专利名称：抗Toll样受体2抗体抑制肿瘤转移的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗Toll样受体2抗体在预防和治疗肿瘤转移的新用 途，属于医药技术领域。
背景技术：
癌症(肿瘤)是严重危害人类健康的疾病。多达90%的癌症患者 最终是死于肿瘤转移，而不是死于肿瘤本身。而且，至今为止尚没有 治疗肿瘤转移的特效药物。肿瘤转移是癌细胞与宿主细胞相互作用的 连续复杂过程。首先，首先癌细胞降解基底膜及其它细胞外基质离开 原位进入间质、淋巴管及血管，随后沿血流或淋巴循环到达新的脏器； 其次，激活细胞合成并分泌各种降解酶类，降解基底膜及细胞处基质 穿过脉管壁进入循环系统，在循环中逃避免疫系统攻击，最后穿过脉 管，外渗达继发部位形成克隆，增殖形成转移灶。在转移瘤形成和生 长过程中，原位瘤周围环境以及肿瘤细胞本身的变化对肿瘤的扩散和 生长是至关重要的。肿瘤细胞内部的改变包括细胞极性丟失、细胞与 细胞之间或者细胞与基质之间的粘附性发生改变，以及支持肿瘤细胞 分离、迁移和浸润的受体激酶信号失调。肿瘤周围基质的改变包括内 皮细胞、成纤维细胞和免疫系统细胞参与肿瘤微环境中活性分子相互 作用，诱导血管和淋巴管生成，同时伴随炎症和免疫抑制反应，促进 细胞迁移和浸润，启动肿瘤转移程序。研究表明，免疫系统在肿瘤的生长和转移过程中均发挥关键作用。 肿瘤细胞作为自身抗原，可诱导机体形成免疫耐受，从而逃脱免疫系 统的监视，有利于肿瘤的生长和扩散。这主要是因为肿瘤相关抗原特 异性的T细胞缺乏活化的APC(通过TLR等"危险信号"受体而活化)所 提供的第二信号，从而导致这些T细胞的耐受、无能或者死亡，免疫 系统也就丧失了针对肺瘤的反应能力。T调节(Treg)细胞通过抑制机 体对自我或非我抗原的免疫反应诱导免疫耐受。肺瘤细胞能利用Treg 细胞保护其自身免受免疫系统的攻击。研究表明，组织局部微环境， 特别是免疫耐受性微环境的形成在肿瘤逃逸和肿瘤转移过程中发挥重 要作用。TLR是一个保守的I型跨膜蛋白家族，现在已经发现的人类TLR 有11个成员，小鼠TLR有13个成员。TLRs被认为是人类天然免疫 的一个重要组分，含有具有识别保守的PAMPs功能的LRR结构域以 及与IL-1受体的细胞内结构域同源的胞内结构域。 一般认为TLR介 导对浸染病原体特异结构的识别，通过DC细胞启动天然免疫和获得 性免疫。已经在许多类型细胞中检测到了 TLR的表达，包括DCs、 T 细胞、嗜酸性细胞、嗜中性细胞、肥大细胞、单核细胞和上皮细胞。 关于TLR激动/抑制剂在肿瘤转移过程中的作用，目前尚未见报道。发明内容为了克服现有技术中存在的技术问题，本发明提供了抗TLR2抗体 在制备抗肿瘤转移药物中的应用。 优选的肿瘤是B16黑色素瘤的。本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包括博莱 霉素和抗TLR2抗体。另外本发明还提供了一种药盒，包括博莱霉素和抗TLR2抗体。本发明系统研究了 TLRs，尤其是TLR2和TLR4在肺瘤转移发生、 发展过程中的作用以及抗TLR2抗体对肿瘤转移的治疗作用。单独给予抗TLR2抗体阻断TLR2活性，也可显著减少肺转移灶的 数目，转移的肺瘤节节数大为减少。与模型组或抗IgG组相比，TLR2 抗体组小鼠的肺脏指数均显著降低。说明阻断TLR2信号通道抑制B16 黑色素瘤细胞的转移。本发明发现博莱霉素与抗TLR2抗体具有协同作用，半数剂量的博 莱霉素和抗TLR2抗体合用即可达到全量博莱霉素的治疗效果，可以减 少博莱霉素的剂量，降低其副作用。体外用抗TLR2中和性抗体处理的B16细胞同样经过静脉注射到 C57BL/J小鼠体内之后B16黑色素瘤细胞的侵袭能力显著下降，小鼠肺 脏黑色素瘤转移灶数目显著减少，肺脏指数明显降低。
抗TLR2抗体显著减少气管灌注液中的CD4+CD25+Treg细胞、TLR2+ 细胞和CDllc+DCs 。博莱霉素可显著减少气管灌注液中的 CD4+CD25+Treg细胞和CDllc+DCs。说明阻断TLR2信号抑制B16黑色素瘤 小鼠肺脏DC成熟、TLR2表达以及调节性T细胞反应。本发明还研究了B16黑色素瘤细胞中TLRs的表达情况。RT-PCR技术 检测B16细胞中TLR1-TLR9的表达表明TLR1-TLR7均有表达。再用免疫荧 光和Wes ten Blot4全测进一步表明TLR2和TLR4在B16黑色素瘤细胞中均 有表达，TLR2和TLR4被阻断后，其荧光显著下降，而lgG处理组TLR2和 TLR4均正常表达，而且LPS能够增加其表达。DC是体内功能最强的专职性抗原呈递细胞和免疫系统的"岗哨，，， 其表面广泛地分布着大多数类型TLR,可通过TLR对病原体的识别，启 动天然免疫，调节获得性免疫，并决定T细胞和B细胞的发育和分化方 向。本发明还研究了B16对DC成熟和功能的调节作用，以及这种作用是 B16细胞本身的成分还是B16分泌的细胞因子等细胞外成分所介导。根 据本发明，分别利用B16细胞的培养液、B16细胞碎片以及B16活细胞处 理DCs，然后通过流式细胞术检测DCs成熟及其表面辅助刺激分子表达 的改变，其中包括CDllc、 MHC I、 MHC II、 CD40、 CD80、 CD86。结果 表明，B16细胞培养液显著抑制DC细胞CD11、 MHCI、 CD40、 CD80和CD86 的表达。B16活细胞具有与B16细胞培养液类似的调节作用，而且作用 相对更强。B16死细胞;卒片作为肿瘤抗原，显著上调MHC 1I分子和CD40 的表达，抑制CD80和CD86的表达。说明B16黑色素瘤细胞抑制DC成熟， 下调DCs辅助刺激分子的表达，B16所致免疫耐受微环境可能主要是B16 黑色素瘤细胞产生至细胞外的物质所介导的。本发明研究了黑色素瘤细胞培养液、死细胞碎片和活的活细胞对 DCs细胞TLR2和TLR4的调节作用。流式细胞术;f企测结果表明，LPS可上 调DCs表面TLR2表达，对TLR4表达没有显著调节作用。B16黑色素瘤细 胞培养液和活的B16细胞均可显著抑制TLR2表达，对TLR4表达没有显著 调节作用。而B16黑色素瘤的死细胞碎片显著上调TLR4表达，对TLR2表 达没有显著调节作用。本发明的研究表明B16黑色素瘤细胞有TLRs表达，用抗TLR2抗
体体外阻断B16细胞的TLR2信号传导通道，可显著降低B16细胞的转 移能力，减少黑色素瘤转移灶的形成和数量。我们的研究结果还表明，抗TLR2抗体通过调节肺组织局部免疫微: 环境向TH1方向发展，抑制肺组织,P-2的表达和活性，显著降低B16 黑色素瘤细胞的转移；但抗TLR4抗体对肿瘤细胞转移没有显著的调节 作用。总之，抗TLR2抗体能抑制肺瘤，尤其是B16黑色素瘤的转移。
Sham,control:假手术组，对照组MOD:模型组BLM:博来霉素组Anti-IgG:抗IgG抗体组Anti-TLR2:抗TLR2抗体组Anti-TLR4:抗TLR4抗体组TLR2+BLM:抗TLR2抗体与博来霉素合用组TLR2;B16:抗TLR2抗体组图1.阻断TLR2信号通道抑制B16黑色素瘤细胞的转移，而阻断TLR4信号通道对B16细胞转移没有显著调节作用。图l-a,所示为代表性小鼠肺脏图片(n=15)。图l-b,所示为小鼠肺脏转移B16黑色素瘤转移灶的数目统计图。图l-c,所示为小鼠肺脏指数统计图。*; <0.05， **p<0.01， ***p<0.001与模型组相比。腳/ <0.001与对照 (sham)组相比。图2.阻断TLR2信号抑制B16黑色素瘤小鼠肺脏DC成熟、TLR2表达以及调节性T细胞反应。图2-A，抑制TLR2活性显著降低B16黑色素瘤小鼠BALF中 CD4+CD25+ Tregs的数目,，
图2-B,抑制TLR2活性显著降低B16黑色素瘤小鼠BALF中 CD4+CD25'炎症细胞的数目。图2-C，抑制TLR2活性显著降低B16黑色素瘤小鼠BALF中TLR2 表达。图2-D，抑制TLR2活性显著降低B16黑色素瘤小鼠BALF中CDllc表达。0.001，与假手术组相比；，< 0.01, #，< 0.001，与模型组相比。图3. B16黑色素瘤细胞中TLRs的表达情况。图3-A， TLR2特异性表达于B16黑色素细胞。图3-B， TLR4特异性表达于B16黑色素瘤细胞。图3-C， Western Blot检测表明B16黑色素瘤细胞表达TLR2和TLR4。图中所示为三次独立实验中具有代表性WestemBlot图。图3-D, TLRs家族成员在B16黑色素瘤细胞中的表达概况。。图中所示为三次独立实验中具有代表性的琼脂糖凝胶图。图4. B16黑色素瘤细胞抑制DC成熟，下调DCs辅助刺激分子的表达。图4-A,CDllc的表达。图4-B，MHCI1的表达。图4-C，MHCI的表达。图4-D,CD40的表达。图4-E,CD80的表达。图4-F,CD86的表达。》<0.05， "P<0.01， 0.001与对照组相比。图5. B16黑色素瘤细胞培养液、死细胞碎片和活的活细胞对DCs细胞TLR2和TLR4表达的调节作用。*尸<0.05， **尸<0.01， 0.001与对照组相比。图5-A双色流式细胞术检测DCsTLR2和TLR4表达的代表性图；图5-B B16黑色素瘤细胞培养液、死细胞碎片和活的活细胞对DCs
表面TLR2表达的影响；图5-C B16黑色素瘤细胞培养液、死细胞碎片和活的活细胞对DCs 表面TLR4表达的影响。
具体实施方式
以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。实施例材料和方法主要试剂和实验动物实验中所使用的Anti-TLR2抗体购自(R&B ); Anti-TLR4抗体购自 (BioLegend ); Ant i —IgG抗体购自(BioLegend);博莱霉素(Bleomycin) 购自日本化药抹式会社(批号450260)。Anti-TLR2抗体对B16肿瘤细胞肺转移实验中所使用的动物规格 为SPF级C57BL/6小鼠(雌性，4周，14~16g),购自北京维通利华实 验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2002-0003。动物饲养于 中国医学科学院药物研究所实验动物中心，恒温恒湿，自由饮食。B16肺瘤转移模型制备雌性C57BL/6 (周龄4-6周)小鼠。实验当天收集B16肿瘤细胞， 过100目筛后形成单细胞悬液，记数后调成5 x 107ml浓度。按照250 ul体积分装到无菌Eppendorf管中。动物经尾静脉注射适量B16细胞 (1 x 107200ul/只)完成模型制备。假手术组尾静脉注射等量PBS緩 冲液。实验期间按照体重以0. lml/10g标准给药，同时记录体重，至 第14天结束实验。实验分组设计如下实验共分为对照组(Sham)、模型组(Mod)给予等溶剂量的溶剂；博来霉素组(BLM )按照6mg/kg剂量隔日给药；抗IgG抗体组、抗TLIU抗 体组、抗TLR4抗体组，在尾静脉注射B16细胞前1天按照200 g/kg剂量 给予抗体，在尾静脉注射B16细胞后3天按照10Q g/kg剂量给予抗体； 抗TLR2抗体与博来霉素合用组，抗体和博来霉素的给药时间方案同前， 剂量降至原来的一半；抗TLR2抗体组2，尾静脉注射的B16细胞体外经 抗小鼠TLR2抗体处理4小时后，计数后按照l x 107200ul/只尾静脉注 射。以上各组均在第14天结束实验。表2.抗TLR2抗体对B16肺转移模型作用的实验设计组别及代号剂量及给药方案溶剂假手术组(11=12)等量溶剂PBS模型组(n-12)MOD等量溶剂PBS博来霉素组(nH2)BLM6mg/Kg，i.p.造模后隔日给药至第14天PBS抗lgG抗体组(n-12)Anti-IgG100-200 g/kg,i.■ VPBS在用B16细胞造模前1天抗TLR2抗体组Anti-TLR2100-200 g/kg,i.v尾静脉注射抗体200PBS(n-l2)g/kg;造模后第3天尾抗TLR4抗体组Anti-TLR4100-200 g/kg,i.■、'静脉注射抗体IOO g/kgPBS(n=12)抗TLR2抗体与博来TLR2+BLM50-100 g/kg,i.v'.;抗体和博来霉素的给药时PBS霉素合用组(n-12)BLM 3mg/Kg间方案同上，剂量减半抗TLR2抗体组TLR2-'平B1"10 g/ml，体外培养的B16细胞加入抗TLR2PBS2(n=12)抗体4小时后，计数后按照lxl。5脂ul/只尾静脉注射B16细胞碎片的制备收集对数生长期B16细胞，离心，用无血清培养基调整细胞浓度为5 x 1(T细胞/ml。在液氮和室温反复冻融四次，显微镜下检查确定没有活的 B16细胞。0. 45nm滤膜过滤除菌，置-2(TC保存备用。B16细胞培养液的制备以5 x 104田胞/ml浓度把B16细胞接入直径为10cm的平皿中培养24 小时，收集培养液，0.45)am滤膜过滤，置-2(TC保存备用。B16细胞与DC混合培养按5 x 105细胞/011细胞浓度把DCs置于直径为6cm的平皿中培养。然 后按照体积比1: 3加入B16细胞培养液；按细胞终浓度5 x 1()5细胞/ml 分别加入B16细胞碎片和B16活细胞于平皿中，与DCs混合培养24小 时。收集DC,用FITC、 PE或PE-Cy5标记的抗CDllc、 MHC II分子、 MHCI分子、CD40、 CD80、 CD86、 TLR2和TLR4抗体染色，多色流式细 胞术检测和分析这些分子表达的改变。RT-PCR取适量B16细月包，THzol法(Invitrogen)提耳叉总RNA,溶于20-40 pl去DEPC水，测定OD260、 OD280,定量后使用M-MMLV逆转录酶按照 操作说明书完成逆转录。扩增B16肿瘤细胞TLRl-9的表达。Western Blot:取适量培养细胞或组织匀浆液，加入裂解緩冲液(含有1。/。NP-40、 0. 5。/。脱氧胆酸钠、0.1% SDS以及1(mol/L的Aprotinin、 Trypsin inhibitor, PMSF、 Leupeptins和DTT),振荡混匀，；水上》文置30min， 间或振荡[26]; 4(C、 12000 rpm，离心15min。取上清，Branfold法 测定蛋白浓度，调节蛋白浓度至相同，分装， 一部分用于SDS电泳， 其余部分置于-80(C保存；ECL和ECL-Plus显色系统(Amersham Biosciences)显色。Western-blot印迹分析软件(Gel-pro 3. 2)，测出 各条带的光密度值，分析多种蛋白质，包括TLR2和TLR4等的表达。流式细胞术收集细胞，PBS洗两次后，加入1% BSA/PBS封闭40min;加入0. 5ml 左右PBS, 1500rpm离心5分钟，弃上清；加入2-3种适量CD4+、 CD25+、 CDllc+、 CD40、 CD80、 CD86、 MHCII抗体避光孵育1小时；PBS洗两次； 加入500ul固定液固定细胞；100目筛网过滤后流式细胞仪检测。免疫荧光显微照相将对数生长期B16细胞置于放有多聚赖氨酸处理盖波片的平亚中
培养，用抗羊抗小鼠TLR2和羊抗小鼠TLR4抗体和同型对照羊抗小鼠IgG 抗体分别处理，24小时后取出已经长有B16细胞的盖片，以兔抗小鼠 IgG、 TLR2和TLR4的抗体及相应二抗分别标记B16细胞，荧光显微镜照 相，以检测B16细胞TLR2和TLR4的表达以及抗TLR2、 TLR4抗体以及抗IgG 抗体分别阻断TLR2、 TLR4和IgG后对TLR2和TLR4表达的影响。14天取小鼠肺脏，照相，计数黑色素瘤转移灶的数目。结果以平均 值土标准差(SD)表示(n=10)(见图1)。肺脏指数的计算公式如下 肺脏指数-小鼠肺脏重量(mg) /小鼠体重(g)。通过流式细胞术检测博莱霉素所致肺纤维化小鼠气管灌注液中浸 润的T调节细胞、TLR2+细胞和CDllc+树突状细胞的改变。(见图2)。分别用羊抗小鼠TLR:!和TLR4抗体以及同型对照抗IgG抗体提前4 小时封闭B16细胞。TLR2表达用兔抗小鼠TLR2抗体和FITC标记的抗 IgG进行染色；TLR4表达用兔抗小鼠TLR4抗体和TRITC标记的抗IgG 进行染色。荧光显微镜照相，分析B16细胞表面TLR2和TLR4的表达。 通过Western Blot 4企测B16黑色素瘤细胞表达TLR2和TLR4。通过 RT-PCR方法4企测TLR家族成员中TLR1-TLR9亚型在B16黑色素瘤细胞 中的表达概况(见图3)。分别用B16黑色素瘤细胞培养液、死细胞碎片和活的活细胞分别 处理未成熟DCs,培养2小时后加入LPS。 24小时后收集DCs， PBS清 洗，FITC、 PE或PE-cy5标记的抗小鼠CDllc、 MHC II、 MHC I、 CD40、 CD80和CD86抗体染色。用多通道流式细胞仪才企测和分析CDllc、 MHC 、 固C 1、CD40、CD80和CD86的表达。结果以平均百分率(％) 土标准差(SD) 表示。实验至少重复三次。(见图4)培养24小时后收集DCs ， PBS清洗，分别用FITC标记的抗小鼠TLR2 抗体和PE标记的抗小鼠TLR4抗体染色，双色流式细胞术^r测和分析 TLR2和TLR4的表达。结果以平均百分率(%) ±标准差(SD )表示。实 验至少重复三次。(见图5)统计分析实验结果用均值土标准误(X±SE )表示，经参数或者非参数方差
斗全—睑，经比4交p<0. 05 i^为有统计学差异，p<0. 01 ^人为4交显著的统计学 差异。结果1. 阻断TLR2信号通道抑制B16黑色素瘤细胞的转移由图1可见，未经免疫的小鼠接种B16后，肺部表面的转移结节 数为215 土 14 (图1A和B),解剖时可见双肺布满黑色转移灶，肺脏指 数显著增加，由为对照组的7. 8 土 0. 1增加为16. 2 土 2. 0 (图1C )。 给予小鼠博莱霉素显著减少B16黑色素瘤转移，降低肺脏指数，其肺 脏黑色素瘤转移结节凄t减为85 土 4 (图1A和B)。单独给予抗TLR2抗 体阻断TLR2活性，也可显著减少肺转移灶的数目(/K0. 001)(图1C), 肺部的转移灶仅散在分布，转移的肿瘤节节数减少为106 土 21。另外， 与模型组或抗IgG组相比，TLR2抗体组小鼠的肺脏指数均显著降低， 降为13. 4 土 0. 98。抗TLR4抗体小鼠肺部的转移灶仍然较多，结节数 目为194 土 42,与模型组或抗IgG组相比没有显著差异(/7 >0. 05)(图 1A和B)。与^t型组相比 抗TLR4抗体组小鼠肺脏指^t没有显著变化 (图1C)。为了探讨博莱霉素与抗TLR2抗体是否有协同作用，以减少博莱霉 素的剂量，降低其副作用，本发明把博莱霉素与抗TLR2抗体的剂量均 减半使用。结果表明，半数剂量的博莱霉素和抗TLR2抗体合用即可达 到全量博莱霉素的治疗效果。另外，本发明还检测了体外用抗TLR2中和性抗体处理的B16细胞 同样经过静脉注射到C57BL/J小鼠体内之后B16黑色素瘤的转移情况。 令人兴奋的是，体外阻断TLR2受体表达后，B16黑色素瘤细胞的侵袭 能力显著下降(；KO. 001 )，小鼠肺脏黑色素瘤转移灶数目仅为31 土 8 (图1A和B ),肺脏指数降为8, 21 土 0. 17 ( /K0. 001 )(图1C )。2. 阻断TLR2信号抑制B16黑色素瘤小鼠肺脏DC成熟、TLR2表达以 及调节性T细胞反应。本发明还研究了 TLR2和TLR4活性被阻断后肺脏肿瘤周围环境中 DCs、 Treg细胞以及其它炎症T细胞的浸润情况。根据本发明，用流式
细胞术检测了小鼠气管灌注液中DCs、 CD4+CD25+Treg细胞、TLR2 +细胞 和T调节细胞以外的其它T辅助细胞(CD4+CD25T细胞)的数量和比例。 结果表明，与对照组相比，；漠型组小鼠气管灌注液中CD4+CD25+Treg细 胞、CD4+CD25T细胞、TLR2+细胞和CDllc+DCs均显著增加(图2 A-D )。 抗TLR2抗体显著减少气管灌注液中的CD4+CD25+Treg细胞、TLR2+细胞 和CDllc+DCs (图2A、 C和D)。博莱霉素可显著减少气管灌注液中的 CD4+CD25+Treg细胞和CDllc+DCs (图2 A和D )。抗TLR4抗体气管灌注 液中这些细胞的数量和比例没有显著的调节作用。3, B16黑色素瘤细胞中TLRs的表达情况. 抗TLR2抗体可显著抑制B16黑色素瘤细胞转移，我们上述的证据已经证明了其"土壤，，发生的改变。因此，我们想知道B16黑色素瘤本身 作为"种子，，是否表达TLR2以及其它TLR。为此我们首先通过RT-PCR技 术检测了B16细胞中TLR1-TLR9的表达情况。结果表明，TLR1-TLR7均有 表达(图3D)。为进一步确定TLRs，尤其是与本文中前期工作相关的 TLR2和TLR4在B16细胞中的表达，我们分别用免疫荧光和Westen Blot 两种方法。如图3A和B所示，TLR2和TLR4在B16细月包中均有表达，TLR2 和TLIU被阻断后，其焚光显著下降，而lgG处理组TLR2和TLR4均正常表 达，提示TLR2和TLR4特异性表达于B16黑色素瘤细胞(图3 A和B )。图 3C进一步确证TLM和TLIM在B16细胞中的表达，而且LPS能够增加其表 达。4. B16黑色素瘤细胞抑制DC成熟，下调DCs辅助刺激分子的表达。 本发明还研究了 B16对DC成熟和功能的调节作用，以及这种作用是B16细胞本身的成分还是B16分泌的细胞因于等细胞外成分所介导。 本发明分别利用B16细胞的培养液、B16细胞碎片以及B16活细胞处理 DCs,然后通过流式细胞术检测DCs成熟及其表面辅助刺激分子表达的 改变，其中包括CDllc、 MHCI、 MHC II、 CD40、 C则、CD86。结果表 明，B16细胞培养液显著抑制DC细胞CDll、 MHCI、 CD40、 CD80和CD86 的表达(图4A, C-F )。 B16活细胞具有与B16细胞培养液类似的调节作 用，而且作用相对更强。B16死细胞碎片作为肿瘤抗原，显著上调MHC II分子和CD40的表达，抑制CD80和CD86的表达(图B， D-F )。这表
明，B16所致免疫耐受微环境可能主要是B16黑色素瘤细胞产生至细胞 外的物质所介导的。5. B16黑色素瘤细胞培养液、死细胞碎片和活的B16细胞对DCs细胞 TLR2和TLR4表达的调节作用。本发明研究了黑色素瘤细胞培养液、死细胞碎片和活的活细胞对 DCs细胞TLR2和TLR4的调节作用。流式细胞术对TLR2和TLR4的4全测结果 表明，LPS可上调DCs表面TLR2表达，对TLR4表达没有显著调节作用。 B16黑色素瘤细胞培养液和活的B16细胞均可显著抑制TLR2表达 (/K0. OOl和,O. 01),对TLR4表达没有显著调节作用(图5A-C)。而B16 黑色素瘤的死细胞碎片显著上调TLR4表达(001 )，对TLR2表达没 有显著调节作用(图5A-C)。结论首先，我们首次发现B16黑色素瘤细胞有TLRs表达，用抗TLR2 抗体体外阻断B16细胞的TLR2信号传导通道，可显著降低B16细胞的 转移能力，减少黑色素瘤转移灶的形成和数量，提示TLR在胂瘤转移 中起关键作用。本发明的研究结果还表明，抗TLR2抗体通过调节肺组织局部免疫 微环境向TH1方向发展，抑制肺组织MMP-2的表达和活性，显著降低 B16黑色素瘤细胞的转移；但抗TLR4抗体对肿瘤细胞转移没有显著的 调节作用。
权利要求
1、抗TLR2抗体在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
2、 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤是B16黑 色素瘤的。
3、 一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包括博莱霉素和抗TLR2抗体。
4、 一种药盒，其特征在于，包括博莱霉素和抗TLR2抗体。
全文摘要
本发明公开了抗TLR2抗体能抑制肿瘤，尤其是B16黑色素瘤的转移。给予抗TLR2抗体阻断TLR2活性，也可显著减少肺转移灶的数目，转移的肿瘤节节数大为减少，显著降低肺脏指数。同时发现博莱霉素与抗TLR2抗体具有协同作用。阻断TLR2信号抑制B16黑色素瘤小鼠肺脏DC成熟、TLR2表达以及调节性T细胞反应。下调DCs辅助刺激分子的表达，主要是B16黑色素瘤细胞产生至细胞外的物质所介导的。抗TLR2抗体通过调节肺组织局部免疫微环境向TH1方向发展，抑制肺组织MMP-2的表达和活性，显著降低B16黑色素瘤细胞的转移；但抗TLR4抗体对肿瘤细胞转移没有显著的调节作用。
文档编号A61K39/395GK101147803SQ20061011327
公开日2008年3月26日 申请日期2006年9月21日 优先权日2006年9月21日
发明者牧 冰, 刘含智, 吕晓希, 冰 崔, 李平平, 杨红振, 王晓星, 胡卓伟, 宾 苑, 蔡文锋, 谢文杰, 金文辛, 闫慧敏, 陈志蓉 申请人:中国医学科学院药物研究所