荧光激活细胞分选(FACS)、荧光共 振能量转移(FRET)、RT-PCR和/或Northern印迹方法。
[0037] 管理ASM病症的治疗
[0038]在多个实施方案中，溶血-SPM水平可作为ASM病症疗法的一部分测量。举例来说， ASM病症可以是尼曼-皮克病(NPD)，例如NPD-A、NPD-B或NPD-C。用于ASM病症的疗法可包括 施用一种或多种降低患者组织中SPM水平的治疗剂(例如ERT、分子伴侣疗法和/或底物减少 疗法）。举例来说，可使用患者内剂量递增酶替代治疗（ERT)方法，如公开于美国申请号 2011/0052559的ASM剂量递增方法，其在本文通过提述以其全文并入（参见举例来说，第 [0063]-[0075]段，对剂量递增方法进行了描述）。
[0039] 在多个实施方案中，公开了通过监测用于ASM病症的剂量递增疗法过程中标志物 如溶血-SPM来监测受试者不良副作用(例如毒性或有害水平的代谢物产生）的方法。所述方 法可包括从受试者收集生物样品、测量样品中溶血-SPM的水平，将所述样品中溶血-SPM的 水平与参照水平比较，和如果所述样品中溶血-SPM的水平与参照样品相比升高，则检测到 不良副作用。施用治疗剂的剂量后或施用下一剂量之前，可收集并评估一种或多种样品。举 例来说，可在施用治疗剂量后1分钟、5分钟、10分钟、30分钟或45分钟，或1、2、3、5、10、12、15 或20小时，或1、2、3、4、5天，或1、2、3、4周，或其间的任何时间段，或使用下一剂量之前收集 并评估样品。在一些实施方案中，所述参照样品是来自不具有ASM病症的对照受试者的样 品。在一些实施方案中，所述参照样品是来自施用更高浓度剂量的治疗剂前(或施用任何治 疗剂前）来自受试者的早期生物样品。在一些实施方案中，如果施用初始剂量或施用增加 (例如更高浓度)剂量的治疗剂(例如更高浓度的ERT)后溶血-SPM的水平相比参照样品中的 水平增加了预先确定的量或高于预先确定的阈值，则其可用作来自治疗的不良副作用的指 示。在一些实施方案中，如果溶血-SPM的水平未增加或未增加到高于阈值水平，则可用作不 良副作用并未发生的指示。
[0040] 在多个实施方案中，提供了针对ASM病症的疗法。所述疗法可包括施用一种或多种 降低患者组织中SPM水平的治疗剂(例如ERT、分子伴侣疗法和/或底物减少疗法）。在一些实 施方案中，所述疗法可包括ERT(例如ASM替代疗法）。所述疗法可包括在疗法过程中对受试 者升高的溶血-SPM水平进行监测和调整治疗剂的浓度(例如ERT的剂量浓度）以将溶血-SPM 水平降低至预先确定的阈值水平以下。在一些实施方案中，监测包括每次治疗剂剂量后或 施用每一后续剂量的治疗剂前，对样品的升高的溶血-SPM水平进行评估。在一些实施方案 中，每次剂量后的监测是任选的，且在一些治疗剂剂量后或在一些后续的治疗剂剂量施用 前周期性实施。
[0041]在一些实施方案中，疗法可包括以顺序剂量的渐增浓度施用ERT(例如ASM替代疗 法），在一些剂量后从患者收集生物样品（例如每次剂量后或每次后续剂量前）、检测样品中 的溶血-SPM水平(例如使用LC/MS/MS)，和在每次剂量后或下一剂量施用前对受试者升高的 溶血-SPM水平进行监测。举例来说，可收集生物样品并在施用ERT剂量1分钟、5分钟、10分 钟、30分钟或45分钟，或1、2、3、5、10、12、15或20小时，或1、2、3、4、5天，或1、2、3或4周后，或 其间的任何时间段后，或施用下一剂量前对升高的溶血-SPM进行监测。监测受试者可包括 从受试者收集生物样品、测量样品中溶血-SPM的水平，将样品中溶血-SPM的水平与参照水 平比较，且如果样品中溶血-SPM的水平与参照水平相比升高了预先确定的量，则调整ERT的 剂量。在一些实施方案中，参照样品是来自不具有ASM病症的对照受试者的样品。在一些实 施方案中，参照样品是施用更高浓度剂量的ERT前(或施用任何ERT前)来自受试者的更早的 生物样品。在一些实施方案中，如果受试者样品中溶血-SPM的水平增加预先确定的量和/或 比参照阈值更高，则其可用作ERT剂量应该降低、延迟或终止以避免毒性或有害水平的代谢 物产生的指示。在一些实施方案中，如果溶血-SPM的水平处于或低于阈值，则可施用相等或 更高浓度的后续剂量。
[0042]在多个实施方案中，提供了剂量递增疗法，包括将ERT以随时间渐增的剂量施用至 受试者以减少积累的SPM而不产生由积累的SPM的快速水解导致的毒性或有害水平的代谢 物。在一些实施方案中，在剂量递增疗法过程中对来自患者的生物样品的升高的溶血-SPM 水平进行监测，因为升高的溶血-SPM将表明毒性或有害水平代谢物的产生。在一些实施方 案中，如果检测到溶血-SPM水平高于阈值浓度，或检测到与之前样品中的水平相比溶血-SPM水平的大幅增加，则延迟或不施用增加剂量的ERLERT可通过任何适于实现治疗效果的 途径施用，包括静脉内、皮内、皮下、腹膜内、肺内、局部、鼻内、颜内或肌内。
[0043] 在一些实施方案中，ERT可包括酸性鞘磷脂酶(ASM)如重组人ASM(rhASM)的施用， 或ERT可包括修饰的ASM (例如修饰的rhASM)的施用。修饰的ASM可包含任何不显著改变其水 解溶酶体鞘磷脂成为神经酰胺和磷酸胆碱的能力的对酶的任何修饰(例如，修饰的ASM展示 至少约20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、99.5或99.9%的未修饰43]?的酶活性，或其间任 何百分数）。修饰的ASM的水解能力可通过本领域技术人员已知的技术评估，如描述于美国 专利号4,039,388、4,082,781、5,686,240和7,563,591 的那些，和国际公开号W0 2007/ 078806和W0 2006/058385的那些，其在本文以其全文通过提述并入。
[0044] 在一些实施方案中，ERT可包括重组人ASM(rhASM)或修饰rhASM的施用。本领域已 知存在多种人ASM同种型，其全部可用于本文公开的方法。参见例如美国申请号2011/ 0052559,其在本文通过提述以其全文并入(参见例如第[108]-[0117]段和[0124]-[0127] 段人ASM同种型及其酶偶联物和它们在ERT中的用途的讨论）。
[0045] 在一些实施方案中，将酶替代疗法以初始较低的、非毒性剂量施用至受试者，随后 在接下来的施用中逐渐增加。受试者可耐受而不产生毒性或有害水平的代谢物的最高剂量 的酶(如通过例如监测毒性标志物如溶血-SPM水平来检测）则可用作维持剂量。可替换地， 少于最高耐受剂量的治疗上有效的剂量可用作维持剂量。治疗上有效的剂量可包含在一轮 或多轮施用后足以降低ASM受试者中积累的鞘磷脂浓度至少约5、10、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%(或其中任何百分数）的任何剂量。
[0046] ASM病症如NPD的治疗需要足够高剂量的治疗剂(例如ERT、分子伴侣疗法和/或底 物减少疗法）以实现治疗剂在病理器官的充分分布(例如脾、肺、肝、心、肾和脑）。已显示在 ASM敲除小鼠中静脉施用重组人ASM后，大多数的ASM活性分布至肝，在其他器官如脾、肝、肾 和肺中检测到少量的ASM酶活活性。参见例如He等，Biochimia et Biophsyica Acta 1432: 251 -264(1999)。因此，具有升高浓度的治疗剂的剂量(例如高浓度的替代酶)对确保充分分 布和递送至例如具有ASM病症如NH)的受试者中的肺、肝、心和肾是必须的。
[0047] ASM敲除型小鼠的研究也已证明酶替代疗法可以足够高的剂量导致毒性或以其他 方式有害的鞘磷脂代谢物的产生。参见例如C.Nickerson,等，American Society of Human Genetics(2005);and J.Murray等，Society of Toxicology(2006)。不受理论限制，高剂量 ASM向NH)受试者的施用可导致大量积累的鞘磷脂水解成为神经酰胺和磷酸胆碱。神经酰胺 已知在细胞死亡中发挥作用且可以是促凋亡作用剂。参见例如Smith and Schuchman, FASEB 22:3419-3431 (2008)。因此，神经酰胺可促成在ASM敲除小鼠和NPD受试者中观察到 的毒性副作用。
[0048]因此，需要校准和协调疗法(例如ERT、分子伴侣疗法和/或底物减少疗法)进而提 供足够的治疗剂浓度以在整个病理器官中减少和预防溶酶体鞘磷脂的未来积累，同时也避 免过度浓度的毒性代谢物的产生。在一些实施方案中，经由管理剂量递增方案提供协调，其 通过评估一些剂量后或每次剂量后患者样品中毒性标志物如溶血-SPM的水平，且如果需要 则如本文所述调整剂量方案来进行。管理治疗剂的剂量可包括增加、减少或维持治疗剂的 浓度，和/或中止治疗。
[0049] 在多个实施方案中，治疗的剂量递增方法涉及施用一次或多次初始低剂量的治疗 剂(例如替代酶)至受试者以降低积累在受试者中的鞘磷脂的量。治疗剂的剂量随后可以全 身性的较高浓度施用直至达到由受试者耐受且治疗上有效的最高剂量。在一些实施方案 中，治疗剂是替代酶(例如rhASM)且将其施用进而使得在一种或多种病理器官中的酶活性 (例如患有ASM病症的患者中展示升高的SPM溶酶体水平的器官)为不患有ASM病症的受试者 (例如健康受试者）的相应器官中的活性水平的至少约5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、75%、80%、85%、90%、95% (或其间的任何百分 数)。
[0050] 在一些实施方案中，治疗ASM病症的方法可包括：（a)施用酶替代方案用于减少受 试者中积累的鞘磷脂底物，其包括：（i)将初始低剂量的rhASM或修饰的rhASM施用至受试 者;并（ii)施用逐渐更高剂量的rhASM或修饰的rhASM至受试者(剂量递增）；（b)在步骤(a) (i)和(a)(ii)中施用的一些剂量后或每次剂量后，对受试者升高的溶血-SPM水平和/或一 种或多种其他不良副作用的标志物进行监测（例如，使用LC/MS/MS以定量溶血-SPM的浓 度）；（c)检测到升高的溶血-SPM水平和/或检测到一种或多种其他不良副作用后，重复、减 少和/或终止剂量递增方法。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用维持方案，所述 维持方案包括施用等于或少于由受试者耐受的最高剂量的剂量作为维持剂量，且任选地进 一步包括在施用维持方案过程中监测升高的溶血-SPM水平。在一些实施方案中，rhASM或修 饰的rhASM的初始剂量可为约0 · 03mg/kg至约1 · Omg/kg，或约0 · lmg/kg至约0 · 5mg/kg(剂量 的浓度作为mg酶比kg体重测量）。在一些实施方案中，将增加的酶浓度的各后续剂量在之前 剂量的约1、2、3、4、5、6或7天，或1、2、3、4或5周后施用。在一些实施方案中，增加的酶的后续 剂量可以为约〇.l-5mg/kg的浓度(例如约0·1、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1、1·5、 2、2.5、3、3.5、4、4.5或511^/1^或其间的任何浓度）。
[0051]在一些实施方案中，在施用下一更高浓度的剂量前，将给定浓度的替代酶的剂量 施用至少两次（例如至少2、3、4或5次）。在一些实施方案中，逐渐更高的剂量可以比之前的 剂量高约〇 · 〇3mg/kg、0 · 05mg/kg、0 · lmg/kg、0· 2mg/kg、0 · 3mg/kg、0 · 4mg/kg、0 · 5mg/kg、 0·6mg/kg、0·7mg/kg、0·8mg/kg、0.9mg/kg、lmg/kg、1·2mg/kg、1·5mg/kg、1·75mg/kg、2mg/ kg、3mg/kg、4mg/kg或5mg/kg(或其间的任何值）。在一些实施方案中，逐渐更高的剂量可以 比之前剂量高约0.03至约0 · lmg/kg、约0 · lmg/kg至约0 · 5mg/kg、约0 · 5mg/kg至约lmg/kg、约 0. 5、g/kg 至约 2mg/kg、约 lmg/kg 至约 2mg/kg、约 2mg/kg 至约 4mg/kg 或约 2mg/kg 至约 5mg/kg (或其间的任何值）。在一些实施方案中，由受试者耐受而不产生毒性或有害代谢物的最高 剂量可以为约1.〇mg/kg至约3.Omg/kg。在一些实施方案中，将所述最高耐受剂量随后作为 维持剂量施用至人受试者。在一些实施方案中，大约每1至8周施用所述维持剂量(例如约每 1、 2、3、4、5、6、7或8周，或其间的任何时间段）。
[0052] 一旦确定最大耐受剂量(例如，不产生毒性或在其他方面有害的水平的代谢物的 剂量），其可用作维持剂量以在未来治疗受试者。维持剂量可每日、每周、每两周、每月、每两 月或每季(或其间的任何时间间隔）施用。对于升高的溶血-SPM水平的监测可在施用维持方 案的过程中实施，例如施用维持剂量后1、2、3、5、10、12、15