一种有机共轭小分子纳米粒子及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种有机共轭小分子纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术：

细菌感染每年威胁着数百万人的生命安全，夺取1700多万人的生命，并且逐渐成为全球公共健康问题。传统的治疗方法包括采用抗生素，金属离子，季铵盐离子等，但这些方法由于高成本，高毒性，对环境高危害等因素受到了应用限制，尤其是细菌对抗生素产生的抗药性，导致了多重耐药性的细菌产生，特别是抗多重耐药性的革兰氏阴性菌。在此情况下，因光动力抗菌治疗(pdat)拥有非创性，选择性、高空间分辨性使其受到了广泛的关注。在pdt中，光源，光敏剂和氧分子是三个重要的组成部分。在光照条件下，光敏剂被激活到单重激发态，通过系间窜越到三重激发态，三重激发态回到基态时将其能量传递给周围氧分子，产生活性氧物种(ros)，达到抗菌效果。研究人员希望得到拥有光吸收能强，光稳定性好和水溶性良好的光敏剂，但传统的光敏剂例如有机染料和磷光过渡金属配合物很难满足上述要求。相比其他光敏剂材料，共轭分子因其特殊的分子结构，光学特性和低成本的特点被认为是一种理想的光敏剂材料。

但现有的疏水共轭分子均难与菌发生相互作用，使其杀菌效果较差。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种有机共轭小分子纳米粒子及其制备方法和应用，该有机共轭小分子纳米粒子具有光毒性和暗毒性协同的杀菌效果。

本发明提供了一种有机共轭小分子纳米粒子，包括有机共轭小分子；

和对所述有机共轭小分子表面修饰的聚苯乙烯马来酸酐；

所述有机共轭小分子选自式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ和式iv结构中的一种或多种；

所述聚苯乙烯马来酸酐具有式ⅴ结构：

优选地，所述有机共轭小分子纳米粒子的平均粒径为80～140nm。

优选地，所述有机共轭小分子的物质的量和聚苯乙烯马来酸酐的质量比为(0.8～1.2)mol:(1.8～2.4)mg。

本发明提供了一种上述技术方案所述有机共轭小分子纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

将有机共轭小分子溶液和聚苯乙烯马来酸酐溶液在水相中混合，得到混合液；

将所述混合液中有机溶剂去除后升温浓缩，过滤，得到有机共轭小分子纳米粒子。

优选地，所述有机共轭小分子溶液中的溶剂和聚苯乙烯马来酸酐溶液中的溶剂均选自四氢呋喃。

优选地，所述有机共轭小分子溶液的浓度为(0.8～1.2)mmol/l；

所述聚苯乙烯马来酸酐溶液的浓度为(1.8～2.4)mg/ml。

优选地，所述升温浓缩的温度为90～99℃。

本发明提供了一种上述技术方案所述有机共轭小分子纳米粒子或上述技术方案所述制备方法制备的有机共轭小分子纳米粒子在制备抗菌药物中的应用。

优选地，制备抗革兰氏阴性菌药物中的应用。

本发明提供了一种有机共轭小分子纳米粒子，包括有机共轭小分子；和对所述有机共轭小分子表面修饰的聚苯乙烯马来酸酐(psma)；所述有机共轭小分子选自式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ和式iv结构中的一种或多种；所述聚苯乙烯马来酸酐具有式ⅴ结构。本发明提供的有机共轭小分子纳米粒子中有机共轭小分子作为光敏剂，用两亲分子psma进行表面修饰，增强了纳米粒子的水溶性，利于与菌进行相互作用，同时具有产生较高的活性氧效率，表明其具有光毒性；其连接的氰基基团表明其对杀菌活性有重要的贡献作用，表明其具有暗毒性。因此，本申请提供的有机共轭小分子纳米粒子具有光毒性和暗毒性协同的作用，可作为抗菌药物治疗细菌引起的感染。此外，本发明提供的制备方法简单且无需任何功能修饰，合成收率高，易于实现工业化。实验结果表明：有机共轭小分子纳米粒子在光照条件下抗菌效果达到了99％。

附图说明

图1为nps1-4的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱；

图2为nps1-4的粒径分布图；

图3为nps1-4的活性氧测定曲线；

图4为不同浓度nps1-4与e.coli作用后zeta电位表征；

图5中a为nps1与e.coli作用后等温滴定量热曲线；图5中b为nps2与e.coli作用后等温滴定量热曲线；

图6中a为不同浓度nps1-4在避光条件下杀菌效率图；图6中b为不同浓度nps1-4在曝光条件下杀菌效率图；

图7为nps1-4(4.8μmol/l)与e.coli作用后的lb琼脂平板图；

图8为nps1-4(4.8μmol/l)与e.coli作用后的电子扫描显微镜图。

具体实施方式

本发明提供了一种有机共轭小分子纳米粒子，包括有机共轭小分子；

和对所述有机共轭小分子表面修饰的聚苯乙烯马来酸酐；

所述有机共轭小分子选自式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ和式iv结构中的一种或多种；

所述聚苯乙烯马来酸酐具有式ⅴ结构：

在本发明中，所述有机共轭小分子纳米粒子的平均粒径优选为80～140nm，更优选为100～110nm。具体实施例中，所述有机共轭小分子纳米粒子的平均粒径为104.3±2.2nm。

所述聚苯乙烯马来酸酐的分子量为1300～1700g/mol，优选为1400～1500g/mol；本发明具体实施例中，所述聚苯乙烯马来酸酐的分子量为1500g/mol，购买于天津天津希恩思生化科技有限公司。在本发明中，所述有机共轭小分子的物质的量和聚苯乙烯马来酸酐的质量比优选为(0.8～1.2)mol:(1.8～2.4)mg，更优选为(0.9～1.1)mol:(1.9～2.4)mg；具体实施例中，所述有机共轭小分子的物质的量和聚苯乙烯马来酸酐的质量比为1.0mol:2.0mg。

在本发明中，所述式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ和式iv结构的有机共轭小分子均为市售商品或本领域技术人员熟知的制备方法自行制备。所述ⅰ结构的有机共轭小分子优选按照synthesis,characterizationandpropertiesofelectrondonor-acceptorcomplexesbasedon9,9-diarylfluorenebyouyang,mietalfromwulihuaxuexuebao,27(6),1516-1524；2011中记载的方法进行制备；式ⅱ结构的有机共轭小分子优选按照anaggregation-inducedemissivechromophoreasaratiometricfluorescentsensorforcyanideinaqueousmediabyfu,guang-liang；zhao,cui-huafromtetrahedron(2013),69(6),1700-1704中记载的方法进行制备；式ⅲ和式iv结构的有机共轭小分子优选按照highlysolid-stateemissivepara-terphenylslaterallysubstitutedwithadiphenylaminogroupbyzhao,cui-hua；zhao,yi-hong；pan,hong；fu,guang-liangfromchemicalcommunications(2011),47(19),5518-5520中记载的方法进行制备。

本发明提供了一种上述技术方案所述有机共轭小分子纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

将有机共轭小分子溶液和聚苯乙烯马来酸酐溶液在水相中混合，得到混合液；

将所述混合液中有机溶剂去除后升温浓缩，过滤，得到有机共轭小分子纳米粒子。

本发明将有机共轭小分子溶液和聚苯乙烯马来酸酐溶液在水相中混合，得到混合液。在本发明中，所述有机共轭小分子溶液中的溶剂优选选自四氢呋喃。所述有机共轭小分子溶液的浓度优选为(0.8～1.2)mmol/l，更优选为(0.9～1.1)mmol/l；具体实施例中，所述有机共轭小分子溶液的浓度为1mmol/l。所述聚苯乙烯马来酸酐溶液中的溶剂优选选自四氢呋喃；所述聚苯乙烯马来酸酐溶液的浓度优选为(1.8～2.4)mg/ml，更优选为(1.9～2.4)mg/ml；具体实施例中，所述聚苯乙烯马来酸酐溶液的浓度为2mg/ml。

本发明优选将有机共轭小分子溶液和聚苯乙烯马来酸酐溶液分别采用0.22μm的有机相滤膜过滤后备用。本发明分别取上述有机共轭小分子溶液和聚苯乙烯马来酸酐溶液至四氢呋喃中，混匀，再倒入水中；所述有机共轭小分子溶液、聚苯乙烯马来酸酐溶液、四氢呋喃和水的体积比优选为0.18～0.22:3.5～4.5:9～11，更优选为0.19～0.21:3.8～4.2:9.5～10.5，最优选为0.2:4:10。具体实施例中，本发明将200μl有机共轭小分子溶液和200μl聚苯乙烯马来酸酐溶液至4ml四氢呋喃中，混匀，再倒入10ml水中。本发明分别取上述有机共轭小分子溶液和聚苯乙烯马来酸酐溶液至四氢呋喃中，优选超声混匀。倒入水中后继续超声4～6min。

得到混合液后，本发明将所述混合液中有机溶剂去除后升温浓缩，过滤，得到有机共轭小分子纳米粒子。本发明优选采用通氮气的方式将混合液中有机溶剂去除；具体实施例中，通氮气的时间为55～65min。升温浓缩的温度优选为90～99℃，更优选为96～99℃；浓缩的方式优选为水浴浓缩，具体实施例中，水浴浓缩的温度为99℃。本发明优选浓缩至混合液体积的45～60％；具体实施例中，水浴浓缩至5ml。

浓缩后，本发明将浓缩产物再过滤，得到有机共轭小分子纳米粒子。本发明优选采用0.22μm的水相滤膜进行过滤。

本发明提供了一种上述技术方案所述有机共轭小分子纳米粒子在制备抗菌药物中的应用。本发明优选将其应用在制备抗革兰氏阴性菌药物中。具体实施例中，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌。

具体实施例中，所述菌液的od600＝1.0。本发明采用1.6～4.8μmol/l的纳米粒子与菌液混合；具体分别为1.6μmol/l、3.2μmol/l、4.8μmol/l。

本发明提供的有机共轭小分子纳米粒子在抗菌中应用，能够去制备抗菌药物，拓展了抗菌材料，对致病菌实现了有效的光动力杀伤。

有机共轭小分子经psma修饰后，增强了水溶性，利于有机共轭小分子与菌进行相互作用。有机共轭小分子纳米粒子在白光照射下，其电子接受能量后从基态跃迁到激发态，通过系间窜越方式跃迁到三线态，从三线态回到基态时会敏化周围氧分子产生活性氧物种。在体系中存在活性氧自由基时，会与细胞膜上的酯类发生过氧化反应，导致细菌的细胞膜破裂，细胞质外流，从而实现了对菌的有效光动力杀伤。同时，发现有机共轭小分子所连接的氰基基团对杀菌活性有重要的贡献作用，具有一定的暗毒性，制备的纳米粒子具有光毒性和暗毒性协同的杀菌效果。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种有机共轭小分子纳米粒子及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

采用纳米沉淀法制备有机共轭小分子纳米粒子

具体步骤为：将具有式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ和式iv结构的有机共轭小分子分别溶解于四氢呋喃(thf)溶液中，配置浓度为1mmol/l，经有机相滤膜过滤(0.22μm)，备用。psma溶解于thf溶液中，配置浓度为2mg/ml，经有机相滤膜过滤(0.22μm)，备用。取上述两种溶液各200μl，加入到装有4ml的thf溶液中，超声混匀。随后倒入装有10ml超纯水的烧瓶中，继续超声约5min。通入氮气约1h，去除体系中的thf，继续通入氮气，水浴锅设置(99℃)进行水浴浓缩，至体系为5ml，经水相滤膜过滤(0.22μm)，制备得到有机共轭小分子纳米粒子溶液，分别记作nps1、nps2、nps3和nps4。

图1为上述制备的纳米粒子的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，图2为上述制备的纳米粒子粒径分布图，平均粒径可达104.3±2.2nm。

实施例2

对制备的有机共轭小分子纳米粒子活性氧测试

活化2,7-二氯荧光素(dcfh)

取4.8mg的2,7-二氯荧光素二乙酸酯(dcfh-da)于1.5ml离心管中，加入1ml乙醇，混匀，得到浓度为10mmol/l的dcfh-da原液。取50μl原液于1.5ml离心管中，加入450μl乙醇混匀，稀释至1mmol/l。加入2ml0.01mnaoh溶液，混匀，25℃活化30min。将活化后液体加入10mlph>7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)，放在冰盒中避光保存，备用。

对照组是单独的dcfh，1ml活化的dcfh溶液加100μlpbs，直接光照，每光照1min测一次，测定总时间是4min。

ros测定：

取1ml活化后的液体于比色皿中，加入100μl的nps溶液，混匀后，用荧光光谱仪测定混合液的荧光发射光谱。之后每光照1min(白光光源强度为0.5mw/cm²)测一次荧光光谱，重复上述步骤。测定总时间为4min。荧光光谱激发波长为488nm，收集波长范围为500-700nm，取524nm处荧光强度数据做图。

为了测试所制备的有机共轭小分子纳米粒子nps1-4产生活性氧的效率，进行了活性氧测试，结果如图4所示。当体系存在nps1和nps2时，在光照条件下，强度为(0.5mw/cm²)，dcfh的荧光强度随着光照时间的增加明显增强，表明nps1和nps2具有较高的产生活性氧效率，存现光动力杀菌的可能性。nps3和nps4相比对照组，dcfh的荧光强度增长较为缓慢，表明nps3和nps4的杀菌效率不以光毒性为主，表明其在后面的杀菌效率与其分子结构和所连氰基基团有关。

实施例3

e.coli与有机共轭小分子纳米粒子作用后进行电势变化测定和等温滴定量热(itc)测定

为了进一步探究有机共轭小分子纳米粒子与e.coli作用机理，进行了电势测定和itc测定，实验步骤如下：

电势测定

取e.coli(od600＝1.0)的菌液100μl，分别加入不同浓度的(0μmol/l、1.6μmol/l、3.2μmol/l、4.8μmol/l)nps，最后加入磷酸盐缓冲液(pbs)使终体积为500μl，混匀后在37℃下培育30min。之后离心(7100rpm，2min)，去除未结合的nps。将菌株重新悬浮于1ml超纯水中，冰浴保存，准备测量电势。

通过图4中实验数据结果表明e.coli与不同浓度的nps(0μmol/l、1.6μmol/l、3.2μmol/l、4.8μmol/l)混合培养后，e.coli表面电势无明显变化。出现这一电势变化趋势可能的原因为制备的nps粒径较小，附着在e.coli表面后未与菌表面细胞膜带负电荷的基团相互作用，从而导致电势无明显变化。

itc测定

随后选取了nps1和nps2作为代表进行itc曲线测定。在样品池中分别加入pbs溶液和e.coli菌液，nps1和nps2溶液通过注射的方式加入到样品池中，通过搅拌器搅拌，转速为60rpm。通过仪器的温度传感装置测量与空白组温差，拟合itc曲线后获得相应的热力学参数。实验条件为25.00±0.01℃环境下进行。实验重复进行，使得标准偏差在±4％以内。

如图5所示，向菌液加入nps1时，菌表面结合nps1后为放热反应，随着nps1溶液滴加量的增加，体系放出的热量逐渐变少，最后趋势接近于0，表明nps1与e.coli的结合接近饱和状态，itc曲线近似呈现s型，相似变化趋势也可在nps2中观察到。通过曲线的变化趋势，获得了相应热力学参数。nps1和nps2与e.coli的结合常数k较大(分别为2.45×10⁷±7.45×10⁶，1.79×10⁷±2.51×10⁶)，表明nps1和nps2均与e.coli的结合作用力较强。nps1和nps2两种纳米粒子表面电势为负，排除了与菌发生静电相互作用。根据nps1和nps2热力学参数δh和δs的变化，分析出两种nps与菌结合作用力较强的原因为nps表面的疏水结构与菌表面的疏水基团相互作用的结果。同时纳米粒子的表面存在的羧基基团可能与菌表面的蛋白和氨基酸发生氢键作用，表明nps1-2与e.coli存在非特异性的相互作用。

实施案例4有机共轭小分子纳米粒子抗菌实验

在37℃下，取100μl的e.coli菌液与不同浓度的nps(1.6μmol/l，3.2μmol/l，4.8μmol/l)混合培养30min。之后在白光光源下照射30min，强度为75mw/cm²。光照结束后e.coli在pbs溶液中连续稀释1×10⁴倍。取100μl菌液涂在含有氨苄(100mg/ml)的琼脂培养基上，在37℃下培养12h。对照组在光照步骤中改为避光30min。选用的一次性灭菌培养皿直径为90mm。培养结束后，进行平板计数，根据下列公式计算抑菌率(ir)：

c为杀菌实验中实验组菌落总数，c0为在杀菌实验中不加入nps空白组菌落总数

抗菌结果如图6所示，nps1与e.coli作用后，在避光条件下，随nps1浓度(1.6-4.8μmol/l)的增加，抑菌率从14％增长到28％，可看出杀菌效果不明显。在光照条件下，杀菌效率有较为明显的提升，4.8μmol/l浓度下杀菌效果达到了62％，证明其光毒性优于暗毒性，表明nps1主要依赖于光照后产生ros的方式进行杀菌。随着nps2浓度的增加，其暗毒性逐渐增强，在终浓度为4.8μmol/l时，杀菌效果达到了89％。在光照条件下，其光毒性同样优于其暗毒性，在终浓度时杀菌效果达到了99％，表明nps2具有光毒性和暗毒性协同的作用。nps3在相同浓度范围内光照条件下比避光条件下有较弱提高，与其在光照条件下产生ros效率较低有关，可能归因于该纳米粒子分子结构。nps4的杀菌效果如紫色柱状图所示，在避光和光照条件下杀菌效果变化不大，结果暗示nps4主要以暗毒性方式进行杀菌。其中nps2，nps3和nps4具有相同的碳骨架结构，所不同为所连接的共轭基团，因此，可进行对比分析，杀菌实验结果表明氰基基团对杀菌活性有重要的贡献。

在高浓度(4.8μmol/l)下，菌落在lb培养基中的生长情况如图7所示，可看出加入纳米粒子后与对照组相比，菌落数量有明显减少的趋势。为了进一步观察菌形态，采用扫描电子显微镜(sem)进一步观察在高浓度(4.8μmol/l)下其细菌形态，结果如图8所示。当体系不加入nps时，在避光和光照条件下，e.coli均呈现完整的细菌形态，可观察到菌之间完整的边界，表现出良好的生长状态，同时表明光照对于菌的生长无明显影响。高浓度情况下，在避光条件时，菌表面的细胞膜开始出现变形，凹陷等现象；在光照条件下，菌表面破坏程度加深，出现破裂融合等现象，与抗菌实验结果一致。

综上，本发明制备了有机共轭小分子纳米粒子，并且可用于对e.coli实现了有效的光动力杀伤。制备的纳米粒子nps1和nps2在白光照射下，具有较高的产生活性氧效率，存在光动力杀菌的可能性。通过电势和itc的测定，表明有机共轭小分子纳米粒子与菌存在非特性结合。杀菌实验结果表明，nps1和nps2能够对e.coli实现有效的光动力杀伤，并且存在一定的暗毒性。nps2，nps3，nps4具有相似的碳骨架结构，通过对比分析在相同浓度下的杀菌效率，实验结果表明氰基基团对e.coli的杀菌具有重要的贡献作用。

由以上实施例可知，本发明提供了一种有机共轭小分子纳米粒子，包括有机共轭小分子；和对所述有机共轭小分子表面修饰的聚苯乙烯马来酸酐(psma)；所述有机共轭小分子选自式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ和式iv结构中的一种或多种；所述聚苯乙烯马来酸酐具有式ⅴ结构。本发明提供的有机共轭小分子纳米粒子中有机共轭小分子作为光敏剂，用两亲分子psma进行表面修饰，增强了纳米粒子的水溶性，利于与菌进行相互作用，同时具有产生较高的活性氧效率，表明其具有光毒性；其连接的氰基基团表明其对杀菌活性有重要的贡献作用，表明其具有暗毒性。因此，本申请提供的有机共轭小分子纳米粒子具有光毒性和暗毒性协同的作用，可作为抗菌药物治疗细菌引起的感染。此外，本发明提供的制备方法简单且无需任何功能修改，合成收率高，易于实现工业化。实验结果表明：有机共轭小分子纳米粒子在光照条件下抗菌效果达到了99％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。