百里香酚在制备用于治疗真菌性角膜炎的药物中的应用的制作方法

[0001]
本发明属于制药技术领域，具体涉及百里香酚在制备用于治疗真菌性角膜炎的药物中的应用。


背景技术：

[0002]
真菌性角膜炎(fungal keratitis，fk)是由致病真菌引起的感染性眼病，能够引起角膜溃疡和穿孔，是致盲高、治疗棘手的角膜疾病。常见的致病菌包括镰刀菌和曲霉菌。在我国，眼部植物性外伤是致病的主要原因，因此与植物相关的烟曲霉菌成为我国真菌性角膜炎患者的最常见致病菌。在临床工作中由于患者就诊不及时，加之常见的抗真菌药物存在水溶性不佳及角膜穿透性差等缺点，治疗效果往往不佳，从而导致部分患者发展为角膜穿孔，甚至失明，寻找一种安全有效的抑制角膜真菌感染的药物是非常必要的。
[0003]
真菌感染角膜后，角膜中的模式识别受体与真菌表面的病原体相关分子模式的相互识别，启动角膜的固有免疫应答清除真菌病原体。角膜固有免疫应答启动后，大量的中性粒细胞及趋化因子聚集，导致角膜水肿和炎症浸润，甚至造成角膜溃疡甚至穿孔。因此，过强的免疫反应在控制外来感染的同时对角膜组织造成损伤，使角膜难以恢复透明，对患者视力造成严重的损伤。因此，保护角膜抵御真菌的感染以及避免角膜产生过强的炎症反应是治疗真菌性角膜炎的关键。
[0004]
百里香酚是多种花草植物精油中提取的单萜酚类化合物，由于其天然易获取以及副作用小的优势，近年来在很多行业中普遍应用。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供百里香酚的新制药用途。
[0006]
为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了百里香酚在制备用于治疗真菌性角膜炎的药物中的应用。
[0007]
在本发明所提供的上述制药用途中，百里香酚用于抑制角膜真菌生长，从而达到抑制角膜的炎症反应程度的治疗作用。其中，所述的角膜真菌为烟曲霉菌。
[0008]
在本发明所提供的上述制药用途中，所述百里香酚抑制角膜组织中lox-1/il-1β信号通路。更具体地，所述角膜组织中lox-1/il-1β信号通路为烟曲霉菌刺激的人角膜上皮细胞中lox-1/il-1β信号通路。
[0009]
本发明的实施方式还提供了一种用于治疗真菌性角膜炎的药物，该药物包含百里香酚和药学上可接受的辅料。
[0010]
本发明首次提出了百里香酚在制备用于治疗真菌性角膜炎的药物中的应用。本发明将不同浓度的百里香酚与烟曲霉菌孢子共培养24小时，以研究不同浓度的百里香酚对烟曲霉菌的抑制作用。在体内研究中，采用c57bl/6小鼠建立真菌性角膜炎模型，研究百里香酚对模型小鼠角膜临床评分、中性粒细胞的募集、lox-1/il-1β信号通路的影响。在体外研究中，采用烟曲霉菌刺激的人角膜上皮细胞模型对百里香酚抑制lox-1/il-1β信号通路进
行验证。上述实验结果证实，百里香酚可抑制角膜烟曲霉菌的生长，在体内和体外条件下均具有对真菌性角膜炎的治疗作用。
附图说明
[0011]
图1是实施例1中烟曲霉菌孢子在不同浓度百里香酚中培养24小时的光密度值的结果图；
[0012]
图2是实施例1中不同浓度百里香酚处理组中真菌细胞壁染色的结果图；
[0013]
图3是实施例2中真菌性角膜炎小鼠模型建立3天后，dmso处理的感染组和百里香酚处理的感染组小鼠角膜在裂隙灯显微镜下的对比图；
[0014]
图4是实施例2中真菌性角膜炎小鼠模型建立3天后，dmso处理的感染组和百里香酚处理的感染组临床评分结果图；
[0015]
图5是实施例2中真菌性角膜炎小鼠模型建立2天后，dmso处理的感染组和百里香酚处理的感染组采用免疫荧光技术检测炎症细胞募集情况的荧光图；
[0016]
图6是实施例2中真菌性角膜炎小鼠模型建立2天后，dmso处理的感染组和百里香酚处理的感染组髓过氧化物酶活性评分结果；
[0017]
图7是实施例2中采用聚合酶链式反应检测百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜中lox-1 mrna表达的影响的结果图；
[0018]
图8是实施例2中采用蛋白质免疫印迹检测百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜中lox-1蛋白分泌的影响的结果图；
[0019]
图9是实施例2中采用聚合酶链式反应检测百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜中il-1βmrna表达的影响的结果图；
[0020]
图10是实施例2中采用蛋白质免疫印迹检测百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜中il-1β蛋白分泌的影响的结果图；
[0021]
图11是实施例3中采用聚合酶链式反应检测百里香酚对真菌刺激的人角膜上皮细胞中lox-1 mrna表达的影响的结果图；
[0022]
图12是实施例3中采用蛋白质免疫印迹检测百里香酚对真菌刺激的人角膜上皮细胞中lox-1蛋白分泌的影响的结果图；
[0023]
图13是实施例3中采用聚合酶链式反应检测百里香酚对真菌刺激的人角膜上皮细胞中il-1βmrna表达的影响的结果图；
[0024]
图14是实施例3中采用蛋白质免疫印迹检测百里香酚对真菌刺激的人角膜上皮细胞中il-1β蛋白分泌的影响的结果图。
具体实施方式
[0025]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
[0026]
百里香酚是多种花草植物精油中的天然单萜酚类化合物，具备一定药用潜力。本发明的具体实施方式中主要探讨：百里香酚对烟曲霉菌生长的抑制作用，以及在体内和体
外条件下对真菌性角膜炎的治疗作用。在体内研究中，采用c57bl/6小鼠建立真菌性角膜炎模型，研究百里香酚对模型小鼠角膜临床评分、中性粒细胞募集、lox-1/il-1β信号通路的影响。在体外研究中，采用烟曲霉菌刺激的人角膜上皮细胞模型对百里香酚抑制lox-1/il-1β信号通路进行验证。
[0027]
本发明的实施方式所制定的实验方案和结果如下：
[0028]
将分生孢子溶于沙氏培养液，制备浓度为5
×
103cfu/ml混合液，与不同浓度的百里香酚在37℃培养箱中培养24小时。测量460nm处的光密度。随后，对菌丝细胞壁进行荧光染色。结果显示，与对照组相比，百里香酚浓度为50μg/ml时能显著抑制烟曲霉的生长，百里香酚浓度为500μg/ml时能完全抑制烟曲霉菌孢子萌发。
[0029]
在体内实验中，使用基质内注射建立真菌性角膜炎小鼠模型，通过结膜下注射百里香酚或等量dmso对模型小鼠的不同分组进行干预，每天采用裂隙灯显微镜观察小鼠角膜并拍摄照片。第二天收集小鼠眼球和角膜，通过免疫荧光法和髓过氧化物酶(mpo)测定法，检测角膜中性粒细胞的募集情况；第3天收集小鼠角膜，通过聚合酶链式反应实验，检测角膜中lox-1及il-1β的mrna表达，通过蛋白质免疫印迹实验，检测角膜中lox-1及il-1β的蛋白水平。结果显示，与dmso对照组相比，百里香酚干预的真菌感染组角膜炎症反应程度减轻，中性粒细胞的募集减少，lox-1/il-1βmrna表达及蛋白水平降低。
[0030]
在体外实验中，采用人角膜上皮细胞对体内研究的抑炎机制进行验证。烟曲霉菌分生孢子刺激人角膜上皮细胞，随后用百里香酚或dmso对不同分组进行干预，8小时或16小时收集细胞。8小时收集细胞用于通过聚合酶链式反应实验检测人角膜上皮细胞中lox-1及il-1β的mrna表达。16小时后收集细胞用于通过蛋白质免疫印迹实验检测人角膜上皮细胞中lox-1及il-1β的蛋白水平。结果与小鼠角膜炎模型结果一致，与dmso对照相比，百里香酚干预可抑制烟曲霉菌刺激组中lox-1/il-1β。
[0031]
实施例1百里香酚抑制烟曲霉菌生长
[0032]
1.实验材料
[0033]
1.1实验药品：百里香酚(购自selleck公司)；卡尔科弗卢尔荧光增白剂(购自sigma-aldrich公司)
[0034]
1.2实验真菌：烟曲霉菌3.0772株(中国普通微生物菌种保藏管理中心)
[0035]
2.实验方法
[0036]
2.1真菌制备
[0037]
将烟曲霉菌菌株接种于沙氏培养基上，37℃恒温培养箱培养2-3天。刮取菌丝及分生孢子取放入5ml无菌pbs中形成混合液，无菌纱布过滤除菌丝。4℃4500rpm离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入5ml菌pbs重悬，形成分生孢子悬浮液。用无菌pbs将分生孢子的浓度调至5
×
106cfu/ml。
[0038]
2.2最低抑菌浓度实验
[0039]
用沙氏培养液将分生孢子悬浮液稀释至5
×
103cfu/ml。将百里香酚溶解在含分生孢子的沙氏培养液中，进行二倍稀释，使百里香酚的浓度最大为500μg/ml，最小为25μg/ml。以每孔100μl的体积分配到96孔板中，重复次数为3。37℃恒温培养箱培养24小时后，用酶标仪测量460nm处光密度值。然后，4℃4500rpm离心5分钟，弃上清，每孔中添加卡尔科弗卢尔荧光增白剂对菌丝细胞壁进行荧光染色，30分钟后用荧光显微镜对各孔菌丝进行观察，并
捕获数字图像。
[0040]
3.实验结果
[0041]
采用最低抑菌浓度法检测百里香酚抑制烟曲霉菌生长。图1是烟曲霉菌孢子在不同浓度百里香酚中培养24小时的光密度值的结果图；图2是不同浓度百里香酚处理组中真菌细胞壁染色的结果图(图中右下角数字代表百里香酚浓度，单位为μm)。
[0042]
如图1所示，与对照组相比，在50μg/ml时百里香酚能显着抑制烟曲霉的生长(p<0.01)。如图2所示，蓝色荧光代表烟曲霉菌菌丝细胞壁，结果显示完全抑制烟曲霉孢子萌发的浓度为500μg/ml。
[0043]
实施例2百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜临床评分、中性粒细胞募集、lox-1/il-1β信号通路的影响。
[0044]
1.实验材料
[0045]
1.1实验药品：百里香酚(购自selleck公司)
[0046]
1.2实验动物：c57bl/6小鼠(购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)
[0047]
1.3实验真菌：烟曲霉菌3.0772株(中国普通微生物菌种保藏管理中心)
[0048]
2.实验方法
[0049]
2.1模型小鼠
[0050]
选择8周龄健康清洁级c57bl/6雌性小鼠作为研究对象。实验前用裂隙灯检查排除眼部疾患，选择右眼为实验眼。实验小鼠的所有操作均符合中国科学技术部关于实验动物人性化治疗准则(vgkfcz-2006
–
398)的规定，并符合美国眼科和视觉研究协会(the association for research in vision and ophthalmology，arvo)关于在眼科和视觉研究中动物使用的原则和标准。
[0051]
2.2百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜临床评分、中性粒细胞募集、lox-1/il-1β信号通路的影响
[0052]
c57bl/6小鼠随机分为dmso对照组、dmso处理的真菌感染组、百里香酚处理组和百里香酚处理的真菌感染组。腹腔内注射8％水合氯醛对小鼠进行麻醉后，用微型注射器将2.5μl浓度为2.5
×
106cfu/ml的分生孢子悬浮液注入真菌感染组和百里香酚处理的真菌感染组小鼠角膜基质中。30分钟后对照组和真菌感染组小鼠球结膜下注入5μl pbs，百里香酚处理组和百里香酚处理的真菌感染组小鼠球结膜下注入5μl溶解于dmso中的百里香酚(50μg/ml)。建模后每天用裂隙灯显微镜观察小鼠角膜并拍照，建模后1天、2天、3天对各组模型小鼠结膜下注射dmso或百里香酚进行干预。建模后第2天处死小鼠，取眼球用于免疫荧光实验，取角膜用于髓过氧化物酶检测。建模后第3天处死小鼠，将角膜用于聚合酶链式反应及蛋白质免疫印迹实验，检测小鼠角膜中lox-1和il-1β的表达。
[0053]
3.实验结果
[0054]
3.1百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜临床评分的影响
[0055]
图3是真菌性角膜炎小鼠模型建立3天后，dmso处理的感染组和百里香酚处理的感染组小鼠角膜在裂隙灯显微镜下的对比图；图4是真菌性角膜炎小鼠模型建立3天后，dmso处理的感染组和百里香酚处理的感染组临床评分结果图。
[0056]
如图3、4所示，与dmso处理的感染组相比，百里香酚处理的感染组中小鼠角膜的炎症程度和临床评分显著降低。
[0057]
3.2百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜中炎症细胞募集的影响
[0058]
图5是真菌性角膜炎小鼠模型建立2天后，dmso处理的感染组和百里香酚处理的感染组采用免疫荧光技术检测炎症细胞募集情况的荧光图；图6是真菌性角膜炎小鼠模型建立2天后，dmso处理的感染组和百里香酚处理的感染组髓过氧化物酶活性评分结果；
[0059]
如图5、6所示，与dmso处理的感染组相比，百里香酚处理可以明显减少真菌性角膜炎模型小鼠感染2天时角膜中中性粒细胞的募集数量以及髓过氧化物酶的活性。
[0060]
3.3百里香酚处理对真菌性角膜炎模型小鼠角膜lox-1/il-1β分泌的影响
[0061]
图7是采用聚合酶链式反应检测百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜中lox-1 mrna表达的影响的结果图；图8是采用蛋白质免疫印迹检测百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜中lox-1蛋白分泌的影响的结果图；图9是采用聚合酶链式反应检测百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜中il-1βmrna表达的影响的结果图；图10是采用蛋白质免疫印迹检测百里香酚对真菌性角膜炎模型小鼠角膜中il-1β蛋白分泌的影响的结果图。
[0062]
如图7、图8所示，聚合酶链式反应实验表明，与dmso处理的感染组相比，百里香酚处理的真菌感染组小鼠角膜中lox-1及il-1β的mrna表达显著降低。如图9、图10所示，蛋白质免疫印迹实验表明，百里香酚处理的真菌感染组小鼠角膜中lox-1及il-1β的蛋白水平较dmso处理的感染组显著降低。
[0063]
实施例3百里香酚能够阻止真菌刺激的人角膜上皮细胞中lox-1/il-1β通路
[0064]
1.实验材料
[0065]
1.1实验药品：百里香酚(购自selleck公司)
[0066]
1.2实验细胞：人角膜上皮细胞(购自中山眼科中心眼表实验室)
[0067]
1.3实验真菌：烟曲霉菌3.0772株(中国普通微生物菌种保藏管理中心)
[0068]
2.实验方法
[0069]
2.1细胞模型实验
[0070]
将人角膜上皮细胞置于37℃，5％co2的培养箱中，培养至细胞密度达到80％。细胞分为dmso对照组、dmso处理的真菌刺激组、百里香酚处理组和百里香酚处理的真菌刺激组。将百里香酚(终浓度50μg/ml)加入百里香酚处理组和百里香酚处理的真菌刺激组细胞培养液中，将等量的dmso加入对照组和真菌刺激组细胞培养液中。随后，将烟曲霉菌分生孢子加入dmso处理的真菌刺激组和百里香酚处理的真菌刺激组细胞培养液中。37℃恒温箱中孵育8小时后，收集细胞用于聚合酶链式反应实验，检测lox-1及il-1β的mrna表达。真菌刺激16小时后，收集细胞用于蛋白质免疫印迹实验，检测lox-1及il-1β的蛋白水平。
[0071]
3.实验结果
[0072]
图11是采用聚合酶链式反应检测百里香酚对真菌刺激的人角膜上皮细胞中lox-1 mrna表达的影响的结果图；图12是采用蛋白质免疫印迹检测百里香酚对真菌刺激的人角膜上皮细胞中lox-1蛋白分泌的影响的结果图；图13是采用聚合酶链式反应检测百里香酚对真菌刺激的人角膜上皮细胞中il-1βmrna表达的影响的结果图；图14是采用蛋白质免疫印迹检测百里香酚对真菌刺激的人角膜上皮细胞中il-1β蛋白分泌的影响的结果图；
[0073]
如图11、图12所示，聚合酶链式反应实验表明，与dmso处理的真菌刺激组相比，百里香酚处理的真菌刺激组人角膜上皮细胞中lox-1及il-1β的mrna表达显著降低。如图13、图14所示，蛋白质免疫印迹实验表明，百里香酚处理的真菌刺激组人角膜上皮细胞中lox-1
及il-1β的蛋白水平与pbs处理的真菌刺激组相比显著降低。
[0074]
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。