专利名称：：抗Toll样受体2抗体抗肺纤维化的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗Toll样受体2抗体在预防和治疗肺纤维化中的新用途，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：Toll样受体(Tolllikereceptors,TLRs)是新近发现的天然免疫受体，它们可以通过广泛地特异性地识别病原微生物，偶联信号传导途径，并激活天然免疫细胞，最终导致一系列的免疫炎症反应。TLRs不仅能激活天然免疫，而且也为激活获得性免疫提供共刺激信号。TLRs在天然免疫与获得性免疫中起重要作用，是两者之间的桥梁。通常，TLR4在急性炎症中起重要作用，而TLR2在慢性炎症中发挥关键作用。博莱霉素(Bleomycin,BLM)是从轮状链霉菌分离而来的长效抗肿瘤药，主要用于治疗淋巴瘤、睾丸瘤和鳞片状细胞瘤等(Yamamoto，2005#28}。博莱霉素具有显著的抗肿瘤作用，但其也具有明显的副作用，包括肺部炎症、肺纤维化和骨髓抑制，这些副作用大大限制了其在临床上的使用。肺纤维化也是肿瘤病人在药物治疗过程中经常出现的副作用。临床上经博莱霉素治疗肿瘤病人肺纤维化的发病率为46%，3%的病人最终死亡。
发明内容针对现有技术中存在的技术问题，尤其是肿瘤病人在药物治疗过程中经常出现的肺纤维化副作用，本发明提供了一种新的技术方案，即利用抗Toll样受体2抗体用于预防和治疗肺纤维化。本发明通过系统的研究发现对于C57BL/6小鼠经气管注射博来霉素(5U/Kg)造成肺纤维化的动物模型，在造模前一天和造模后3、7、11、15和19天分别静脉注射抗TLR2抗体和同型对照抗IgG抗体。通过病理组织学以及病理影像学分别分析和评价博莱霉素灌注小鼠肺部炎症、损伤和纤维化的改变，发现阻断TLR2信号能显著降低博莱霉素灌注小鼠的死亡率；阻断TLR2信号通道显著降低博莱霉素诱导的肺部炎症和损伤，减少博莱霉素所致肺纤维化和肺部羟脯氨酸的含量，并能减少小鼠肺灌注液中CDllc+DCs的浸润和TLR2+的表达。实验结果表明，抗TLR2抗体能抑制博莱霉素所致肺纤维化，大大降低其死亡率，减少博莱霉素的副作用，为病人贏得宝贵的治疗时间。Sham:々i手术组MOD:模型组algG:抗IgG抗体组aTLR2:抗TLR2抗体组aTLR4:抗TLR4抗体组n=10-14。》<0.05,"P〈0.01与假手术组相比；##尸<0.01与模型组相比。图1.阻断TLR2信号通道减少博莱霉素诱导的急性肺损伤、肺部炎症和纤维化。图1-A小鼠的生存率。图1-B小鼠肺部炎症指数。图1-C小鼠肺HE染色和Masson染色。图1-D小鼠肺纤维化。图1-E小鼠肺部羟脯氨酸的含量。图1-F小鼠肺灌注液中CDllc+DCs细胞的浸润。图1-G小鼠肺灌注液中TLR2+细胞的浸润。具体实施方式以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。实施例材料和方法主要试剂和实验动物实验中所使用的Anti-TLR2抗体购自(R&B);Anti-TLR4抗体购自(BioLegend);Anti—IgG抗体购自(BioLegend);博莱霉素(Bleomycin)购自日本化药抹式会社(批号450260)。Anti-TLR2抗体对博莱霉素所致肺纤维化实验中所使用的动物规格为SPF级C57BL/6小鼠(雄性，6~8周，16~18g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2002-0003。动物饲养于中国医学科学院药物研究所实验动物中心，恒温恒湿，自由饮食。肺纤维化动物模型制备雄性C57BL/6(周龄6-8周)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥钠(45mg/kg,i.p.)麻醉，气管内注射博莱霉素(5U/kg)。具体方案如下以尽量小的创伤切开颈部皮肤，在弯头眼科镊的协助下，暴露气管，使用微量进样器穿刺气管，向气管内注入约50ul适量博来霉素，迅速地旋转并直立5分钟，以便使博来霉素均匀地进入左右肺叶。整个操作在约60度左右的手术操作台进行。假手术组气管内注射等量的注射用生理盐水。实验期间按照体重以0.1ml/10g标准给药，同时记录体重及动物的死亡率，至第28天结束实验。实验分组设计如下实验共分为对照组(Sham)、模型组(Mod)、抗IgG抗体组、抗TLR2抗体组、抗TLR4抗体组。在博来霉素造模的第-1、3、7、11、15、19、23天按照0.1ml/10g分别给予相应的溶剂或抗体。至第28天结束实验。详细的分组设计参见表l。表1.抗TLR2抗体对博莱霉素所致肺纤维化作用实验设计<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>博来審素所致肺纤维化实验病理形态学分析及Masson特殊染色病理影像学分析取动物右侧下叶肺组织，4%多聚曱醛固定后石蜡包埋。在包埋肺组织的蜡块最大横截面切片，苏木素/伊红(HE)染色观察炎症病理改变，Masson染色观察纤维化状况，并根据Masson特殊染色的结果由第三方单位(中国疾病预防控制中心辐射安全所北京康宝科技服务部)进行病理分级观察。肺组织炎症分级标准(0-5):0,正常组织；1，^L小的炎症改变；2,轻微到中等程度的炎症改变，没有明显的肺组织结构的破坏；3,中等程度的炎症损伤(肺泡隔膜增厚)；4，中等程度到严重的炎症损伤，形成组织团块，或者局限性肺炎区域破坏肺组织正常结构；5,严重的炎症损伤，局部区域肺组织结构严重破坏引起管腔闭合等。肺组织纤维化计分标准(0-8):0,正常组织；1，肺泡壁或者支气管壁轻度纤维性增厚；3，肺泡壁或者支气管壁中等程度增厚，没有明显对肺组织结构造成损伤；5，逐渐明显的纤维化，对肺组织结构形成明显的损伤，形成纤维化带或者纤维化聚集区；7，严重的破坏肺组织，形成大面积的纤维化区域；8，纤维化造成区域性完全破坏或者管腔闭合；在1,3,5,7级别，如果出现非常难以区分的中间状态，则计分2，4，6。应用高清晰素彩色病理图文分析系统SpotAdvanced3.0获得高清晰的Masson特殊染色的病理图片(200倍放大)。使用Image-ProPlus5.1测量出每个视野Masson染色后的胶原的着色面积、视野下肺组织面积。以着色面积、着色面积与视野肺组织面积比表示该胶原的相对含量。每个标本随机取IO个视野，取均值代表一个动物胶原组织在肺组织内的相对含量和表达强度通过非参数方差分析比较各组"视野下胶原绝对面积"以及"胶原相对面积"。羟脯氨酸测定羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在，因此通过羟脯氨酸检测胶原蛋白的含量。检测动物左肺全叶羟脯氨酸的含量，评价肺纤维化的情况。具体方法如下取动物左侧全部肺叶，记录湿重，生理盐水超声匀浆制备成10%的组织勻浆，取约150ul的匀浆上清液，加500ul碱水解液，涡旋混匀后，120度0.1Kpa条件下碱水解法处理40min(方法参照南京建成生物工程技术有限公司试剂盒说明书，略有改动)，调pH值后定容，活性炭处理后，离心取上清。按照建成试剂盒说明书(氯胺T法)进行羟脯氨酸测定。统计分析实验結果用均值士标准误(i±SE)表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p〈0.05认为有统计学差异，p<0.01认为较显著的统计学差异。结果阻断TLR2信号通道减少博莱霉素诱导的急性肺损伤、肺部炎症和纤维化。我们采用C57BL/6小鼠经气管注射博来霉素(5U/Kg)造成肺纤维化动物模型，检测抗TLR2和TLR4中和性抗体对博莱霉素所致肺部炎症和肺纤维化的调节作用。结果表明，由于肺部炎症和损伤较重，模型组动物的生存率在50%左右，给予抗TLR2抗体阻断TLR2活性，可非常显著地增加动物的生存率(/K0.01);阻断TLR4活性对小鼠生存率没有显著影响(/>0.05)(图5A)。与模型组相比，TLR2信号通道被阻断后小鼠肺部炎症细胞浸润显著减少，炎症病理指数显著降低(/<0.05),而阻断TLR4信号通道有加重博莱霉素所致肺部炎症的趋势(图1B-C)。与假手术组相比，；漢型組动物肺部胶原表达、纤维化病理指数以及单个肺叶的羟脯氨酸含量均显著增加；抗TLR2抗处理组动物胶原沉积、纤维化病理指数和羟脯氨酸含量均显著降低，而抗TLR4抗体增加动物肺脏的胶原沉积、纤维化病理指数和羟脯氨酸含量(/K0.05)(图1C-E)。为检测肺脏周围环境中的免疫状态的改变，我们检测了小鼠肺灌注液中TLR2表达和CDllc+DCs细胞的浸润情况。结果表明，与假手术组相比，模型组动物肺部浸润的CDllc+DCs显著增多，TLR2表达显著增加；抗TLR2抗体显著减少浸润的CDllc+DCs，下调TLR2表达(图1F-G)。结论本发明釆用抗TLR2抗体阻断TLR2信号传导通道，可显著抑制博莱霉素所致肺纤维化，减少肺部炎症，显著降低肺纤维化小鼠死亡率。用半数剂量的博莱霉素与抗TLR2抗体合用可获得与全量博莱霉素同样的治疗效果，但显著减少博来霉素的副作用。权利要求1.抗Toll样受体2抗体在制备预防和/或治疗肺纤维化药物中的应用。全文摘要本发明公开了抗Toll样受体2抗体能显著降低博莱霉素灌注小鼠的死亡率；阻断TLR2信号通道显著降低博莱霉素诱导的肺部炎症和损伤，减少博莱霉素所致肺纤维化和肺部羟脯氨酸的含量，并能减少小鼠肺灌注液中CD11c+DCs的浸润和TLR2+的表达。说明抗Toll样受体2抗体能用于制备预防和/或治疗肺纤维化药物。文档编号A61K39/395GK101147804SQ200610113278公开日2008年3月26日申请日期2006年9月21日优先权日2006年9月21日发明者牧冰,刘含智,吕晓希,冰崔,李平平,杨红振,王晓星,胡卓伟,宾苑,蔡文锋,谢文杰,金文辛,闫慧敏,陈志蓉申请人:中国医学科学院药物研究所