酸性鞘磷脂酶病症的标志物及其用图
【专利说明】酸性鞘磷脂酶病症的标志物及其用途
[00011本申请要求保护2013年6月7日提交的美国临时申请号61/832,302的35U.S.C.§ 119下的优先权，其在本文通过提述以其全文并入。
[0002] 本公开涉及筛选、诊断、监测和/或治疗酸性鞘磷脂酶(ASM)病症如尼曼-皮克病 (Niemann-Pick disease)的方法。
[0003] 酸性鞘磷脂酶(ASM)是溶酶体磷酸二酯酶，其将鞘磷脂(SPM)，一种存在于脑、肝、 肺、脾和淋巴结中的磷脂储存物质，水解为神经酰胺和磷酸胆碱。ASM活性的丧失可导致机 体不能分解SPM。在具有ASM病症的患者中，SPM主要在巨噬细胞中积累，但也在肝细胞和其 他细胞类型中，导致显著的肝脾肿大、血小板减少症、肺间质性疾病和冠状动脉疾病。SPM在 血浆、全血或尿中并不显著升高，使其作为非侵入性生物标记的用途有限。
[0004] ASM病症的诊断目前需要侵入性测试且/或耗费时间的医疗检验，如疑似临床表征 和症状的评估，肝或肺活检、在血液样品中对ASM活性进行测试(其中已报道了假阴性和假 阳性病例）和/或基因测试(例如，SMPD1基因突变分析）ASM病症的治疗可包括替代酶的施 用。在高剂量，酶替代疗法可导致毒性或有害代谢物的产生。相应地，对开发改进的用于筛 选、诊断和/或监测ASM病症治疗过程的方法存在需求。本文公开了非侵入性筛选、诊断、监 测疗法的和/或调整用于治疗ASM病症的治疗剂的剂量方法，其包括在生物样品中测量溶 血-SPM的水平(神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosy lphosphory lcho 1 ine)或溶血-鞘磷脂）。可 将升高的溶血-SPM水平用于筛选或诊断ASM病症。升高的溶血-SPM水平也可用作一种或多 种与过高剂量的酶替代疗法相关的毒性代谢物产生的信号或征兆，进而允许校准酶疗法以 降低SPM的积聚同时避免所述疗法的有害副作用。升高的溶血-SPM水平还可用于监测ASM病 症治疗过程的长期效力(例如，如果溶血-SPM水平在治疗过程未减少，这可表明治疗无效）。
[0005] 尼曼-皮克病(NPD)是一种遗传性常染色体隐性脂质贮积病症，通过SPM在细胞如 巨噬细胞和神经元的溶酶体中损害正常细胞功能的过度积累表征。尼曼-皮克A型（"NPD-A")是在婴儿中迅速进展的神经退行性疾病且通常导致在二至三岁内死亡。尼曼-皮克B型 ("NPD-B")导致肝脏和脾脏肿大，和呼吸窘迫，随后通常在成年早期发生死亡。其他尼曼-皮 克病的类型，例如类型以〃即0-(：〃），也可能与3?1和/或溶血-3?1的积累相关。其在本文也称 为ASM病症(ASMD)。这些尼曼-皮克病的形式在本文统称为尼曼-皮克病(NPD)。
[0006] NPD在德系犹太人(Ashkenazi Jewish)后裔中相比普通人群发生频率更高。估测 在德系犹太人中NPD-A的发生率为约1/40，000,其中基因频率(q)为约1/200且杂合子携带 频率（2pq)为l/100(Goodman，1979，in"Genetic Disorders Among The Jewish People", John Hopkins Univ · Press，Baltimore，pp · 96-100) aNPD-B在德系犹太人群体中的杂合子 携带率的频率较低。同上。在德系犹太人后裔的个体中，NPD A和B的组合杂合子携带频率估 测为约1/70。同上。在不同国家进行的流行病学研究中，NPD A和B疾病的组合发生率在全球 的数个国家新生儿中估测为 1/167,000至 1/250，000(Miekle等，1999JAMA 281 (3) :249-254;Poorthuis等，1999Hum.Genet· 105:151-156;Pinto等，2004 Euro·J.Hum.Gene· 12:87-92)。相信杂合子携带率为1/200个体至1/250个体。
[0007] 患有NPD-A或NPD-B的患者具有残留的ASM活性(约为正常的1至10% )，但这不足以 预防鞘磷脂在溶酶体中的过度积累。此外，NPD-B的临床过程高度多变，且目前尚不能将疾 病的严重性与残留ASM活性水平关联。尽管受NPD-A或NPD-B影响的患者的酶诊断可在血液 样品中进行，但该诊断经常在侵入性方法如肝或肺活检之后进行。此外，专门的杂合子酶学 检测已证明存在问题，特别是使用外周血白细胞作为酶的来源。一种可能性是在某些来源 中中性鞘磷脂酶的出现和/或由突变等位基因导致的残留ASM活性的存在促成不能可靠地 区别任一疾病亚型的携带者。即使使用培养的皮肤成纤维细胞(其不表达中性鞘磷脂酶)并 未提供杂合体的明确结果。相应地，对用于精确检测、筛选、诊断和治疗ASM病症如NPD的可 替换地方法存在需求。
[0008] 酶替代疗法(ERT)已用于治疗不同溶酶体贮积疾病。参见美国专利7,001，994和美 国专利申请号2011/0052559，其讨论了泰萨二氏病(Tay-Sachs)、蓬佩病(Pompe)和尼曼-皮 克病等的ERT，在本文以其全文通过提述并入。ERT尝试用外源提供的酶补充缺陷和/或不足 的酶。在针对尼曼-皮克病的ERT的情况中，目的将是使受影响的个体能够处理鞘磷脂并避 免其在溶酶体内的积聚。为有效起见，该疗法初始可需要足够大量的替代酶以分解积累的 鞘磷脂，以及持续施用替代酶以避免随后鞘磷脂的再次积累。然而积累的鞘磷脂的代谢可 导致毒性或有害代谢物的产生。因此，需要对ERT进行仔细协调以有效减少患者中积累的鞘 磷脂而不产生升高的可能导致不良副作用的代谢物水平。
[0009] 如之前注意到的是，SPM在血浆、全血或尿中并未显著升高，使其作为非侵入性生 物标记用于筛选、诊断或监测ASM病症的治疗的用途有限。如本文公开，溶血-SPM(神经鞘氨 醇磷酸胆碱或溶血-鞘磷脂），SPM的去酰化形式，在患有ASM病症和/或正在接受ASM病症治 疗的患者的组织包括外周组织中显著升高，使其成为用于筛选、诊断和/或监测ASM病症治 疗的潜在标志物。该二分法与许多其他可在血浆中检测到酰化和去酰化鞘糖脂两者的水平 变化的溶酶体贮积症相反。给定改变的SPM水平在来自患有ASM病症或正在进行ASM病症治 疗的患者的血浆中不能检测，可能已经预期到溶血-SPM将同样不适于筛选、诊断或监测治 疗。然而，如本文公开，已发现溶血-SPM在来自不同组织包括外周组织如血浆的生物样品中 可以以改变的水平检测。
[0010] 溶血-鞘脂类(溶血-SL)，其包含溶血-SPM，为鞘脂类的去酰化形式;数个研究已显 不在某些溶酶体1C积症中有所升高。Galbiati等，〃Combined hematopoietic and lentiviral gene-transfer therapies in newborn Twitcher mice reveal contemporaneous neurodegeneration and demyelination in Krabbe disease，〃 J.Neurosci. Res. 87 :1748-1759(2009)。溶血-SPM和其他溶血-SL产生的机制尚未完全阐 明。缺乏鞘氨醇的同时升高表明相应的鞘脂类的去酰化是可能的生成途径。然而，目前仅有 的已鉴定的鞘磷脂脱酰酶来自特应性皮炎受试者的角质层。Murata等，〃Abnormal expression of sphingolipid acylase in atopic dermatitis:an etiologic factor for ceramide deficiency?"，J · Invest · Dermatol · 106:1242-1249( 1996)。这种脱酰酶的 表达在某些生理条件下似乎局限于所选细胞类型。来自胎盘、脑和尿的纯化的ASM已显示不 水角军溶血 _SPM〇Pentchev 等，''The isolation and characterization of Sphingomyelinase from human placental tissue,^Biochim.Biophys.Acta.488:312-321 (1977) ;Yamanaka和Suzuki，〃Acid sphingomyelinase of human brain:purification to homogeneity，"J.Neurochem.38:1753-1764(1982);Quintern等，"Acid sphingomyelinase from human urine:purification and characterization，〃 Biochim.Biophys. Acta. 922:323-336( 1987)。关于溶血-SPM的生物合成途径理解的缺乏进 一步强调了预测其在患有ASM病症的患者中的先验表达水平的困难性。
[0011] 溶血-SPM在体外的血液中具有较短半衰期，这是由于其通过自体毒素 (autotaxin)(-种具有溶血磷脂酶D活性的胞外酶)快速代谢成鞘氨醇-1-磷酸。Tokumura 等，〃Identification of human plasma lysophospholipase D，a lysophosphatidic acid-producing enzyme ,as autotaxin,a multifunctional phosphodiesterase, J.Biol.Chem.277:39436-39442(2002);Clair等，"Autotaxin hydrolyzes sphingosylphosphorylcholine to produce the regulator of migration, sphingosine-1-phosphate，''Cancer Res · 63:5446-5453(2003)。除NPD-B患者的脾和肝和 具有很少或无 ASM活性且表现出严重的神经性疾病的NPD-A受试者的脑，在其他器官中并未 报道存在溶血-SPM的水平。
[0012] 如本文公开，溶血-SPM可从来自患有ASM病症和/或正在针对ASM病症进行治疗的 患者的生物样品（例如，取自外周组织的样品）中以改变的浓度检测到。改变的水平可反映 治疗的瞬时效果(例如改变的溶血-SPM水平可充当用于响应ERT的急性毒性代谢物产生的 标志物）。改变的水平还可在诊断上使用（例如，改变的溶血-SPM水平可充当诊断或筛选标 志物以鉴定患有ASM病症的具有症状或症状发生前的受试者）。改变的水平也可用于监测对 于ASM病症的治疗过程的长期效力（例如，如果溶血-SPM的水平在治疗过程中不降低，其可 表明无效治疗）。相应地，本文公开的是使用新型生物标志物包括溶血_SPM(神经鞘氨醇磷 酸胆碱或溶血-鞘磷脂)筛选、诊断、监测治疗进展和/或调整用于治疗ASM病症如NH)的治疗 剂剂量的新方法。监测治疗过程可包括在治疗过程中检测一种或多种毒性标志物的水平的 降低(例如溶血-SPM)，进而指明有效的治疗方案，或检测标志物水平随时间变化的缺乏，进 而指明无效的方案。
[0013] 本文公开的方法也包括治疗患有酸性鞘磷脂酶(ASM)病症的人受试者的方法。一 些方面，所述方法可包括将具有第一浓度的用于治疗ASM病症的第一剂量的治疗剂施用至 受试者；和如果在所述第一剂量施用后已确定所述受试者具有少于或等于参照水平的溶 血-SPM水平，则将具有等于或大于所述第一浓度的第二浓度的第二剂量的治疗剂施用至受 试者。所述方法可包括在来自外周组织的生物样品中测量溶血-SPM和通过检测改变的溶 血-SPM水平鉴定患有ASM病症的患者。所述方法还包括通过检测一种或多种作为用治疗剂 (例如在患者组织中降低SPM水平的作用剂）治疗患者的结果而改变的毒性标志物包括溶 血-SPM的水平来监测或调整对于患者ASM病症的治疗。所述方法允许对这些患者的非侵入 性评估。
[0014] 本文公开的方法还可在一些实施方案中使用以筛选、诊断、监测治疗进展和/或调 整对ASM病症如NH)的治疗。举例来说，所述方法包括通过测量毒性标志物(例如溶血-SPM) 来调整给予患者的用于治疗ASM病症的治疗剂剂量，进而管理由治疗导致的毒性代谢物的 水平。本文公开的方法可在某些实施方案中用于监测对于ASM病症治疗过程的长期效力(例 如如果溶血-SPM的水平在治疗过程中未减少，其可表明无效治疗）。所述方法在某些实施方 案中可用于筛选受试者（例如症状出现前的患者)升高的溶血-SPM作为ASM病症的初始征 兆。随后对筛选中鉴定为具有升高的溶血-SPM的受试者可给予额外评估(例如ASM血液测 试、基因测试等）以诊断/确认ASM病症的诊断，而那些未展示升高的溶血-SPM的受试者将不 被给予额外评估。该筛选方法可能潜在降低测试花销。
[0015]本文公开的方法可包括在来自人受试者的生物样品中测量溶血-SPM并基于测量 的溶血-SPM水平以优化的浓度施用用于治疗ASM病症的治疗剂(例如ERT、分子伴