脂质、碳 水化合物、多糖或上述的组合，如，脂蛋白、糖蛋白等。调节剂包括天然存 在的Toll样受体配体的基因修饰形式，例如具有改变的活性，以及天然存 在的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。抑制剂和激活剂的"基 于细胞的测定，，包括，例如，如本文中所描述的，将假定的调节剂化合物应 用于表达Toll样受体的细胞，接着测定对Toll样受体信号传导的功能作用。 基于细胞的测定包括但不限于来自哺乳动物受治疗者的体内组织或细胞样 品或体外基于细胞的测定，包括将用潜在的激活剂、抑制剂或调节剂处理的 Toll样受体与没有用抑制剂、激活剂或调节剂处理的对照样品比较，以检查 抑制的程度。可将对照样品(未用抑制剂处理)赋予100%的相对Toll样受体 活性值。当Toll样受体活性值相对于对照是约80%，任选地50%或25-0%时，实现Toll样受体的抑制。当Toll样受体活性值相对于对照是高110%, 任选地150%，任选地200-500%或1000-3000%时，实现Toll样受体的激活。
例如，经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的激动剂可驱动信号传 导，其将促进适应性的免疫应答，即，对接种有利。激动剂也可提供宿主对 不同感染的抵抗力的短期增加。具有经由不依赖MyD88或依赖MyD88途径 选择性地进行信号传导的能力能产生特定的作用，例如较低的毒性和不依赖 MyD88的信号传导的I型干扰素的选择性诱导，或依赖MyD88的信号传导 的依赖NF-kB的细胞因子的选择性诱导。
作为另一个实例，经由CD14的Toll样受体4信号传导的拮抗剂可抑制 重症感染(severe infection)的潜在地致命的炎症作用，并可用于自身免疫病。
提供了一种用于鉴定经由Toll样受体4途径的细胞中信号传导的调节 剂的方法，其包括将试验化合物与基于细胞的测定体系接触，所述测定体系 含有表达能将对配体的应答进行信号传导的Toll样受体4的细胞，以选择 的有效激活Toll样受体4信号传导的量为所述测定体系提供CD14和配体， 并检测所述测定体系中所述试验化合物对Toll样受体4信号传导的作用， 测定中所述试验化合物的功效指示调节。
在另一方面，所述方法提供了表达能将对配体的应答进行信号传导的 TRAM-Trif的细胞，以选择的有效激活TRAM-Trif信号传导的量为所述测 定体系提供CD14和配体，并检测所述测定体系中所述试验化合物对 TRAM-Trif信号传导的作用，测定中所述试验化合物的功效指示调节。如上 文对经由CD14的TLR4信号传导所做的描述，TRAM-Trif信号传导是不依 赖MyD88的信号传导。TRAM-Trif信号传导的激动剂选择性地导致干扰素 的产生，并比以LPS的方式(刺激两种途径)激活受体具有较少的毒性。 TRAM-TRIF信号传导的激动剂可用于配制佐剂(adjuvant)和抗病毒作用。 TRAM-TRIF信号传导的拮抗剂可在某些程度上抑制炎症，而部分保留IL-6、 IL-12和TNF的诱导，这可有助于抵抗感染。
可测定分子与Toll样受体结合的能力，例如通过假定的配体与包被在测 定平板上的Toll样受体免疫粘合素的能力。通过比较与非Toll样受体的结 合可测定结合的特异性。"试验化合物"指作为CD14或Toll样受体4的调节剂而被试验的任何 化合物。试验化合物可是任何小有机分子或生物实体，诸如蛋白质，例如抗 体或肽、糖、核苷酸，核酸(例如反义寡核苷酸、iRNA或核酶)，或脂质。 可选地，试验化合物可以是调节剂，该调节剂是CD14蛋白或Toll样受体4 蛋白的基因改变的形式。通常，试验化合物是小有机分子、肽、脂质或脂质 类似物。在一实施方案中，可通过固定配体或受体测定与Toll样受体结合的抗 体。例如，测定可包括将与His标签融合的Toll样受体固定于Ni激活的NTA 树脂珠上。将抗体加入至以既定的温度温育了 一段时间的适当的緩冲剂和珠 中。在洗涤出去未结合的物质后，可用例如SDS、具有高pH的緩冲液等释 放结合的蛋白并进行分析。"信号传导反应"指经由Toll样受体例如Toll样受体4的信号传导。 将应答进行信号传导可涉及例如依赖于由Toll样受体4(TLR4)和MD-2所形 成的跨膜复合物的LPS应答，通过该跨膜复合物，信号得以传播。TLR4以 4种衔接子蛋白的方式进行信号传导，所述蛋白似乎以功能对形式(MyD88 和Mal(也称为TIRAP)与TRIF和TRAM)起作用。可产生在基于细胞的测 定中用于产生信号的化合物，例如通过与酶或荧光团结合。作为标记的感兴 趣的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶；或氧化酶(oxidotase)， 特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、 丹磺酰、伞形酮等。化学发光化合物包括荧光素和2，3-二氢酞。秦二酮，如鲁 米诺。"检测试验化合物对Toll样受体4信号传导的作用"可涉及在哺乳动物 受治疗者中的治疗或预防作用，如减轻、消除或防止该受治疗者中的疾病、 疾病的症状或疾病的副作用。"检测试验化合物对Toll样受体4信号传导 的作用"可涉及在基于细胞的测定如诊断测定中具有作用的化合物，如通过 LPS信号传导或脂质A信号传导所测量的，和通过TNF-a表达所测量的。 CD14基因中功能缺失突变如Heedless突变可影响I型IFN的产生。所述突 变防止了光滑LPS和脂质A两者经由不依赖MyD88的途径进行信号传导。 具体地说，CD14功能缺失突变，Heedless,防止了 I型IFN和IFN-P mRNA的产生，以及诱导可诱导的IFN基因如IFIT1和ISG15。在对脂质A的应答 中，在Heedless突变细胞中未能4全测到IRF-3磷酸二聚体的形成。来自CD14 功能缺失突变(Heedless)的转基因动物的巨噬细胞对于VSV诱导的细胞溶 解是高敏感性的。"伴随施用"已知的药物和本发明的化合物意指在已知的药物和化合物 均具有治疗或诊断作用的时间上施用所述药物和化合物。此类伴随施用可包 括在施用本发明的化合物的同时(即相同时间)、之前或随后施用药物。对于 具体的药物和本发明的化合物，本领域普通技术人员在决定施用的时间、顺 序和剂量时没有困难。通常，短语"良好耐受，，指在健康的状态中缺少不利的变化，该变化作 为治疗结果而出现并影响治疗决定。作为CD14或Toll样受体4调节剂的抗体合，并能调节、激活或抑制对外源性配体例如粗糙LPS或脂质A的先天免 疫应答，或应答细胞中水泡性口炎病毒(VSV)感染或狂犬病病毒感染，并 不应答外源性配体光滑LPS。节细胞中信号传导的化合物。参阅，例如Akashi等，7Tze Jowma/ o/ /画,/， 164: 3471-3475， 2000; Leturcq等，J C7/w /騰W. 98: 1533-1538, 1996。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段选择性地与抗原结合(例如， 竟争性地结合，或与相同表位例如构象或线性表位结合)，杂交瘤细胞系产 生的抗体与该抗原选捧性地结合。因此，对于由抗体结合的已知的表位，表位可以是空间上紧密接近或功能上相关，例如，在线性序列或构象空间中重 叠或邻近的表位。可用肽线性程序(peptide threading program)计算性地鉴定 潜在的表位，并用本领域已知的方法例如通过测定抗体与Toll样受体4或 CD14的突变体或片段例如Toll样受体4或CD14结构域的突变体或片段的 结合来证明。测定本文所述的抗体序列的方法在本领域内是已知的；例如，可通过 使用已知的技术分离和鉴定编码来自杂交瘤细胞系的抗体的cDNA,来测定 抗体的序列。测定cDNA序列的方法在本领域内是已知的。本文所述的抗体通常具有至少一个或两个重链可变区(VH)和至少一个或两个轻链可变区(V。。可将Vh和Vt进一步细分为高变区，称为互补性 决定区(CDR)，其与较高度保守的框架区(FR)散开(interspersed)。这些区域已 《寻以明确；也阐述(参阅，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242， 1991和Chothia等， / Mo/. 196: 901-907, 1987)。 含有 一个或多个框架区的抗体或抗体片段也可以用于本发明。在由脂多糖诱 导的细胞中，此类片段具有特异性地与Toll样受体4结合并激活或抑制 TNF-a活性的能力，或激活或抑制巨噬细胞对水泡性口炎病毒或狂犬病病毒 的应答。如本文所述的抗体可包括重链和/或轻链恒定区(恒定区通常介导抗体和 宿主組织或因子的结合，包括免疫系统的效应细胞和经典补体系统的第一成 分(Clq))，并因此可分别形成免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。例如，抗 体可以是四聚体(两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链，其可通过例 如二疏键连接)。抗体可含有仅仅重链恒定区的一部分(例如，称为CH1、 CH2 和CH3的三种重链结构域中的一种)或轻链恒定区的一部分(例如，称为CL 区的一部分)。抗原结合片段也包括于本发明中。此类片段可以是(i)F化片段(即由 VL、 VH、 Cl和CH1结构域组成的单价片段)；(ii) F(ab，)2片段(即含有通过 二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段)；(iii)由VH和ChI結枸域 组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的Vl和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb 片段(Ward等，Nature 341: 544-546, 1989),其由VH结构域组成；和/或(vi) 分离的互补性决定区(CDR)。可利用本领域已知的方法合成抗体片段(包括上文所述的抗原结合片 段)，例如在自动化的肽合成仪中，或通过在例如大肠杆菌(五.co/z')中表达全 长的基因或基因片段。可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生FU，)2片段，并可通过还原F(ab，)2片段的二硫键产生Fab片段。可选地，可构建Fab表达文库(Huse等，5We"ce 246: 1275-81， 1989)，以使得较快速地鉴定具有所期望的特异性的单克隆Fab片段。产生其他抗体和抗体片段的方法在本领域内是已知的。例如，尽管Fv片段的两个结构域Vt和VH由单独的基因编码，但可用重组的方法或能使它们变成单蛋白链的合成的连接体将它们连接，在该蛋白链中，Vl和Vh区配 对形成单价分子(也称为单链Fv(scFv),参阅例如Bird等，5We"ce 242: 423-426， 1988; Huston等，TVoc. 7Va//. ^cad 5W. C/5L4 85: 5879-5883， 1988; Colcher等，j朋.7Vr爿cad 880: 263-80， 1999以及Reiter， C7/". Omcwi as. 2: 245-52, 1996)。产生单链抗体的技术也描述于美国专利号4， 946,778和4,704,692中。 此类单链抗体包括于术语抗体的"抗原结合片段，，中。可使用本领域普通技 术人员已知的常规技术获得这些抗体，并以与筛选完整抗体相同的方法，筛 选供使用的所述片段。而且，单链抗体可形成复合物或多聚体，并因此成为 具有相同靶蛋白的不同表位的特异性的多价抗体。本文所述的抗体和其部分可是单克隆抗体、从单克隆抗体中产生或通过 本领域已知的方法产生。抗体可重组产生(例如，通过噬菌体展示或通过组 合方法产生，如下列文献所描述的美国专利号5,223,409; WO 92/18619;WO 91/17271; WO92/20791; WO 92/15679; WO93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02890; Fuchs等，5/。/. rec/z"o/ogy 9: 1370-1372, 1991; Hay 等,//w附Afw爿w&6o办场Zjr/fifowos 3: 81-85, 1992; Huse等，5"cz'ewce 246: 1275-1281， 1989; Griffiths等，五雄OJ 12: 725-734, 1993; Hawkins等， / Mo/, 所o/. 226: 889-896, 1992; Clackson等，7Va/w" 352: 624-628, 1991; Gram等， A/a".5W. 89: 3576-3580， 1992; Garrad等，所o/ rec/^/ogv 9: 1373-1377， 1991; Hoogenboom等，7Vwc/. Jc/A A仏19: 4133-4137, 1991;和 Barbas等，iVoc. 7V^/.爿ca^. 5W. f/&4 88: 7987-7982， 1991)。作为一个实施例，可通过用TLR4多肽或CD14多肽或其片段(例如衍生 自例如TLR4或CD14的抗原性肽片段(即具有其一部分的序列))免疫动物、11样受体4抗体或CD14抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段 可与纯化的TLR4或CD14结合。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片 段可与组织切片、完整细胞(活的、裂解的或分级分离的)或膜部分中的TLR4 或CD14结合。可在例如体外体系例如外周血单核细胞(PBMC)中试验抗体 在由脂多糖诱导的细胞中激活或抑制TNF-a活性的能力，或激活或抑制巨 噬细胞对水泡性口炎病毒或狂犬病病毒应答的能力。在使用衍生自TLR4或CD14的抗原性肽的情况下，通常包括TLR4或 CD14结构域的至少8(例如10、 15、 20、 30、 50、 100或更多)个连续的氨基 酸残基。在一些实施方案中，抗原性肽含有所有的TLR4或CD14的结构域。 产生的抗体可以与天然形式的蛋白(因此具有线性或构象表位的抗体也在本 发明范围内)、变性或其他非天然形式或上述两种形式的蛋白质中的一种结 合。可通过本领域已知的方法例如通过基于计算机的抗原性预测算法鉴定可 能是抗原性的肽。有时可通过鉴定与天然形式而非变性形式蛋白的结合的抗 体，鉴定构象表位。可用抗原将宿主动物(例如家兔、小鼠、豚鼠或大鼠)免疫，该抗原可任 选地与载体(即，稳定或另外改进有关分子免疫原性的物质)连接，并任选地 与佐剂一起施用(参阅例如Ausubel等，如上)。示例性的载体是钥孔虫戚血 蓝蛋白(KLH)和示例性的佐剂，其通常根据宿主动物的种类选择，包括弗氏 佐剂(完全的或不完全的)，佐剂矿物凝胶(例如氩氧化铝)，表面活性物质如 溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyol)、聚阴离子(polyanion)、肽、油乳剂、 二硝基酚、BCG(bacille Calmette-Guerin，卡介苗)，和短小棒状杆菌 (Cw7"e6ac^7'wm parvw附)。KLH有时也称为佐剂。在宿主中产生的抗体可 通过例如亲和层析法纯化，在所述方法中，多肽抗原或其片段固定于树脂上。抗原性肽包含的表位通常位于蛋白的表面(例如亲水区)或高抗原性区内 (可最初根据含有的许多带电荷的残基选择此类区)。人类蛋白序列的Emini 表面可能性分析(Emini surface probability analysis)可用于指示具有定位于蛋 白表面的特别高的可能性的区。抗体可以完全是人类抗体(例如基因改造在小鼠或其他哺乳动物中制备 的抗体以产生来自人类免疫球蛋白序列的抗体，如来自人类免疫球蛋白基因(K、入、ci(IgA!和IgA2)、 Y(IgG!、 IgG2、 IgG3、 IgG4)、 5、 e和p恒定 区基因或多种免疫球蛋白可变区基因)。可选地，抗体可以是非人类抗体(例 如啮齿动物(如小鼠或大鼠)、山羊、家兔或非人类的灵长类动物(如賓吳)抗体。在携带人类而非小鼠免疫球蛋白基因的转基因小鼠中可产生人类单克 隆抗体。来自这些小鼠(在用目的抗原免疫后)的脾细胞可用于产生杂交瘤， 其分泌对来自人类蛋白的表位具有特异性亲和性的人mAb (参阅，例如WO 91/00906， WO 91/10741; WO 92/03918; WO 92/03917; Lonberg等，Atowre 368: 856-859, 1994; Green等，7Vam" 7: 13-21, 1994; Morrison等，iV^/.Jcad 5W.固81: 6851-6855, 1994; Bruggeman等，/國画/. 7: 33-40, 1993; Tuaillon等，iVoc. Ato/.5W. 卯3720-3724， 1993;和Bruggeman等， / /画画/. 21: 1323-1326, 1991)。抗TLR4抗体或抗CD14抗体可以是这样一种抗体，即在该抗体中，其可变区或其可变区的一部分(如CDR)在非人类生物体(例如大鼠或小鼠)中产生。因此，本发明包括嵌合的、CDR接枝的和人源化的抗体，以及在非人 类生物体中产生并接着进行^修饰(例如在可变的框架区或恒定区中)以减少在人类中的免疫原性的抗体。可利用本领域已知的重组技术产生嵌合抗体 (即其不同部分来自不同的动物物种的抗体，例如鼠mAb的可变区和人类免 疫球蛋白的恒定区)。例如，可用限制酶消化编码鼠(或其他物种)单克隆抗体 分子的Fc恒定区的基因以除去编码鼠Fc的区域，并且因此可替代编码人类 Fc恒定区的基因的等同部分(参阅例如，欧洲专利申请号125,023; 184, 187; 171,496和173,494;也可参阅WO 86/01533;美国专利号4，816，576; Better 等，5We"ce 240: 1041-1043,1988; Liu等户rac. Ato/.爿c^/. f/5^ 84: 3439-3443, 1987; Liu等，J！ /画画/. 139: 3521-3526, 1987; Sun等，胸/. 」cad 84: 214-218， 1987; Nishimura等，i 饥47: 999-1005，1987; Wood等，A^wre 314: 446-449， 1985; Shaw等， / A^/. 80: 1553-1559, 1988; Morrison等，Ato/.爿cm/. 5W. C75^ 81: 6851， 1984; Neuberger等，312: 604， 1984和Takeda等，A^w" 314: 452， 1984)。在人源化的或CDR接枝的抗体中，用供体CDR (donor CDR)将至少一 种或两种但通常所有的三种接纳体CDR (Recipient CDR)(免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的)替代(参阅例如美国专利号5,225,539; Jones等，iW /wre 321: 552-525, 1986; Verhoeyan等，5We, 239: 1534， 1988;和Beidler等，J /ww柳o/. 141: 4053-4060, 1988)。供体CDR仅需要取代人源化抗体与Toll 样受体4或CD14结合所需的CDR的数量。供体可以是啮齿动物抗体，且 接纳体可是人类框架或人类共有框架。通常，将提供CDR的免疫球蛋白称 为"供体"(并且经常是啮齿动物的免疫球蛋白)，将提供框架的免疫球蛋白 称为"接纳体"。接纳体框架可以是天然存在(例如人类)的框架，共有框 架或序列，或此外至少85% (例如90%， 95%, 99%)相同的序列。"共 有序列"是从相关的序列家族中最频繁存在的氨基酸(或核苷酸)中形成的序 歹'J(参阅例^口 Winnaker， From Genes to Clones, Verlagsgesellschaft， Weinheim， Germany, 1987)。共有序列中的每一位置由该家族中在该位置最频繁存在的 氨基酸残基占据(对于两个氨基酸以相同的频率存在的位置，包括两者中的 任何一个)。"共有框架，，指共有免疫球蛋白序列中的框架区。可制备Toll 样受体4或CD14的人源化抗体，在该抗体中，特异的氨基酸残基已得以替 代、删除或加入(例如在框架区，以改进抗原结合)。例如，人源化的抗体具 有与供体的框架残基或接纳体的氨基酸相同而不是与接纳体框架残基相同 的框架残基。为了产生此类抗体，通过相应的供体氨基酸替代所选的小量的 人源化的免疫球蛋白链的接纳体框架残基。替代可在邻近CDR处或在与 CDR相互作用的区域中发生(美国专利号5, 585,089,特别是参阅12-16栏)。 人源化抗体的其他技术描述于EP 519596 Al中。如上文所述或使用本领域已知的其他方法可将Toll样受体4抗体或 CD14抗体人源化。例如，通过替代Fv可变区的序列可产生人源化的抗体， 该可变区不直接与与来自人类Fv可变区的等同序列结合的抗原有关。产生 人源化抗体的普通方法由Morrison, 5We脏229: 1202-1207， 1985、 Oi等， B涯c/n.m— 4: 214, 1986和Queen等(美国专利号5,585,089; 5,693,761和 5，693,762)提供。这些方法所需的核酸可从产生针对Toll样受体4或CD14 的抗体或其片段的杂交瘤获得，所述抗体或其段具有期望的特性，例如在由脂多糖诱导的细胞中激活或抑制TNF-a活性或激活或抑制巨噬细胞对水泡 性口炎病毒或狂犬病病毒应答的能力。接着可将编码人源化抗体或其片^a的 重组DNA克隆至适当的表达载体中。在某些实施方案中，抗体具有效应子功能并能固定补体，然而在其他的实施方案中，其既不能募集(recruit)效应子细胞也不能固定补体。抗体也可 具有少许结合Fc受体的能力或不具有该能力。例如，其可以是不能与Fc受 体结合的同种型、亚型、片段或其他的突变体(例如，抗体可具有突变(例如 删除)Fc受体结合区)。缺少Fc区域的抗体通常不能固定补体，并且因此较 少可能引起它们结合的细胞的死亡。在其他的实施方案中，可将抗体偶联至异质物质如治疗剂(如抗生素)或 可检测标记。可检测标记可包括酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、卩-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶)、辅基(例如链霉亲和素/生物素和亲和素/生物 素)或荧光、发光、生物发光或放射性物质(例如伞形酮、荧光素、异硫氰酸 荧光素、罗丹明、二氯三吖嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白(其是荧光)， 鲁米诺(其是发光的)，荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白(其是生物发光的)， 和"mTc、 188Re、 mIn、 125I、 131I、 35S或311(其是放射性的))。本文所述的抗体(例如单克隆抗体)可用于分离Toll样受体4或CD14蛋 白或其片段，如与在由脂多糖诱导的细胞中激活或抑制TNF-a活性有关的 或与激活或抑制巨噬细胞对水泡性口炎病毒或狂犬病病毒应答(通过例如亲 和层析或免疫沉淀)有关的片段，或可用于在例如细胞溶解产物或上清液(通 过Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定等)或组织切 片中检测它们(P23)。这些方法允许测定具体蛋白表达的丰度(abundance)和模 式。该信息可用于做出诊断或用于评价临床试验或治疗的效力。本发明也包括编码上述抗体的核酸、载体和细胞(例如哺乳动物细胞， 如CHO细胞或淋巴细胞)，该细胞(例如用编码与Toll样受体4或CD14特 异性结合的抗体的核酸转化的细胞)含有所述核酸。相似地，本发明包括制 备本发明抗体的细胞系(如杂交瘤)和制备那些细胞系的方法。CD14或Toll样受体4多肽和其调节剂的免疫检测除了用核酸杂交技术检测CD14基因或Toll样受体4基因和基因表达 外，也可用免疫测定4全测CD14或Toll样受体4蛋白。此类测定可用于筛选 CD14或Toll样受体4的调节剂，以及用于治疗和i貪断应用。免疫测定可用 于定性或定量分析CD14蛋白或Toll样受体4蛋白。可适用技术的一般的综述可见于Harlow和Lane, J"fz7)oWes: J Z^0rato7 Maw認/， 1988。 A.产生抗体产生与CD14或Toll样受体4蛋白特异性反应的多克隆和单克隆抗体的 方法对本领域才支术人员来it是已知的(参阅例如Coligan, Cw〃eW iVotoco/s /" 7m細wo/ogv， 1991; Harlow和Lane,同上；Goding, Mowoc/owa/爿w"6o&esv iV/""》e^朋d尸ra"/cas，第二版，1986;和Klohler等，M^wre 256: 495-497， 1975)。此类技术包括通过从噬菌体或类似载体的重组抗体文库中选择抗体 来制备抗体，以及通过免疫家兔或小鼠来制备多克隆和单克隆抗体(参阅例 如，Huse等，246: 1275-1281， 1989; Ward等，iVafwre 341: 544-546, 1989)。许多含有CD14蛋白或Toll样受体4蛋白的部分的免疫原可用于产生特 异性地与CD14蛋白或Toll样受体4蛋白反应的抗体。例如，如本文所述， 可分离重组的CD14蛋白或Toll样受体4蛋白或其抗原性片段。如上所述可 在真核或原核细胞中表达重组蛋白，并如上文一般所描述的进行纯化。重组 蛋白是优选的用于产生单克隆或多克隆抗体的免疫原。可选地，可将衍生自 本文公开的序列和与载体蛋白缀合的合成肽用作免疫原。也可以纯或者不纯 的形式使用天然存在的蛋白。接着将产物注射至能产生抗体的动物。可产生 单克隆或多克隆抗体，用于随后的免疫测定中测量蛋白的用途。产生多克隆抗体的方法对本领域技术人员来说是已知的。使用标准的佐 剂如弗氏佐剂和标准的免疫方法，用蛋白质免疫近交品系小鼠(例如BALB/C 小鼠)或家兔。通过采集试-验血液和测定对p亚单位反应性的效价监控动物 对免疫原制剂的免疫应答。当获得抗体对免疫原的适当高的效价时，从动物 中收集血液并制备抗血清。如果需要，可进一步分级分离抗血清以富集与蛋 白反应的抗体(参阅Harlow和Lane ，如上)。可通过本领域技术人员熟悉的各种技术获得单克隆抗体。筒单地说，通 常通过与骨髓瘤细胞融合，使来自用期望的抗原免疫的动物的脾细胞无限增 殖(参阅Kohler等，5^Jiw附w"o/. 6:511-519，1976)。无限增殖化的可选方 法包括用EB病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因、反转录病毒转化或本领 域熟知的其他方法。筛选来自单独无限增殖化的细胞的克隆用于产生期望的抗原特异性和亲和性的抗体，并且可通过各种技术包括注射入脊推动物宿主的腹膜腔来增加通过此类细胞产生的单克隆抗体的产量。可选地，根据Huse 等S"'^zce 246: 1275-1281, 1989概述的一般方法，可通过筛选来自人类B细 胞的DNA文库，分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA。收集单克隆抗体和多克隆血清并在免疫测定例如用固定于固体载体的 免疫原的固相免疫测定中针对免疫原蛋白进行滴定。通常，选择具有104或 更高效价的多克隆抗血清，使用竟争性结合免疫测定，测试它们针对非CD14 或Toll样受体4蛋白的交叉反应性。特异性的多克隆抗血清和单克隆抗体 通常以至少约O.lmM、更通常至少约1 ^M、优选至少约O.lpM或更好并最 优选0.01^iM或更好的Kd结合。也可通过从物种如非人类哺乳动物中减去其 他的交叉反应直向同源物，制备仅对具体的CD14直向同源物或Toll样受体 4直向同源物如人类CD14或人类Toll样受体4具有特异性的抗体。如此， 可获得仅与CD14或Toll样受体4结合的抗体。一旦获得针对CD14蛋白或Toll样受体4蛋白的特异性抗体，便可通过 多种免疫测定法检测蛋白质。另外，抗体可在治疗上用作CD14或Toll样受 体4的调节剂。对于免疫和免疫测定方法的综述，参阅Basic and Clinical Immunology (Stites和Terr编辑，第7版，1991)。而且，可在任何几个构型 中进行本发明的免疫测定，所述构型在酶免疫测定(Enzyme Immunoassay)中 (Maggio编辑，1980)以及Harlow和Lane (同上)中得以广泛综述。B.免疫结合测定使用许多公认的免疫结合测定方法(参阅例如美国专利4，366，241; 4,376,110; 4,517,288和4,837,168)中的任何一种，可检测和/或定量CD14蛋 白或Toll样受体4蛋白。对一般的免疫测定的综述，也可参阅AfeAoA /" Ce〃y4wf/6o(iz'as1 Ce〃 5z'o/ogy，第37巻(Asai编專專,1993); J5os7'c (^"/^///^/1朋0/0^);(8也68和丁6订编辑，第7版，1991)。免疫结合测定(或免 疫测定)通常使用与选择的蛋白或抗原(在此情况下，CD14蛋白或Toll样受 体4蛋白或其抗原亚序列)特异性结合的抗体。.可通过本领域技术人员熟知 的许多方式中的任何一种和如上所述产生抗体(例如抗CD14或抗Toll样受 体4)。免疫测定也经常使用标记剂(labeling agent)与由抗体和抗原产生的复合 物特异性结合和将其标记。标记剂自身可以是含有抗体/抗原复合物的部分 (moiety)中的一种。因此标记剂可以是标记的CD14或标记的Toll样受体4 或标记的抗CD14或抗Toll样受体4抗体。可选地，标记剂可以是第三个部 分，如第二抗体，其与抗体/CD14或抗体/Toll样受体4复合物(第二抗体通 常对第一抗体来源的物种的抗体具有特异性)特异性地结合。能特异性结合 免疫球蛋白恒定区的其他蛋白如蛋白A或蛋白G可用作标记剂。这些蛋白 显示了与来自多种物种的免疫球蛋白恒定区的强的非免疫原性的反应性(参 阅例如Kronval等，J /mmw"o/. 111: 1401-1406, 1973; Akerstrom等，《/ /www"o/. 135: 2589-2542， 1985)。标记剂可用可检测部分如生物素修H:牟，另 一分子如链霉亲和素可特异性地与生物素结合。对于本领域技术人员来说， 多种可检测部分是熟知的。在整个测定中，在每一试剂组合后要求温育和/或洗涤步骤。温育步骤 可从约5秒至几个小时，任选地从约5分钟至约24个小时变化。然而，温 育的时间依赖于测定形式、抗原、溶液体积、浓度等。尽管可在超过温度范 围如10°C-40°C时进行测定，但通常在环境温度下进行测定。非竟争性测定形式检测样品中CD14或Toll样受体4的免疫测定可以 是竟争性的或非竟争性的。非竟争性免疫测定是直接测量抗原的量的测定。 在一优选的"夹层(sandwich)"测定中，例如，可将抗CD14或Toll样受体 4抗体直接结合于固定它们的固体基质(substrate)。这些固定的抗体随后捕获 存在于试验样品中的CD14或Toll样受体4。然后，因此而固定的CD14蛋 白或Toll样受体4蛋白由标记剂结合，如带有标记的第二 CD14抗体或Toll 样受体4抗体。可选地，第二抗体可缺少标记，但通过标记的第三抗体依次 结合它，该第三抗体对第二抗体来源的物种的抗体具有特异性。通常用可检 测部分(moiey)如生物素修饰第二或第三抗体，另一个分子如链霉亲和素与该 可^r测部分特异性结合以提供可^r测的部分。竟争性测定形式在竟争性测定中，通过测量已知的加入的(外源 的)CD14蛋白或Toll样受体4蛋白的量间接测定存在于样品中CD14蛋白或 Toll样受体4蛋白的量，样品中未知的CD14蛋白或Toll样受体4蛋白从抗CD14抗体或抗Toll样受体4抗体中置换(竟争掉(competed away))该已知的 加入的(夕卜源的)CD4蛋白或Toll样受体4蛋白。在一竟争性测定中，将已知 量的CD14蛋白或Toll样受体4蛋白加入至样品中，随后将样品与特异性地 结合于CD14蛋白或Toll样受体4蛋白的抗体接触。结合于抗体的外源CD14 蛋白或Toll样受体4蛋白的量与存在于样品中的CD14蛋白或Toll样受体4 蛋白的浓度成反比。在一特别优选的实施方案中，将抗体固定于固体基质上。 可通过测量存在于CD14蛋白/抗体复合物或Toll样受体4蛋白/抗体复合物 中的CD14或Toll样受体4的量，或可选地通过测量剩余的未复合的蛋白的 量，来测定结合于抗体的CD14蛋白或Toll样受体4蛋白的量。可通过提供 标记的CD14分子或Toll样受体4分子，检测CD14蛋白或Toll样受体4 蛋白的量。半抗原抑制测定是另一种优选的竟争性测定。在这种测定中，将已知的 CD14蛋白或Toll样受体4蛋白固定于固体基质上。将已知量的抗CD14抗 体或抗Toll样受体4抗体加至样品中，随后将样品与固定的CD14或Toll 样受体4接触。结合于已知的固定的CD14或Toll样受体4的抗CD14抗体 或抗Toll样受体4抗体的量与存在于样品中的CD14蛋白或Toll样受体4 蛋白的量成反比。可通过检测抗体的固定部分(fraction)或抗体保留于溶液的 部分(fraction),再次检测固定的抗体的量。检测可以是直接的，其中将抗体 标记，或是间接的，通过随后加入标记的部分(moiety)的方式，如上文所述， 该标记的部分与抗体特异性地结合。交叉反应性测定竟争性结合形式的免疫测定也可用于交叉反应性测 定。例如，可将CD14蛋白或Toll样受体4蛋白固定至固体载体。将为抗血 清与固定抗原的结合而竟争的蛋白(如CD14或Toll样受体4和同源物)加入 至测定中。将加入的蛋白的为抗血清与固定的蛋白结合而竟争的能力与 CD14蛋白或Toll样受体4蛋白与其自身竟争的能力进行比较。用标准的计 算，计算上述蛋白的交叉反应性百分比。选择并汇集与每一个上文列出的加 入的蛋白具有少于10%交叉反应性的那些抗血清。通过免疫吸附，用加入的 经思考过的蛋白例如关系较远的同系物，将交叉反应抗体从汇集的抗血清中 任选地除去。然后，免疫吸附的和汇集的抗血清可用于如上所述的竟争性结合免疫测定中以将第二蛋白与免疫原蛋白比较，该第二蛋白被认为可能是CD14蛋白 或Toll样受体4蛋白的等位基因或多形型突变体。为了进行这种比较，以 宽泛的浓度范围各自测定两种蛋白，并且测定抑制50%的抗血清与固定的蛋 白的结合需要的每一种蛋白的量。如果抑制50%结合所需的第二蛋白的量少 于抑制50%结合所需的CD14蛋白或Toll样受体4蛋白的量的10倍，那么 认为第二蛋白与针对CD14或Toll样受体4免疫原产生的多克隆抗体特异性 地结合。其他的测定形式Western印迹(免疫印迹)分析用于测定和定量样品中 CD14蛋白或Toll样受体4蛋白的存在。这种技术通常包括通过基于分子量 的凝胶电泳分离样品蛋白，将分离的蛋白转移至适宜的固体载体(如硝化纤 维滤纸、尼龙滤纸或衍生的尼龙滤纸(derivatized nylon filter)),用与CD14蛋 白或Toll样受体4蛋白特异性地结合的抗体温育样品。抗CD14抗体或抗 Toll样受体4抗体在固体载体上与CD14或Toll样受体4特异性地结合。用 与抗CD14抗体或抗Toll样受体4抗体特异性地结合的标记的抗体(如标记 的绵羊抗小鼠抗体)，可将抗体直4妄标记或可选地随后标记。其他的测定形式包括脂质体免疫测定(liposome immunoassay, LIA),其佳_ 用被设计为结合特异性分子(如抗体)的脂质体，并释放包裹的试剂或标记。 随后，根据标准的技术(参阅Monroe等，Jww. Wev. 5: 34-41, 1986)检测释放的化学物。减少非特异性结合本领域技术人员应知道将免疫测定中的非特异性结 合降至最低是经常期望的。特别地，在测定包括固定于固体基质上的抗原或 抗体的情况下，期望将与基质非特异性结合的量降至最低。减少此类非特异 性结合的方法对本领域技术人员来说是熟知的。通常，这种技术包括用蛋白 质性质的组合物包被基质。具体而言，广泛使用蛋白组合物如牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)、脱脂奶粉和明胶，奶粉是最优选的。标记在测定中所用的具体的标记或可检测基团并非本发明关键的方 面，只要其不显著地干扰测定中所用的抗体的特异性结合。可检测基团可以 是具有可检测的物理或化学特性的任何物质。此类可检测标记在免疫测定领域已得以很好的开发，并且通常，可将可用于这些方法的大多数任何标记应 用于本发明。因此，标记是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、 光或化学方式4全测的任何组合物。在本发明中有用的标记包括磁珠(如DYNABEADS )、荧光染料(如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、 放射性标记(如311、 125I、 35S、 "C或"P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶和通常用于ELISA中的其他酶)、化学发光标记和显色标记(colorimetric label),如胶体金或有色玻璃或塑料珠(plastic bead)(如聚苯乙烯、聚丙烯、 胶乳等)。根据本领域熟知的方法，可将标记直接或间接偶联至测定的期望的成 分。如上文所指出的，以依赖于所需的敏感性、与化合物缀合的便利性、所 需的稳定性、可利用的仪器和处理规定选择标记，可使用广泛类型的标记。非方丈射性标记经常以非直接的方式连接。通常，将配体分子(如生物素) 共价结合于分子。随后配体与另一个分子(链霉亲和素)结合，该分子或先天 性地可检测或共价结合于信号体系如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化 合物。可以以与抗体或第二抗体的任何适宜的组合使用配体和它们的耙标， 所述抗体识别CD14蛋白或Toll样受体4蛋白，所述第二抗体识别抗CD14 抗体或抗Toll样受体4抗体。也可将分子直接与产生信号的化合物缀合，如通过与酶或荧光团缀合。 作为标记的感兴趣的酶主要是水解酶，具体而言，磷酸酶、酯酶和糖苦酶， 或氧化酶，具体而言，过氧化物酶。荧光化合物包括焚光素和其衍生物、罗 丹明和其衍生物、丹磺酰、伞形酮等。化学发光化合物包括荧光素和2,3-二氢酞嗪二酮，如鲁米诺。对于可用的各种标记或产生信号的体系的评论， 参阅美国专利号4,391,904。检测标记的方式对本领域技术人员而言是熟知的。因此，例如，对于标 记是放射性标记的情况，检测的方式包括在放射自显影中的闪烁计数器和照 相胶片。对于标记是荧光标记的情况，其可通过激发具有适当波长的光的荧 光染料并检测所得的荧光来检测。通过使用电子检波器如电荷耦合器件 (charge coupled device, CCD)或光电倍增管等来可视地检测荧光。类似地， 可通过提供适当的酶底物并检测所得的反应产物来检测酶标记。最后，可通过观察与标记有关的颜色来检测简单的显色标记。因此，在各种浸渍片(dipstick)测定中，交联金(conjugated gold)经常显示粉红色，而各种交联珠 (conjugated bead)显示珠的颜色。一些测定形式不要求使用标记的成分。例如，可使用凝集测定 (agglutination assay)检测耙标抗体的存在。在此情况下，含有把标抗体的样 品凝集抗原包被的颗粒。在这种形式中，不需要标记任何成分，并且通过简 单的可视>全查，；险测耙标抗体的存在。CD14或Toll样受体4调节剂的高通量测定作为CD14或Toll样受体4调节剂试验的化合物可以是任何小有机分子 或生物实体，诸如蛋白质(例如抗体或肽)，糖，核酸(例如反义寡核苦酸、 iRNA或核酶)，或脂质。可选地，调节剂可以是CD14蛋白或Toll样受体 4蛋白的基因改变的形式。通常，试验化合物是小有机分子、肽、脂质和脂 质类似物。基本上任何化学化合物都可用作本发明测定中的潜在调节剂或配体，但 经常使用溶解于水或有机溶液(特别是基于DMSO)中的大多数化合物。将测大的化学物文库，其通常是平行运行的(例如在自动测定(robotic assay)中， 在微量滴定板上以微滴形式)。应理解有许多化学化合物的供应商，包括 Sigma (St. Louis, MO)、 Aldrich (St. Louis, MO)、 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 、 Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Switzerlangd)等。在一个优选的实施方案中，高通量筛选方法包括提供含有大量潜在治疗 化合物(潜在的调节剂或配体化合物)的组合的小有机分子或肽文库。然后， 使用本文所述的一种或多种测定来筛选这些"组合的化学物文库"或"配体 文库"，以鉴定那些表现所需特征性活性的文库成员(特定的化学物种类或 亚类)。由此所鉴定的化合物可用作传统的"珠化合物"，或者它们可用作 潜在或实际的治疗剂。组合的化学物文库是利用组合许多化学"模块组分(building block)"如 试剂，通过化学合成或生物合成产生的不同的化学化合物的集合(collection)。 例如，对于既定的化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数目)，通过以每一种可能的方式组合一套化学模块组分(氨基酸)，形成线性组合化学物文库如 多肽文库。通过此类混合化学模块组分的组合，可以合成数以百万的化学化 合物。对本领域技术人员而言制备和筛选组合化学物文库是熟知的。此类组合化学物文库包括^_不限于肽文库(参阅例如美国专利号5,010,175, Furka, / 37: 487-493, 1991和Houghton等，A^wre 354: 84-88， 1991)。 也可以使用产生化学多样性文库的其他化学剂。此类化学剂包括但不限于肽 (例如PCT公布号WO 91/19735)，编码的肽(例如PCT公布号WO 93/20242)、 随机生物寡聚物(例如PCT公布号WO 92/00091)、苯二氮卓类 (benzodiazepine)(例如美国专利号5,288,514), diversomer如乙内酰脲、苯二 氮卓类和二肽(Hobbs等，Ato. Jcad 5W. 90: 6909-6913， 1993)、插烯 多肽(Hagihara等，《/114: 6568， 1992)、具有葡萄糖骨架的非 肽的拟肽类(Hirschmann等，J! Jmw. C/zew. 5bc. 114: 9217-9218， 1992)、小化 合物文库的类似的有机合成体(Chen等，J. Jmw. CTze附.5bc. 116: 2661, 1994)、寡氨基曱酸酯类(Cho等，5Wewce 261: 1303, 1993)，和/或肽基膦酸酯 (Campbell等，J. Org. Chem. 59: 658, 1994)、核酸文库(参阅Ausubel, Berger 和Sambrook，都如上)，肽核酸文库(参阅例如，美国专利5,539,083)、抗体文 库(参阅例如Vaughn等，7Vm^e所0tec/2w /0gy 14: 309-314， 1996和 PCT/US/96/10287)、碳水化合物文库(参阅例如Liang等，5We"ce 274: 1520-1522,1996和美国专利,593,853)、小有机分子文库(参阅例如苯二氮卓 类，BaumC和EN，Jan18,第33页，1993;类异戊二烯，美国专利5,569,588; p塞唑烷酮(thiazolidinone )和间p塞。秦酮(metathiazanone)，美国专利5,549,947; 吡咯烷，美国专利5,525,735和5,519,134;吗啉代化合物(morpholino compound),美国专利5,506,337;苯二氮卓类，5,288,514等)。制备组合文库的装置可以商购获得(参阅例如357 MPS, 3卯MPS， Advanced Chem Tech, Louisville KY， Symphony, Rainin， Wobum, MA, 433A Appllied Biosystems， Foster City, CA， 9050 Plus, Millipore， Bedford, MA)。另 外，许多组合文库自身可商购获得(参阅例如ComGenex， Princeton, N丄, Asinex， Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar， Ltd, Moscow, RU,3D Pharmaceuticals, Exton， PA， Martek, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD，等)。候选化合物(candidate compound)可用作鉴定用于治疗病症的药物的策 略的一部分，所述病症与经由包括Toll样受体4/CD14相互作用或Toll样受 体4/CD14/TRAM/Trif相互作用的途径的TNF-a诱导有关。认为与TLR4、 CD14或TRAM/Trif结合的试验化合物是候选化合物。鉴定与TLR4、 CD14或TRAM/Trif结合或调节TLR4、 CD14或 TRAM/Trif蛋白或多肽或其生物学活性部分的活性的候选或试验化合物的 筛选测定也包括于本发明。用本领域已知的组合文库方法的许多方法中的任 何一种都能获得试验化合物，组合文库法包括但不限于生物文库、空间寻址 平行固相或液相文库、需要去褶合的合成文库法、"一珠一化合物"文库法 和使用亲和层析选择的合成文库法。对于例如肽文库，可以使用生物文库法， 然而其他四种方法适用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145， 1997)。合成分子文库的方法的实例可见于本领 域内，例如在下列文献内:DeWitt等，尸rac.扁.JcW. 90: 6卯9,1993; Erb等，TVoc. A^/.爿c^/. 5W. t/.S.vl 91: 11422， 1994; Zuckermann等， / MW. C72e肌37: 2678， 1994; Cho等，5We"ce 261: 1303, 1993; Carrell等， C/2， /"A ￡<i33: 2059， 1994; Carell等，C/z艮肌五"g/. 33: 2061, 1994和Gallop等，MW. 37: 1233, 1994。在一些实施方案中，试-验化合物是TLR4、 CD14或TRAM/Trif的显性负相突变体(dominant negative variant》化合物文库可以存在于溶液中(例如Houghten，万/o/Tec/zm々"as 13: 412-421, 1992)或珠(Lam, Atow^ 354: 82-84， 1991)、芯片(Fodor, A^wre 364: 555-556, 1993)、细菌(美国专利号5,223,409)、孢子(美国专利号5,571,698， 5,403,484和5，223，409)、质粒(Cull等，尸rac TVa".L/5L4 89: 1865-1869, 1992)上或噬菌体上(Scott等，6Wewce 249: 386-390, 1990; Devlin, 5We打ce 249: 404-406， 1990; Cwirla等，iV^/.爿c"d 87: 6378-6382， 1990和Felici,J. Mo/.舰222: 301-310,1991)。通过例如在存在试验化合物的情况下监控形成Toll样受体4/CD14复合物或Toll样受体4/CD14/TRAM/Trif复合物的能力，可测定试验化合物调节 TLR4、 CD14或TRAM/Trif或其生物学活性部分的活性的能力。通过监控 Toll样受体4蛋白与CD14结合的能力，也可测定试验化合物调节Toll样受 体4或其生物学活性部分的能力。此类测定可以有TRAM/Trif的存在。结 合测定可以是基于细胞的或无细胞的。通过本文描述或本领域已知的用于测定直接结合的方法中的一种，可测 定Toll样受体4蛋白与CD14和/或TRAM/Trif结合或相互作用的能力。在 一实施方案中，通过监控TNF-a的诱导，可测定Toll样受体4蛋白与CD14 和/或TRAM/Trif结合或相互作用的能力。检测TNF-a包括检测重组TNF-a 的表达，该重组TNF-a也编码可检测的标记如FLAG序列或荧光素酶。这 种测定是除了直接结合测定以外的测定。通常，此类测定用于测定试验化合 物影响Toll样受体4蛋白与CD14和/或TRAM/Trif结合的能力。通常，将试验化合物与CD14结合、干扰通过Toll样受体4但不干扰通 过TRAM/Trif的信号传导或另外影响TNF-a表达的诱导的能力与对照比较， 在该对照中，在缺乏试验化合物的情况下，测定TNF-a表达的结合或诱导。 在一些情况下，使用预先确定的参考值。相对于对照，可测定此类参考值， 在这种情况下，不同于对照的样品将显示化合物与目的分子(如Toll样受体 4)结合或调节表达(如在脂多糖诱导的细胞中激活或抑制TNF-a的活性，或 激活或抑制巨噬细胞对水泡性口炎病毒狂犬病病毒的应答)。参考值也可反 映用某标准(如抗体对Toll样受体4的亲和性，或通过脂多糖调节TNF-a表 达)观察的结合的量或TNF-a表达的诱导。在此情况下，与对照相似(例如相 同或小于)的试验化合物将显示化合物是候选化合物(例如与Toll样受体4结 合至与对照抗体相同或比其更大的程度)。本发明还涉及通过上述筛选测定鉴定的新的制剂和其如本文所述的治 疗用途。在一实施方案中，本发明提供了使用CD14或Toll样受体4蛋白或天然 存在或重组的表达CD14或Toll样受体4蛋白的细胞或组织的可溶性测定。 在另一实施方案中，本发明提供了以高通量形式的基于固相的体外测定，其 中CD14或Toll样受体4蛋白或其配体经由共价或非共价相互作用附着于固相基质。任一本文所述的测定可适于高通量筛选。在本发明的可溶或固体状态的高通量筛选测定中，在一天内筛选最多几千个不同的调节剂或配体是可能的。这种方法可用于体外的CD14或Toll 样受体4蛋白或含有CD14或Toll样受体4蛋白的基于细胞或基于膜的测定。 特别是，微量滴定板的每个孔可用于进行单独的针对选择的潜在的调节剂的 测定，或者，如果要观察浓度或温育时间的作用，每5-10个孔可试验单个 的调节剂。因此，单个标准的微量滴定板可测定约100种(如96种)调节 剂。如果4吏用1536孔板，那么单个板可容易地测定约100至约1500种不同 的化合物。 一天测定许多个板是可能的，使用本发明的集成体系(integrated systems),测定筛选最多约6,000、 20,000、 50,000或多于100,000种不同的 化合物是可能的。对于固体状态的反应，目的蛋白或其片段例如胞外结构域，或含有目的 蛋白或其作为融合蛋白的 一部分的片段的细胞或膜，可直接或间接地经由共 价键或非共价键例如经由标签结合于固体状态成分。标签可以是多种成分中 的任何成分。通常，将结合标签的分子(标签结合剂(tag binder))固定于固体 载体，并且通过标签和结合剂的相互作用，将加了标签的目的分子附着于固 体载体。可基于文献中充分描述的已知的分子相互作用使用许多标签和标签结 合剂。例如，对于标签具有天然结合剂如生物素、蛋白A或蛋白G的情况， 其可与适当的标签结合剂(亲和素、链霉亲和素、中性亲和素(neutravidin)、 免疫球蛋白的Fc区等)结合使用。具有天然结合剂如生物素的分子的抗体也 可广泛获得并且是适当的标签结合剂(参阅SIGMA Immunochemicals 1998, catalogue SIGMA, St Louis MO)。类似地，可以与适当的抗体组合使用任何半抗原性或抗原性化合物以形 成标签/标签结合剂对。数以千计的特定抗体可以商购获得并且许多其他的 抗体在文献中有描述。例如，在一个普通的配置(configuration)中，标签是 第 一抗体而标签结合剂是识别该第一抗体的第二抗体。除抗体-抗原相互作 用外，受体-配体相互作用作为标签和标签结合剂也是适当的。例如，细胞 膜受体(如细胞受体-配体相互作用如Toll样受体、运铁蛋白、c-盒、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族、整合蛋白家族、选择蛋白家族等；参阅例如Pigott和 Power, The Adhesion Molecule Facts Book I , 1993。类似地，毒素和毒液、病 毒表位、激素(如鸦片剂、类固醇等))、胞内受体(如其调节各种小配体包括 类固醇、曱状腺激素、类视黄醇和维生素D;肽)的激动剂和拮抗剂，药物， 凝集素，糖，核酸(线性和环式多聚体构型两者)，寡糖，蛋白质，磷脂和抗 体都可与各种细胞受体相互作用。合成的多聚体如聚氨基曱酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙 烯亚胺、聚苯A《醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚乙酸酯也可形成适当的标签或 标签结合剂。在本文描述的测定体系中，许多其他的标签/标签结合剂对也 是可用的，如同对通过对本发明公开内容的回顾，对技术人员是显而易见的 一样。普通的连接体如肽、聚酯等也可充当标签，并包括多肽序列如约5-200 个氨基酸之间的多Gly序列。此类柔顺的连接体对本领域技术人员而言是已 知的。例如，聚乙二醇连接体可/人Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama获得。这些连接体任选地具有酰胺键、硫氩键或异功能键。使用目前可用的多种方法的任何方法，将标签结合剂固定于固体基质。 固体基质通常通过将所有的或部分基质暴露于化学试剂下衍生或功能化，该 化学试剂将化学基团固定于可与标签结合剂的一部分反应的表面。例如，适 于附着于较长的链部分的基团包括胺基、羟基、巯基和羧基。氨烷基硅烷和 羟烷基硅烷可用于使多种表面如玻璃表面功能化。构建这些固相生物聚合物 的测定详细描述于文献中。参阅例如Merrifield， /爿m. C/zem. 5bc 85: 2149-2154， 1963 (描述了例如肽的固相合成)；Geysen等， / /wmw". Me仇102: 259-274， 1987 (描述了固相成分在针(pin)上的合成)；Frank和Doring, 7^ra/zWra" 44: 6031-6040， 1988 (描述了各种肽序列在纤维素圓盘上的合 成)；Fodor等，5Wewce 251: 767-777， 1991; Sheldon等，C7z'"/ca/ C7^w/W^ 39: 718-719, 1993和Kozal等,7Va/WMM^fe/we2: 753-759， 1996 (都描述了固定于 固体基质的生物聚合物的测定)。将标签结合剂固定于基质的非化学方法包 括其他的普通方法，如热、通过UV辐射交联等。作为CD14和Toll样受体4调节剂的双特异性化合物一方面，提供了一种鉴定候选或双特异性化合物的方法，所述化合物减 少了非人类动物血清和/或循环中因子的浓度。用本发明的方法选择或优化 的化合物可用于治疗受治疗者如人类受治疗者，其将从施用此类化合物中受 益。可在本发明方法的实施方案中试验的候选化合物是双特异性化合物。如 本文中所用的，"双特异性化合物，，包括具有两种不同结合特异性的化合物。 示例性的双特异性化合物包括例如双特异性抗体、杂聚物和基于抗原的杂聚 物。可在本发明的实施方案中试验的双特异性分子优选包括对CD14，优选 人类CD14具特异性的结合部分，其交联于对靶标制剂(例如截然不同的抗 体或抗原)具特异性的第二结合部分。对Toll样受体4具特异性的结合部分 的实例包括但不限于Toll样受体4配体，例如CD14,或在优选的实施方案 中，Toll样受体4的抗体。在另 一个实施方案中，基于新的Toll样受体4结合分子与Toll样受体4 结合的能力，可鉴定它们。例如在无细胞的结合测定中，可试验化合物或小 分子文库。任何数量的试验化合物如拟肽类、小分子或其他的药物可用于试 验，并且，可使用本领域已知的组合物文库法的许多方法中的任何一种获得， 包括生物文库、空间寻址平行固相或液相文库、需要去褶合的合成文库法、 一珠一化合物文库法和使用亲和层析选择合成的文库法。生物文库法限于肽 文库，而其他的四种方法适用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam, 爿油'ca"cerZ)n^Das. 12: 145, 1997)。在许多试验调节剂和天然提取物文库的药物筛选方案中，为了使在一既 定时期内测量的调节剂的数量最大化，高通量筛选是值得做的。在无细胞体 系中进行的测定，例如用纯化的或半纯化的蛋白得到的，经常优选作为"初 级"筛选，在该初级筛选中，产生它们以允许快速的研发和相对容易地检测 由试验的调节剂介导的分子靶标中的改变。而且，试验调节剂的细胞毒性和 /或生物利用率的作用通常在体外体系中被忽略，非主要集中于药物对分子 靶标的作用的测定，在与上游或下游元件的结合亲和性的改变中是显而易见的。在另一个实施方案中，本领域已知的噬菌体展示技术可用于鉴定新的TLR4、 CD14或TRAM/Trif结合分子。在一实施方案中，本发明提供了用于筛选与TLR4、 CD14或TRAM/Trif 或其生物学活性部分结合的候选化合物或试验化合物的测定。鉴定与TLR4、 CD14或TRAM/Trif结合的分子的基于细胞的测定可用 于鉴定用于本发明的双特异性化合物中的其他制剂。例如，表达TLR4、 CD14 或TRAM/Trif的细胞可用于筛选测定。例如，可鉴定在与TLR4、 CD14或 TRAM/Trif的结合中产生具有统计上显著变化的化合物。在一实施方案中，测定是无细胞测定，在该测定中基于Toll样受体4 结合分子与TLR4、 CD14或TRAM/Trif体外结合的能力鉴定Toll样受体4 结合分子。可提供TLR4、 CD14或TRAM/Trif结合分子，并用本领域公认 的测定直接结合的方法试验蛋白与TLR4、 CD14或TRAM/Trif结合的能力。 可使用例如实时生物分子相互作用分析(BIA)的技术实现所述蛋白与靶标分 子结合能力的测定。Sjolander等，^加/. Oze附.63: 2338-2345， 1991和Szabo 等,Cwr. 0/ /". &rw".说o/. 5: 699-705， 1995。如在本文中所用的，"BIA，，是 在未标记任何相互作用物(如BIAcore)的情况下实时研究双特异性相互作用 的技术。表面等离振子共振(surface plasmon resonace， SPR)的光学现象中的变 化可用作生物分子间的实时相互作用的指示。本发明的无细胞测定服从于蛋白的可溶和/或膜结合形式两者的用途。 在使用蛋白的膜结合形式的无细胞测定的情况下，可期望使用增溶剂以便将 蛋白的膜结合形式维持于溶液中。此类增溶剂的实例包括非离子去垢剂如 n-辛基葡萄糖苷、n-十二烷基葡萄糖苷、n-十二烷基麦芽苷、辛酰基-N-曱基 葡萄糖胺、癸酰基-N-曱基葡萄糖胺、Triton X-100、 Triton X-114、 Tesit 、 异十三烷基聚(乙二醇醚)n、 3-[(3-胆酰胺丙基)二曱铵基]-l-丙烷磺酸酯 (CHAPS)、 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-2-羟基-l-丙烷磺酸酯(CHAPSO)或 N-十二烷基-N,N-二甲基-3 -铵基-1 -丙烷 磺酸酯。这些测定可用于鉴定调节(如抑制或增加)本发明的蛋白与靶标分子的相互 作用的化合物。测定所述蛋白与靶标分子结合或相互作用的能力可以通过例如直接结 合实现。在直接结合测定中，所述蛋白可与放射性同位素或酶标记偶联，以 便可通过检测复合物中标记的蛋白来测定所述蛋白与靶标分子的结合。例如可用125I、 35s、 "c或&直接或间接标记所述蛋白，并且通过直接计算放射发射或通过闪烁计数(scintillationcounting)检测放射性同位素。可选地，可用 例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶来酶促标记分子，并通过测定 适当的底物向产物的转化来检测酶标记。通常，期望固定本发明的蛋白或其结合蛋白，以利于从一种或两种蛋白 的未复合形式中分离复合物，以及适应测定的自动操作。在存在或缺乏候选 制剂的情况下与上游或下游结合元件的结合可在适于含有反应物的任何容 器中实现。其实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一实施方案中， 可提供增加结构域的融合蛋白，该结构域使该蛋白结合于基质(mtrix)。例如， 可将谷胱甘肽-S-转移酶/CD14 (GST/CD14)融合蛋白吸附于谷胱甘肽琼脂珠 (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，随后将其 与细胞溶解产物(例如"S标记的细胞溶解产物)和试验调节剂结合，并在 利于复合物形成的条件下温育混合物，例如盐和pH的生理学条件，但可使 用稍纟效较严谨的条件。温育后，洗涤珠以除去任何未结合的标记，并直接固 定基质并测定放射性标记(如置于闪烁体中的珠)或在随后将复合物解离后， 在上清液中固定基质并测定放射性标记。可选地，将复合物从基质中解离， 通过SDS-PAGE分离，并且使用标准的电泳技术，从凝月交中定量发现于珠 部分中CD14结合蛋白的量。在基质上固定蛋白的其他技术也可以用于在受治疗者测定中的用途。例 如， <吏用本领域熟知的l支术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals, Prockford, 111)，可从生物素-NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)中制备生物素化的分 子，并在包被链霉亲和素的96孔板(Pierce Chemical)的孔中固定。在未标记任何相互作用物的情况下，测定化合物调节TLR4、 CD14和 TRAM/Trif间相互作用的能力也在本发明的范围内。例如，在未标记所述蛋白或靶标分子的情况下，可用微生理计(microphysiometer)检测本发明的蛋白 与其耙标分子的相互作用。McConnell等，5We"ce 257: 1906-1912。如本文中 所用的，"微生理计"(如细胞传感器(cytosensor))是使用光寻址电位传感器 (LAPS)测量细胞酸化其环境的速率的分析装置。酸化作用速率中的变化可用 作化合物和受体间相互作用的指标。可在本发明中试验的基于抗原的杂聚物优选包括对TLR4、 CD14或 TRAM/Trif，优选人类的TLR4、 CD14或TRAM/Trif具特异性的结合部分， 该结合部分交联于自身抗体识别的抗原。自身抗体识别的抗原的实例包括但 不限于下列中的任何一种因子VllI (与通过替代重组因子Vlfl治疗血友病有关 的抗体)、肌肉乙酰胆碱受体(抗体与重症肌无力疾病有关)、心磷脂(与狼疮 疾病有关)、血小板相关蛋白(与特发性血小板减少性紫癜疾病有关)、与斯约 格伦综合症有关的多种抗原、与组织移植自身免疫反应有关的抗原、发现于 心肌上的抗原(与自身免疫性心肌炎疾病有关)、与免疫复合物介导的肾疾病 有关的抗原、dsDNA和ssDNA抗原(与狼痴性肾炎有关)、桥粒芯蛋白和桥关的任何^"他抗原。 <'、'、3、、，、在本发明试验的示例性的杂聚物和基于抗原的杂聚物以及制备它们的 方法在本领域内是已知的。例如，示例性的杂聚物论述于下列文献中WO 03007971 Al;美国20020103343A1;美国专利号5,879,679;美国专利号 5,487,890;美国专利号5，470，570; WO 9522977A1; WO/02075275A3; WO/024608A2或A3; WO/01808831A1; WO/0145669A1; WO9205801A1; Lindorfer等，7mm朋o/. Md/zo(is 248: 125， 2001; Hahn等，/附臓wo/. 166: 1057， 2001; Nardin等，J /画,M"/zo<is 211: 21， 1998; Kuhn等，/画画/. 160: 5088, 1998; Taylor等，C朋cer 7w附wwo/. /w腦wc^/zer 45: 152， 1997; Taylor 等，/mwwm /. 159: 4035， 1997;和Taylor等，Jm附朋o/148: 2462， 1992。另 外，可以制备这些杂聚物的变体形式。例如，在一实施方案中，可使用以不 同的连接化学剂制备的双特异性分子的形式。可用于交联双特异性分子成分 的示例性试剂包括聚乙二醇、SATA、 SMCC以及本领域已知的其他化合物， 并且可/人例如Pierce Biotechnology获得。可试验的双特异性分子的示例性幵'夕式描述于2002年9月16日提交的美国专利序列号60/411,731中，其内容通 过引用并入本申请。在另 一个实施方案中，可制备双特异性分子的不同的多聚体形式(例如 二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或更高多聚体形式)。在另一个实施方案 中，可试验双特异性分子的纯化形式，例如如同2002年5月13日提交的美 国专利序列号60,380,211中所描述的，其内容通过引用并入本申请。在另一个实施方案中，当杂聚物的一个结合部分是抗体时，可以使用不 同表型的抗体(例如IgA、 IgD、 IgE、 IgGl、 IgG2(例如IgG2a)、 IgG3、 IgG4 或IgM)。在另一个实施方案中，抗体分子的部分(例如Fab片段)可用作一个 结合部分。在一优选的实施方案中，至少一个结合部分是含有Fc结构域的 抗体。在一实施方案中，抗体是小鼠抗体。在另一个实施方案中，可试验修饰对抗体的作用，例如可试验抗体的去 免疫化的作用，例如如同2003年3月28日提交的美国专利序列号60/458， 869中所描述的。在本发明提供的方法中，可将一种因子例如致病因子在非人类动物的血 清、循环和/或组织中的浓度减少例如至少约20%、约30%、约40%、约50%、 约60%、约70%、约80%、约90%或约100%。在另一个实施方案中，可间接测量因子在受治疗者血清、循环和/或组 织中的浓度。例如，可测量由存在于血清和/或循环中的因子导致的病理， 例如通过检查来自动物的组织样品。另一个对因子在非人类动物的血清、循 环和/或组织中的浓度的间接测量是测量因子在非人类动物中引起感染的能 力。例如，可测量双特异性化合物对临床征候和感染症状的作用。也可试验 双特异性化合物抑制感染传播的能力，例如从一个器官系统到另 一个器官系 统的传播，或从一个体到另一个体的传播。在另一个实施方案中，可测量双特异性化合物与非人类动物中能产生 TLR4、 CD14或TRAM/Trif的细胞的结合能力。例如，在一个实施方案中， 使用 一种技术如实时生物分子相互作用分析(BIA) (Sjolander等，C7^附. 63: 2338-2345, 1991和Szabo等，CWr. C^z". 历o/. 5: 699-705， 1995),可实现双特异性分子与TLR4、 CD14或TRAM/Trif靶标分子结合的能力的测定。如本文中所用的，"BIA，，是在未标记任何相互作用物(例如BIAcore) 的情况下实时研究双特异性分子相互作用的技术。可将在表面等离子共振 (SPR)的光学现象中的变化用作生物分子间实时反应的指示。在另一个实施方案中，测量非人类动物细胞对因子的破坏(例如由巨噬 细胞杀死)。可选择减少因子在非人类动物的血清和/或循环中的浓度(与未接受双特 异性化合物的非人类动物中观察的浓度比较)的化合物。可从许多试验的化合物中选择用于受治疗者测定中试验的化合物。在另 一个实施方案中，在本发明测定中试验的双特异性化合物已被鉴定为能结合 TLR4、 CD14或TRAM/Trif，例如在体外测定中，并且用本发明的测定能可 对其评价或优化。在这种情况下，将一种双特异性化合物减少血清和/或循 环中因子浓度的能力与另 一种双特异性化合物或相同化合物的非优化形式 比较，以测定其减少血清和/或循环中因子浓度的能力。在优选的实施方案中，以约l吗化合物/kg体重至约100吗化合物/kg 体重的浓度范围，施用本发明的双特异性化合物。如本文中所规定的，双特 异性化合物治疗上有效的量(即有效剂量)的范围在约0.01至5000吗/kg 体重，优选约O.l至500吗/kg体重，更优选约2至80iig/kg体重，甚至更 优选约5至70吗/kg、 10至60吗/kg、 20至50 (ig /kg、 24至41吗/kg、 25 至40吗/kg、 26至39吗/kg、 27至38(ig/kg、 28至37jxg/kg、 29至36 [ig /kg、 30至35吗/kg、 31至34吗/kg或32至33吗/kg体重。技术人员能理 解某些因素可影响有效治疗受治疗者所需的剂量，这些因素包括但不限于疾 病或病症的严重性、以前的治疗、受治疗者综合的健康和/或年龄和存在的 其他疾病。而且，用治疗上有效量的蛋白、多肽或抗体治疗受治疗者可包括 单一治疗，或优选可包括一系列治疗。在一优选的实施例中，静脉(iv)注射制剂后，用约1至500吗/kg体 重的范围的双特异性化合物治疗动物。也可以理解，用于治疗的双特异性化 合物的有效剂量相对具体治疗的疗程可增加或减少。由于如本文所述的诊断 测定的结果，剂量变化可产生或变得显而易见。施用试验化合物和/或因子的途径可以是静脉(iv )注射至动物的循环中。其他的施用途径包括但不限于局部的、胃肠外的、皮下的或通过吸入。术语 "胃肠外的"包括注射例如通过皮下、静脉内或肌肉内途径，也包括局部施用，例如在疾病或损伤的部位。从植入物(implant)持续释放化合物在本领域 内也是已知的。相关领域的技术人员可意识到根据待治疗的病症的特性，患 者的体重、年龄，和一般的状况以及施用途径，适宜的剂量是变化的。可根 据动物试验，确定基本的剂量，根据本领域可接受的实践进行用于人类施用 的剂量比例缩》史。可在一剂量范围将候选化合物和因子施用于动物。当将因子也施用于动 物时，候选化合物可在施用因子之前、同时或之后施用。可用本发明的表达TLR4、 CD14或TRAM/Trif的转基因动物如小鼠筛 选或评^f介可用于治疗人类病症或疾病的候选化合物，该病症或疾病与受治疗 者血清和/或循环中不想要的(unwanted)因子的存在有关，如自身抗体、感染 因子或毒素。包括血源性因子(blood-borne agent),其包括但不限于任何下列血源性因子 病毒、病毒颗粒、毒素、细菌、聚核苷酸、抗体，如与自身免疫病有关的抗 体。在一实施方案中，示例性的靶向病毒因子包括但不限于下列任一因子 细月包月巴大病毒、流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、水泡性口 炎病毒、狂犬病病毒、单纯疱渗病毒(herpes simple virus)、肝炎病毒、腺病 毒2、牛病毒性腹玛病毒(bovine viral diarrhea virus)、人类免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)、登革热病毒(dengue virus)、 马尔堡病 毒(Marburg virus) 、 EB病毒(Epstein-Barr virus)。示例性的细菌因子包括铜绿假单胞菌(尸"w^ wowos aen^'"om)、荧光 <艮单月包菌(i^e"(sto附o"as ^worascew力、食酸寸艮单月包菌CPsewtfomoMas flc/tfovonms)、 产碱假单胞菌(i^油,"os a/c"/^酒)、恶臭假单胞 / W油)、嗜麦芽窄食单胞菌(5te"o化6ip/2omcwas ,/啤/n7/a)、洋 葱伯克霍尔德菌(Bw狄oWen'a cepac&)、嗜水气单胞菌 /7j^/ro/ /n7/a)、 大肠斥干菌co/z')、 弗氏 一宁檬酸斥干菌(Cz>oZ)acter 、鼠伤寒沙门氏菌(5^/wowe〃a妙/z/聽W,)、 伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门菌(<Sa/mowe//a para0^/"')、肠炎沙门氏菌 (&z/附o"g〃a g"tenY/fifo)、 痢疾志贺菌(57z/ge〃<3、 弗氏志贺菌 ykx"en')、索氏志贺菌(57z/ge〃a sow"ez〕、阴沟肠杆菌(五"&rak cfer c/oacae)、产气肠杆菌(五"feraZ)acfer fi^ogewes)、克雷白氏肺炎菌(X7eZw'e〃a / "ew附o"/ae)、 产酸克雷伯菌(A7e厶57W/a OAytoca)、 粘质沙雷氏菌0Sem2打'a 、 土拉热弗朗西丝氏菌(Frawc&e/A3 fw/arera&)、 摩根氏菌 (7kforga"e〃a加orga"//)、 奇异变形菌(/Vofews附z'A3Zn7^)、普通变形菌(/Votews vw/gan力、产碱普罗登斯菌(/VovzV5fe""'a a/c^/acz'ms)、雷氏普罗威登斯菌 (7VoW^fe"c/a 、斯氏普罗威登斯菌(/Vov/6fe"c/a WwaW/)、 乙酸4丐不动杆茵(^cZ"eto6acfer ca/coac幼'c—、 溶血不动軒菌(^4"V^o6acter //aemo/少mw"、小肠结肠炎耶尔森菌(Jera/m'fl ewteraco/Z"c")、鼠疫耶尔森菌 (y^s/m'a / eW》、^叚结核耶尔森菌(Feraz'"/a j^yewc/ofw6e/rw/cw:s)、中间耶尔森 菌(7em'"/a z'她rmWa)、 百曰咳杆菌(万oniefe〃a/ eW顧/力、副百曰咳博代氏 杆菌; ara/ emAW&)、 支气管败血性博 氏菌(Bordetella bronchiseptica)、流感嗜血杆菌(ifaewop/n7ws /"y7we"zae)、 副流感嗜血杆菌 (^/"ae附c^/z//1^ /7"ra/"y M^2zae)、 溶血|1耆血4干菌(//(3^附0/ / 7")51 /zae附ofy"cw^)、 畐'J 溶血嗜血;^干菌(H^附op/n7ws / ara/^e附。/少ricws) 、 ；^土克雷嗜血才干菌(T/ae/wop/n./w* dwcre 、 多杀巴斯德菌(尸ostewre〃fl附w/to"Wa)、溶血巴#Jt德菌(尸osfewre〃a /wemo/yrica)、 卡他布兰汉菌(万raw/zame〃(3 cata^r/zafc)、 幽门螺》走杆菌 ;77/0W)、胎儿弯曲菌(Cawp_y/o6acter /e似力、空肠弯曲杆菌 (G3w/7_y/o6acfer 、 大肠弯杆菌(G3W/ 少/o6"cter co//)、 伯氏疏螺》走菌(So7re/Z(3 Zwrg(io^n')、 霍舌L 瓜菌(F/6n》c/zo/erae)、 富'J溶血 瓜菌(T/Z Wo / flra/wewo/j^'cws)、 嗜肺军团菌(Zeg/owe〃" /7wewmop/n7/a)、 单才亥细月包增生利 斯特菌(Zi他n'a附o"ocjtoge"es)、淋病奈瑟菌(A^'5^n'a go"o/r/zoeae)、脑膜炎 奈瑟菌(7Ve/^er/a附em'"g/"ci&)、阴道力口德纳菌(G27Y/wgre〃a vag/""fc)、脆弱类 杆菌(jBflC/cfes加g船)、吉氏拟杆菌(5aC/cfes ^sto謹外拟杆菌属3425 同源类群、普通拟杆菌(5acferazVfes vw/gam力、椭圆拟杆菌(5a"era/cfes ova/ws)、 多形拟杆菌(^7cfera/^fes Aeto/otoo附/craw)、单形拟杆菌(5acfera/cfes wm/or附/s)、 埃氏拟4干菌(Bflcfera^fes eggerf/z")、 内脏扣乂 #干菌(Sac&ro/tfes ■sp/a"c/2"/c2^)、艰难才炎状芽胞杆菌(C/osW^wm di折c/fe)、结核分枝杆菌(聊co6acten.ww ft/6ercw/os&)、 鸟分斗支杆菌(聊co6acten.ww av/wm)、 细胞内分 才支軒菌(Afyco6acfer/w附/wfrv2ce〃w/are)、麻风分支才干菌(Afyco6"cteWw附/epnae)、 白喉斥干菌(Co^y"e6(2cfen.wm (^》/^/^n.ae)、 溃疡才奉杆菌(Co y"e6acten.wm w/cenms)、肺炎链球菌(5V邵tococcus / we,om'—、无乳链球菌(5^; tococci^ aga/a"/ae)、 产脓链球菌(5W/ tococcws / 少roge"as)、 粪肠球菌(五她rococcws y^eca/z's)、屎肠球菌(五她racoccus金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 表皮葡萄球菌(5te/ /2少/ococcws epz'cferm/cfe)、 腐生葡萄球菌 (5Va/^/ococcw ra/ ra/ 一/c —、 中间葡萄球菌(S鄉/^/ococcw51 、 猪葡萄球菌猪亚种OSto/ /^/ococcws /^/cws swfe/ . /^/cws)、溶血葡萄球菌 (/SV"/ /z卢co"wj /z"柳o/Wc—、人葡萄球菌(iS鄉/^/ococcws /zomz'"/力、解糖葡 萄球菌(S鄉/i!少/ococcws sacc/zara/Wc w力。在一实施方案中，靶向因子抵抗传统的治疗，例如抵抗抗生素。在另一实施方案中，可由本发明基于抗原的杂聚物结合的示例性耙向因子，包括但不限于任一下列因子与通过替代重组因子vn治疗血友病有关的自身抗体；与自身免疫病重症肌无力、狼疮、狼疮性肾炎、特发性血小板减少性紫癜、斯约格伦综合症、心肌炎、天疱疮和类天疱疮有关的自身抗体； 与组织移植自身免疫反应有关的抗体；与免疫复合物介导的肾疾病有关的自在其他的实施方案中，可由本发明的双特异性化合物结合的示例性生物 因子包括与生物战有关的感染因子和毒素，包括但不限于下述任何一种炭 疽病毒、天花病毒、鼠疫病毒、依波拉(Ebola)病毒以及马尔堡病毒。在一实施方案中，在进行本发明的测定中，在施用双特异性化合物之前、 同时或之后，将因子施用于转基因动物。可^f务饰本发明的双特异性化合物或其任何部分以增加其半寿期(half life)。在制药工业中，肽类似物通常作为与其模板肽具有类似特性的非肽药 物使用。术语称这些类型的非肽药物为肽模拟物或拟肽类(Fauchere， Adv. Drug Res. 15: 29, 1986; Veber等，TINS第392页，1985和Evans等，MW. Ozem30: 1229,1987，其通过引用并入本申请)，并且通常借助于计算机化的 分子模拟研发它们。可用结构上与治疗有用的肽相似的肽才莫拟物产生等同的治疗或预防作用。通常拟肽类与示例多肽(即具有生物或药理活性的多肽) 如抗原多肽在结构上相似，但具有通过本领域已知的和进一步描述于下述文献中的方法由选自下组的键任选地替代的一种或多种肽4定-CH2NH-、 -CH2S-、 -CHrCH2-、 -CI^CH画(顺式和反式)、-COCH2-、 CH(OH)CH2誦和 CH2SO-，所述文献为Spatola, A.F. in Chemistry and Biochemistry of Amino A cids, Peptides, and Proteins Weinstein, B.编辑,Marcel Dekker， New York,第 267页，1983; Spatola, A. F.， Vega Data,第1巻，第3期，"Peptide Backone Modifications," 1983; Morley, 7>e"&. i^arw. 5W.第463-468页，1980; Hudson 等，/"f. J14: 177-185， 1979 (-CH2NH-， -CH2-CH2-); Spatola等, 丄z/e 5W. 38: 1243-1249, 1986 (-CH2-S-); Harm,C/2e附.5bc.尸erh'w. Trara. 1: 307-314, 1982 (-CH國CH-，顺式和反式)；Almquist等， / MW. C/2级23: 1392-1398, 1980 (-COCH2-); Jennings-White等，T^ra/^Ao"23: 2533, 1982 (-COCH2-); Szelke等,欧洲专利申请号EP45665 CA: 97: 39405, 1982 (-CH(OH)CH2-); Holladay等，T^ra/z^ra".丄欲.24: 4401-4404, 1983 (-C(OH)CH2曙);和Hruby, h/e 5W. 31: 189-199, 1982 (-CH2-S-)，前述每一文献 通过引用并入本申请。具体优选的非肽键是-CH2NH-。此类肽模拟物可显著 优于多肽实施方案，包括，例如更经济的生产、更好的化学稳定性、增加 了药理特性(如半寿期、吸收、效力、功效等)、改变了特异性(例如生物活性 的宽光镨、减少了抗原性和其他的优势。标记拟肽类通常涉及将一种或多种 标记直接或通过间隔基(spacer)(如氨基)共价连接于拟肽类的非干扰位置，该 非干扰位置通过定量构效(quantitative structure-activity)数据和/或分子才莫拟 预测。这些非干扰位置通常是与大分子不形成直接接触的位置，拟肽类与该 大分子结合产生治疗作用。拟肽类的衍生(例如标记)基本上不应干扰拟肽类 的期望的生物或药理活性。以相同类型的D-氨基酸系统地替代氨基酸序列的一个或多个氨基酸(例 如D-赖氨酸替代L-赖氨酸)，可用于产生更稳定的肽。另夕卜，通过本领域已 知的方法(Rizo等，i ev.所oc/ze附.61: 387， 1992，其在此引入作为参考)， 可产生约束肽，例如，通过加入能形成使肽环化的分子内二碌^建的内半胱氨可在原核或真核宿主细胞中产生此类^"饰的多肽。可选地，可通过化学 方法合成此类肽。在重组宿主中表达异质多肽、化学合成多肽和体外翻译的方法为本领域公知的，并描述于下列文献中Maniatis等,Afo/ecw/ar C7om'"g: 爿丄a6orato j M3wwa/，第二版，Cold Spring Harbor, N,Y.， 1989; Berger等， Methods in Enzymology，第152巻，Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego， Calif.; Merrifidd, /爿淤.C7zem. 5bc. 91: 501, 1969; Chaiken, C及C O". 所oc/z謡.11: 255， 1981; Kaiser等，5We腳 243: 187， 1989; Merrifield, 5We聰232: 342， 1986; Kent, j薩.及ev.历oc/z亂 57: 957， 1988;和Offord， S纖'，歸c iVote一 Wiley Publishing, 1980,前述 文献通过引用并入本申i奮。通常通过直接的化学合成产生多肽并将其用作杂聚物的结合部分。肽可 作为修饰的肽产生，其非肽部分通过共价^t连接于N-末端和/或C末端。在 某些优选的实施方案中，将羧基末端或氨基末端或两者进行化学修饰。末端 氨基和羧基最常见的修饰分别是乙酰化和酰胺化。可将氨基末端的修饰如酰 化(如乙酰化)或烷基化(如甲基化)、羧基末端的修饰如酰胺化以及其他的末 端修饰包括环化并入至试验化合物的各种实施方案中。某些氨基末端和/或 羧基末端的修饰和/或向核心序列的肽延伸可提供有利的生理、化学、生物 化学和药理特性，如增加的稳定性、增加的效力和/或功效、对血清蛋白 酶的抵抗性、合乎需要的药物动力学特性，和其他的特性。构建转基因动物一方面，本发明提供了一种基因组含有编码CD14的多核苦酸的动物， 该多核苷酸可操作地连接于启动子，使得在动物的巨噬细胞中功能性地表达 非人类或人类的TLR4、 CD14或TRAM/Trif基因，或在巨噬细胞中非人类 或人类的CD14是功能缺失突变。本发明还提供了一种制备转基因非人类动 物的方法，所述转基因非人类动物在其巨噬细胞中表达非人类或人类CD14。在本发明的方法中所用的转基因动物可以是例如哺乳动物、鸟类、爬行 类动物或两栖类动物。可用于本文中所述用途的适宜的哺乳动物包括啮齿类 动物、反刍动物、有蹄类动物、驯养的哺乳动物和产乳动物。优选的动物包 括啮齿动物、山羊、绵羊、骆驼、母牛、猪、马、公牛、美洲驼、鸡、鵝和火鸡。在一优选的实施方案中，非人类动物是小鼠。制备转基因动物的各种方法在本领域内是已知的(参阅例如Watson等， "The Introduction of Foreign Genes Into Mice," in Recombinant DNA, 第二版, W.H. Freeman和Co., New York,第255-272页，1992; Gordon, 及ev. Qyto/. 115: 171-229, 1989; Jaenisch, 5We"ce 240: 1468-1474, 1989; Rossant, TVewraw 2: 323-334， 1990)。产生转基因猪的示例性方案可见于White和Yannoutsos， Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology,第88-94 页；美国专利号5，523，226;美国专利号5，573，933; PCT申请WO 93/25071 和PCT申请WO 95/04744。产生转基因大鼠的示例性方案可见于Bader等， C7/m'ca/ awd ￡jc/ en'mewto/尸/2ar,c0/0gv 尸一/o/ogy, 潜W 3: S81-S87, 1996。产生转基因母牛的示例性方案可见于Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, Carl A. Pinkert编辑，Academic Press, Inc。产生转基因绵羊 的示例性方案可见于Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994， Carl A. Pinkert编辑，Academic Press, Inc。在下文更详细地论述几个示例性的方 法。A.注射入前核可通过向卵细胞中引入依据本发明的核酸构建体来产生转基因动物。将 所得的卵细胞移植至供正常胎儿发育的雌性子宫，随后将发育和携带转基因 的动物回交，以产生转基因的杂合子。用各种发育阶段的胚胎靶细胞引入本 发明的转基因。根据胚胎靶细胞的发育阶段，使用不同的方法。引入转基因 的示例性的方法包括但不限于受精卵或接合子的微注射(Brinster等，iVoc. Ato/. Jcad 82: 4438-4442， 1985)和病毒整合(Jaenisch， TVoc. iVa".JcW. 腦73: 1260-1264， 1976; Jahner等，iVoc. Ato/.颠d 腦82: 6927-6931, 1985; Van der Putten等，7V^/. Jcad 5W. 82: 6148-6152, 1985)。胚胎操作和微注射的方法描述于，例如Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1986， 其内容通过引用并入本申请)。可使用类似方法产生其他的转基因动物。在一示例性的实施方案中，产生转基因小鼠使用下列步骤。将来自确定 的近交遗传背景的雄性小鼠和雌性小鼠交配。事前用妊娠马血清(PMS)处理交配的雌性小鼠以诱导卵泡的生长，并以人绒毛膜促性腺激素(hCG)处理以 诱导排卵。交配后，处死雌性小鼠并将受精卵从其输卵管中移除。这时，前 核仍然没有融合并且可通过使用光学显微镜方法观察它们。在一可选的方案 中，可在不同的发育阶段收获胚胎，例如可以收获胚泡。在改良的Dulbecco 磷酸盐緩冲盐水(DPBS)中恢复胚胎，并将其维持在补加了 10%胎牛血清的 改良的Dulbecco必需培养基(DMEM)中。随后将外源DNA或重组构建体(如TLR4、 CD14或TRAM/Trif表达构 建体)微注射入前核中(100-1000个分子/卵)。使用连接于显微镜的标准微操 作器可进行表达构建体的微注射。例如，当进行微注射时，通常将胚胎保存 于油下的100微升的DPBS滴中。将DNA溶液注射入雄性前核中。通过前 核的膨胀监控成功的注射。其后不久，发生前核(雌性前核和雄性前核)的融 合，并且在某些情况下，外源DNA插入至(经常)受精卵或接合子的一染色 体中。用类似的技术，可将如下所述的制备的重组ES细胞注射入胚泡中。B.胚胎干细胞在另 一个制备转基因小鼠的方法中，可将本发明的重组DNA分子引入 小鼠的胚胎干(ES)细胞中。随后用与上文分段中所述的那些类似的技术，将 所产生的重组ES细胞微注射入小鼠胚泡中。ES细胞可从植入前胚胎中获得，并在体外培养(Evans等，Atowre 292: 154-156， 1981; Bradley等，iVm^e 309: 255-258, 1984; Gossler等，尸rac. A^f/. 爿cad 5W. 83: 9065-9069, 1986; Robertson等，Atowre 322: 445-448,1986)。能整合至正发育的胚胎种系中并变成胚胎种系的一部分以便产生靶 向构建体的种系传播的任何ES细胞都可适用于本文的用途。例如，可用于 产生ES细胞的小鼠品系是129J品系。优选的ES细胞系是鼠细胞系D3(美 国典型培养物收藏目录号CRL 1934)。用本领域已知的和描述于下列文献中 的方法，可培养ES细胞并为DNA插7vf故准备Robertson, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson编辑.IRL Press, Washington, D,C.， 1987; Bradley等，Cwrrewf 7bpz.cs Z)eve/. 5fo/. 20: 357-371, 1986和Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold-Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986,前述文献的内容通过引用并入本申请。可通过本领域已知的方法，将表达构建体引入ES细胞中，例如，描述 于Sambrook等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press编辑1989(其内容通过引用并入本申请)中的那些方 法。适宜的方法包括但不限于电穿孔、微注射和磷酸钙处理方法。引入到 ES细胞中的表达构建体(如TLR4、 CD14或TRAM/Trif)优选是线性的。通 过用适宜的限制性核酸内切酶消化DNA可实现线性化，该酶是选择的仅在 载体序列内切割而不在基因(如TLR4、 CD14或TRAM/Trif基因)内切割。引入表达构建体后，筛选存在构建体的ES细胞。可用多种方法篩选细 胞。对于构建体中使用标记基因的情况，可试验存在标记基因的动物细胞。 例如，对于标记基因是抗生素抗性基因的情况，在其他的致死浓度的抗生素 存在下培养细胞(如选择neo的G418)。存活的那些细胞可能整合了转基因构 建体。如果标记基因是其编码活性可以检测的酶(如p-半乳糖香酶)的基因， 可在适宜的条件下将酶底物加入至细胞，并可分析酶活性。可选地或另外， 可直接检查ES细胞基因组DNA。使用标准的方法可从ES细胞中提取DNA， 并且可用探针或经设计以与转基因特异性杂交的探针在Southern印迹上探 测该DNA。通过PCR用经特异性设计以扩增特定大小的DNA片段和此类 转基因序列的探针，也扩增基因组DNA,只有含有靶向构建体的那些细胞 产生适当大小的DNA片段。将隐含本发明的重组核酸分子(如TLR4、 CD14或TRAM/Trif)的接合 子植入假孕的雌性小鼠中，该小鼠通过以前与切除输精管的雄性小鼠交配而 获得。在一般的方法中，将受体雌性小鼠麻醉，在腰侧部做切割以暴露输卵 管，并将胚胎转至输卵管的壶腹区。将体壁(body wall)缝合并且用创伤夹 (woundclip)将该皮肤关闭。在整个怀孕期，胚胎发育，并且代孕母鼠分娩潜 在转基因小鼠。最后，试验存在有外源或重组DNA的新生小鼠。所有注射 的卵中，平均10%正确发育并产生小鼠，所有出生的小鼠中，平均4分之一 (25%)是转基因的，总效率为25%。 一旦这些小鼠被繁殖，它们以正常方 式(孟德尔法则)传递连接至小鼠染色体的外源基因。D. 筛选转基因构建体的存在在出生后可通过标准的方法鉴定转基因动物。筛选存在转基因构建体的 来自尾组织的DNA，例如用Southern印迹和/或PCR。随后，如杲i人为显示 是嵌合体的后代携带转基因，将其彼此杂交，以产生纯合的动物。如果不清 楚后代是否具有种系传递，可将它们与双亲品系或其他的品系杂交，并且筛 选后代的杂合性。通过DNA的southern印迹和/或PCR扩增鉴定杂合子。 随后可将杂合子彼此杂交以产生纯合的转基因后代。可通过来自这种杂交产 物的小鼠以及已知为杂合子的小鼠和野生型小鼠的等量基因组DNA的 Southern印迹来鉴定纯合子。可基于人类或非人类的TLR4、 CD14或 TRAM/Trif基因或标记基因或两者来设计筛选Southern印迹的探针。其他鉴定和表征转基因后代的手段在本领域内是已知的。例如，通过用 针对由引入的基因编码的蛋白(如人类或非人类TLR4、 CD14或TRAM/Trif 蛋白)的抗体或针对标记基因(其中这种基因得以表达)产物的抗体探测 westen印迹，可用western印迹评估引入这些后代的各种组织中的基因的表 达水平。可使用适宜的抗体进行原位分析以寻找转基因产物的存在或缺失，例如 固定细胞并用抗体标记，和/或FACS (fluorescence activated cell sorting,荧 光激活细胞分选术)分析来自后代的各种细胞如红细胞。例如，为了证明 TLR4、 CD14或TRAM/Trif在巨噬细胞中的表达，可用对人类TLR4、 CD14 或TRAM/Trif Rl具特异性的抗体进行流式细胞术，将该抗体直接缀合或与 缀合荧光团的并且识别TLR4、 CD14或TRAM/Trif的抗体的第二抗体结合 4吏用。在这种分析中，对于TLR4、 CD14或TRAM/Trif的存在，人类红细 胞可用作阳性对照，且正常小鼠的红细胞可用作阴性对照。E. 含有多种转基因或其他突变的小鼠如本文中所述在其循环的红细胞中表达TLR4、 CD14或TRAM/Trif的 转基因小鼠可与下列小鼠杂交a)隐含其他的转基因的小鼠，或b)在其他的 基因上含有突变的小鼠。用标准的杂交育种方法，可产生对每一突变是杂合 或纯合的小鼠，并将其保持。可与含有CD14基因的小鼠繁殖的小鼠的实例 包括但不限于更有自身免疫病倾向的小鼠品系，如为狼疮模型的小鼠品系，例如小鼠品系NZB/W、 MRL+或S几。本发明还涉及获自转基因动物的细胞。因为由于突变或者环境影响，在 随后的后代中可发生一定的修饰，此类后代实际上可与亲本细胞不相同，但 仍然包括于本文所述的术语范围内。重组核酸技术用于实施本发明的核酸，无论是RNA、 iRNA、反义核酸、cDNA、基 因组DNA、载体、病毒或其杂合物(hybrid),可从各种来源分离、基因工程 改造、扩增和/或表达/重组产生。可从这些核酸中单独分离或克隆而产生重 组多肽并试验其期望的活性。可以使用任何重组表达体系，包括细菌、哺乳 动物、酵母、昆虫或植物细胞表达体系。可选地，这些核酸可通过熟知的化学合成:J支术体外合成，例如下列文献 中所描述的Adams, /爿附.C/ze肌5bc 105: 661, 1983; Bolousov， M/c/e/c ^c/A 25: 3440-3444, 1997; Frenkel， i^Vee i^&c说o/. 19: 373-380,1995; Blommers,历oc/z謹'勿33: 7886-7896， 1994; Narang, Me仇68: 90, 1979; Brown, Me仇五"，o/' 68: 109, 1979; Beaucage， Wra.丄饥22: 1859， 1981;美国专利号4,458,066。本发明提供了含有本发明序列如本发明示例性序列的亚序列的寡核苷 酸。寡核苷酸可包括例如可化学合成的单链多脱氧核苷酸或双互补的多脱氧 核香酸链。操作核酸的技术，例如亚克隆、标记探针(如使用克列诺(Klenow)聚 合酶、切口平移、扩增进行随机引物标记)、测序、杂交等，充分描述于科 学和专利文献中，参阅例如Sambrook编辑，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第二版)，1-3巻，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubd编辑，John Wiley和Sons, Inc., New York, 1997; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucletic Acid Probes, Part I . Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen纟扁4尋，Elsevier, N.Y.， 1993 。通过本领域技术人员熟知的许多普通方法中的任何手段，可分析并定量核酸、载体、壳体、多肽等。这些手段包括例如分析生物化学法如NMR、 分光光度法、射线照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄 层层析(TLC)和高扩散层析；各种免疫方法，如流体或凝胶沉淀素反应、免 疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫 荧光测定、Sourthem分片斤、Northern分析、点印迹分析(dot-blot analysis)、 凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、核酸或把标或信号扩增法、放射标记、闪烁计 数和亲和层析。通过从基因组样品中克隆，并且如果需要，筛选和再克隆从例如基因组 克隆或cDNA克隆中分离的或扩增的插入片段，可获得和操作用于实践本发 明方法的核酸。用于本发明方法中的核酸的来源包括包含于例如下组中的基 因组或cDNA文库哺乳动物人工染色体(MAC),参阅例如美国专利号 5,721,118; 6,025,155;人类人工染色体，参阅例如Rosenfeld, 15: 333-335,1997;酵母人工染色体(YAC);细菌人工染色体(BAC); Pl人工染 色体，参阅例如Woon， Ge圃^ 50: 306-316, 1998; Pl来源的载体(PAC )， 参阅例如Kern，所o&c/zm々w^ 23: 120-124, 1997;粘粒、重组病毒、噬菌体或 质粒。本发明提供了融合蛋白和编码它们的核酸。可将CD14或Toll样受体4 多肽融合于异质的肽或多肽，如给与期望的特性如增加的稳定性和简化的纯 化的N-末端鉴定肽。也可将本发明的肽或多肽合成和表达成连接有一个或 多个另外的结构域的融合蛋白，用于例如产生更具免疫原性的肽、更易于分 离重组合成的肽、鉴定和分离抗体和表达抗体的B细胞等。有利于检测和 纯化的结构域包括例如金属螯合肽如聚组氨酸束(polyhistidine tract)和允许 在固定的金属上纯化的组氨酸-色氨酸组件、允许在固定的免疫球蛋白上纯 化的蛋白A结构域和用于FLAGS延伸/亲和纯化体系(Immunex Corp， Seattle Wash)中的结构域。在纯化结构域和含有基元(motif)的肽或多肽间包括可切 割的连接体序列如Factor Xa或肠激酶(Invitrogen, San Diego Calif.)以促进 纯化。例如，表达载体可包括编码表位的核酸序列，该核酸序列连接于跟随 着硫氧还蛋白和肠激酶切割位点的6个组氨酸残基(参阅例如Willianms， 说oc/2em&^v 34: 1787-1797, 1995; Dobeli，尸rate/" Pwri/" 2: 404-414，1998)。组氨酸残基利于检测和纯化，而肠激酶切割位点提供了用于纯化来 自残余的融合蛋白表位的手段。 一方面，可用指导翻译的多肽或其片段的分 泌的前导序列，在适当的阶段组装编码本发明的多肽的核酸。涉及编码融合 蛋白的载体的技术和融合蛋白的应用充分描述于科学和专利文献中，参阅例 如，Kroll， DiVJ Ce〃.所o/. 12: 441-53, 1993。A. 转录调控元件可将本发明的核酸可操作地连接于启动子。启动子可是一个基元或一列 指导核酸的转录的核酸调控序列。启动子可包括转录起始位点附近的必需的 核酸序列，例如，在II型聚合酶启动子的情况下，TATA元件。启动子也任 选地包括远端增强子或阻遏子元件，远端增强子或阻遏子元件可位于从转录 起始位点开始的达几千个碱基对处。"组成性"启动子是在大多数环境和发 育条件下起作用的启动子。"可诱导"启动子是在环境或发育调控下的启动 子。"组织特异性"启动子是在有机体的一定的组织类型中起作用而在同一 个有机体的其他组织类型中不起作用的启动子。术语"可操作地连接"指核 酸表达调控序列(如启动子或转录因子结合位点阵列)和另一核酸序列之间的功能^:,其中，表达调控序列指导对应于另一序列的核酸的转录。B. 表达栽体和克隆载体本发明提供了含有本发明核酸如编码本发明蛋白的序列的表达载体和 克隆载体。本发明的表达载体和克隆载体可含有病毒颗粒、杆状病毒、噬菌 体、质粒、噬菌粒、粘粒、F粘粒、细菌人工染色体、病毒DNA(如疫苗、 腺病毒、腐臭痘病毒(foul pox virus)、伪狂犬病病毒和SV40的衍生物)，基 于P1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体和对目的宿主(如芽胞杆菌 (&c///^)、曲霉(^sper^7to)和酵母)具特异性的任何其他栽体。本发明的载 体可包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列。对本领域技术人员而 言，大量适宜的载体是熟知的，并且可以商购获得。如果需要，用常规分子生物学方法，可将本发明的核酸克隆至多种载体 中的任何载体，克隆体外扩增的核酸的方法描述于例如美国专利号5,426,039 中。为了促进扩增的序列的克隆，可将限制酶位点"构建入"PCR引物对。本发明提供了编码本发明的多肽和肽的表达载体文库。可将这些核酸引入细胞的基因组或细胞质或细胞核中，并通过充分描述于科学和专利文献中的多种常规技术表达，参阅例如Roberts, Atowe 328: 731, 1987; Scheider, /Vofe/"Ex/ r尸wn/" 6435: 10， 1995; Sambrook， Tijssen或Ausubel。载体可从天 然来源中分离、从如ATCC或GenBank文库的来源中获得或通过合成或重 组方法制备。例如，可在表达盒、在细胞中稳定或瞬间表达的载体或病毒(如 游离基因表达体系)中表达本发明的核酸。可将选择标记掺入至表达盒和载 体中以在转化的细胞和序列上赋予可选择的表型。例如，选择标记可编码游 离基因的维持和复制，使得不需要整合至宿主基因组。一方面，体内施用本发明的核酸，用于原位表达本发明的肽或多肽。可 以以"棵DNA，，(参阅例如美国专利号5,580，859)或以表达载体如重组病毒 的形式施用核酸。可通过任何途径施用核酸，包括如下文所述的肿瘤周围或 肿瘤内施用。体内施用的载体可获自病毒基因组，包括重组修饰的有包膜的 或无包膜的DNA和RNA病毒，这些病毒优先选自杆状病毒科 (baculoviridiae)、细小病毒科(parvoviridiae)、小RNA病毒科(picornoviridiae)、 疱渗病毒科(herpesveridiae)、痘病毒科(poxyiridae)、腺病毒科(adenoviridiae) 或小RNA病毒科(picomanaviridiae)。也可使用嵌合载体，其利用了每一个 亲本载体的特性的有利优点(参阅例如Feng, Atowe B/0&c/2w0/0gy 15: 866-870,1997)。可通过重组DNA技术修饰此类病毒基因组，以包括本发明 的核酸，并可进一步改造成复制缺陷、条件复制或具有复制能力。在可选的 方面中，载体获自腺病毒基因组(如获自人类腺病毒基因组的无复制能力的 载体，参阅例如美国专利号6,096,718; 6,110,458; 6,113,913; 5,631,236)、 与腺相关病毒基因组和反转录病毒基因组。反转录病毒载体可包括基于下列 病毒的那些病毒鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免 疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(fflV)和其组合；参阅，例如美国专利 号6,1177,681; 6,107,478; 5,658,775; 5,449,614; Buchscher， / Wra/. 66: 2731-2739, 1992; Johann， 《/ Wra/. 66: 1635-1640, 1992。基于腺相关病毒 (AVV)的载体可用于放射免疫(radioimmun)具有靶标核酸的细胞，例如， 在体外产生核酸和肽中，以及在体内和体外转体内基因治疗步骤中；参阅例 如美国专利号6，110，456; 5,474,935; Okada， GWze 77^. 3: 957-964, 1996。如本文中所用的"表达盒，，指核苷酸序列，其在与此类序列相容的宿主 中能影响结构基因(如编码蛋白的序列，如本发明的多肽)的表达。表达盒包 括至少启动子，该启动子可操作地连接于编码多肽的序列，和任选地与其他 序列如转录终止信号连接。也可以使用影响表达必需的或有利的其他的因 子，如增强子。当核酸置于功能关系中时，其可操作地连接于另一个核酸序列。例如， 如果启动子或增强子影响了序列的转录，可将其可操作地连接于编码序列。至于转录调控序列，可操作地连接意指被连接的DNA序列是连续的，并且 在需要连接两个蛋白编码区的情况下，为连续的并在阅读框中。对于开关序 列，可操作地连接表示序列能影响开关重组。因此，表达盒也包括质粒、表 达载体、重组病毒、任何形式的重组"棵DNA，，载体等。"载体"意指能转运与其连接的另一个核酸的核酸分子。 一种类型的载 体是"质粒"，其是其他的DNA片段可与之连接的环式双链DNA环。另 一种类型的载体是病毒载体，其中，可将其他的DNA片段连接至病毒基因 组。某些载体(例如具有细菌复制起点的细菌载体，和附加型哺乳动物载体) 能在引入所述载体的宿主细胞中自主复制。通过引入宿主细胞，可将其他 的载体(如非附加型哺乳动物载体)整合至宿主细胞基因组中，并据此与宿 主基因组一起得以复制。而且，某些载体能指导与其可操作地连接的基因的 表达。此类载体在本文中称为"重组表达载体"(或简单地称为"表达载体")。 通常，在重组DNA技术中使用的表达载体经常是质粒形式。在本发明的说 明书中，可交互使用"质粒"和"载体",因为质粒是最常用的载体形式。 然而，本发明意于包括其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷 反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其具有等同的功能。C.宿主细胞和转化的细胞本发明也提供了转化的细胞，其含有本发明的核酸序列，例如编码本发 明多肽的序列，或本发明的载体。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任 何宿主细胞，包括原核细胞、真核细胞，如细箭细胞、真菌细胞、酵母细胞、 哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。示例性的细菌细胞包括大肠杆菌、链 霉菌属、枯草芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和下列各属中的各种种类假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属。示例性的昆虫细胞包括果蝇S2(Drosophila S2) 和夜蛾Sf9 ( Spodoptem Sf9 )。示例性的动物细胞包括CHO、 COS或Bowes 黑色素瘤或任何小鼠或人类的细胞系。选择适当的宿主在本领域技术人员的 能力范围内。使用多种技术中的任何技术，可将载体引入宿主细胞，包括转化、转染、 转导、病毒感染、基因枪或Ti介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钓转 染、DEAE-Dextran介导的转染、脂转染或电穿孔。改造的宿主细胞可培养于修饰的以适于激活启动子、选择转化体或扩增 本发明的基因的传统营养培养基中。适宜的宿主菌(host strain)转化和宿主菌 生长至适当的细胞密度后，可通过适当的方式(例如温度变动或化学诱导)诱 导选择的启动子，并且可将细胞另外培养一段时间以使它们产生期望的多肽 或其片段。可通过离心收获细胞，通过物理或化学方式石皮裂细胞，并且保留所得粗 提物用于进一步纯化。通过任何便利的方法，可将用于表达蛋白的微生物细 胞破裂，包括冷冻融化循环、超声处理、机械破裂或使用细胞溶解剂。此类 方法对本领域技术人员而言是熟知的。通过包括下列方法的方法可从重组细 胞培养物中回收和纯化表达的多肽或片段硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴 离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、 羟磷灰石层析和凝集素层析。如果需要，在多肽完整构型中，可使用蛋白再 折叠步骤。如果需要，高效液相色谱(HPLC)可用于最后的纯化步骤。也可使用各种哺乳动物细胞培养体系以表达重组蛋白。哺乳动物表达体 系的实例包括COS-7系猴肾成纤维细胞，和能从相容的载体中表达蛋白的 其他细胞系，如C127、 3T3、 CHO、 HeLa和BHK细胞系。可以以常规的方式4吏用宿主细胞中的构建体，以产生由重组体序列编码 的基因产物。根据重组体产生方法中所用的宿主，可将由含有载体的宿主细 胞产生的多肽糖基化或不糖基化。本发明的多肽可包括或也可不包括起始甲碌u氨酸残基。可使用无细胞翻译体系以产生本发明的多肽。无细胞翻译体系可使用从 DNA构建体转录的mRNA,即所述DNA构建体含有可才喿作地连接于编码多肽或其片段的核酸的启动子。在一些方面中，在指导体外转录反应前，可将DNA构建体线性化。随后将转录的mRNA用适当的无细胞翻译提取物如家 兔网织红细胞提取物温育，以产生期望的多肽或其片段。表达载体可含有一种或多种可选择的标记基因，以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型特性，如二氬叶酸还原酶或真核细胞培养的新霉素抗性，或 如大肠杆菌中四环素或氨千青霉素抗性。D.核酸扩增在实践本发明中，通过例如扩增，可复制编码本发明的多肽的核酸或修^ 饰的核酸。本发明提供了扩增编码本发明多肽的核酸的扩增引物序列对，例 如能扩增含有CD14蛋白或Toll样受体4序列或其亚序列的核酸序列的引物对。扩增方法包括例如聚合酶链式反应，PCR (PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Innis编辑，Academic Press,N.Y., 1990和PCR STRATEGIES, 1995， Innis编辑，Academic Press, Inc., N.Y.);连接酶链式反应(LCR)(参阅例如Wu, G^omzh 4: 560, 1989; Landegren, 5We"ce 241: 1077， 1988; Barringer, 89: 117, 19卯)；转录扩增 (参阅例如，Kwoh,尸rac. Ato/.爿c^/. 86: 1173, 1989);和自动维持序列复制(参阅例如，Guatelli,尸rac. Ato/.爿cad 5W. 87: 1874, 1990); Q p画复 制酶扩增(参阅例如，Smith, / C"". M/craZ>Zo/. 35: 1477-1491, 1997);自动Q-(3 复制酶扩增测定(参阅例如,Burg， Mo/. CW/. iVc^es 10: 257-271, 1996)和其他 的RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA， Cangene, Mississauga, Ontario); 也可参阅Berger， M^zoA ￡"，0/. 152: 307-31.6, 1987; Sambrook; Ausubel; 美国专利号4,683,195和4,683,202; Sooknanan,所otec/z"o/ogy 13: 563-564, 1995。E.核酸杂交本发明提供了分离的或重组的核酸序列，其在严谨条件下与本发明示例 性的序列杂交，例如CD14序列或Toll样受体4序列，或其任何互补序列， 或编码本发明的多肽的核酸。在可选的方面中，严谨条件是高严谨条件、中 度严谨条件或低严谨条件，如本领域所知的和本文中所述的。这些方法可用于分离本发明的核酸。在可选的方面中，本发明的核酸，如通过其在低严谨条件下杂交的能力所定义的，可以是在约5个残基和全长之间的本发明的核酸，例如，它们在 长度上可至少是5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 90、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800或更多残基，或基因或编码序列如cDNA的全长。也 可包括比全长短的核酸。这些核酸可用作例如杂交探针、标记探针、PCR 寡核苷酸探针、iRNA、编码抗体结合肽(表位)、基元、活性位点等的反义 或序列。"选择性地(或特异性地)与……杂交，，指，在严谨杂交条件下，当具 体的核苷酸序列存在于复合混合物(如总的细胞或文库DNA或RNA)中时， 一个分子与该序列结合、双螺旋或杂交，其中至少在约IO倍的背景检测该 具体的核苷酸序列。在一实施方案中，通过其在严谨条件下与核酸杂交的能 力确定其在本发明的范围内，否则确定其在本发明的范围内(如本文中所述 的实例性的序列)。"严谨的杂交条件"指这样的条件，即探针在该条件下与通常以核酸的 复合混合物形式的靶标亚序列杂交，而不与显著量的其他序列(阳性信号(如 鉴定本发明的核酸)约10倍背景杂交)杂交。严谨条件是依赖序列的并且在 不同的环境中不同。较长的序列在较高的温度特异性杂交。对核酸杂交的详 尽指南见于Sambrook编辑，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (第二版)，第l誦3巻，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel编辑，John Wiley和Sons, Inc., New York, 1997; LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLETIC ACID PROBES, PART I . Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen编辑，Elsevier, N.Y.， 1993。通常，对于在确定的离子强度、pH的特定的序列，选择严谨条件是比 热熔点I低约5°C-10°C。 Tm是这样一种温度(在确定的离子强度、pH和核 酸浓度)在该温度下，50°/。的与耙标互补的探针与靶标序列均衡杂交(因为靶标序列过量存在，在Tm下，50%的探针被均衡占用)。严谨条件是这样的 条件，即在该条件下，盐的浓度少于约l.OM钠离子，通常在pH7.0-8.3时 约O.Ol-l.OM钠离子浓度(或其他的盐)，且温度对于短的探针(如10-50个核 苷酸)是至少约30 °C,对于长的探:针(如多于50个核苷酸)是至少约60 °C。 加入如Sambrook(下文引用)所述去稳定剂如曱酰胺，也可获得严谨条件。对 于高严谨杂交，阳性信号是至少2倍的背景，优选10倍的背景杂交。示例 性的高严谨或严谨杂交条件包括50%的曱酰胺、5xSSC和P/。SDS,在42 。C温育，或5 x SSC和1。/。SDS，在65。C温育，和在0.2x SSC和0.1%SDS 中在65。C洗涤。对于选择性或特异性杂交，阳性信号(如鉴定本发明的核酸) 是约IO倍的背景杂交。用于鉴定本发明范围内的核酸的严谨条件包括例如， 在含有50%的曱酰胺、5 x SSC和1% SDS的緩冲液中在42。C杂交，或在含 有5 x SSC和1% SDS的緩冲液中在65°C杂交，两者都以0.2 x SSC和0.1% 的SDS在65°C洗涤。在本发明中，在严谨条件下用本文中公开的核酸序列， 可在标准的Southern印迹中鉴定含有本发明的核酸的基因组DNA或cDNA。 用于这类杂交(以鉴定本发明范围内的核酸)的其他严谨条件为包括在40°/0 甲酰胺、1MNaCl、 1%SDS中在37。C杂交的那些条件。然而，选择杂交形式并不关键一_是洗涤条件的严谨性提出决定核酸是 否在本发明的范围内的条件。用于鉴定本发明范围内的核酸的洗涤条件包括 例如pH7时约0.02 mol的盐浓度和至少约50°C或约55°C-60°C的温度；或 在72°C约0.15MNaCl的盐浓度约15分钟；或约0.2 x SSC的盐浓度，在至 少约50°C或约55°C至约60°C，约15至约20分钟；或用浓度约2 x SSC的 含有0.1% SDS的盐，室温下洗涤两次，每次15分钟，随后用含有0.1% SDS 的的O.l x SSC在68。C洗涤两次，每次15分钟；或等同的条件。有关SSC 緩冲液和等同条件的描述，参阅Sambrook, Tijssen和Ausubel。F.寡核苷酸探针及其使用方法本发明也提供了用于鉴定编码一种多肽的核酸的核酸探针，该多肽是 TLR-4信号传导活性调节剂。 一方面，该探针含有至少本发明核酸的至少 IO个连续的碱基。可选地，本发明的探针可以是至少约5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、150,或约10-50、约20-60、约30-70个如本发明的核酸中所列出的序列的 连续碱基。探针通过结合和/或杂交鉴定核酸。可将探针用于本发明的测定， 参阅下文的讨-论。本发明的探针也可用于分离其他的核酸或多肽。G.测定序列同一性程度本发明提供了与CD14多核苦酸或Toll样受体4多核苷酸具有至少 90%、 91%、 92°/0、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更多序列 同一性的核酸。本发明提供了与CD14蛋白或Toll样受体4蛋白具有至少 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更多序列 同 一性的多肽。可用序列比较算法通过分析或通过可视的检查来测定序列的 同一性。使用本领域中已知的多个序列比较算法的任何算法和程序，可评价 蛋白和/或核酸序列的同 一性(同源性)。对于序列的比较，通常一个序列充当参考序列，将试验的序列与该参考 序列比较。当使用序列比较算法时，将试验序列和参考序列登输入计算机， 如果需要，指定亚序列坐标(coordinate),并指定序列算法程序参数。可使用 缺省程序参数，或指定可供选择的参数。随后基于程序参数，序列比较算法 计算试验序列相对于参考序列的序列同一百分数。对于核酸和蛋白的序列比 较，可使用下文讨论的BLAST和BLAST 2.2.2或FASTA版本3.0t78算法和 缺省参数。如本文所用的"比较窗(comparison window)"包括参考选自下组的连续 位置的数目中的任何一个20-600，通常约50至约200，更通常约100至约 150，其中，在将两条序列最佳比对后，可将序列与相同数目的连续位置的 参考序列比较。比对用于比较的序列的方法在本领域内是熟知的。可根据下 列方法进行用于比较的序列的最佳比对如Smith和Waterman, 々 p/. Mafc/z. 2: 482, 1981的局部同源性算法；Needleman和Wunsch, / Mo/.所o/. 48: 443， 1970的同源性比对算法；Pearson和Lipman,尸rac. A^/.Sc/. t/.5".A 85: 2444， 1988的研究相似性的方法；计算机化的执行这些算法(FASTDB (Intelligenetics)， BLAST (National Center for Biomedical Information), GAP, BESTFIT, FASTA和Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)中的TFASTA;或人工比对和可一见的枱r查(参阅例i口 Ausubel等，(1999 Suppl.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience， N.Y. 1987)。适宜测定同一性百分数和序列相似性的算法的优选实例是FASTA算 法，其描述于Pearson和Lipman，Ato/. Jcad 5W. 85: 2444， 1988。也可参阅Pearson, MeAoA五w23;附0/. 266: 227-258， 1996。将用于DNA序列的 FASTA比对中计算同一性百分数的优选的参数进行优化，BL50矩阵(BL50 Matrix)15: -5 ; k誦元组=2 ; 连接罚分(joining penalty" 40 , 优化 (optimization)=28;空位罚分(gap penalty)-12，空位长度罚分(gap length penalty)=-2;和宽度(width)- 16。另 一个适宜测定同一性百分数和序列相似性的算法的优选实例是 BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等，」V"c. A^y 25: 3389-3402， 1977和Altschul等， / Mo/. 215: 403-410, 1990。利用本文所 述的参数，使用BLAST和BLAST2.0测定本发明的核酸和蛋白的序列同一 性百分数。通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information , http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/)可公开地获得进行BLAST分析 的软件。这种算法首先包括通过鉴定咨询序列(query sequence)中长度W的 短字，鉴定高得分序列对(HSP),当与数据库序列中相同长度的字比对时， 该咨询序列匹配或满足正评价的阈值分T。 T称为邻近字得分阈值(Altschul 等，如上)。这些初始的邻近字的采样(hit)充当启动搜寻以发现包含它们的较 长的HSP的种子(seed)。沿着每一个序列在两个方向上延伸字的采样，直到 可增加累积的比对分。用参数M(—对匹配残基的奖赏分，总是〉0)和N(错 配残基的罚分；总是<0)，计算核香酸序列的累积分。对于氨基酸序列，使 用得分矩阵计算累积分。当累积的比对分由于来自其最大获得值的量X 而降低时；由于累积一个或多个负得分残基比对，累积的分变成0或更低时； 或达到任一序列的末端时，停止字的采样在每一个方向上的延伸。BLAST 算法参数W、 T和X决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸 序列)用字长(W)ll、期望值(E)IO、 M=5、 N^4和两条链的比较作为缺省。 对于氨基酸序列，BLASTP程序用字长3、期望值(E) 10和BLOSUM62得 分矩阵(参阅Kenikoff和Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915，1989)比对(B)50、期望值(E)IO、 M=5、 N=-4和两条链的比较作为缺省。BLAST算法也进行两条序列之间相似性的统计分析(参阅，例如Karlin 和Altschul, iVoc. 7V^/.5W. CZS.A卯5873-5787， 1993)。由BLAST算 法提供的一种相似性测量是最小总数概率(P(N))，其提供了可能性的指示， 通过该可能性，偶尔发生两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配。例如，如果 最小总数概率在试验核酸与参考核酸的比较中小于约0.2,更优选小于约 0.01和最优选小于约0.001，那么iL为该核酸与参考序列相似。有益的算法的另 一实例是PILEUP。用递增的两两比对显示关联和序列 同一性百分数，PILEP从一组相关的序列中产生多重序列比对。它也绘出显 示用于产生比对的簇类关系的树或系统树(dendogram)。 PILEUP使用Feng 和Doolittle J. Mol. Evol. 35: 351-360, 1987的递增的比对方法的简化形式。 所用的方法与Higgins和Sharp, G45/OS5: 151-153， 1989描述的方法类似。 该程序可比对达300条序列，每一个最大长度为5,000个核苦酸或氨基酸。 多比对方法从两个最相似的序列的两两比对开始，产生一簇两条比对的序 列。随后将这个簇与下一个最相关的序列或比对序列的簇进行比对。通过两 个单独序列的两两比对的简单延伸，比对序列的两个簇。通过一系列递增的 两两比对，实现最终的比对。通过指定具体的序列和它们的序列比较区域的 氨基酸和核苷酸坐标，以及通过指定程序参数，来运行该程序。使用PILEUP, 将参考序列与其他的试验序列比较，以测定序列同一性关系百分数，使用下 列参数缺省空位权数(3.00),缺省空位长度权数(0.10),和加权的末端空 位。可从GCG序列分析软件包例如7.0版本(Devereaux等，M/c ^czV/s12: 387-395, 1984)获得PILEUP。适宜多DNA和氨基酸比对的算法的另 一优选的实例是CLUSTALW程 序(Thompson等，M/c爿"'(is22: 4673-4680, 1994)。 CLUSTALW进行序列 组(groupsofsequences)间的多种配对比较，并且基于同源性，将它们聚集成 多种比对。缝隙开放和缝隙延伸罚分分别是10和0.05。对于氨基酸比对， 可将BLOSUM算法用作蛋白权数矩阵(Henikoff & Henikoff, TVa". 4cad t/.5H 89: 10915-10919, 1992)。"序列同一性"指氨基酸和核苷酸序列间相似性的测量，并且用本领域已知的方法如下文中所述的方法测量。在两条或多条核酸或多肽序列的关系中，"相同的"或百分比"同 一性" 指两条或多条序列或亚序列，当在比较窗或指定区中比较和比对最大相关性 时，其是相同的或具有相同氨基酸残基或核苷酸的指定的百分比数(即在特定区内60%同一性，优选65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 ％、 97%、 98%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%或更多同一 性)，如使用下列序列比对算法或通过手工比对和可视的检查所测量的。在两种核酸或多肽中，"基本上相同"指两条或多条序列或亚序列，当 比较和比对最大相关性时，如使用下列序列比较算法或通过可视检查所测量 的，其具有至少60°/。、通常至少70%、优选至少80%、最优选至少90%或 至少95°/。核苷酸或氨基酸残基同一性。优选地，基本上相同存在于长度上是 至少50个碱基或残基的序列区中，更优选至少约100个碱基或残基的区中， 并最优选序列超过至少约150个碱基或残基基本上相同。在最优选的实施方 案中，序列遍及所有编码区的长度是基本上相同的。两条或多条核酸或多肽序列中的"同源性"和"同一性"指两条或多条 序列或亚序列，当在比较窗或指定区比较和比对最大相关性时，其是相同的 或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的指定的百分比数，如使用许多序列比较 算法中的任何算法或通过手工比对和可视检查所测量的。对于序列的比较， 一条序列可充当参考序列(CD14或Toll样受体4多核苷酸或多肽的实例性序 列)，试验序列可与其进行比较。当使用序列比较算法时，将试验序列和参 考序列登录入计算机，如果需要，指定亚序列坐标，且可指定序列算法程序 参数。可使用缺省程序参数，或指定可供选择的参数。随后基于程序参数， 序列比较算法计算试-验序列相对于参考序列的百分比序列同 一性。如本文中所用的"比较窗"包括涉及许多连续残基的任一片段。例如， 在本发明可选的方面，将无论何处变化范围从20至本发明的实例性多肽或 核酸序列如CD14或Toll样受体4多核香酸或多肽的全长的连续残基，与连 续位置相同数目的参考序列进行比较，在这两条序列任选地比对后。如果参 考序列与本发明的示例性多肽或核酸序列具有必不可少的序列同 一 性，如与 CD14或Toll样受体4多核苷酸或多肽具有至少90%、 91°/。、 92%、 93%、94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更多的序列同一性，那么该序列在本 发明的范围内。基元，其可使用上文程序进行检测，包括编码亮氨酸拉链、螺旋-转角-螺旋(helix-tum-helix)基元、糖基化位点、遍在蛋白化位点、a-螺旋构型和卩-折叠片的序列；编码信号肽的信号序列，该信号肽指导所编码蛋白的分泌； 转录和调节中涉及的序列如同源框； 一段酸性序列、酶活性位点、底物结合 位点和酶切割位点。H. 计算机系统和计算机程序结果(computer systems and computer program products)为了在硅氧烷(silico)中测定和鉴定序列同一性、结构同源性、基元等，在可由计算机阅读和存取的任何介质上，可进行本发明的序列的储存、记录 或操作。因此，本发明提供了计算机、计算机系统、计算机可读介质、计算 机程序结果等，在那里记录或储存本发明的核酸和多肽序列。如本文中所用 的，单词"记录"与"储存，，指在计算机介质上储存信息的过程。本领域技 术人员可容易地采用任何已知的方法在计算机可读介质上记录信息，以产生 含有本发明的 一 种或多种核酸和/或多肽序列的产品。本发明的另一方面是计算机可读介质，其具有在其上记录的至少一条本 发明的核酸和/或多肽序列。计算机可读介质包括磁可读介质、光可读介质、 电子可读介质和磁/光介质。例如，计算机可读介质可以是硬盘、软盘、磁带、CD-ROM、多功能数码光盘(Digital Versatile Disk, DVD)、随机存储器 (Random Access Memory, RAM)或只读存4诸器(Read Only Memory, ROM),以 及其他类型的本领域技术人员所知的其他介质。如本文中所用的，术语"计算机，，、"计算机程序，，和"处理器"使用 其最广泛的普通意思，并且合并所有的此类设备(devices)。抑制多肽和转录物的表达本发明提供了与本发明的核酸序列互补的核酸(例如本发明核酸序列的 反义序列)。反义序列能抑制蛋白编码基因(如CD14编码核酸)的转运、 剪接或转录。通过耙向基因组DNA或信使RNA,可实现抑制。例如，可通过杂交和/或切割来抑制靶标核酸的转录或功能。本发明提供的 一组抑制剂包括寡核苷酸，其能结合基因或信息(message)，在任何一种情况下都防止或 抑制蛋白的产生或功能。结合可通过序列特异性的杂交。另一类有用的抑制 剂包括引起蛋白信息的失活或切割的寡核苷酸。寡核苷酸可具有导致此类切 割的酶活性，如核酶。可将寡核香酸进行化学修饰或与能切割互补核酸的酶 或组合物结合。技术人员可针对许多不同的此类寡核苷酸的库筛选具有所需 活性的那些寡核苷酸。使用反义、核酶技术和RNAi技术来调控基因表达的常规方法，或以这 种方式用于表达外源基因的基因治疗方法的常规方法，在本领域内是熟知 的。这些方法中的每一种都利用了编码本发明的磷酸酶多肽的反义或核酶转 录物的系统，如载体。术语"RNAi，，表示RNA干扰。该术语在本领域内理 解为包括使用可以沉默基因的RNA分子的技术。参阅，例如McMans等, A^w阳i^v/ewsGe"幼'(^3: 737,2002。在本申请中，术语"RNAi，，包括分子 如短干扰RNA (siRNA)、微RNA (mRNA)、小时序RNA (stRNA)。 一般来说， RNA干扰产生于双链RNA与基因的相互作用。.A.反义寡核苷酸本发明提供了能结合CD14信使RNA的反义寡核香酸，其通过靶向 mRNA,可抑制多肽的活性。设计反义寡核苷酸的策略充分描述于科学和专 利文献中，使用本发明的新的试剂，技术人员可设计此类寡核苷酸。例如， 筛选有效反义寡核苷酸的基因步移(gene walking)/RAN作图方法在本领域内 是熟知的，参阅，例如Ho，MeAo^五"2jwo/314: 168-183,2000，描述了 RNA 作图测定，其以标准的分子技术为基础，为选择有效的反义序列提供了便利 可靠的方法。也可参阅Smith, /尸/2^m. 11: 191-198， 2000。可用天然存在的核酸作反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以是任何长度， 例如，在可选的方面，反义寡核苷酸约5-100、约10-80、约15-60、约18-40。 通过常规筛选，可确定最佳长度。反义寡核苷酸可以任何浓度存在。通过常 规的筛选，可确定最佳浓度。多种合成的非天然存在的核苷酸和核酸类似物 是已知的，其可解决这种潜在的问题。例如可以使用含有非离子骨架(如 N-(2-氨乙基)甘氨酸单元)的肽核酸(PNAs)。也可使用具有硫代磷酸酯键的反义寡核苷酸，如下列文献中所描述的WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, Toxz'co/ 4PpZ户/zar附aco/. 144: 189-197, 1997;. Antisense Therapeutics, ed. Agrawal, Humanna Press, Totowa, N丄，1996。本发明提供的具有合成的DN A骨架类似物的反义寡核苷酸也包括二硫代磷酸酯、磷酸甲酯、氨基磷酸酯、 烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3，-硫缩醛、亚曱基(甲基亚氨基)、3，-N-氨 基曱酸酯和吗啉代氨基曱酸酯核酸(morpholino carbamate nucleic acids),如上 文所述。组合化学法可用于产生大量可快速筛选特异性寡核苷酸的寡核苷酸，该 特异性寡核苷酸对任何粑标如本发明的有义多肽和反义多肽具有适当的结合亲和力和特异性(参阅，例如Gold, J所o/. C&m. 270: 13581-13584， 1995)。B. siRNA"小干护匸RNA(siRNA)"指约10-30个核菩酸长的RNA分子，因其通过 RNA干扰(RNAi)特异性地干扰蛋白表达的能力而命名。优选地，siRNA分 子是12-28个核苷酸长，更优选15-25个核苷酸长，更优选19-23个核苦酸 长，最优选21-23个核苷酸长。因此，优选的siRNA分子在长度上是12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28或 29个核苷酸。RNAi是双步机制。Elbashir等，Ge"^s Dev., 15: 188-200,2001。首先，由 已知是切酶的酶将长的dsRNAs切割得21-23核糖核苦酸(nt)片段，该片段称 为小干扰RNA(siRNA)。随后，siRNA与核糖核酸酶复合物(术语称为RISC, RNA诱导的沉默复合物)结合，该siRNA能将这种复合物把向于互补的 mRNA, RISC随后切割在互补的siRNA对面的把标mRNA，其使得mRNA 变得对其他的RNA降解途径敏感。本发明的siRNA被设计与靶标核糖核苷酸序列相互作用，意味着该 siRNA充分互补于耙标序列，以与耙标序列结合。本发明也包括经过化学修 饰的siRNA分子，所述修饰赋予增强的抗核酸酶降解的稳定性，但保留了 与可能存在的靶标核酸结合的能力。C. 抑制性核酶本发明提供了能结合信息的核酶，该信息通过靶向mRNA抑制多肽的 活性，例如抑制具有CD14活性(例如TLR4信号传导活性)的多肽。设计 核酶和选择用于靶向的蛋白特异性反义序列的策略充分描述于科学和专利 文献中，技术人员利用本发明的新的试剂，可设计此类核酶。核酶通过利用核酶的靼标RNA结合部分与把标RNA结合而起作用，该 结合部分与切割靶标RNA的RNA的酶促部分保持紧密靠近。因此，核酶 通过互补的碱基配对，识别和结合耙标RNA,并且一旦结合于正确的位点， 则酶促作用以切割和失活革巴标RNA。如果切割发生在编码区，以这种方式 切割RNA将破坏其指导所编码的蛋白的合成的能力。在核酶已结合和切割 其RNA革巴标后，其通常从该RNA中释》丈，因此可以重复地结合和切割新 的靶标。在某些情况下，核酶的酶特性优于其他技术如反义技术(其中核酸分子 简单地与核酸靶标结合，以阻抑其转录、翻译或与另一个分子的结合)，因 为实现治疗所必需的核酶的有效浓度可低于反义寡核苷酸实现治疗所必需 的浓度。这种潜在的优势反映了核酶的酶促能力。因此，单个核酶分子能切 割许多靶标RNA分子。另外，核酶通常是高特异性抑制剂，抑制的特异性 不但依赖于结合的碱基配对机制，也依赖于分子抑制与其结合的RNA的表 达的机制。即，抑制是由RNA靶标的切割引起的，因此将特异性定义为靶 标RNA的切割速率与非乾标的RNA的切割速率之比。因此，核酶作用的 特异性可以比结合相同RNA位点的反义寡核苦酸的更大。酶促核酶RNA分子可在垂头状模体中形成，但也可在发夹、丁型肝炎 病毒、I组内含子、RNA酶P-样RNA的模体(与RNA指导序列联合)中形 成。此类垂头4犬才莫体的实例由Rossi,爿/^s i ^searc/z <3"<ii/w 2<3" i ^rov/nw^s 8: 183， 1992描述；发夹模体由Hampel, Biochemistry 28: 4929, 1989和Hample, Nuc. Acids Res. 18: 299， 1990描述；丁型肝炎病毒才莫体由Perrotta， Biochemistry 31: 16， 1992描述；RNA酶模体由Guerrier-Takada， Cell 35: 849， 1983描述，以及I组内含子由Cech美国专利号4,987,071描述。叙述这些 具体的模体并非是进行限制；本领域技术人员将意识到，本发明的酶促RNA分子具有与一个或多个靶标基因RNA区互补的特异性底物结合位点，并且具有在该底物结合位点内的或围绕该底物结合位点的核苷酸序列，该核^列赋予所述分子以RNA切割活性。 治疗方法本文中也描述了治疗受治疗者的预防和治疗方法，该受治疗者患有或有 风险(或易于)患有与不良的Toll样受体4表达或活性有关的病症。预防方法本发明涉及，通过为受治疗者施用调节经由Toll样受体4、 Tram/Trif 或CD14的信号传导的制剂，防止该受治疗者与不希望量的Toll样受体4表 达或活性有关的疾病或病状的方法。通过例如本文中所述的或本领域内已知 的诊断或预示测定的任何组合，可鉴定处于由Toll样受体4或CD14介导的 信号传导所引起或促成的疾病或不良症状风险中的受治疗者。通常，此类病 症涉及先天免疫系统的不良激活，例如细胞因子(如TNF-a)的不良诱导。 作为预防剂的物质的施用可发生于症状表现之前，与缺乏制剂时候的症状比 较，以便防止、延迟或减少症候。在某些实施方案中，制剂降低了 Toll样 受体4与CD14和/或TRAM/Trif的结合。在某些实施方案中，制剂减少了 配体与Toll样受体4、 CD14和/或TRAM/Trif的结合。基于本文中所述的筛 选测定，可鉴定适当的制剂。通常，此类制剂特异性地与Toll样受体4、 CD14 和/或TRAM/Trif结合。治疗方法本发明的另一方面涉及用于治疗目的TLR4、 CD14或TRAM/Trif表达 或活性的方法。所述方法包括将细胞与制剂接触，该制剂调节一个或多个与 该细胞有关的Toll样受体4和/或CD活性的活动，例如，特异性地与CD14 结合并抑制经由Toll样受体4的信号传导。制剂可以是化合物，所述化合 物特异性地与Toll样受体4结合并选择性地激活或抑制细胞中被在脂多糖 诱导的TNF-a活性，或激活或抑制巨噬细胞对水泡性口炎病毒或狂犬病病 毒的应答。制剂可以是抗体或蛋白、Toll样受体4蛋白的天然存在的同源配 体(cognate ligand)、肽、Toll样受体4或CD14的拟肽、小的非核酸有4几分 子或小的无机分子。这些调节方法可在体外进行(例如通过用制剂培养细 胞)，或可选地，在体内进行(例如通过向受治疗者施用制剂)。本发明提供了治疗受疾病或病症侵袭的个体的方法，该疾病或病症特征为Toll样受体4蛋白的不良表达或活性，例如不良的细胞因子活性，例如 TNF-a。在一实施方案中，所述方法包括施用增加或减少经由Toll样受体4 的信号传导的制剂(如通过本文所述的筛选测定鉴定的制剂)或制剂的组合。 可由该制剂治疗的病状包括其中受治疗者表现出先天免疫系统的不良激活 (如不良的炎症)的那些疾病。可由新的方法和组合物治疗的其他病症包4舌真菌感染、脓血症(sepsis)、 细胞肥大病毒感染、肺结核、骨吸收(如在牙周疾病中)、关节炎(如莱姆关 节炎有关的)和病毒性肝炎。干扰经由Toll样受体4的信号传导(如通过结 合CD14)的化合物也可用于选择性控制炎性反应中的细胞因子生成，例如， 应答微生物(如分枝杆菌)感染而产生的那些细胞因子。通过用以抑制CD14与Toll样受体4的结合或抑制配体与Toll样受体4 复合物的结合的技术，可实现对有关先天免疫系统的不良激活如不良的炎症 反应的病症的成功治疗。例如，证明显示了负调节活性的化合物(如使用本 文所述的测定法鉴定的制剂，如抗体)可用于防止和/或改善不良的CD14 或Toll样受体4活性引起的病症的症状。此类分子包括但不限于肽、磷酸 肽、小的有机或无机分子或抗体(包括，例如单克隆抗体、多克隆抗体、人 源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体或单链抗体和Fab和F(ab，)2表达文库 片段、scFV分子和其表位结合片段)。特别是，特异性地与Toll样受体4 结合并可激活或抑制细胞中由脂多糖诱导的TNF-a活性或者激活或抑制巨 噬细胞对水泡性口炎病毒或狂犬病病毒的应答的抗体和其衍生物(例如，其 抗原结合片段)。试剂盒本发明提供了含有组合物例如本发明核酸、表达盒、载体、细胞、多肽 (如CD14多肽或TRAM/Trif信号激活多肽或Toll样受体4信号激活多肽) 和/或抗体的试剂盒。试剂盒也可含有讲授本发明的方法和用途的非结构性 物质，如本文中所述的。治疗应用此,本发明提供了治疗自身免疫病、感染性疾病、Toll样受体4信号传导缺 陷或CD细胞缺陷的组合物和方法。示例性的自身免疫病是急性特发性血小板减少性紫癥、慢性特发性血小 板减少性紫癜、皮肌炎(dermatomycositis)、西德纳姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、重症肌无力、系统性红斑狼疳、狼痴性肾炎、风湿热、多腺体综合 症、大疱性类天疱疮、糖尿病、过敏性紫斑(Henoch-Schonlein Purpura)、后 链球菌肾炎(post-streptococcalnephritis )、结节性红斑、多发性大动脉炎 (Takayasu's arteritis),肾上腺皮质功能不全、风湿性关节炎、多发性硬化、 肉样瘤(sarcoidosis)、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动 脉炎、僵直性脊推炎、肺出血肾炎综合症、thromboangitisubiterans、干燥综 合症、原发性胆汁性肝硬化、桥本曱状腺炎、曱状腺毒症、硬皮病、慢性活 动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、pamphigus vulgaris,韦格纳肉 芽肿、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、 pemiciousanemia、急进性肾小球肾炎和纤维性肺泡炎。示例性的感染性疾病包括但不限于病毒性疾病或细菌性疾病。本发明的 多肽或多核苷酸可用于治疗或4全测感染性物质。例如，通过增加免疫应答， 特别是增加B和/或T细胞的增殖和分化，可治疗感染性疾病。通过提高现 有的免疫应答或通过激发新的免疫应答，可增加免疫应答。可选地，本发明 的多肽或多核苷酸也可直接抑制感染性物质，而无需引起免疫应答。病毒是感染性物质的一实例，其可引起可由本发明的多肽或多核苷酸治 疗或检测的疾病或症状。病毒的实例包括但不限于下列DNA和RNA病毒 科虫Jf某病毒(Arbovirus )、腺病毒科(Adenoviridae)、 沙状病毒科 (Arenaviridae)、动l^炎病毒(Arterivirus)、双RNA病毒科(Bimaviridae)、布尼 病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、圓环病毒科(Circoviridae)、 冠^)犬病毒矛牛(Coronaviridae)、黄病毒f牛(Flaviviridae)、肝病毒牙牛(Hepadnaviridae) (肝炎)、疱渗病毒科(Herpesviridae)(如细胞肥大病毒、单纯疱渗(Herpes Simplex)、 带4犬痕渗(herpes zoster)) 、 (Mononegavirus)( ^口副净占病毒牙牛 (Paramyxoviridae)、麻渗病毒、^M犬病毒科(Rhabdoviridae))、正粘、液病毒考牛 (Orthomyxoviridae)(如流感病毒)、乳头瘤状病^^牛(Papovaviridae)、细小病毒 科(Parvoviridae)、 小RNA病毒科(Picomaviridae)、 (Poxyiridae)(如天花、牛痘)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(如轮状病毒)、反转录病毒科(Retroviridae) (HTLV-I、 HTLV-II、慢病毒载体(lentivirus))和披盖病毒科(Togaviridae)(如风 疹病毒属(Rubivirus))。属于这些科的病毒可引起多种疾病和症状，包括但不 限于关节炎、细支气管炎(bronchiollitis)、脑炎、眼部感染(如流行性急性 结膜炎、角膜炎)、慢性疲劳综合症、肝炎(甲型、乙型、丙型、戊型肝炎， 急慢性肝炎，丁型肝炎)、脑膜炎、机会感染(如AIDS)、肺炎、伯基特淋巴 瘤、水痘(chickenpox)、出血热、麻渗(Measles)、流行性腮腺炎(Mumps)、副 流感、狂犬病、普通感冒、脊髓灰质炎、白血病(leukemia)、风疹、性传播 疾病、皮肤病、卡波西肉瘤(Kaposi's warts)和病毒血症。本发明的多肽或多 核苷酸可用于治疗任何这些症状或疾病。同样，可引起疾病或症状并且可由本发明的多核苷酸或多肽治疗或检测 的细菌或真菌物质，包括但不限于下列革兰氏阴性菌和革兰氏阳性细菌科和 真菌放线菌目(勿/"om戸to/^s) (e.g.,棒状杆菌属(Co，eZ^cten'wm)、 分枝 斥干菌属(Afyco6acfer/w附)、"i若卡氏菌属(iVorcaniZ"》、曲霉属(^5pgrg77/cw&)、芽 胞杆菌科(Bacz7/flceae)(如炭疽(Anthrax),梭菌属(C/oWn^wm))、拟杆菌科 (丑acterazV/aceae)、 芽生菌C6/ostomyca^)、鲍特氏菌属(5orcfete〃fl)、螺旋体 属C8orre//a),布鲁氏菌(Brace/ZowS)、 念珠菌病(Caw&Wa^)、 弯曲菌属 (Camp_y/o6ac—、球霉菌症(Coccidioidomycosis)、隐球菌病(Cryptococcosis)、 Dermatocycoses 、肠杆菌科(五她ratetehaceae)(克雷伯氏菌属(^/血!W/o:)、 沙门氏菌属(5^/附0^//0)，沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、丹 毒丝菌属(Erysipelothrix)、螺i走4干菌属(//e/z'co^c&r)、军团病(Legionellosis)、 钩端螺旋体病(Leptospirosis)、 李斯特菌属(Listeria)、 支原体目 (Mycoplasmatales)、 奈瑟氏5求菌科(Neisseriaceae)(如不动杆菌属 (Acinetobacter)、淋病(Gonorrhea)、 Menigococcal)、巴斯德菌感染(如放线杆 菌属(勿/"ote/to)、嗜血杆菌属(Zfe3,pMw51)、 巴氏杆菌属(尸a他脏〃a》、 假单胞菌属(尸"w^ wowoy)、立克次氏体科(Rickettsiaceae)、 衣原体科 (Chlamydiaceae)、 4每毒(Syphilis)和葡萄球菌(Staphylococcal),这些细菌或真 菌科可引起下列疾病或症状，包括但不限于菌血症、心内膜炎、眼部感染 (流行性急性结膜炎、肺结核、葡萄膜炎)、龈炎、机会感染(如AIDS相关的 感染)、甲沟炎(paronychia)、假肢相关的感染(prosthesis-related infections)、Reiter疾病(Reiter's Disease)、呼吸道感染如百日咳或脓胸(Empyema)、脓血 症、莱姆病(Lyme Disease)、猫4爪病(Cat-ScratchDisease),痢疾、副伤寒、食 物中毒、伤寒、肺炎、淋病、脑膜炎、衣原体(Chlamydia)、梅毒、白喉、麻 风病、副结核病、肺结核、狼疱、肉毒杆属中毒(Botulism)、坏疽、破伤风、 脓疱病(impetigo)、风湿热、猩红热、性传播疾病、皮肤病(如蜂窝织炎、 dermatocycoses)、毒血症、尿道感染、伤口感染。本发明的多肽或多核苷酸 可用于治疗任何这些症状或疾病。而且，引起可由本发明的多核香酸或多肽治疗或检测的疾病或症状的寄 生物包括，但不限于下列科阿米巴(Amebiasis)、巴贝虫(Babesiosis)、球虫 (Coccidiosis)、隐孑包子虫(Cryptosporidiosis)、 Dientamoebiasis、媾疫(Dourine)、 Ectoparasitic 、 贾第鞭毛虫(Giardiasis)、蠕虫(Helminthiasis)、 利什曼 (Leishmaniasis)、泰勒氏梨浆虫(Theileriasis)、弓形体(Toxoplasmosis) 、 4,虫 (Trypanosomiasis)和滴虫(Trichomonas)。这些寄生虫可引起多种疾病，包括 但不限于济疮、恙螨病、眼部感染、肠疾病(如痢疾、贾第鞭毛虫病)、肝 病、肺病、机会感染(如AIDS相关的)、疾疾、妊娠合并症和弓形体病。本 发明的多肽或的核苷酸可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。优选，使用本发明的多肽或的核苦酸可通过向患者施用有效量的多肽， 或通过从患者移除细胞、提供细胞本发明的多肽并将改造的细胞返还至患者 (体外治疗)。而且，本发明的多肽或多核苷酸可用作疫苗中的抗原，增加针 对感染性疾病的免疫应答。药物组合物的配置和施用本发明提供了含有本发明的核酸、肽和多肽(包括抗体)的药物组合物。 如上文中所讨-论的，本发明的核酸、肽和多肽可用于抑制或激活内源性CD14 多肽。此类细胞或非人类动物中的抑制可产生筛选模式(screening modality)， 用于鉴定治疗或改善自身免疫病、抗原呈递细胞缺陷或CD14细胞缺陷的化 合物。向受治疗者施用本发明的药物组合物，用于在受治疗者中产生耐受原 'l"生免疫环境(toleragenic immunological environment)。这可用于4吏受治疗者对 抗原耐受。可将本发明的核酸、肽和多肽与药学上可接受的载体(赋形剂)组合，以形成药物组合物。药学上可接受的载体可含有生理上可接受的化合物，例如， 其作用以稳定、增加或P条低本发明的药物组合物的吸收或清除速率。生理上可接受的化合物可包括例如碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧 化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白，减少肽或多肽的清 除或水解的组合物，或赋形剂或其他的稳定剂和/或緩沖剂。去垢剂，包括 脂质体载体，也可用于稳定、增加或降低药物组合物的吸收。肽和多肽的药 学上可接受的载体和制剂对本领域技术人员而言是已知的，并且详细描述于 科学和专利文献中，参阅例如Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton， Pa. ("RemingtonV')的最l斤版本。其他的药学上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或特别用于 防止微生物的生长或作用的防腐剂。多种防腐剂是熟知的，包括例如酚和抗 坏血酸。本领域技术人员将意识到，选择药学上可接受的载体(包括生理上 可接受的化合物)，依赖于例如本发明的肽或多肽的给药途径和其具体的生 理化学特性。一方面，将本发明的核酸、肽或多肽的溶液溶解于药学上可接受的载体 中，例如，当组合物是水溶性时的水载体。可用于肠内、胃肠外或经粘膜药 物送递的制剂的水溶液的实例包括，例如水、盐水、磷酸緩沖盐水、Hanks 溶液、林格溶液、葡萄糖/盐水、葡萄糖溶液等。制剂可含有如接近生理条 件所要求的药学上可接受的辅助物质，如緩沖剂、张力调节剂(tonicity adjusting agents)、湿润剂、去污剂等。添加剂还可包括附加的活性成分，如 杀菌剂或稳定剂。例如，溶液可含有醋酸钠、乳酸纳、氯化钠、氯化钾、失 水山梨醇月桂酸酯(sorbitan monolaurate)或三乙醇胺油酸酯(triethanolamine oleate)。通过常规的熟知的灭菌技术，可将这些化合物灭菌，或可进行无菌 过滤。可将所得的水溶液包装使用，或冷冻干燥，在施用前，将冻干的制剂 与无菌的水溶液组合。在这些制剂中肽的浓度可有;f艮大变化，并且依照所选 的具体给药模式和患者的需要，基于流体体积、粘度、体重等来选择肽的浓 度。固体制剂可用于肠内(口服的)施用。可将它们配制成药丸、片剂、粉剂 或胶嚢。对于固体组合物，可使用常规的无毒固体载体，包括例如药物级 的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、水杨酸钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服施用，通过混合任何常规使用的赋形剂(如上文列举的那些)以及通常10%-95%的活性成分(如肽)，来形成药学上可接受的无 毒组合物。非固体制剂也可用于肠内施用。载体可从各种油中选择，包括石 油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油 等。适宜的药学上的赋形剂包括如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗 糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单油酸 甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇。本发明的核酸、肽或多肽，当口服施用时，可进行保护以避免消化。这 可通过将本发明的核酸、肽或多肽与使它们抗酸解和酶解的组合物复合或通 过将核酸、肽或多肽包装于适当的抗性载体如脂质体中实现。保护化合物免 受消化的方式在本领域内是熟知的，参阅例如Fix，P/2armA仏13: 1760-1764, 1996; Samanen， /尸/^w/aco/. 48: 119-135, 1996;美国专利号5,391,377 描述了用于口服送递治疗剂的脂质组合物(脂质体送递在下文中进一步详细 讨论)。全身给药可通过经粘膜或经皮肤的方式。对于经粘膜或经皮肤施用，适 于穿过屏障的渗透剂可用于制剂中。此类渗透剂在本领域内 一般是已知的，包括例如，对于经粘膜施用，胆汁盐和梭链孢酸衍生物。另外，渗透剂科用 于促进透过。经粘膜施用可经由鼻喷雾剂或使用栓剂。参阅例如Sayani， 及ev. T7zer Z>wg O^r/w13: 85-184， 1996。对于局部的经皮肤施用，可将 制剂配制成软膏、乳剂、药膏(salves)、粉剂和凝胶剂。也可以持续送递或持续释放机制施用本发明的核酸、肽或多肽，该机制 可体内送递制剂。例如，能持续送递肽的生物可降解微球体或胶嚢或其他的 生物可降解多聚体配置可包括于本发明的制剂中(参阅例如Putney, 5/ofec/z"o/. 16: 153-157, 1998)。对于吸入，可使用本领域已知的任何体系送递本发明的核酸、肽或多肽， 所述体系包括干粉气溶胶、液体送递体系、空气喷射雾化器、推进剂体系等。 参阅例力口 Patton, S/o/ec/zm々was 16: 141-143, 1998，例^口 Dura Pharmaceuticals (San Diego， Calif.)， Aradigrn (Hayward， Calif.), Aerogen (Santa Clara， Calif.)， Inhale Therapeutic Systems(San Carlos, Calif.)等的用于多肽大分子的产品和吸入送递体系。例如，可以气溶胶或雾剂(mist)的形式施用药物制剂。对于 气溶胶施用，可以精细分离的形式连同表面活性剂和推进剂 一起提供制剂。 在另一方面，将制剂送递至呼吸组织的装置是吸入器，制剂在该吸入器中蒸 发。其他的液体送递体系包括例如空气喷射雾化器。在制备本发明的药物中，可使用和操作多种制剂修饰，以改变药物动力 学和生物分布。改变药物动力学和生物分布的许多方法对本领域的普通技术 人员而言是已知的。此类方法的实例包括在由物质如蛋白、脂质(如脂质体， 参阅下文)、碳水化合物或合成聚合物(见上文的讨论)中保护本发明的组合 物。有关药物动力学的一般讨-沦，参阅例如Remington的37-39章。本发明的核酸、肽或多肽可本领域已知的任何方式单独或作为药物组合 物送递，所述方式如全身地、区域性地或局部地(如直接进入或定位于肿 瘤)；通过动脉内的、鞘内(IT)、静脉内(IV)、胃肠外、胸膜腔内、表面、口 服或局部施用，皮下、气管内(如通过气溶胶)或经粘膜(如口腔、膀胱、阴道、 子宫、直肠、鼻粘膜)。制备可施用组合物的实际方法对本领域的技术人员 而言是已知的或显而易见的，并且详细描述于科学和专利文献中，参阅，例 如Remington的文献。对于"区域作用(regional effect)",例如集中于具体器 官， 一种施用模式包括动脉内或鞘内(IT)注射，以便例如集中于具体的器官， 如脑和CNS(参阅例如Gurun， X"eW/z爿"a/g. 85: 317-323, 1997)。例如，对于 期望将本发明的核酸、肽或多肽直接送递至脑的情况，如果优选，则进行颈 动脉内注射。如果需要高的全身剂量，胃肠外施用是优选的送递途径。制备 可胃肠外施用的组合物的实际方法对本领域的技术人员而言是已知的或显 而易见的，并且详细描述于例如Remington的文献，也可参阅Bai, / A^wra/附ww"o/. 80: 65-75， 1997;『w""， A^"ro/. <SW. 152: 31-38， 1997; Tonegawa, /Md 186: 507-515, 1997。一方面，可将含有本发明的核酸、肽或多肽的药物制剂合并至脂单层或 双层中，例如脂质体，参阅例如美国专利号6,110,490; 6，096，716; 5,283,185; 5,279,833。本发明也提供了将本发明的核酸、肽或多肽附着于所述单层或双 层的表面的制剂制剂中，已。例如，可将肽附着于含有酰肼-PEG-(二硬脂酰磷脂酰基)乙醇胺的脂质体(参阅例如Zalipsky，CTzew. 6: 705-708, 1995)。可使用脂质体或任何形式的脂质膜，如平面脂质膜或完整细胞(如红细胞)的细胞膜。脂质体制剂可用任何方式施用，包括静脉内、经皮肤(参阅例如Vulta，J尸/7arw.5W. 85:5-8, 1996)、经粘膜或口服施用。本发明也提 供了将本发明的核酸、肽和/或多肽合并于微粒(micelles)和/或脂质体中药物 制剂(参阅，例如Suntres， P/zwm.尸/^rmaco/. 46: 23-28, 1994; Woodle， 户/^m. i 饥9: 260-265， 1992)。脂质体和脂质体制剂可才艮据标准的方法可制 备，并且在本领域内是公知的，参阅例如Remington的文献，Akimaru, Qvtoh"esMo/ 7Tzer 1: 197-210， 1995; Alving,/wmw"o/.及ev. 145: 5-31， 1995; Szoka，i ev.所qp/7".9: 467, 1980,美国专利号4， 235,871, 4,501,728和4,837,028。在一个实施方案中，用防止化合物从体内快速排出的载体制备活性化合 物，如包括植入和微嚢送递体系的控制释放制剂。可使用生物可降解的生物 相容性聚合物，如乙烯-醋酸乙烯、聚乙醇酸、胶原、聚正酯(polyorthoesters) 和聚乳酸。制备此类制剂的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。可从 Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.购买才才泮十。也可将月旨质体悬浮 液(包括靶向感染细胞的脂质体和抗病毒抗原的单克隆抗体)用作药学上可 接受的载体。可根据本领域技术人员已知的方法来制备这些载体，如描述于 美国专利号522,811中的方法。为便于施用和统一剂量，以剂量单位形式配制口服或胃肠外组合物是有 利的。本文中所用的剂量单位形式指物理上分离的单位，适宜作为待治疗的 受治疗者的单位剂量；每一单位含有预定量的活性化合物和所需的药物载 体，经计算，所述预定量的化合物将产生期望的治疗作用。通过标准的药物方法，可在细胞培养物或试一验动物中测定此类化合物的 毒性和治疗功效，如测定LD5。(半数致死剂量)和ED5。(半数治疗有效剂量)。 毒性和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并可表达为LD5o/EDso的比。优 选显示高治疗指数的化合物。虽然可使用显示了毒性副作用的化合物，但应 小心设计送递体系，该体系将此类化合物靶向于受感染的组织，以便将对未 感染的细胞的损害降至最低，从而减少副作用。量范围。此类化合物的剂量优选位于循环浓度范围内，该循环浓度包括具有几乎没有或没有毒性的ED5。。根据使用的剂量形式和采用的施用途径，剂 量可在此范围内变化。对于用于本发明的方法中的任何化合物，可根据细胞 培养测定，对治疗上有效的剂量进行最初的估计。可在例如炎症或涉及不期 望的炎症的病症的动物模型中配制剂量，以实现循环血浆浓度范围，该浓度 范围包括如在细胞培养中所测定的IC5o (即实现症状半数抑制的试验化合物 的浓度)。此类信息可用于更准确地确定人类中的可用剂量。例如，可通过 高效液相色谱测定通常为标记制剂的血浆浓度。可用于研究如临床前方案的 动物模型在本领域内是已知的，例如，用于炎症病症的动物模型，如 Sonderstrup (Springer, 6"ewi /mmMwo/ aAo/. 25: 35-45, 2003)和Nikula等(/w/za/. 7bx/co/. 4(12): 123-53， 2000)所描述的，以及本领域中所知的那些，例如用于 真菌感染、脓血症、细胞肥大病毒、结核病、病毒肝炎和感染(例如由分枝 杆菌引起)。如本文中所定义的，蛋白或多肽如抗体的治疗上有效的量在约0.001-30 mg/kg体重内变化，例如约0.01-25 mg/kg体重、约0.1-20 mg/kg体重，或约 1-10 mg/kg体重、2-9 mg/kg体重、3-8 mg/kg体重、4-7 mg/kg体重或5-6 mg/kg 体重。可在约1至10周内(例如，2至8周内，3至7周内，或者约4、 5 或6周)每天一次或几次或每周一次或几次施用.蛋白或多肽。在某些情况下， 可在几个月或更长时间需要剂量。技术人员可以理解某些因素可影响有效治疗受治疗者所需要的剂量和周期，所述因素包括但不限于疾病或病症的严重 度、以前的治疗、受治疗者的总体情况和/或年龄以及存在的其他疾病。而 且，以治疗有效量的制剂如蛋白或多肽(包括抗体)治疗受伤者可包括单独治 疗，或优选包括一系列治疗。对于抗体，剂量通常是O.l mg/kg体重(如10 mg/kg-20 mg/kg)。部分人 抗体和完全人抗体通常比其他抗体在人类中具有更长的半衰期。因此，较低 剂量和较少频率使用通常是可能的。修饰如脂质化可用于稳定抗体和增加吸 收和组织渗透(例如进入脑)。脂质化抗体的方法描述于Cruikshank等，《/ Jc《wz>W /附mwwe 6j)Wrawes i/wmaw i 欲ovzWogy, 14: 193，1997。本发明包括通过调节经由Toll样受体4或CD的信号传导来调节TNF-a 的表达或活性的制剂或化合物。制剂可以是例如小分子。此类小分子包括但不限于肽、拟肽类(如类肽)、氨基酸、氨基酸类似物、分子量小于约10,000g/摩尔的非核酸有机化合物或无机化合物(即包括异质有机和有机金属化合物)、分子量小于约5,000 g/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约1000 g/ 摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约500g/摩尔的有机或无机化合物和 这些化合物的盐、酯以及其他药学上可接受的形式。示例性的剂量包括毫克或微克量的小分子/千克的患者或样品重量(如约 l微克/千克至约500微克/千克，约100微克/千克至约5毫克/千克，或约l -微克/千克至约50微克/千克)。还可理解，对于将要调节的表达或活性，小 分子的适当剂量依赖于小分子的效价。当一种或多种这些小分子施用于动物 (如人类)以便调节本发明的多肽或核酸的表达或活性时，医师、兽医或研究 人员可例如首先开相对低剂量的处方，随后增加剂量，直到获得适当的应答。 另外，可以理解任何特定动物受治疗者的具体剂量水平依赖于多种因素，包 括具体施用的化合物的活性，受治疗者的年龄、体重、总体健康、性别和饮 食，施用时间，施用途径，排泄速率，任何药物组合和将要调节的表达或活 性的程度。可例如共价和/或用连接体将抗体或其片段连接于另 一个治疗部分如治 疗剂或放射性金属离子，以形成共辄物。治疗剂包括但不限于抗生素(如更 生霉素(过去称为放线菌素))、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)。本文中所述的共轭物可用于调节给定的生物应答。例如，结合至抗体的 部分可是拥有期望的生物活性的蛋白或多肽。此类蛋白包括例如毒素，如 相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞外毒素或白喉毒素；蛋白，如肿瘤坏死 因子、a-干扰素、p-干扰素、神经生长因子、血小板^f汙生的生长因子、组织 纤维蛋白溶酶原激活剂；或生物应答调节物。可选地，可将抗体结合于第二抗体，以形成如由Segal(美国专利号 4，676,980)所述的抗体异质共辄物(antibody heteroconjugate)。可将药物组合物与施用说明书一起包括于容器、包装或分配器中。 通常将药物组合物为配制成无菌的、大致等渗的，并且完全服从美国食 品药品管理局的良好药物生产(GMP)规则。治疗方案药物动力学根据施用方法，可以多种单位剂量形式施用本发明的药物组合物。通常 的核酸、肽和多肽药物组合物的剂量对本领域技术人员而言是熟知的。此类剂量通常实际上是建议性的，并且^L据患者的具体治疗环境、患者的耐受性 等而进行调整。足以实现此目的的核酸、肽或多肽的量定义为"治疗上有效 的剂量"。有效用于此用途的剂量日程和量，即"剂量方案"将依赖于多种因 素，包括疾病或生理状况的阶段，疾病或生理状况的严重度，患者健康的总 体状态、患者的生理状态、年龄、活性制剂的药物制剂和浓度等。在制定患 者的剂量方案时，也考虑给药模式。剂量方案也必须考虑药物动力学，即药 物组合物的吸收速率、生物利用率、代谢、清除等。参阅，例如最新的Remigton 的文献；Egleton， i^/ "cfes 18: 1431-1439， 1997; Langer, 5We"ce 249: 1527-1533， 1990。在治疗应用中，以足以至少部分治疗生理状况或疾病和/或其并发症的 量，将组合物施用于遭受自身免疫病、感染性疾病、抗原呈递细胞缺陷或 CD14缺陷的患者。例如， 一方面，可使在几个小时内(通常1、 3或6个小 时)，施用约0.01 mg/hr-约1.0 mg/hr的用于静脉内(IV)施用的可溶性肽药物 组合物剂量，其可间歇循环地重复几周。可使用高很多的剂量(如达到约10 mg/ml)，特别是将药物施用于隐蔽的位点而并不进入血流时，如进入体腔或 进入器官的内腔，如脑脊髓液(cerebrospinal fluid, CSF)中。仅出于解释的目的，提供了实施本发明的具体的实施方案的下列实施 例，这些实施例并无意以任何方式限制本发明的范围。在此引用的所有出版物、专利和专利申请的公开内容通过引用结合入本文。
具体实施方式
实施例1Heedless突变transmissible recessive繁殖Heedless以产生纯合原种，Heedless为在G3动物中鉴定的可传递 的隐性LPS-高应答表型。在应答来自明尼苏达沙门氏菌的光滑LPS化学型 而不是粗糙LPS化学型或脂质时发生突变，以抑制TNF的产生(图la-c)。该突变还部分减少了对TLR2-TLR6配体的应答(图ld-h)，所述TLR2-TLR6 配体包括合成的二酰化的巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2; R立体异构体的减 少>S立体异构体)和Pam2CSK4以及高纯化的脂磷壁质和酵母聚糖A。对 Pam3CSK4 (—种TLR2-TLR1配体)和对其他已知TLR配体如Resiquimod (TLR7)、 polylC(TLR3)和CpG(TLR9)的应答是正常的(图li-l)。因此，该突 变对经由TLR4的信号传导产生了配体限制的但基本完全的作用，并且对经 由TLR2-TLR6复合物的信号传导产生了广泛但部分的作用。图1显示Heedless突变的粗糙LPS和TLR2-6的特异性。将野生型(WT)、 杂合Heedless (Hdl het)、纯合Heedless (Hdl homo)或Myd88缺陷的小鼠用 3%的巯基乙酸盐/酯腹膜内注射，以诱导巨噬细胞侵润。分离、培养巨噬细 胞，并对所显示的每一个具体诱导物进行剂量应答试验。在用诱导物37GC 温育4h后，收集上清液，并使用如以前所述的L929生物测定以双份形式 测定TNF的浓度。值代表平均值士SEM(r^6只小鼠或更多)。所用的诱导物 是光滑LPS(a)、粗糙LPS(b)、脂质A(c)、 S-MALP-2 (d)、 R-MALP-2 (e)、 LTA (f)、酵母聚糖A (g)、 PaHi2CSK4 (h)、 Poly LC (i)、瑞喹莫德(j)、 PaHi3CSK4 (k)和含有CpG的DNA(l)。在三个独立的试验中观察到了相似的结果。实施例2对不依赖LPS化学型的休克的抗性(Resistance to shock independent of LPS chemotype)因为Heedless在应答光滑LPS时选择性地防止TNF的产生，因此预期 突变将仅保护小鼠免受光滑(但不是粗糙)LPS的致命作用。通过腹膜内途径， 用1 mg LPS (光滑或粗糙化学型)注射突变的纯化小鼠或杂合的CWBL/6同 窝出生小鼠。所有的接受粗糙或光滑LPS的杂合小鼠在36小时内死亡。与 预料的相反，无论施用了粗糙还是光滑的LPS，所有的纯合Heedless小鼠都 存活。感觉所有的Heedless纯合小鼠都显示出比对照少得多的对粗^t和光滑 的化学型的敏感性(图2a和2b)。尽管粗糙LPS可诱导Heedless巨噬细胞产 生TNF,但突变必须禁止至少一些方面的LPS应答。实施例3Heedless阻抑LPS诱导的I型IFN的产生所有形式的LPS经由TLR4至MyD88非依赖性的途径(涉及适体MyD88 和Mai)和MyD88非依赖性途径(涉及适体TRIF和TRAM)来传递信号。 Poltorak等，5We"ce 282: 2085-2088， 1998; Hoebe等，Atowre 640-643， 2003; Yamamoto等，iV^. /附附m"o/. 4: 1144-1150， 2003; Kawai等，11(1): 115-122， 1999; Yamamoto等，A^w" 420: 324-329, 2002; Horng等，Atowe 420: 329-333,2002。 LPS诱导的IFN-卩的产生完全依赖于TRIF和TRAM,其允许IFN-卩 转录因子IRF-3的磷酸化和二聚体化。Hoebe等，Atowre 424: 743-748， 2003; Yamamoto等,5Wewce 301: 640-643， 2003; Yamamoto等,Ato. 7m,wo/. 4: 1144-1150， 2003。利用酪氨酸激酶Tyk2和信号转导物和转录激活剂STAT-1 ， IFN-卩经由自扩增回路(autoamplication loops)增加了其自身的合成，并且已 知IFN-卩在LPS毒性中起主要作用。Karaghiosoff等，A^. /附m柳o/. 4: 471-477，2003。 检查了 Heedless突变对I型IFN的作用，发现该突变防止了光滑LPS 和脂质A经由MyD-8非依赖性途径的信号传导(图2c、 d)。具体地说，Heedless 防止了 I型IFN和IFN-P的mRNA的产生，以及防止了 IFN可诱导基因(如 IFITl、 ISG15)的诱导。在应答脂质A时，在Heedless突变细胞中未检测 到IRF- 3磷酸二聚体(phosphodimer)的形成(图2e)。然而，转录因子NF-KB 的激活和促分裂原激活的蛋白激酶ERK1和ERK2的磷酸化正常发生于 Heedless巨喧细胞中(图2f)。也检查了 TNF和I型IFN在注射了粗糙LPS 或光滑LPS的小鼠的体内的产生。光滑LPS和粗糙LPS在野生型小鼠的血 清中都诱导了 TNF和I型IFN的大量产生(图2g-j)，然而光滑LPS未在 Heedless突变小鼠的血清中诱导TNF和I型IFN(图2g和2i)。粗糙LPS在 Heedless和野生型小鼠中诱导了 TNF的产生J旦未刺激I型IFN在Heedless 小鼠中产生(图2h， j)。这些结果符合巨噬细胞体外的应答分析，并且与 Heedless通过体内防止LPS诱导的I型IFN产生而抑制致死性的假说一致。 因此，LPS受体复合物可选择性地启动MyD-88依赖性信号传导或同时启动 MyD-88依赖性的MyD-88非依赖性的信号传导。Heedless感染的蛋白控制 MyD88依赖性途径的可利用性，并且。Heedless蛋白是光滑LPS诱导任何 形式的TLR4信号传导所必须的。最后，Heedless蛋白是脂质A(或粗糙LPS) 诱导经由MyD88非依赖性途径的信号传导是必须的，但不是脂质A(或粗糙LPS)诱导经由MyD88依赖性途径的信号传导所必须的。图2显示Heedless防止LPS对IFN^的诱导。用1 mg来自S. Wom/s 的LPS(光滑LPS) (a)或来自明尼苏达沙门氏菌Re595的LPS(粗糙LPS) (b)， 腹膜内注射年龄匹配的雄性Heedless杂合小鼠和纯合小鼠(同窝出生的小 鼠)。在三天的时间内监控存活率，并且将数据表示为卡普兰-迈耶曲线图 (Kaplan-Meier plot) (PO.OOOl)。 (c)测量来自所述突变小鼠(n-6)的巨噬细胞 上清液中的I型IFN的活性。用光滑LPS (100 ng/ml)或脂质A (100 ng/ml) 将细胞处理4个小时。误差条表示确定的SEM。 (d)用PolyIC或脂质A将 来自野生型C57BL/6或Heedless小鼠的腹膜巨噬细胞处理2个小时。从细 胞和IFN-卩诱导物中分离总RNA,并通过RT-PCR分析IFNP、 IFN-诱导基 因IFIT1、 ISG15和IL-12(3、 HPRT的诱导。IRF-3激活的免疫印迹分析(e), 或在用脂质A处理的(100 ng/ml)野生型和Heedless巨噬细胞中IkB和ERK (p42/M)的磷酸化(f)。 (g-j)在用LPS注射的小鼠的血清中，TNF和I型干扰 素的产生。用5 mg来自5*. Wwt^ (g, i)的光滑LPS或来自明尼苏达沙门氏 菌Re595的粗糙LPS,腹膜内注射年龄匹配(8周大)的野生型和Heedless小 鼠(每组4只小鼠)(h，j)。在指示的时间收集血液，并通过如在材料和方法中 所述的TNF或IFN生物测定，分析血清中TNF(g,h)和I型IFN(i,j)的浓度。 在另外的试验中，获得了类似的结果。实施例4经由Heedless和TLR4的VSV信号I型干扰素在限制病毒增殖中的关键作用导致在控制体外巨噬细胞中 的水泡性口炎病毒(VSV)生长中对Heedless需求的检验。当以范围为10-50 的MOI暴露于VSV下时，Heedless巨噬细胞远比野生型C57BL/6巨噬细胞 更易裂解。而且，与来自C3H/HeN小鼠的LPS非应答性Tlr^LPs-"^^11巨噬 细胞相比，来自C3H/HeJ小鼠的LPS应答Tlrr4Lps-^Ps-d巨噬细胞明显是高易 感的。在Heedless巨噬细胞中发现了比感染的野生型细胞至少多1000倍的 病毒，表明来自Heedless小鼠的巨噬细胞不能含有感染(图3b)。另外， Heedless巨噬细月包产生的IFN-a显著地减少(图3c)。通过在感染之前用I型干扰素处理细胞，防止了 VSV对Heedless或Thy^Ps-^Ps-d巨噬细胞的溶胞作 用。为了排除VSV接种体的LPS污染是导致Heedless和TLR4依赖性的抗 感染性的原因，用与巨噬细胞培养相同的培养基，将病毒在Vero单层细胞 上连续传代。通过直接将来自生产系(producer line)的稀释培养基直接施加于 巨噬单层细胞，进行病毒感染，而无需进行病毒纯化或浓缩(将模拟感染的 生产细胞用作对照)，并单独地检测病毒滴度。与LPS不同，在感染后8h、 16h、 21h和36h,病毒不能诱导TNF应答，并且未4企测到NF-kB激活也未 检测到ERK磷酸化(图3e)。尽管来自C57BL/6小鼠的巨噬细胞的VSV感染 在4小时后诱导了强烈的IRF-3激活应答(显示为迁移的条带)(图3f),但来 自Heedless小鼠的巨噬细胞的感染在10小时后诱导了最小的IRF-3激活。 因此，Heedless-TLR4-IRF-3-IFN-(3轴是对VSV的保护性应答所需要的。在 获得自TLR-3缺陷小鼠的巨噬细胞中未显示易感性的增加。图3表示Heedless巨噬细胞对VSV诱导的溶胞作用是高敏感的。在巯 基乙酸酯引发的、来自C57BL/6(WT)、 heedless (Hdl)、 C3H/HeN (HeN)和 Tlr4一^PS-d C3H/HeJ (HeJ)小鼠的腹膜巨噬细胞中，检查VSV的溶胞作用。 在感染后48小时，测量细胞存活率(a)、病毒滴度和培养基中的IFN-a(c)， 所述感染是用每个巨噬细胞10或50个病毒颗粒的多重性感染(moi)开始的。 在病毒感染前4小时，检测用IFN-卩预处理培养物中的细胞存活(d)。在用 VSV(50moi)感染指示时间的野生型巨噬细胞中，IkB、 ERK(p42/44)磷酸化 的免疫印记分析(e)。在用VSV (50 moi)感染至指示时间的野生型和Heedless 巨噬细胞中IRF-3的免疫印迹分析(f)。在三个独立的实验中，观察到了类似 的结果。实施例5Heedless对应CD14突变Heedless突变定位于中央的小鼠染色体18，从而在24个配子上排除了 〉98.2%的小鼠基因组(图6)。关键的区域含有编码CD14的基因。抗CD14 的cDNA通过RT-PCR扩增并测序时，在Heedless样品中观察到了早期终止密码子(premature stop condon)。 Ferrero and Goyert, M/c/e/c ^4c/(is1及es.， 16: 4173, 1988;NCBIGenBankP08571。因为关键碱基的形态不寻常，在来自许多纯合小鼠的DNA的双链中呈 现了双峰的现象，因此，通过使用酶BfliA-I的限制性核酸内切酶切割，证 实了存在突变，该酶能切割野生型等位基因，但不能切割Heedless等位基因 (图4)。突变预示了 83个羧基末端氨基酸的移除，这形成了 366个氨基酸的 CD14多肽链的富含亮氨酸的重复LRR结构域。图4表示通过限制性核酸内切酶切检测的Heedless,其为CW4中的突 变。使用基因组DNA才莫板，通过PCR,扩增来自野生型小鼠、Heedless纯 合小鼠和杂合小鼠的a/W基因的片段，该片段含有hdl突变位点。用限制 酶BfUAI将约0.2微克的每个片段在50QC消化2小时，并在1%的琼脂糖凝 胶上分离。BfiiAI消化后，未切割的PCR片段是1571bp。预测野生型(但不 是hdl)序列的消化产生长度为1111 bp的片段和另一个长度为460 bp的片 段。图6表示通过测序作图和鉴定的Heedless突变。(a.)F2小鼠表型分类是 基于，使用L929生物测定，测量LPS诱导的巨噬细胞TNF产生。在24个 配子(meioses)上，实现了将hdl限制于染色体的中央区，且峰LOD分大于6。 (b.)突变的Consed显示，显示来自hdl/hdl纯合小鼠的远端编码区(顶端脉迹， 双向测序)和来自正常C57BL/6小鼠(底部脉迹)的序列。在突变系中，AC被 T所替代，但尽管具有纯合性，仍作为双峰出现。因为以前没有报道CD14在聚集LPS应答中运用选择性，因此决定排除 不相关的突变可能产生所观察到的表型的可能性，并且检查Cdl4T小鼠。来 自这些动物的巨噬细胞精确显示了与在Heedless细胞中所观察的相同的表 型(图2c、 3d、 5a和5b)。而且，当加入高浓度(大于2 jig/ml)的巨噬细胞培 养物时，纯化的重组可溶性CD14能交叉再活化Heedless表型(图5c)。因此， Heedless表型是由无功能的CD14等位基因引起的。图5表示在Cdl4纯合突变细胞中被重组mCD14交叉再活化的光滑LPS 反应性。a、 b.用指示量的光滑LPS (a)、脂质A (b)或50mg/ml光滑LPS + 指示量的重组mCD14 (c)将来自正常或CD14敲出小鼠的腹膜巨噬细胞处理4小时。在(c)中，显示了 Cdl4T细胞应答和Hdl突变细胞应答。当反应终点 时测量TNF的产生。实施例6LPS诱导的TRIF-TRAM途径激活和VSV应答所需要的CD14无偏表型篩选(Unbiased phenotypic screening)和定位克隆表明，CD14具 有与之前归于其的功能不同的功能。并非简单地聚集Lps信号，CD14是LPS诱导的TRIF-TRAM途径的激活所绝对需要的。其对于对VSV的应答 也是必须的，这使独有的TLR4-介导的IRF-3磷酸二聚体形成的激活成为必 需。CD14在较小的程度上也参与经由TLR2-TLR6受体复合物(也已知含有 CD36)的信号传导。根据上述陈述，可能猜想CD14能区分粗糙和光滑LPS化学型。然而， 数据并未得出这样的结论。相反，因为在缺乏CD14的情况下，TLR4-MD-2 复合物区分了光滑和粗糙LPS，因此是TLR4-MD-2具有识别的能力，而 CD14实现了粗糙和光滑LPS化学型的特定生物活性。CD14给与在应答粗 糙LPS或脂质A中激发MyD88非依赖性信号传导的能力。相反，CD14给 与在应答光滑LPS中的所有TLR4依赖性信号传导活性。因此，CD14不区 分粗糙和光滑化学型，而在经由两者的信号传导中充当必需的因子。LPS受体充当具有两个终止的开关(switch);根据CD14和激活配体的存 在或不存在，可发生受体的"完全激活，，或限制的MyD88依赖性激活。在缺 少CD14时，粗糙LPS或脂质A刺激MyD-88依赖性激活，这与脂质A分 子经历与TLR4直接接触以侵/f言号传导的假说一致。Poltorak等，尸rac. A^/. 爿cad 97: 2163-2167， 2000; Lien等，C7z力./wveW. 105: 497-504,2000。因为一些细胞表达TLR4-MD-2，但不表达CD14,因此当动物用产生 粗糙LPS化学型的有机体感染时，由粗糙LPS发动的严格地MyD-88依赖 性信号传导可能发生，并且是不限制于CD14缺陷小鼠的现象(例如肥大细 胞和B细胞不表达CD14;]VLHuber等，个人通信)。尽管以前认为通过TLR7 的方式信号传导，但在巨噬细胞中，VSV显然依赖于CD14-TLR4途径，并 且引起IRF-3依赖性的IFN-p产生，但不激活MyD88途径。Lund等，iVoc. A^/.5W. U 101: 5598-5603， 2004。 一种能解释我们的观察的假说认为，通过对TLR4-MD-2复合物的超分 子结构的作用(即通过诱导的复合物靠近)，CD14允许MyD88非依赖性信号 转导，而MyD88依赖性信号传导产生于粗糙LPS或脂质A对无序 TLR4-MD-2复合物的直接刺激。在可选的模型中，CD14可能允许 TLR4-MD-2复合物经历构象变化，当LPS存在时，该构象变化允许MyD88 非依赖性的信号传导。在任一模型中，可想象，CD14直接接合粗糙和光滑 化学型LPS分子；TLR4-MD-2仅能接合无辅助的前者。近来，通过X-射线 晶体学测定的CD14的三维结构已公开了 LPS和其他微生物配体的可能的结 合位点以及可能与下游信号转导有关的位点，并可能最终有助于解释在此^艮 道的作用。Kim等，J说o/. 280: 11347-11351,2005。必须注意，a/w无效等位基因与7w/无效等位基因的纯合小鼠彼此在表型上可区别的。在两种情况下，都不能相应LPS并产生IFN-P。然而，7W/ 突变巨噬细胞也显示了相当严重的脂质A诱导的TNF产生的减少，而 巨噬细胞优选能够应答脂质A而产生TNF。 Hoebe等，A^w^ 424: 743-748,2003。 这可能是由于TRIF与MyD88依赖性途径组分(如TRAF-6 )之间功 能上重要的相互作用。Jiang等，尸亂Ato/.5W C7. 5". ^ 101: 3533- 3538，2004。 而且OIM突变影响TLR2-TLR6的感知(sensing)，而7W/突变不影响。 Hoebe等，A^w" 424: 743-748， 2003; Yamamoto等，5Werace 301: 640-643， 2003。在作为TLR2-TLR6的促进物(facilitator)和TLR4刺激物(包括LPS和仍 然未知的VSV感染产物)的双重作用中，CD14传导来自结构上分离的分子 的信号，并且可推断TLR2-TLR6复合物如TLR4-MD-2复合物那样与CD14 相互作用。LTA和MALP-2 (但不是酵母聚糖)两者部分地依赖于CD36以及 CD14，以经由TLR2-TLR6异二聚体传导信号，并且目前正在检查CD36无 效等位基因(Cd36。w)和Cdl4腿的混合纯合子的表型。Hoebe等，A^wre433: 523-527, 2005。在巨噬细胞对VSV的抗性中，CD14-TLR4信号传导轴 (signaling axis)的必要功能是未预料到的，清楚的是至少在巨噬细胞中，对 于检测这种微生物，TLR4而非TLR3或TLR7是至关重要的。可能不同的 细胞类型通过识别特定的病毒产物而经由不同的TLRs来感知相同的病毒。在VSV感染过程中激活CD14并允许MyD88非依赖性的TLR4的应答的分 子身份尚待确定。图7表示概括粗糙和光滑LPS (具有不同长度多糖的脂质A"圓柱体"(波 浪线))、TLR4/MD-2复合物(分别为蓝色和黑色的矩形)和CD14(圆形)之间相 互作用的示意图。CD14允许对光滑和粗糙LPS等量的应答。在缺乏CD14 时，粗糙LPS可激活MyD88非依赖性的信号传导，光滑LPS在缺乏CD14 时没能激活LPS信号。图8表示假设的机制，据此，CD14可允许来自TLR4复合物的MyD88 依赖性信号传导。显示了光滑和粗糙LPS、 CD14、 TLR4/MD-2和适体蛋白 的俯视图(细胞膜是透明的)。A.在缺乏CD14时，粗糙LPS可刺激 MyD88/Mal从单个TLR4/MD-2复合物募集，但将光滑LPS从相互作用中排 除。B.在存在CD14时，在TLR4/MD-2复合物间发生超分子的聚集，并且 作为诱导邻近的结果，发生TRIF/TRAM募集。光滑和粗糙LPS分子可被 CD14接合，并且可合并成组装复合物(assembly complex)。实施例7 方法学小鼠如以前所述，在诱变中使用C57BL/6小鼠。Hoebe等,Atow^ 424: 743-748,2003。在TG注射三天后，收获巯基乙酸酯(TG)引起的腹膜巨噬细 胞，并如以前所述^4居对TLR激动剂的应答来筛选。Hoebe等，424: 743-748, 2003。 Cdl4卞和C3H/HeJ小鼠从Jackson实验室获得。C3H/HeN 小鼠从Charles River获得。根据TSRI动物使用委员会(TSRI Animal Use Committee)的规则进行所有的试验。Heedless的遣传作图和定位鉴定将Heedless纯合小鼠与C3H/HeN小鼠 远交并与Heedless原种回交。以60个信息微卫星基因座，将24只小鼠进行 基因分型。将突变限定在两个染色体18标记间(通过单交叉乂人相邻的标记中 分离，并且通过多交叉/人远端标记中分离)。用萸光引物和ABI3100DNA测 序器，通过片段长度分析进行基因分型。用这种机器，也进行序列分析，并 且所有的情况下使用内部引物在未克隆的DNA片段上进行。试剂从德国的Alexis获得明尼苏达沙门氏菌Re595 (粗糙)LPS、马流产 沙门氏菌0Sa/mowe〃" "6w^s equi)(光滑)LPS、.鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(光滑)LPS、来自Sa/mo"e〃a Af/"wesoto R595(Re)(超纯，液体) 的脂质A以及Macrophage-Activation Lipopeptide-2 (MALP-2, S和R形式)。 高度纯化的脂磷壁质由T. Hartung惠赠。由Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) 合成未甲基化的寡核苷酸 5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT-S'。 dsRNA从Amersham Pharmacia Biotech 获得。Resiquimod从3M Corporation获得。PaHi2CSK4和PaIn3CSK4从EMC 」微生物保藏中心(EMC microcollections， Tubingen, Germany)获得。 酵母 聚糖A从Sigma获得。所有的试剂以规定的浓度使用。重组的可溶性CD14 从CellSciences (Canton, MA)购买。rMuIFN-p和BFN國a ELISA从R&D System 获得。在序列分析中所用的B/"-/从New England Biolabs获得。通过使用 来自Invitrogen的ThermoScriptRT-PCR系统，进行RT-PCR。从细胞中分离 总RNA，并且通过RT-PCR分析I型干扰素的诱导，RT-PCR条件是28-30 个循环940C， 30 s; 58 0C ， 30 s;和68。C, 40 s。用下列引物扩增IFN-卩、ISG15、 IFIT1、 IL画12卩、HRPT的cDNA:5'-TTCCTGCTGTGCTTCTCCAC画3' 和5'-AAGGTACCTTTGCACCCTCC-3'用 于 IFN-(3, 5'-TGGGACCTAAAGGTGAAGATGCTG-3' 和5'-TGCTTGATCACTGTGCACTGGG-3' 用 于 ISG15,5'-TCACTTCACATGGAAGCTGCTATTTG-3' 和 5'画CCATGGCTTGTTTATAATTTCCTCCTC國3' 用 于 IFIT1,5'-CGGGTCTGGTTTGATGATGTCC画3' 和5'画GACCCTGACCATCACTGTCAAAGAG-3' 用 于 IL-12卩， 5'-GGACAGGACTGAAAGACTTGCTCG-3' 和5'-TCCAACAAAGTCTGGCCTGTATCC-3'用于HRPT 。 JumpStart RED AccuTaq LA DNA聚合酶从Sigma获得。针对IRF-3的抗体(用于在天然凝胶 中检测磷酸二聚体)从Santa Cruz Biotechnology获得。针对磷酸化的IkB和 ERKl/2 (p42/p44)的抗体从Cell Signaling (Beverly, MA)获得，针对IRF3和|3-微管蛋白的抗体分别从Zymed (South San Frandsco, CA)和Pharmingen (SanDiego， CA)获得。生物测定参考重组小鼠IFN-P,使用以干扰素敏感荧光素酶构建体转 染的L-929细胞系，测量I型IFN的活性。参考重组小鼠TNF标准，使用 L-929细胞溶胞测定，测定通过腹膜巨噬细胞产生的TNF活性。为了测量 VSV对TG引起的腹膜巨噬细胞的溶胞作用，以每孔105的密度，将细胞涂 布在96孔板中，并且每个孔接种病毒，通过噬菌斑形成测定在L-929单层 细胞上单独滴定该病毒。将细胞以MTT染色以评价在规定的时间间隔后的 存活率。免疫印迹在溶胞緩冲液(0.5。/。 Triton X-100, 20 mM HEPES， pH 7.4， 150 mM NaCl, 12.5 mM 3-磷酸甘油，1.5 mM MgCl2, 10 mM NaF, 2 mM 二硫苏糖 醇，1 mM原钒酸钠，2 mM EGTA， 20 牛胰蛋白酶抑制剂，1 mM苯基甲磺 酰氟)中，将在指示的时间内用光滑LPS或脂质A处理或未处理的腹膜巨噬 细胞进行溶胞作用。通过SDS-PGAGE分离细胞提取物，转移至稳定素-P 膜(Millpore)并使用针对磷酸ERK、磷酸-IicB、 IRF3和P-微管蛋白的抗体通 过免疫印迹进行分析。如以前所述的，进行IRF-3磷酸二聚体形成的蛋白分 析。Poltorak等，5We"ce 282: 2085-2088， 1998。当本文中使用有关物理特性(如分子量)或化学特性(如化学式)的范 围时，意思是包括范围的所有的组合或亚组合和其中的具体实施方案。本文中引用的每一专利、专利申请或出版物的公开内容通过引用将其整 体结合入本文。本领域技术人员将意识到可对本发明的实施方案做许多的变化和调整， 并且在未偏离本发明的精神的情况下实现此类变化和调整。因此，预期所附 权利要求涵盖了落入本发明的真实的精神和范围内的所有此类等同的变化。
权利要求
1.一种用于治疗怀疑患有感染的哺乳动物受治疗者中棒状病毒感染的方法，所述方法包括以有效减轻或消除棒状病毒感染或防止其发生或复发的量，向所述受治疗者施用经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的调节剂。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述调节剂是经由CD14的Toll样 受体4信号传导活性的拮抗剂。
3. 根据权利要求1的方法，其中所述调节剂是CD14活性或Toll样 受体4信号传导活性的抑制剂。
4. 根据权利要求3的方法，其中所述抑制剂是CD14或TLR-4的干 扰RNA、短发夹RNA、核酶或反义寡核苷酸。
5. 根据权利要求3的方法，其中所述抑制剂是CD14或TLR-4的单 克隆抗体、多克隆抗体、肽、拟肽或小化学抑制剂。
6. 根据权利要求5的方法，其中所述抑制剂是CD14的抗体。
7. 根据权利要求5的方法，其中所述抑制剂是TLR-4的抗体。
8. 根据权利要求5的方法，其中所述棒状病毒是狂犬病病毒或水泡 性口炎病毒。
9. 一种用于治疗哺乳动物受治疗者中自身免疫病的方法，所述方法 包括以有效减轻或消除自身免疫病或防止其发生或复发的量，向所述哺乳 动物受治疗者施用经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的调节剂。
10. 根据权利要求9的方法，其中所述调节剂是经由CD14的Toll样 受体4信号传导活性的拮抗剂。
11. 根据权利要求10的方法，其中所述调节剂是CD14活性或Toll 样受体4信号传导活性的抑制剂。
12. ^f艮据权利要求11的方法，其中所述抑制剂是CD14或TLR-4的 单克隆抗体、多克隆抗体、肽、拟肽或小化学抑制剂。
13. 根据权利要求11的方法，其中所述抑制剂是CD14的抗体。自胶凝的藻酸盐体系及其用途发明领域本发明涉及具有延迟胶凝过程的藻酸盐体系，并涉及制备和使用该体系的 组合物、器件和成套工具和方法。发明背景本申请要求于2004年10月12日提交的标题为"自胶凝藻酸盐体系及其 用途(Self-Gelling Alginate Systems and Uses Thereof)"的美国临时申 请No. 60/617, 852的优先权，该申请的内容参考结合于本文。藻酸盐是亲水性的海洋生物高分子，具有能在生理相关的温度下形成并固 化的热稳定凝胶的独特性能。藻酸盐是一类由1-4配糖连接的(3-D-甘露糖醛酸 (M)和oc-L-古洛糖醛酸(G)残基的非支化的二元共聚物。两种糖醛酸单体的相对量和它们在聚合物链中的顺序排列可依据藻酸盐的来源而变化。藻酸盐是在如 Za历i/7aria力/pei^oi"ea、 i/acrocys^is / /_ri/e_ra、 Ae5^0/2ia /n'gresce刀51禾口 」SCOp/ yW咖/K^OSM7的海洋褐藻中的结构聚合物。藻酸盐也可以由诸如绿脓 假单胞菌、^zotoZ acter K2V e7a"a^7禾口 /^e〃c/oy/ o/2a51 /7"ore5"cejV751等特定细 菌所产生(W004011628 Al)。藻酸盐凝胶可在二价阳离子与来自G残基的负电荷基团形成离子键时产 生，所述G残基来自不同的两种藻酸盐中的每一种，因而使这些两种聚合物交 联。在许多藻酸盐聚合物中形成多重交联键而产生为藻酸盐凝胶结构的基质。藻酸盐凝胶可以是水凝胶，即含有大量水但没有发生溶解的交联的藻酸盐 聚合物。生物聚合物凝胶，如藻酸盐水凝胶，是用于组织工程(tissue engineering applications)和其它生物应用的较佳候选物。因为这种性能和 能够在生理条件条件下形成凝胶，藻酸盐被广泛使用并对其用于封装目的以及 作为生物构建材料进行了研究。将细胞截留在藻酸盐珠中是常用的技术。藻酸 盐也显示是作为其它类型生物结构，包括组织工程应用和作为神经再生用的骨 架的有用材料。目前有各种制备藻酸盐水凝胶的方法。最常用的方法是透析/扩散法，该
14. 根据权利要求11的方法，其中所述抑制剂是TLR-4的抗体。
15. —种用于治疗哺乳动物受治疗者中炎症的方法，所述方法包括以 有效减轻或消除炎症或防止其发生或复发的量，向所述哺乳动物受治疗者 施用经由CD14的Toll样受体4信号传导活性的调节剂。
16. 根据权利要求15的方法，其中所述调节剂是经由CD14的Toll 样受体4信号传导活性的拮抗剂。
17. 根据权利要求16的方法，其中所述调节剂是CD14活性或Toll 样受体4信号传导活性的抑制剂。
18. 根据权利要求17的方法，其中所述抑制剂是CD14或TLR-4的 单克隆抗体、多克隆抗体、肽、拟肽或小化学抑制剂。
19. 根据权利要求17的方法，其中所述抑制剂是CD14的抗体。
20. 根据权利要求17的方法，其中所述抑制剂是TLR-4的抗体。
21. —种用于鉴定细胞中经由Toll样受体4途径信号传导的调节剂的 方法，所述方法包括将试验化合物与基于细胞的测定体系接触，所述测定体系包括表达能 将对配体的应答进行信号传导的Toll样受体4的细胞；以选择的有效激活Toll样受体4信号传导的量，向所述测定体系提供 CD14和所述配体；以及检测在所述测定体系中所述试验化合物对Toll样受体4信号传导的 作用，测定中所述试验化合物的功效指示调节。
22. 根据权利要求21的方法，所述方法还包括在细胞中共表达CD14 和Toll样受体4。
23. 根据权利要求21的方法，所述方法还包括向所述测定体系中提 供Toll样受体4，并检测所述试验化合物对所述测定体系中CD14/Toll样 受体4信号传导的作用，测定中的所述试验化合物的功效指示调节。
24. 根据权利要求21的方法，其中所述配体是内源性配体或外源性 配体。
25. 根据权利要求24的方法，其中所述外源配体是脂多糖、脂质A、 二酰化脂肽、三酰化脂肽、S-MALP-2、 R-MALP-2、细菌脂肽、Pam2CSK4、 脂磷壁质或酵母聚糖A。
26. 根据权利要求24的方法，其中所述外源性配体是来自明尼苏达 沙门氏菌的粗糙脂多糖、光滑脂多糖或脂质A。
27. 根据权利要求26的方法，其中所述检测步骤还包括测量对细胞 中肿瘤坏死因子产生的作用，其中，在对来自明尼苏达沙门氏菌的粗糙脂 多糖的响应中TNF的产生发生改变，而在对来自明尼苏达沙门氏菌的光 滑脂多糖或脂质A的响应中TNF的产生不发生改变。
28. 根据权利要求21的方法，其中所述内源性配体是脂质。
29. 根据权利要求21的方法，其中所述检测步骤还包括通过所述化 合物实现所述配体与CD14结合的减少。
30. 根据权利要求21的方法，其中所述检测步骤还包括通过所述化 合物实现CD14与Toll样受体4结合的减少。
31. 根据权利要求21的方法，其中所述检测步骤还包括通过所述化 合物实现所述配体与CD14结合的增加。
32. 根据权利要求21的方法，其中所述检测步骤还包括通过所述化 合物实现CD14与Toll样受体4结合的增加。
33. 根据权利要求30的方法，其中所述化合物是Toll样受体4途径 信号传导的拮抗剂。
34. 根据权利要求32的方法，其中所述化合物是Toll受体4途径信 号传导的激动剂。
35. 根据权利要求33的方法，其中所述^r测步骤还包括在细胞测定 中测量肺瘤坏死因子的减少。
36. 根据权利要求34的方法，其中所述检测步骤还包括在细胞测定 中测量胂瘤坏死因子的增加。
37. 根据权利要求32的方法，其中所述细胞测定还包括巨噬细胞。
38. 根据权利要求21的方法，其中所述检测步骤还包括测量与所述 配体结合的标记的CD14或与Toll样受体4结合的标记的CD14。
39. 根据权利要求38的方法，其中所述标记是放射性标记或荧光标记。
40. 根据权利要求21的方法，其中所述细胞表达能将对配体的应答 进行信号传导的TRAM-Trif;以选择的有效激活TRAM-Trif信号传导的量，向所述测定体系提供 CD14和所述配体；以及检测试验化合物对测定体系中TRAM-Trif信号传导的作用，测定中 的所述试验化合物的功效指示调节。
41. 根据权利要求40的方法，所述方法还包括在细胞中共表达CD 14、 Toll样受体4和TRMA-Trif。
42. 根据权利要求40的方法，所述方法还包括向所述测定体系中提 供Toll样受体4,并检测试验化合物对测定体系中CD14/ Toll样受体 4/TRAM-Trif信号传导的作用，测定中的所述试验化合物的功效指示调节。
43. 根据权利要求40的方法，其中所述检测步骤还包括通过所述化 合物实现配体与Toll样受体4结合的减少。
44. 根据权利要求40的方法，其中所述检测步骤还包括通过所述化 合物实现Toll样受体4与TRAM-Trif结合的减少。
45. 根据权利要求40的方法，其中所述检测步骤还包括通过所述化 合物实现配体与CD14结合的增加。
46. 根据权利要求40的方法，其中所述检测步骤还包括通过所述化 合物实现Toll样受体4与TRAM-Trif结合的增加。
47. 根据权利要求40的方法，其中所述化合物是TRAM-Trif途径信号传导的激动剂。
48. 根据权利要求40的方法，其中所述化合物是TRAM-Trif途径信 号传导的拮抗剂。
49. 根据权利要求40的方法，其中所述配体是内源性配体或外源性 配体。
50. 根据权利要求49的方法，其中所述外源性配体是脂多糖。
51. 根据权利要求49的方法，其中所述内源性配体是脂质。
52. 根据权利要求47的方法，其中所述检测步骤还包括在所述细胞 测定中测量IRF-3磷酸化的增加。
53. 根据权利要求48的方法，其中所述检测步骤还包括在细胞测定 中测量IRF-3磷酸化的减少。
54. 根据权利要求47的方法，其中所述检测步骤还包括在细胞测定 中测量p-干扰素的增加。
55. 根据权利要求47的方法，其中所述^r测步骤还包括在细胞测定 中测量p-干扰素的减少。
56. 根据权利要求47的方法，其中所述检测步骤还包括在细胞测定 中测量对病毒感染的易感性的減少。
57. 根据权利要求48的方法，其中所述检测步骤还包括在细胞测定 中测量对病毒感染的易感性的增加。
58. 根据权利要求40的方法，其中所述细胞测定还包括巨噬细胞。
59. 根据权利要求40的方法，其中所述检测步骤还包括测量与所述 配体结合的标记的C14或与TLR4或TRAM-Trif结合的标记的CD14。
60. 根据权利要求59的方法，其中所述标记是放射性标记或荧光标记。
61. —种用于筛选治疗感染性疾病的化合物的方法，所述方法包括将试验化合物与基于细胞的测定体系接触，所述测定体系包括表达能 将对配体的应答进行信号传导的Toll样受体4的细胞；以选择的有效激活Toll样受体4信号传导的量，向所述测定体系提供 CD14和配体；以及检测所述试验化合物对所述测定体系中Toll样受体4信号传导的作用，测定中所述试验化合物的功效指示对所述感染性疾病的调节。
62. 根据权利要求61的方法，其中所述细胞表达能将对所述配体的 应答进行信号传导的TRAM-Trif;以选择的有效激活TRAM-Trif信号传导的量，向所述测定体系提供 CD14和所述配体；以及检测所述试验化合物对所述测定体系中TRAM-Trif信号传导的作用， 测定中所述试验化合物的功效指示对感染性疾病的调节。
63. 根据权利要求61的方法，其中所述化合物是对所述配体进行信 号传导的Toll样受体4的拮抗剂。
64. 根据权利要求62的方法，其中所述化合物是对所述配体进行信 号传导的Toll样受体4的拮抗剂。
65. 根据权利要求61的方法，其中所述感染性疾病是细菌或病毒疾病。
66. 根据权利要求65的方法，其中所述感染性疾病是棒状病毒感染、 狂犬病病毒感染、水泡性口炎病毒感染、fflV感染、AIDS、细胞肥大病 毒感染或金黄色葡萄球菌感染。
67. 根据权利要求66的方法，其中所述化合物是棒状病毒糖蛋白G 与CD14相互作用的抑制剂。
68. —种用于筛选治疗自身免疫病的化合物的方法，所述方法包^":将试验化合物与基于细胞的测定系统接触，所述测定体系包括表达能 将对配体的应答进行信号传导的Toll样受体4的细胞；以选择的有效激活Toll样受体4信号传导的量，向所述测定体系提供 CD14和配体；以及检测所述试验化合物对所述测定体系中Toll样受体4信号传导的作 用，测定中的所述试验化合物的功效指示对自身免疫病的调节。
69. 根据权利要求68的方法，其中所述细胞表达能将对所述配体的 应答进行信号传导的TRAM-Trif;以选择的有效激活TRAM-Trif信号传导的量，向所述测定体系提供 CD14和所述配体；以及检测所述试验化合物对所述测定体系中TRAM-Trif信号传导的作用， 测定中的所述试验化合物的功效指示对自身免疫病的调节。
70. 根据权利要求68的方法，其中所述化合物是对所述配体进行信 号传导的Toll样受体4的拮抗剂。
71. 根据权利要求68的方法，其中所述自身免疫病是胰岛素依赖型 糖尿病、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎、风湿性关节炎、实验 性自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、葡萄膜视网膜炎的实验形 式、桥本曱状腺炎、原发性粘液水胂、曱状腺毒症、恶性贫血、自身免疫 性萎缩性胃炎、艾迪生病、提前绝经、男性不育、儿童糖尿病、古德帕斯 丘综合症、寻常性天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、水晶体源性葡萄膜炎(phacogenic uveitis )、自身免疫性溶血性贫血、特发性白血病、原发性 胆汁性肝硬化、活动性慢性肝炎HBs-ve、隐原性肝硬化、溃疡性结肠炎、 斯约格伦综合症、硬皮病、韦格纳肉芽胂病、多发性皮肌炎/皮肌炎 (poly/dermatomyositis)、盘一犬红J寇《良痴或系统性红斑《良痴。
72. —种用于篩选治疗炎症的化合物的方法，所述方法包括将试验化合物与基于细胞的测定体系接触，所述测定体系包括表达能 将对配体的应答进行信号传导的Toll样受体4的细胞；以选择的有效激活Toll样受体4信号传导的量，向所述测定体系提供 CD14和配体；以及检测所述试验化合物对所述测定体系中Toll样受体4信号传导的作 用，测定中所述试验化合物的功效指示对自身免疫病的调节。
73. 根据权利要求72的方法，其中所述细胞表达能将对所述配体的 应答进行信号传导的TRAM-Trif;以选择的有效激活TRAM-Trif信号传导的量，向所述测定体系提供 CD14和所述配体；以及冲企测所述试验化合物对所述测定体系中TRAM-Trif信号传导的作用，测定中所述试验化合物的功效指示对自身免疫病的调节。
74. 根据权利要求72的方法，其中所述化合物是对所述配体进行信 号传导的Toll样受体4的拮抗剂。
75. —种转基因非人类动物，所述动物含有异源核酸，其中所述核酸 含有CD14基因的功能缺失等位基因，所述动物显示了相对于野生表型的 表型，所述表型包括抑制巨噬细胞激活、对病毒或细菌感染的易感性、 TNF-a产生减少的特性，或其任何两个或多个的组合。
76. 根据权利要求75的转基因非人类动物，其中所述CD14突变动物 的表型的特征是对由脂多糖诱导的IRF-3磷酸化和二聚体化的减少、对通 过脂多糖诱导的非应答IFN-P的产生或巨噬细胞对由水泡性口炎病毒或 狂犬病病毒诱导的细胞溶解的高敏感性。
77. 根据权利要求75的转基因非人类动物，其中所述CD14基因中功 能缺失的等位基因是在Q284X的早期终止密码子。
78. 根据权利要求75的转基因非人类动物，其中所述动物是小鼠或 大鼠。
79. —种细胞或细胞系，所述细胞或细胞系来自根据权利要求75的 转基因非人类动物。
80. —种筛选Toll样受体4或TRAM-Trif信号传导活性的调节剂的体 外方法，所述方法包括将根据权利要求79的细胞或细胞系与试验化合 物接触；检测TNF-a产生量、对病毒或细菌感染的易感性或Toll样受体4 或TRAM-Trif诱导的巨噬细胞激活活性的增加或减少，由此鉴定所述试 验化合物为Toll样受体4或TRAM-Trif诱导的巨噬细胞激活活性的调节 剂。
81. —种筛选Toll样受体4或TRAM-Trif信号传导活性的调节剂的体 内方法，所述方法包括将根据权利要求79的细胞或细胞系与试验化合 物接触；检测TNF-a产生量、对病毒或细菌感染的易感性或Toll样受体4 或TRAM-Trif诱导的巨噬细胞激活活性的增加或减少，由此鉴定所述试 验化合物为Toll样受体4或TRAM-Trif诱导的巨噬细胞激活活性的调节 剂。
全文摘要
提供了用于筛选和鉴定化合物的组合物和方法，所述化合物经由CD14和配体而调节Toll样受体4(TLR4)途径的信号传导。提供了通过经由CD14和配体而调节Toll样受体4(TLR4)途径的信号传导来治疗哺乳动物受治疗者中各种疾病状态例如炎症或自身免疫疾病的方法。提供了转基因非人类动物和研发转基因非人类动物的方法，其中，所述转基因非人类动物在CD14基因中含有功能缺失突变。
文档编号A61K39/395GK101227922SQ200680024623
公开日2008年7月23日 申请日期2006年5月5日 优先权日2005年5月6日
发明者布鲁斯·比特勒, 蒋争凡 申请人:斯克里普斯研究学院