磷脂-flavagline缀合物及将其用于靶向癌症治疗的方法与流程

磷脂-flavagline缀合物及将其用于靶向癌症治疗的方法
[0001]
相关申请的交叉引用
[0002]
本申请要求于2018年4月10日提交的美国临时专利申请第62/655,659号的优先权，其以其整体通过引用并入本文。
技术领域
[0003]
本公开涉及磷脂-flavagline缀合物和靶向癌症疗法。


背景技术：

[0004]
临床使用的大多数抗癌药物的效用由于其对所有增殖细胞的毒性和/或无法对所有肿瘤细胞发挥其作用而受到限制。具有独特作用机制旨在提供增强的靶向性的新药剂继续被开发，但是，这些化合物中的许多仍然缺乏绝对的肿瘤选择性，并且由于脱靶效应，在其治疗使用方面仍然受到限制。抗体药物缀合物(adc)已被设计为与肿瘤细胞表面上的特定表位结合，并且为了减少相关毒性已提供靶向肿瘤细胞的替代方法。尽管具有高选择性，但非常少的抗体药物缀合物是在治疗上有用的，因为它们仅实现了些许的细胞摄取和有限的细胞杀伤活性。需要更有效的肿瘤靶向平台。


技术实现要素：

[0005]
在一个方面，本公开涉及根据式i的磷脂醚(ple)或其盐：
[0006][0007]
其中x是氢、甲基或羧基取代的苯基。在一些实施方式中，所述ple选自以下：
[0008][0009]
在一些实施方案中，ple还包括与其连接的可检测部分。
[0010]
在另一方面，本公开涉及包含本文详述的ple和载体的组合物。
[0011]
本公开的另一方面提供了选自以下的化合物：
[0012][0013]
本公开的另一方面提供了包含这些化合物中的至少一种和载体的组合物。
[0014]
本公开的另一方面提供了根据式ii的缀合物或其盐：
[0015][0016]
其中x是或亚甲基，或键；y是包含二硫键(disulfide)的连接基；z是flavagline抗癌药。在一些实施方式中，所述flavagline抗癌药包含flv-1、flv-3、其衍生物或类似物或其组合。在一些实施方式中，所述连接基包含以下：
[0017][0018]
在一些实施方式中，所述缀合物选自以下：
[0019][0020]
本公开的另一方面提供了一种组合物，其包括如本文详述的缀合物和药学上可接受的载体。
[0021]
本公开的另一方面提供一种治疗受试者癌症的方法，该方法包括向受试者施用如本文详述的缀合物。
[0022]
本公开的另一方面提供一种将药物靶向受试者中的肿瘤或癌细胞的方法，该方法包括向受试者施用如本文详述的缀合物。
[0023]
在一些实施方式中，flavagline抗癌药定位于或行进至肿瘤或癌细胞的细胞质或细胞器。在一些实施方式中，所述缀合物或flavagline抗癌药对受试者中的癌细胞是选择性的。在一些实施方式中，缀合物或flavagline抗癌药被引入肿瘤或癌细胞比被引入健康细胞多至少约两倍。一些实施方式中，所述癌症选自黑素瘤、脑癌、肺癌、肾上腺癌、肝癌、肾癌(renal cancer或kidney cancer)、胰腺癌、食道癌、胃癌(gastric cancer或stomach cancer)、结肠癌、结直肠癌、肛门癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫颈癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、血液癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、胚细胞瘤、鳞状细胞癌和腺癌。在一些实施方式中，受试者是人类。
[0024]
本公开提供根据以下详细描述和附图将是明显的其他方面和实施方式。
附图说明
[0025]
图1a、图1b、图1c、图1d、图1e为标记了脂质筏的肿瘤细胞的图像。与正常细胞相比，肿瘤细胞具有更高浓度的脂质筏。图1f是具有clr 1501(化合物(1))的正常成纤维细胞和caki-2肿瘤细胞的图像。clr 1501高度定位于caki-2细胞，而最低限度地定位于正常成纤维细胞。图1g是对照a549细胞的图像，图1h是用甲基b-环糊精处理以破坏脂质筏的a549细胞的图像。图1g和图1h二者中的细胞都用clr 1501(化合物(1))孵育，并且a549细胞中的大多数脂质筏的破坏导致clr 1501(化合物(1))的摄取减少60％。图1i、图1j和图1k是用clr 1501(化合物(1))孵育并对内质网(er)染色的pc3细胞的图像。clr 1501(化合物(1))在恶性细胞中与er共定位，但在正常细胞中没有与er共定位(未示出)。图1l、图1m和图1n是
用clr 1501(化合物(1))孵育并对细胞核和线粒体染色的pc3细胞的图像。clr 1501(化合物(1))与线粒体共定位。
[0026]
图2是注射了clr 1502(化合物(2))的带有结直肠(hct-116)肿瘤的小鼠的图像，显示对肿瘤的定位。
[0027]
图3是在a549(人肺腺癌)细胞或正常人真皮成纤维细胞(nhdf)中，与缀合至ple的细胞毒性化合物(clr 1865，化合物(8))相比，对于细胞毒性化合物(flv1)而言细胞毒性对浓度的曲线图。
[0028]
图4是在a375(人黑素瘤)细胞和hek293(人胚胎肾)细胞中，对于ple缀合物clr 1852(化合物(9))的摄取而言倍数增加对时间的图。
[0029]
图5是小鼠中的乳腺癌模型的图像，显示clr 1502(化合物(2))的体内摄取。
[0030]
图6是骨髓瘤细胞系的图像，显示clr 1501(化合物(1))的摄取。
[0031]
图7是癌症干细胞、正常脑组织和正常干细胞的图像，显示clr 1501(化合物(1))特异性摄取到癌细胞中。
[0032]
图8是在a549(人肺腺癌)细胞和正常人真皮成纤维细胞(nhdf)中，与flv3相比，对于clr 1852(化合物(9))而言细胞毒性百分比对浓度的曲线图。
[0033]
图9是在hct 116肿瘤模型中，与clr 1852(化合物(9))相比，对于载体而言肿瘤体积对时间的曲线图。
[0034]
图10是在hct 116肿瘤模型中，与clr 1852(化合物(9))相比，对于载体而言体重对时间的曲线图。
[0035]
图11是在a375(人黑素瘤)细胞系和a549(人肺腺癌)细胞系中，对于胞质溶胶中检测的flv3而言浓度对时间的图(归一化至胞质溶胶的体积)。
具体实施方式
[0036]
发明详述
[0037]
本文描述的是磷脂化合物和磷脂-flavagline缀合物。基于含有比正常组织更高浓度的天然存在的醚脂质的众多动物肿瘤和人类肿瘤，开发了磷脂醚(ple)分子。本文详述的ple分子可以用作肿瘤靶向平台，以选择性地将药物递送至肿瘤和癌细胞。
[0038]
如本文详述的，ple分子的组织分布在超过100种不同的肿瘤细胞(包括新鲜的人类肿瘤样品)中进行了检查。ple分子证实了与正常组织相比在肿瘤组织中摄取增加。ple分子可以通过连接基缀合至flavagline分子及其衍生物以形成磷脂-flavagline缀合物。
[0039]
1.定义
[0040]
除非另有定义，本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常地理解相同的含义。如有冲突，以本文件包括定义为准。以下描述了优选的方法和材料，但是与本文描述的那些相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用其全部并入本文。本文公开的材料、方法和实施例仅是说明性的，而无意于进行限制。
[0041]
如本文所使用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”、“含有”及其变体为旨在不排除其他行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或单词。除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“和”和“该”包括复数引用。本公开还预期“包含”本文提出的实施方
式或元素的其他实施方式、“由”和“基本上由”本文提出的实施方式或元素组成的其他实施方式，无论是否明确提出。
[0042]
对于本文数值范围的记载，明确地预期了这些数值范围之间的每个介于中间的具有相同的精确度的数。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，还预期了数字7和8；对于范围6.0-7.0，明确地预期了数6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
[0043]
如本文中所使用的术语“约”适用于一个或多个关注的值，指类似于陈述的参考值的值。在某些方面，术语“约”指一数值范围，其落入所述参考值任一方向的(比参考值大或比参考值小)20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内，除非另有说明或从上下文可以明显看出(除非其中这样的数会超过可能值的100％)。
[0044]
特定官能基团和化学术语的定义在下面更详细地描述。为了本公开的目的，根据元素周期表，cas版本，《化学和物理手册》(handbook of chemistry and physics)，第75版，内封面来识别化学元素，并通常如其中所描述的来定义特定的官能基团。另外，在有机化学(organic chemistry)，thomas sorrrell，大学科学书籍，索萨利托，1999；smith和march march的高级有机化学(smith and march march
′
s advanced organic chemistry)，第7版，john wiley&sons，inc.，纽约，2013；larock，综合有机转化(comprehensive organic transformations)，vch出版公司，纽约，1989；carruthers，有机合成的一些现代方法(some modern methods of organic synthesis)，第三版，剑桥大学出版社，剑桥，1987；中描述了有机化学的一般原理，以及特定的官能部分和反应性；其每一个的全部内容通过引用并入本文。
[0045]
本文所用的术语“烷氧基”(alkoxy或alkoxyl)指通过氧原子附加至母体分子部分的如本文定义的烷基。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。
[0046]
如本文所用的术语“烷基”指含有1至20个碳原子的直链或支链的饱和烃链。术语“较低级的烷基”或“c
1-6
烷基”指含有1至6个碳原子的直链或支链烃。术语“c
1-4
烷基”指含有1至4个碳原子的直链或支链烃。术语“c门烷基”指含有1至3个碳原子的直链或支链烃。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。
[0047]
如本文所用的术语“烯基”指含有2至20个碳原子和至少一个碳-碳双键的不饱和烃链。
[0048]
如本文所用的术语“炔基”指含有2至20个碳原子和至少一个碳-碳三键的不饱和烃链。
[0049]
如本文所用的术语“烷氧基烷基”指通过如本文所定义的亚烷基基团附加至母体分子部分的如本文所定义的烷氧基基团。
[0050]
如本文所用的术语“芳基烷基”指通过如本文所定义的亚烷基基团附加至母体分子部分的如本文所定义的芳基基团。
[0051]
如本文所用的术语“烷基氨基”指通过如本文所定义的氨基基团附加至母体分子部分的如本文所定义的至少一个烷基基团。
[0052]
如本文所用的术语“亚烷基”指衍生自1至10个碳原子例如2至5个碳原子的直链烃或支链烃的二价基团。亚烷基的代表性实例包括但不限于-ch2ch
2-、-ch2ch2ch
2-、-ch2ch2ch2ch
2-和-ch2ch2ch2ch2ch
2-。
[0053]
如本文所用的术语“酰胺”指-c(o)nr-或-nrc(o)-，其中r可以是氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、烯基或杂烷基。
[0054]
如本文所用的术语“氨基烷基”指通过如本文所定义的亚烷基基团附加至母体分子部分的如本文所定义的至少一个氨基基团。
[0055]
如本文所用的术语“氨基”指-nr
x
r
y
，其中r
x
和r
y
可以是氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、烯基或杂烷基。对于氨基烷基基团或其中氨基将两个其他部分附加在一起的任意其他部分的情形，氨基可以为-nr
x-，其中r
x
可以是氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、烯基或杂烷基。
[0056]
如本文所用的术语“芳基”指芳族基团，例如苯基基团或双环稠环系统。双环稠环系统的示例有附加至母体分子部分并稠合至如本文定义的环烷基基团、苯基基团、如本文所定义的杂芳基基团或如本文所定义的杂环基的苯基基团。芳基的代表性实例包括但不限于吲哚基、萘基、苯基、喹啉基和四氢喹啉基。“芳基烷基”指被芳基自由基取代的如本文定义的烷基。
[0057]“亚芳基”指具有两个单价自由基中心的如本文所定义的芳基，所述单价自由基中心通过从母体芳基的两个不同碳原子去除两个氢原子而得到。典型的亚芳基自由基包括但不限于亚苯基和亚萘基。“芳基亚烷基”指具有两个单价自由基中心的如本文所定义的芳基烷基，所述单价自由基中心通过从芳基自由基去除一个氢原子和从该基团的烷基自由基去除另一个氢而得到。
[0058]
如本文所用的术语“羧基”指羧酸或-cooh。
[0059]
术语“环烷基”指单价饱和烃环或双环基团。环烷基基团具有零个杂原子和零个双键。环烷基基团是单环的，或为稠合、螺环或桥连的双环系统。单环环烷基基团在环中含有3至10个碳原子，优选含有4至7个碳原子，更优选含有5至6个碳原子。双环环烷基基团在环中含有8至12个碳原子，优选含有9至10个碳原子。环烷基基团可以是取代的或未取代的。环烷基基团包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
[0060]
如本文所用的术语“环烯基”指包含至少一个碳-碳双键并且优选每个环具有5-10个碳原子的非芳族单环或多环的环系统。示例的单环环烯基环包括环戊烯基、环己烯基和环庚烯基。
[0061]
如本文所用的术语“环炔基”指包含至少一个碳-碳三键并且优选每个环具有5-10个碳原子或每个环具有多于10个碳原子的单环或多环的环系统。
[0062]
如本文所用的术语“卤代烷基”指如本文所定义的烷基基团，其中一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氢原子被卤素取代。卤代烷基的代表性实例包括但不限于2-氟乙基、2，2，2-三氟乙基、三氟甲基、二氟甲基、五氟乙基和三氟丙基(例如3，3，3-三氟丙基)。
[0063]
如本文所用的术语“卤素”或“卤代”是指cl、br、i或f。
[0064]
如本文所用的术语“杂烷基”指如本文所定义的烷基基团，其中烷基基团的至少一个碳被杂原子如氧、氮和硫取代。杂烷基的代表性实例包括但不限于烷基醚、仲烷基胺和叔
烷基胺、酰胺和烷基硫化物。
[0065]
如本文所用的术语“杂芳基”指包含至少一个独立地选自由n、o和s组成的组的杂原子的芳族单环的环系统或芳族二环的环系统。芳族单环的环是含有至少一个独立地选自由n、o和s组成的组的杂原子的五元环或六元环。五元芳族单环的环具有两个双键，六元六元芳族单环的环具有三个双键。二环杂芳基基团的示例有附加至母体分子部分并稠合至如本文所定义的单环环烷基基团、如本文所定义的单环芳基基团、如本文所定义的单环杂芳基基团或如本文所定义的单环杂环的单环杂芳基环。杂芳基的代表性实例包括但不限于吲哚基，吡啶基(包括吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基)，嘧啶基，吡嗪基，哒嗪基，吡唑基，吡咯基，苯并吡唑基，1，2，3-三唑基，1，3，4-噻二唑基，1，2，4-噻二唑基，1，3，4-噁二唑基，1，2，4-噁二唑基，咪唑基，噻唑基，异噻唑基，噻吩基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，苯并噁唑基，苯并噁二唑基，苯并噻吩基，苯并呋喃基，异苯并呋喃基，呋喃基，噁唑基，异噁唑基，嘌呤基，异吲哚基，喹喔啉基，吲唑基，喹唑啉基，1，2，4-三嗪基，1，3，5-三嗪基，异喹啉基，喹啉基，6，7-二氢-1，3-苯并噻唑基，咪唑并[1，2-a]吡啶基，萘啶基，吡啶并咪唑基，噻唑并[5，4-b]吡啶-2-基，噻唑并[5，4-d]嘧啶-2-基。
[0066]
本文所用的术语“杂环”或“杂环的”或“杂环基”指单环杂环、二环杂环(杂二环)或三环杂环。单环杂环是含有至少一个独立地选自由o、n和s组成的组的杂原子的三元环、四元环、五元环、六元环、七元环或八元环。三元环或四元环包含零个或一个双键，并且一个杂原子选自由o、n和s组成的组。五元环包含零个或一个双键并且一个、两个或三个杂原子选自由o、n和s组成的组。六元环包含零个、一个或两个双键并且一个、两个或三个杂原子选自由o、n和s组成的组。七元环和八元环包含零个、一个、两个或三个双键并且一个、两个或三个杂原子选自由o、n和s组成的组。单环杂环的代表性实例包括但不限于氮杂环丁烷基(azetidinyl)，氮杂环庚烷基(azepanyl)，氮丙啶基(aziridinyl)，二氮杂环庚烷基(diazepanyl)，1，3-二噁烷基(1，3-dioxanyl)，1，3-二氧戊环基(1，3-dioxolanyl)，1，3-二硫戊环基(1，3-ditbiolanyl)，1，3-二噻烷基(1，3-dithianyl)，咪唑啉基，咪唑烷基，异噻唑啉基，异噻唑烷基(isothiazolidinyl)，异噁唑啉基(isoxazolinyl)，异噁唑烷基(isoxazolidinyl)，吗啉基，噁二唑啉基(oxadiazolinyl)，噁二唑烷基(oxadiazolidinyl)，噁唑啉基，噁唑烷基，氧杂环丁烷基(oxetanyl)，哌嗪基，哌啶基，吡喃基，吡唑啉基，吡唑烷基，吡咯啉基，吡咯烷基，四氢呋喃基，四氢吡喃基，四氢吡啶基，四氢噻吩基，噻二唑啉基(thiadiazolinyl)，噻二唑啉烷基(thiadiazolidinyl)，1，2-噻嗪基(1，2-thiazinanyl)，1，3-噻嗪基(1，3-thiazinanyl)，噻唑啉基，噻唑烷基，硫代吗啉基，1，1-二氧代硫代吗啉基(硫代吗啉砜)，硫代吡喃基和三噻嗪基(trithianyl)。二环杂环是稠合至苯基基团的单环杂环，或稠合至单环环烷基的单环杂环，或稠合至单环环烯基的单环杂环，或稠合至单环杂环的单环杂环，或桥接的单环杂环环系统，其中环的两个非相邻原子通过1、2、3或4个碳原子的亚烷基桥连接或通过两个、三个或四个碳原子的亚烯基桥连接。二环杂环的代表性实例包括但不限于苯并吡喃基，苯并硫代吡喃基(benzothiopyranyl)，苯并二氢吡喃基，2，3-二氢苯并呋喃基，2，3-二氢苯并噻吩基，2，3-二氢异喹啉，氮杂双环[2.2.1]庚基(包括2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)，2，3-二氢-1h-吲哚基，异吲哚啉基，八氢环戊并[c]吡咯基(octahydrocyclopenta[c]pyrrolyl)，八氢吡咯并吡啶基和四氢异喹啉基。三环杂环的示例有稠合至苯基基团的二环杂环，或稠合至单环环烷基的二环杂环，或稠
合至单环环烯基的二环杂环，或稠合至单环杂环的二环杂环，或其中二环的环的两个非相邻原子通过1、2、3或4个碳原子的亚烷基桥连接或通过两个、三个或四个碳原子的亚烯基桥连接的二环杂环。三环杂环的实例包括但不限于八氢-2，5-环氧并环戊二烯(octahydro-2，5-epoxypentalene)，六氢-2h-2，5-亚甲基桥环戊并[b]呋喃(hexahydro-2h-2，5-methanocyclopenta[b]furan)，六氢-1h-1，4-亚甲基桥环戊并[c]呋喃(hexahydro-1h-1，4-methanocyclopenta[c]furan)，氮杂-金刚烷(1-氮杂三环)[3.3.1.1
3，7
]癸烷)，和氧杂-金刚烷(2-氧杂三环[3.3.1.1
3，7
]癸烷)。单环杂环、二环杂环和三环杂环通过环内包含的任何碳原子或任何氮原子连接至母体分子部分，并且可以是未取代的或取代的。
[0067]
如本文所用的术语“杂芳基烷基”指通过本文所定义的亚烷基基团附加至母体分子部分的如本文所定义的杂芳基基团。
[0068]
如本文所用的术语“杂环基烷基”指通过如本文所定义的亚烷基基团附加至母体分子部分的如本文所定义的杂环基团。
[0069]
如本文所用的术语“羟基”指-oh基团。
[0070]
如本文所用的术语“羟烷基”指通过如本文所定义的亚烷基基团附加至母体分子部分的至少一个-oh基团。
[0071]
在一些情况下，烃基取代基(例如，烷基或环烷基)中碳原子的数由前缀“c
x-y
-”表示，其中x是取代基中碳原子的最小数，y是取代基中碳原子的最大数。因此，例如，“c
1-3
烷基”指含有1-3个碳原子的烷基取代基。
[0072]
术语“取代的”指可以进一步被一个或多个非氢取代基基团取代的基团。取代基基团包括但不限于卤素，＝o(氧代)，＝s(硫代)，氰基，硝基，氟代烷基，烷氧基氟代烷基，氟代烷氧基，烷基，烯基，炔基，卤代烷基，卤代烷氧基，杂烷基，环烷基，环烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基烷基，杂芳基烷基，芳基烷基，羟基，羟烷基，烷氧基，烷氧基烷基，亚烷基，芳氧基，苯氧基，苄氧基，氨基，烷基氨基，酰基氨基，氨基烷基，芳基氨基，磺酰基氨基，亚磺酰基氨基，磺酰基，烷基磺酰基，芳基磺酰基，氨基磺酰基，亚磺酰基，-cooh，酮，酰胺，氨基甲酸酯和酰基。
[0073]
术语指单键或双键或三键
[0074]
对于本文描述的化合物，可以根据允许的原子和取代基的化合价选择其基团和取代基，使得该选择和取代导致稳定的化合物，例如，其不会通过例如重排、环化、消去等自发地进行转化。
[0075]
如本文所用的术语“施用”指通过任何合适的途径提供、接触和/或递送化合物或缀合物以实现期望的效果。这些化合物或缀合物可以以多种方式包括但不限于口服、眼、鼻、静脉内、局部、作为气雾剂、栓剂等并且可以组合使用施用于受试者。
[0076]
如本文所用的“癌症”可包括源自肿瘤、赘生物、癌症、前期癌、细胞系、恶性肿瘤的任何细胞或组织，或具有扩展和生长至无限程度的任何其他来源的细胞。癌细胞可以源自天然存在的来源或可以是人工创造的。癌细胞也可以能够侵入其他组织并转移。癌细胞还包括已经侵入其他组织和/或转移的任何恶性细胞。在有机体的环境中，一种或多种癌细胞也可以称为癌症、肿瘤、赘生物、生长、恶性肿瘤或本领域中用于描述癌性状态的细胞的任何其他术语。癌症可包括，例如，黑素瘤，脑癌，肺癌，肾上腺癌，肝癌，肾癌(renal cancer或kidney cancer)，胰腺癌，食道癌，胃癌(gastric cancer，stomach cancer)，结肠癌，结直
肠癌，肛门癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫颈癌，淋巴瘤，白血病，骨髓瘤，血液癌，肝癌，视网膜母细胞瘤，神经胶质瘤，肉瘤，胚细胞瘤，鳞状细胞癌和腺癌。
[0077]
术语“对照”，“参照水平”和“参照”在本文中可互换地使用。参照水平可以是预先确定的值或范围，其被用作评估测量结果的基准。如本文所用的“对照组”指对照对象的组。预先确定的水平可以是来自对照组的截止值(cutoffvalue)。预先确定的水平可以是来自对照组的平均值。截止值(或预先确定的截止值)可以通过自适应指数模型(adaptive index model(aim))方法论来确定。截止值(或预先确定的截止值)可以通过从患者组的生物样品的接受者工作曲线(receiver operating curve(roc))分析来确定。如生物学领域通常知晓的那样，roc分析是测试将一种状况与另一种状况区分开的能力的确定。p.j.heagerty等(biometrics 2000，56，337-44)中提供了roc分析的描述，其公开通过引用其整体并入本文。或者，截止值可以通过患者组的生物学样品的四分位数分析来确定。例如，截止值可以通过选择对应于在第25个百分位数-第75个百分位数范围内的任何值、优选对应于第25个百分位数的值、对应于第50个百分位数的值或对应于第75个百分位数的值以及更优选对应于第75个百分位数的值来确定。这样的统计学分析可以使用本领域已知的任何方法进行，并且可以通过任何数量的商业上可获得的软件包(例如来自analyse-it software ltd.，leeds，uk；statacorp lp，college station，tx；sas institute inc.，cary，nc)来实施。对于靶标或对于蛋白质活性的健康的或正常的水平或范围可以根据标准惯例来定义。对照可以是疾病状态已知的受试者或来自其的样品。受试者或来自其的样品可以是健康的、患病的、治疗前患病的、治疗期间患病的、治疗后患病的或治疗后健康的或其组合。如本文所用的术语“正常受试者”指健康受试者，即没有疾病的临床征兆或症状的受试者。对正常受试者进行了其他未被检测到的疾病征兆或症状的临床评估，该评估可能包括常规身体检查和/或实验室测试。在一些实施方式中，对照是健康对照。在一些实施方式中，对照包括癌症。
[0078]
如本文所用的术语“有效剂量”或“治疗剂量”或“治疗有效量”或“有效量”指足以引起治疗效果的量，或对于必要的时间段有效，以达到预期的治疗结果的药物剂量。有效剂量可以由本领域技术人员确定，并且可以根据多种因素例如疾病状态、年龄、性别和个体重量、施用方式、疾病的阶段和严重程度、受试者的总体健康状况、开药医生的判断和药物在个体中引起期望的应答的能力而变化。治疗有效量也是一个其中物质的治疗有益作用超过任何有毒的或有害的作用的量。“预防有效量”指在剂量上和对于必要时间段有效以达到预期的预防疾病的结果的量。通常，由于在疾病之前或在疾病的初期阶段在受试者中使用了预防剂量，预防有效量将小于治疗有效量。
[0079]
术语“抑制(inhibit或inhibiting)”指与不存在抑制剂相反的，抑制剂存在的情况下活性被降低或被阻止。术语“抑制(inhibition)”指过程的减少或下调，或对于过程的刺激的消除，其导致生物标志物或多肽的表达或活性的缺乏或最小化。抑制可以是直接的或间接的。抑制可以是特异性的，即抑制剂抑制生物标志物或多肽而不抑制其它。
[0080]
如本文所用的“样品”或“测试样品”可以指任何样品，其中化合物或靶标的存在和/或水平要被检测或确定。样品可以包括液体、溶液、乳液、混合物或悬浮液。样品可以包括医学样品。样品可以包括任何生物流体或组织，例如血液、全血、血液的部分(例如血浆和血清)、外周血单核细胞(pbmc)、肌肉、间质液、汗液、唾液、尿液、眼泪、滑液、骨髓、脑脊液、
鼻分泌物、唾液、羊水、支气管肺泡灌洗液、胃灌洗、呕吐、粪便物、肺组织、外周血单核细胞、总白细胞、淋巴结细胞、脾细胞、扁桃体细胞、癌细胞、肿瘤细胞、胆汁、消化液、皮肤或其组合。在一些实施方式中，样品包括等分试样。在其他实施方式中，样品包括生物流体。样品可以通过本领域已知的任何方法获得。样品可以如从患者获得的那样直接使用或可以进行预处理，例如通过过滤、蒸馏、萃取、浓缩、离心、干扰组分的失活、试剂的添加等进行预处理，如本文讨论的一些方式或本领域已知的其他方式改变样品的特性。样品可以在诊断之前、治疗之前、治疗期间、治疗之后、诊断之后或其组合获得。
[0081]
如本文所用的术语“特异性”指真阴性的数除以真阴性的数加上假阳性的数，其中特异性(“spec”)可以在0＜spec＜1的范围内。因此，具有灵敏性和特异性二者均等于1或100％的方法是优选的。
[0082]“特异性结合”通常指当化合物或缀合物与靶标结合时，其结合至该靶标比其结合至随机的、无关的靶标更容易。
[0083]
如本文所用的“受试者”可以指想要或需要本文描述的化合物或方法的哺乳动物。受试者可以是人类或非人类的动物。受试者可以是哺乳动物。哺乳动物可以是灵长目动物或非灵长目动物。哺乳动物可以是灵长目动物，例如人类；非灵长目动物，例如，狗、猫、马、牛、猪、小鼠、大鼠、骆驼、美洲驼、山羊、兔子、绵羊、仓鼠和豚鼠；或非人类的灵长目动物，例如，猴子、黑猩猩(chimpanzee)、大猩猩(gorilla)、猩猩(orangutan)和长臂猿(gibbon)。受试者可以是任何年龄或发育阶段的受试者，例如成年、青少年或婴儿。受试者可以是雄性或雌性。在一些实施方案中，受试者具有特异性遗传标记。
[0084]
如本文所用的术语“有毒的”指会对受试者有害的或导致任何不良影响的化学实体、试剂或物质的量。术语“无毒的”指具有可能损害受试者的程度相对低的物质。“细胞毒性”指对细胞有毒的化学实体、试剂或物质。毒性可指对整个有机体例如动物、细菌、植物或如本文定义的其他受试者的作用，以及对有机体的子结构例如细胞(细胞毒性)或器官(器官毒性(organotoxicity))、例如肝脏(肝毒性)的作用。毒理学的中心概念是作用为剂量依赖性的；当以足够大的剂量摄入水时，甚至水也可能导致水中毒，而对于甚至非常有毒的物质例如蛇毒，也存在一种剂量，低于该剂量无法检测到毒性作用。相对无毒的组合物或化合物可以允许宽范围的受试者能够没有严重的安全隐患或风险地安全地接受该组合物或化合物。
[0085]
本文所用的术语“治疗”指其中目的是减慢(减轻)不希望的生理状况、失调或疾病，或获得有益的或期望的临床结果的治疗。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓和；状况、失调或疾病的程度的缩减；状况、失调或疾病的状态的稳定(即不恶化)；发作的延缓或状况、失调或疾病的进展的减慢；状况、失调或疾病状态的改善；无论可检测的或不可检测的缓解(无论部分的或全部的)，或状况、失调或疾病的改进或改善。治疗还包括与不接受治疗的预期存活相比延长存活。“治疗”，当涉及到保护受试者免受疾病之害时，指压制、抑制、改善或完全消除疾病。预防疾病包括在疾病发作之前将本发明的组合物施用于受试者。压制疾病包括在疾病诱导之后但其临床症候出现之前向受试者施用本发明的组合物。抑制或改善疾病包括在疾病的临床症候出现后向受试者施用本发明的组合物。该疾病可以包括癌症。
[0086]
2.磷脂醚
[0087]
本文提供的是磷脂醚(ple)分子。ple可以根据式i或其盐：
[0088][0089]
其中x是氢、甲基或羧基取代的苯基。
[0090]
在一些实施方式中，ple选自以下：
[0091][0092][0093]
ple可以缀合至可检测的部分(也称为报告物或标记物)，例如，荧光分子、化学发光(chemuminescent)分子，放射性标记，磁性标记，红外分子(infrared molecule)或其组合。磁性标记是这样的标记部分：当与磁性接近传感器充分关联时，其可以被磁性接近传感器检测到并导致磁性接近传感器输出信号。磁性标记可以包括一种或多种选自顺磁性的、超顺磁性的、铁磁性的、铁磁性的、反铁磁性的材料或其组合等。荧光标记是通过荧光检测器可检测的标记部分。合适的荧光分子(荧光团，fluorophore)包括当不限于：荧光素、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯、荧光素的琥珀酰亚胺酯、荧光素二氯三嗪的5-异构体、笼状羧基荧光素-丙氨酸-甲酰胺(caged carboxyfluorescein-alanine-carboxamide)、oregon green 488、oregon green 514；荧光黄(lucifer yellow)、吖啶橙(acridine orange)、罗丹明(rhodamine)、四甲基罗丹明、texas red、碘化丙啶、jc-1(5，5
′
，6，6
′-
四氯-1，1
′
，3，3
′-
四乙基苯并咪唑基碳菁化碘)(jc-1(5，5
′
，6，6
′-
tetrachloro-1，1
′
，3，3
′-
tetraethylbenzimidazoylcarbocyanine iodide))、四溴罗丹明123、罗丹明6g、tmrm(四甲基罗丹明甲基酯)、tmre(四甲基罗丹明乙基酯)、四甲基rosamine(tetramethylrosamine)、罗丹明b和4-二甲基氨基四甲基rosamine(4-dimethylaminotetramethylrosamine)、绿色荧光蛋白、蓝移绿色荧光蛋白、蓝绿移绿色荧光蛋白、红移绿色荧光蛋白、黄移绿色荧光蛋白、4-乙酰氨基-4
′-
异硫氰酸芪-2，2
′
二磺酸(4-acetamido-4
′-
isothiocyanatostilbene-2，2
′
disulfonic acid)；吖啶及其衍生物，例如吖啶、吖啶异硫氰酸酯；5-(2
′-
氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(edans)；4-氨基-n-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3，5二磺酸盐；n-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a二氮杂-5-二环戊二烯并苯-3-丙酸(4，4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a，4a diaza-5-indacene-3-propioni-c acid)bodipy；级联蓝(cascade blue)；亮黄；香豆素及其衍生物：香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(amc，coumarin 120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花青染料；荧光桃红(cyanosine)；4
′
，6-二氨基-2-苯基吲哚
(dapi)；5
′
，5
″-
二溴邻苯三酚-磺酞(5
′
，5
″-
dibromopyrogallol-sulfonaphthalein)(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4
′-
异硫氰基苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4，4
′-
二异硫氰基二氢-茋-2-，2
′-
二磺酸；4，4
′-
二异硫氰酸芪-2，2
′-
二磺酸；5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰氯(dns，丹磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4
′-
异硫氰酸酯(dabitc)；曙红及其衍生物：曙红，曙红异硫氰酸酯，赤藓红及其衍生物：赤藓红b，赤藓红，异硫氰酸酯；乙锭；荧光素及其衍生物：5-羧基荧光素(fam)，5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基-1-荧光素(dtaf)，2
′
，7
′
二甲氧基-4
′5′-
二氯-6-羧基荧光素(joe)，荧光素，荧光素异硫氰酸酯，qfitc，(xritc)；荧光胺；ir144；ir1446；孔雀石绿异硫氰酸盐；4-甲基伞形酮邻甲酚酞(4-methylumbelli-feroneortho cresolphthalein)；硝基酪氨酸；副蔷薇苯胺；酚红；b-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘及其衍生物：芘、丁酸芘、琥珀酰亚胺1-芘；丁酸盐量子点(butyrate quantum dots)；活性红4(cibacron
tm brilliant red 3b-a)罗丹明及其衍生物：6-羧基-x-罗丹明(rox)，6-羧基罗丹明(r6g)，丽丝胺罗丹明b磺酰氯罗丹明(rhod)，罗丹明b，罗丹明123，罗丹明x异硫氰酸酯，磺基罗丹明b，磺基罗丹明101，磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(texas red)；n，n，n
′
，n
′-
四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(tritc)；核黄素；5-(2
′-
氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(edans)，4-(4
′-
二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(dabcyl)，玫红酸；cal fluor orange 560；铽螯合物衍生物；cy 3；cy 5；cy 5.5；cy 7；ird 700；ird 800；la jolla blue；酞菁；和萘酞菁，香豆素和相关染料，呫吨染料例如罗多尔(rhodol)类，试卤灵，bimanes，吖啶类，异吲哚类，丹酰(dansyl)染料，氨基邻苯二甲酰肼例如鲁米诺，和异鲁米诺衍生物，氨基邻苯二甲酰亚胺，氨基萘二甲酰亚胺，氨基苯并呋喃，氨基喹啉，二氰基氢醌，荧光铕和铽络合物；它们的组合等。
[0094]
可检测部分可以与ple共价地或可裂解地连接。例如，标记的ple可以选自以下：
[0095][0096]
上面的化合物(1)为带有稳定地连接至ple的荧光部分bodipy的ple(3)，也可以称为clr 1501。上面的化合物(2)为带有稳定地连接至ple的近红外分子ir-775的ple(3)，也可以称为clr 1502。化合物(1)和(2)也可以称为磷脂药物缀合物(pdc)。
[0097]
ple或其缀合物可以是对肿瘤或癌细胞特异性的。施用于受试者后，ple或其缀合物可以定位于肿瘤或癌细胞。与被引入健康细胞相比，ple或其缀合物可以更多地被引入肿瘤或癌细胞。ple或其缀合物被引入肿瘤或癌细胞可以比被引入健康细胞多至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍。
[0098]
3.磷脂-flavagline缀合物
[0099]
ple可以通过连接基缀合至flavagline化合物以形成磷脂-flavagline缀合物(也称为ple-flavagline缀合物)。该缀合物可以根据式ii或其盐：
[0100]
[0101]
其中x为或亚甲基，或键；y是包含二硫键的连接基；z是flavagline抗癌药。式ii的缀合物也可以称作磷脂药物缀合物(pdc)。
[0102]
flavagline类是米仔兰(aglaia)属(楝科(meliaceae))的植物中发现的天然产物家族。flavagline类的特征是环戊并[b]苯并呋喃骨架。flavagline类可以具有强的杀虫、抗真菌、抗炎、神经保护、心脏保护和抗癌活性。flavagline类可以增强化学疗法的疗效和/或减轻化学疗法的心脏不良反应。flavagline类可以包括例如flv1、flv3、其衍生物或类似物，或其组合。
[0103]
在一些实施方式中，flavagline包括flv1或其盐：
[0104][0105]
在一些实施方式中，flavagline包括flv3或其盐：
[0106][0107]
flavagline化合物可以以立体异构体的形式存在，其中存在不对称中心或手性中心。立体异构体为“r”或“s”取决于围绕手性碳原子的取代基的构型。本文使用的术语“r”和“s”是如在iupac 1974对于e部分的推荐(基础立体化学(fundamental stereochemistry)，理论和应用化学(pure appl.chem)，1976，45，13-30)中定义的构型。本公开预期了各种立体异构体及其混合物，并且这些立体异构体及其混合物具体地包括在本发明的范围内。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体，以及对映异构体或非对映异构体的混合物。化合物的各个立体异构体可以由包含不对称中心或手性中心的商业可获得的起始原料合成
制备，或者通过制备外消旋混合物，然后通过本领域普通技术人员熟知的拆分方法来制备。这些拆分方法的示例有(1)如在furniss，hannaford，smith和tatchell，“vogel
′
s textbook of practical organic chemistry”，第5版(1989)，longman scientific&technical，essex cm20 2je，england中描述的，将对映异构体混合物与手性助剂结合，通过重结晶或色谱法分离所得的非对映异构体的混合物，以及从所述助剂任选释放光学纯产物，或(2)在手性色谱柱上直接分离光学对映体的混合物，或(3)分步重结晶方法。应该理解的是，flavagline化合物可以具有互变异构形式，以及几何异构体，并且这些也构成本公开的实施方式。
[0108]
连接基可以是可裂解的连接基，例如二硫键，并且被特定地设计用于递送flavagline至肿瘤或癌细胞。在一些实施方式中，所述连接基包括二硫键。在一些实施方式中，所述连接基包括以下：
[0109][0110]
在一些实施方案中，磷脂-flavagline缀合物选自以下：
[0111][0112]
clr 1865(带有flv1)(8)，和
[0113][0114]
clr 1852(带有flv3)(9)。
[0115]
本公开还包括同位素标记的化合物，例如同位素标记的ple，同位素标记的flavagline，同位素标记的连接基，或同位素标记的磷脂-flavagline缀合物。同位素标记的化合物与本文详述的那些相同，但是存在以下事实：一个或多个原子被具有原子质量或质量数不同于自然界发现的原子质量或质量数的原子取代。适合于包含在本发明化合物中的同位素的实例是氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯，分别例如但不限于2h、3h、
13
c、
14
c、
15
n、
18
o、
17
o、
31
p、
32
p、
35
s、
18
f和
36
cl。用较重的同位素如氘(即2h)代替，可以提供某些由于更高的代谢稳定性例如体内半衰期的增加或减少的剂量需求带来的治疗优势，因此在一些情况下可能
是优选的。所述化合物可以引入正电子发射同位素用于医学成像和用于确定受体分布的正电子发射断层成像(pet)研究。可以引入化合物中的合适的正电子发射同位素是
11
c、
13
n、
15
o和
18
f。同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术制备或使用适当的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂通过类似于所附实施例中描述的那些过程来制备。
[0116]
所公开的ple或磷脂-flavagline缀合物可以以药学上可接受的盐存在。术语“药学上可接受的盐”指化合物的盐或两性离子，其是水溶性或油溶性或可分散的，适合于失调的治疗而没有异常毒性、刺激性和过敏反应，与合理的获益/风险比相称并且对于其预期用途有效。所述盐可以在化合物的最终分离和纯化期间制备，或通过将化合物的氨基基团与合适的酸反应而单独地制备。例如，化合物可以溶解在合适的溶剂中，例如但不限于甲醇和水，并用至少一当量的酸例如盐酸处理。所得的盐可以沉淀析出并通过过滤分离，并在减压下干燥。或者，可以在减压下除去溶剂和过量的酸以提供盐。代表性的盐包括醋酸盐，己二酸盐，藻朊酸盐，柠檬酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，二葡萄糖酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，甲酸盐，羟乙基磺酸盐，延胡索酸盐，乳酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，亚萘基磺酸盐(naphthylenesulfonate)，烟酸盐，草酸盐，双羟萘酸盐(pamoate)，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，草酸盐，马来酸盐，新戊酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，三氯乙酸盐，三氟乙酸盐，谷氨酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，磷酸盐等。化合物的氨基基团还可以被烷基氯化物、溴化物和碘化物例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、月桂基、肉豆蔻基、硬脂基等的氯化物、溴化物和碘化物季铵化。
[0117]
碱性加成盐可以在所公开的化合物的最终分离和纯化期间通过将羧基与合适的碱反应来制备，合适的碱例如是金属阳离子(例如锂、钠、钾、钙、镁或铝)的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，或者是有机的伯胺、仲胺或叔胺。可以制备季胺盐，例如那些衍生自甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、n，n-二甲基苯胺、n-甲基哌啶、n-甲基吗啉、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、n，n-二苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺(1-ephenamine)和n，n
’-
二苄基乙二胺，乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等的季胺盐。
[0118]
磷脂-flavagline缀合物可以是对肿瘤或癌细胞具有特异性的。施用于受试者后，磷脂-flavagline缀合物可以定位于肿瘤或癌细胞。磷脂-flavagline缀合物可定位或行进至肿瘤或癌细胞的细胞质或细胞器。与被引入健康细胞相比，磷脂-flavagline缀合物可以更多地被引入肿瘤或癌细胞中。磷脂-flavagline缀合物被引入至肿瘤或癌细胞可以比被引入至健康细胞多至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍。
[0119]
flavagline可以从ple裂解，例如施用至受试者后在体内裂解。flavagline可以定位于或行进至肿瘤或癌细胞的细胞质或细胞器。与被引入健康细胞相比，flavagline可以更多地被引入肿瘤或癌细胞中。flavagline被引入肿瘤或癌细胞可以比被引入健康细胞多至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍。
[0120]
a.合成
[0121]
ple可以根据实施例1合成制备。或者，如本文详述的ple可以通过本领域技术人员
已知的方法合成制备。flavagline可以根据实施例1合成制备。或者，如本文详述的flavagline可以通过本领域技术人员已知的方法合成制备。flavaglines也可以从例如上海皓元医药股份有限公司(haoyuan chemexpress co.)(中国上海)商购获得。ple-flavagline缀合物可以根据实施例1合成制备。或者，如本文详述的ple-flavagline缀合物可以通过本领域技术人员已知的方法合成制备。
[0122]
4.药物组合物
[0123]
如本文详述的ple和磷脂-flavagline缀合物可以根据制药领域技术人员众所周知的标准技术配制成药物组合物。所述组合物可以包含所述化合物(例如ple和磷脂-fla vagline缀合物)和药学上可接受的载体。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”指任何类型的无毒的惰性固体、半固体或液体的填充剂、稀释剂、包囊材料或制剂助剂。
[0124]
施用所公开的ple和磷脂-flavagline缀合物的途径和组合物的形式将决定所使用的载体的类型。药物组合物的形式可以是各种各样的形式，例如适合用于全身施用(例如口服、直肠、舌下、口腔、植入、鼻内、阴道内、经皮、静脉内、动脉内、肿瘤内、腹膜内或肠胃外)或适合用于局部施用(例如，皮肤、肺、鼻、耳、眼、脂质体递送系统或离子电渗疗法)的形式。在一些实施方案中，药物组合物用于施用于受试者的中枢神经系统。技术和配方通常可在“remington
′
s pharmaceutical sciences”(meade出版公司，easton，pa)中找到。药物组合物通常必须在生产和储存条件下是无菌的和稳定的。所有载体在组合物中都是任选的。
[0125]
药学上可接受的载体包括，例如，稀释剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂、着色剂、调味剂、甜味剂、抗氧化剂、防腐剂、助流剂、溶剂、助悬剂、湿润剂、表面活性剂、软化剂、抛射剂(propellant)、保湿剂、粉末、ph调节剂及其组合。
[0126]
尽管组合物中组分的量可以根据所制备的组合物的类型而变化，但是一般而言，全身性组合物可以包含0.01％至50％的化合物(例如ple或磷脂-flavagline缀合物)和50％至99.99％的一种或多种载体。用于肠胃外施用的组合物通常可以包含0.1％至10％的化合物和90％至99.9％的一种或多种载体。口服剂型可包含例如至少约5％的化合物，或约25％至约50％的化合物。口服剂量组合物可以包含约50％至约95％的载体，或约50％至约75％的载体。与所公开的化合物结合使用的载体的量足以提供用于化合物的每单位剂量施用的组合物的实际量。在以下参考文献中描述了在本发明的方法中有用的用于制备剂型的技术和组合物：现代制药学(modem pharmaceutics)，第9章和第10章，banker和rhodes，eds(1979)；lieberman等，药物剂型(pharmaceutical dosage forms)：片剂(1981)；和ansel，药物剂型简介(introduction to pharmaceutical dosage forms)，第二版，(1976)。
[0127]
5.施用
[0128]
ple或磷脂-flavagline缀合物或包含其的药物组合物可以施用于受试者。考虑到诸如年龄、性别、重量和特定受试者的状况及施用途径等因素，包含化合物(例如ple或磷脂-flavagline缀合物)的这样的组合物可以以一定剂量和通过医学领域技术人员公知的技术施用。
[0129]
所述化合物(例如ple或磷脂-flavagline缀合物)可以预防性地或治疗性地施用。在预防性施用中，所述化合物可以以足够引起应答的量施用。在治疗性应用中，所述化合物以足以引起治疗效果的量施用于有需要的受试者。足以实现此目的的量定义为“治疗有效量”。用于该用途的有效的量将取决于例如所施用的化合物方案的特定组合物、施用方式、
疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况和开药医生的判断。治疗有效量也是一个其中化合物的治疗有益作用超过任何有毒的或有害的作用的量。“预防有效量”指在剂量上和对于必要时间段有效达到期望的预防疾病结果的量。通常，由于在疾病之前或在疾病的初期阶段在受试者中使用预防剂量，预防有效量将小于治疗有效量。
[0130]
例如，化合物的治疗有效量可以为约1mg/kg至约1000mg/kg，约5mg/kg至约950mg/kg，约10mg/kg至约900mg/kg，约15mg/kg至约850mg/kg，约20mg/kg至约800mg/kg，约25mg/kg至约750mg/kg，约30mg/kg至约700mg/kg，约35mg/kg至约650mg/kg，约40mg/kg至约600mg/kg，约45mg/kg至约550mg/kg，约50mg/kg至约500mg/kg，约55mg/kg至约450mg/kg，约60mg/kg至约400mg/kg，约65mg/kg至约350mg/kg，约70mg/kg至约300mg/kg，约75mg/kg至约250mg/kg，约80mg/kg至约200mg/kg，约85mg/kg至约150mg/kg，和约90mg/kg至约100mg/kg。
[0131]
所述化合物可以通过本领域已知的方法施用，如在donnelly等(ann.rev.immunol，1997，15，617-648)；felgner等(美国专利号5580859，1996年12月3日颁发)；felgner(美国专利号5703055，1997年12月30日颁发)；和carson等(美国专利号5679647,1997年10月21日颁发)中描述，其全部内容通过引用其整体并入本文。所述化合物可以复合到可以使用例如疫苗枪施用于个体的颗粒或珠子上。本领域技术人员会知晓，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如施用途径。
[0132]
所述化合物可以通过多种途径递送。有代表性的递送途径包括肠胃外施用，例如皮内、肌内或皮下递送。其他途径包括口服施用、鼻内、阴道内、经皮、静脉内、动脉内、肿瘤内、腹膜内和表皮途径。在一些实施方式中，所述化合物是静脉内地、动脉内地、腹膜内地施用于受试者。在一些实施方式中，所述化合物是静脉内地施用于受试者。在一些实施方式中，所述化合物是口服地施用于受试者。
[0133]
在一些实施方式中，所述化合物以控释制剂的形式施用。所述化合物例如可以释放到循环中。在一些实施方式中，所述化合物可以经至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约1周、至少约1.5周、至少约2周、至少约2.5周、至少约3.5周、至少约4周或至少约1个月的时间内释放。
[0134]
所述化合物可以以单一剂量施用或偶尔地(episodically)施用或重复剂量施用。例如所述化合物可以每一小时、每2小时、每4小时、每8小时、每12小时、每25小时、每36小时、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每1周、每2周、每3周或每4周施用一次。
[0135]
6.方法
[0136]
a.治疗受试者中的癌症的方法
[0137]
本文提供的是治疗受试者中的癌症的方法。该方法可以包括向受试者施用如本文中详述的磷脂-flavagline缀合物。在一些实施方式中，癌症选自黑素瘤，脑癌，肺癌，肾上腺癌，肝癌，肾癌(renal cancer或kidney cancer)，胰腺癌，食道癌，胃癌(gastric cancer，stomach cancer)，结肠癌，结直肠癌，肛门癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫颈癌，淋巴瘤，白血病，骨髓瘤，血液癌，肝癌，视网膜母细胞瘤，神经胶质瘤，肉瘤，胚细胞瘤，鳞状细胞癌和腺癌。
[0138]
b.将药物靶向受试者中的肿瘤或癌细胞的方法
[0139]
本文提供的是将药物靶向受试者中的肿瘤或癌细胞的方法。该方法可以包括向受试者施用如本文中详述的磷脂-flavagline缀合物。在一些实施方式中，癌症选自黑素瘤，
脑癌，肺癌，肾上腺癌，肝癌，肾癌(renal cancer或kidney cancer)，胰腺癌，食道癌，胃癌(gastric cancer，stomach cancer)，结肠癌，结直肠癌，肛门癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫颈癌，淋巴瘤，白血病，骨髓瘤，血液癌，肝癌，视网膜母细胞瘤，神经胶质瘤，肉瘤，胚细胞瘤，鳞状细胞癌和腺癌。
[0140]
7.实施例
[0141]
实施例1
[0142]
化学合成
[0143]
ple。ple根据以下方案1合成制备：
[0144][0145]
方案1
[0146]
flavagline。flavagline是商业上可获得的。flv1和flv3购自上海皓元医药股份有限公司(中国，上海)。flv1和flv3或者根据以下方案2合成制备：
[0147][0148][0149]
方案2
[0150]
ple-flavagline构建体。clr 1852(化合物(9))和clr 1865(化合物(8))是根据以下方案3合成制备的：
[0151][0152]
方案3
[0153]
实施例2
[0154]
肿瘤细胞上脂质筏的存在
[0155]
超过100个细胞系用霍乱毒素亚单位b染色，用4％甲醛固定，并用菲律宾菌素iii染色30分钟。如图1a-图1d中所示，几乎每个被测试的肿瘤类型都证实了在细胞膜中高的脂质筏浓度(超过100个细胞系，新鲜的患者样品等)。如图1e中所示，将a549细胞与正常成纤维细胞共培养48小时，然后用霍乱毒素亚单位b染色，用4％甲醛固定，并用菲律宾菌素iii染色30分钟。这些结果证明，肿瘤细胞具有比正常细胞更高浓度的脂质筏。
[0156]
实施例3
[0157]
pdc向肿瘤细胞的选择性摄取
[0158]
将正常成纤维细胞和caki-2肿瘤细胞(人透明细胞肾细胞癌)铺板并共培养过夜(图1f)。然后将细胞用5μm的clr 1501(化合物(1))在完全培养基中于37℃孵育24小时。第二天，洗涤细胞并与细胞核染色剂共染色(hoechst 33342)。激发clr 1501，然后用alexa-fluor 488过滤器检测。clr 1501高度定位于caki-2细胞中，而最低限度地定位于正常成纤维细胞中。
[0159]
实施例4
[0160]
脂质筏的破坏减少pdc的摄取
[0161]
将a549细胞铺板至单独的孔中过夜。第二天，细胞未被处理(图1g)或用甲基b-环糊精处理(图1h)，其已经显示有选择性地破坏脂质筏。然后将所有细胞用5μum的clr 1501(化合物(1))孵育24小时。与未处理的细胞(图1g)相比，a549中大多数脂质筏的破坏导致clr 1501的摄入减少60％(图1h)。
[0162]
实施例5
[0163]
pdc追踪至内质网
[0164]
将人前列腺腺癌细胞(pc3)在微孔板vi(ibidi，verona，wi)上铺板过夜，然后用5μm的clr 1501(化合物(1))在完全培养基中于37℃孵育24小时。洗涤后，按符合方案集(per protocol)将细胞用共染色，并用nikon a1r共聚焦光学显微镜成像。激发clr 1501和er并用alexa-fluor488使用标准荧光素过滤器检测。clr 1501在恶性细胞中与er共定位(图1i-图1k)，但在正常细胞中没有与er共定位(未示出)。
[0165]
实施例6
[0166]
pdc追踪至内质网
[0167]
pc3(iv级，人前列腺腺癌)细胞系在微型载玻片vi(ibidi，verona，wi)上培养过夜。第二天，将细胞用5μm的clr 1501(化合物(1))在完全培养基中于37℃孵育24小时。用pbs洗涤后的第二天，将细胞用细胞核染色剂(hoechst 33342)和线粒体标记物(invitrogen，carlsbad，ca)共染色。细胞使用nikon a1r共聚焦显微镜观察。激发clr 1501并用alexa-fluor488过滤器检测，而细胞核染色和线粒体染色被激发并分别用dapi过滤器和texas-red过滤器检测。clr 1501与线粒体共定位(图1l-图1n)。
[0168]
实施例7
[0169]
pdc在体内提供靶向递送
[0170]
给带有结直肠(hct-116)肿瘤的裸小鼠注射1mg clr 1502(化合物(2))，并在pearl红外线成像系统(pearl infrared imaging system)上成像。不同的颜色反映了clr 1502随时间变化的强度。注射后约5.5小时，肿瘤仍显示红色(反映clr 1502的最高分布)(图2)。在24小时内，获得了clr 1502的最大分布。在30分钟内记录了最初的靶向(未示出)。
[0171]
实施例8
[0172]
细胞毒性pdc提供靶向性并且可能改善治疗指数
[0173]
将a549(人肺腺癌)细胞和正常人真皮成纤维细胞(nhdf)铺板于96孔培养皿中过夜。所有细胞均用浓度递增的单独的母体细胞毒性化合物(flv1或flv3)处理或用浓度递增的pdc(用可裂解的连接基缀合至ple部分的母体细胞毒性化合物，clr 1865(化合物(8)))
处理或用浓度递增的clr 1852(化合物(9))处理。母体细胞毒性化合物显示出对于a549细胞与其对于nhdf细胞几乎相同的效力。但是，pdc分子对a549细胞显示出选择性(图3)。pdc分子显示出其在nhdf细胞上几乎没作用，除非其达到最高浓度，并且显示出在a549细胞中与母体分子几乎相似的效力。pdc分子对于肿瘤细胞的细胞毒性和其对于正常细胞的细胞毒性之间的差异可能已经表明有可能改善母体分子治疗指数。
[0174]
实施例9
[0175]
细胞毒性pdc提供靶向性
[0176]
评估了clr 1852(化合物(9))在a375(人黑素瘤)细胞中和在hek293(人胚胎肾)细胞中的摄取。将细胞用clr 1852(化合物(9))孵育24小时。已经显示，在治疗的24小时内，与正常细胞相比，肿瘤细胞无论如何均具有pdc的6至28倍的增加(图4)。
[0177]
实施例2-9的结果表明磷脂醚分子通过脂质筏靶向肿瘤细胞。与正常细胞相比，即使在共培养中，pdc也显示出向肿瘤细胞中的显著的摄取。进入肿瘤细胞后，pdc追踪至线粒体和内质网。在体内，pdc既靶向肿瘤又在肿瘤内迅速积累。细胞毒性pdc提供了改善的靶向性和改善安全性的可能性。
[0178]
实施例10
[0179]
ple的细胞摄取
[0180]
各种癌细胞系在体外和体内暴露于荧光标记的ple(clr 1501，化合物(1))。连续24小时测量肿瘤细胞摄取。结果示于表1和图5、图6和图7中。ple化合物对于肿瘤和癌细胞是特异性的。
[0181]
将荧光标记的ple(clr 1501，化合物(1))施用于良性组织，没有观察到摄取(表2)。
[0182]
表1 ple的体外细胞摄取
[0183]
[0184]
[0185][0186]
表2 clr1404在良性组织中的摄取
[0187][0188]
实施例11
[0189]
ple-flavagline缀合物在癌细胞中的活性
[0190]
将ple-flavagline缀合物clr 1852(化合物(9))和clr 1865(化合物(8))施用于细胞系a375(人恶性黑素瘤)、a549(人肺腺癌)、hct 116(人结肠癌)和nhdf(正常的人真皮成纤维细胞)。计算ic
50
。结果示于表3。
[0191]
表3各种癌细胞系中的ic
50
(μm/ml)
[0192]
化合物a375a549hct 116nhdf治疗指数(ti)flv30.0150.090.0090.0080.89clr 18520.90.020.067.2(18.3)360(915)clr 18659.750.671.287.8(25)11.64(37.3)
[0193]
在各种浓度下测定了clr 1852的细胞毒性。如在图8中所示，可能由于不完全释放，clr 1852与单独的flv3相比，显示出在效力上不太大的损失。
[0194]
以丙胺太林为对照，检查了clr 1865(化合物(8))、clr 1852(化合物(9))和flv3在血浆中的稳定性(表4)。少量分子暴露于血浆，然后通过hplc或ms分析血浆以确定该分子是否分解。clr 1865和clr 1852显示出出色的人血浆稳定性。clr 1852在小鼠血浆中的性能优于clr 1865。clr 1865仅在小鼠血浆中稳定3.3小时。clr 1852在血浆中稳定至少7小时。
[0195]
表4血浆稳定性
[0196]
化合物人半衰期(min)小鼠半衰期(min)clr 1852＞400＞400clr 1865＞400199丙胺太林5485
[0197]
在小鼠中检查了clr 1865和clr 1852的治疗指数(ti)(表5)。表5中列出的是施用于小鼠的剂量，和多少只小鼠在治疗后存活(“3/3”表示3只小鼠中3只是活着的)。与单独的flv3相比，clr 1852和clr 1865二者都显示出在耐受性方面出色的改善。clr1852未能达到最大耐受剂量(mtd)，可能是因为其溶解度限制了更大剂量。clr 1865的mtd为5mg/kg至10mg/kg。clr 1852的体内治疗指数为至少25，clr 1865的体内治疗指数为至少12.5。
[0198]
表5体内治疗指数
[0199]
剂量(mg/kg)flv3clr 1852clr 1865
0.13/33/33/30.253/33/33/30.5ld3/33/31.0n/a3/33/35.0n/a3/33/310.0n/a3/32/3
[0200]
检查了clr 1852在hct 116细胞(人结肠癌)中的疗效。将clr 1852以每次1mg/mg的三次剂量施用于hct 116细胞。与载体相比，clr 1852在约27天时开始减少肿瘤体积(图9)。可能由于毒性，与载体相比，clr 1582导致不太大的重量减轻(图10)。与单独的flv3相比，clr 1582提供了在耐受性方面至少提高6倍(数据未示出)。
[0201]
将clr 1852和flv3单独地施用于a375和a549细胞。使用lc/ms测量flv3在细胞裂解物和生长培养基中的水平。如在图11中所示，在24小时后，在细胞裂解物中存在高水平的flv3。24小时后，在生长培养基中存在中等水平的flv3。在24小时细胞内的flv3水平呈现稳定水平，而flv3的细胞外水平则持续升高。
[0202]
***
[0203]
特定方面的前述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，以至于其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识，无需过度实验，无需脱离本公开的总体构思的情况下，容易地修改和/或调整诸如特定方面的各种应用。因此，基于本文提出的教导和指导，这样的调整和修改均应在本公开的方面的等同形式的含义和范围内。应当理解，本文的措词或术语是用于描述的目的而非限制，使得本说明书的术语和措辞将由本领域技术人员根据教导和指导进行解释。
[0204]
本公开的广度和范围不应被上述示例性方面中的任何一个限制，而应仅根据下面权利要求和其等同物来界定。
[0205]
为了所有目的，本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文件通过引用其全部并入本文，如同每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文件均单独的为了所有目的通过引用并入一样。
[0206]
出于完整性的缘故，本发明的各个方面以下面编号的条款陈列：
[0207]
条款1：根据式i的磷脂醚(ple)或其盐：
[0208][0209]
其中x是氢、甲基或羧基取代的苯基。
[0210]
条款2：条款1所述的ple，选自以下：
[0211][0212]
条款3：条款1或2所述的ple，还包含与其连接的可检测的部分。
[0213]
条款4：一种组合物，其包括条款1或2或3所述的ple和载体。
[0214]
条款5：一种化合物，其选自以下：
[0215][0216][0217]
条款6：一种组合物，其包括条款5所述的化合物和载体。
[0218]
条款7：根据式ii的缀合物或其盐：
[0219][0220]
其中x是或亚甲基，或键；y是包含二硫键的连接基；z是flavagline抗癌药。
[0221]
条款8：条款7所述的缀合物，其中所述flavagline抗癌药包括flv-1、flv-3、其衍生物或其类似物或其组合。
[0222]
条款9：条款7-8中任一项所述的缀合物，其中所述连接基包含以下：
[0223][0224]
条款10：条款7-9中任一项所述的缀合物，选自以下：
[0225][0226]
条款11：一种组合物，其包括条款7-10中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。
[0227]
条款12：在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括将条款7-10中任一项所述的缀合物施用于所述受试者。
[0228]
条款13：将药物靶向受试者中的肿瘤或癌细胞的方法，所述方法包括将条款7-10中任一项所述的缀合物施用于所述受试者。
[0229]
条款14：条款12-13中任一项所述的方法，其中flavagline抗癌药定位于或行进至肿瘤或癌细胞的细胞质或细胞器。
[0230]
条款15：条款12-13中任一项所述的方法，其中所述缀合物或flavagline抗癌药对于受试者中的癌细胞是选择性的。
[0231]
条款16：条款12-13中任一项所述的方法，其中所述缀合物或flavagline抗癌药被引入肿瘤或癌细胞比被引入健康细胞多至少约2倍。
[0232]
条款17：条款12-16中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、脑癌、肺癌、肾上腺癌、肝癌、肾癌(renal cancer或kidneycancer)、胰腺癌、食道癌、胃癌(gastric cancer，stomach cancer)、结肠癌、结直肠癌、肛门癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫颈癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、血液癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、胚细胞瘤、鳞状细胞癌和腺癌。
[0233]
条款18：条款12-17中任一项的所述的方法，其中所述受试者是人类。