圆齿野鸦椿提取物在制备糖尿病药物中的应用的制作方法

本发明属于植物活性物质的提取及应用领域，具体涉及圆齿野鸦椿提取物在制备糖尿病药物中应用。

背景技术：

目前，糖尿病已成为继心血管疾病、恶性肿瘤之后的第三大慢性疾病之一，由胰岛素分泌缺陷或胰岛素受体功能受损引起的高糖血症，容易导致人体多个器官组织(如心脑血管、肾脏、神经、视网膜等)发生严重病变和功能障碍。1型糖尿病多由自身免疫系统缺陷、遗传因素、病毒感染等引起，体内胰岛素严重不足，临床上常通过直接补充胰岛素进行治疗；2型糖尿病患者最显著的特征是产生了胰岛素抵抗，其外周靶器官(肝脏、肌肉和脂肪组织等)无法正常进行葡萄糖的摄取和利用，从而造成人体器官功能异常和代谢紊乱，甚至引起死亡。目前我国的糖尿病患者总数高居世界第一，且发病呈年轻化趋势，给国民经济和社会发展带来了沉重的负担。

临床上常用的降糖药包括双胍类、磺脲类、噻唑烷二酮类、苯甲酸衍生物类、α-葡萄糖苷酶抑制剂等，虽然能有效控制血糖浓度上升，但不能保持血糖在正常范围内，并且有显著的耐药性和副作用。近年来，一些传统药用植物来源的药效成分显示出了良好的降糖疗效，具有毒副作用小的特点，并且在提高机体免疫力方面亦有良好的作用。因此从天然药物中寻找降血糖的药物已成为糖尿病新药研发的重要方向。

圆齿野鸦椿(euscaphiskonishiihayata，又名福建野鸦椿)为省沽油科野鸦椿属(euscaphis)植物，别名鸡肫子、鸡眼睛、狗头椒。根据《中国植物志》的记载，我国有2种省沽油科野鸦椿属植物，为野鸦椿[euscaphisjaponica(thunb.)dippel]和福建野鸦椿(圆齿野鸦椿)。野鸦椿是传统的中草药，主要治疗胃痛、跌打损伤、风湿疼痛、眩晕、泻疾、痢疾等，而圆齿野鸦椿主要用于观赏植物，目前对其药用价值研究较少，两者为同一属的两种植物。我们采用四氧嘧啶诱发胰腺损伤，建立1型糖尿病小鼠模型；采用高糖高脂饲料喂养、注射小剂量链脲佐菌素诱发实验性2型糖尿病小鼠模型。以圆齿野鸦椿提取物对糖尿病模型小鼠进行给药，发现圆齿野鸦椿提取物均能显著抑制1型和2型糖尿病小鼠的血糖升高，调节血清胰岛素浓度，提高小鼠肝糖原含量，降低糖化血清蛋白浓度，调节1型和2型糖尿病小鼠的糖代谢，可为预防和治疗高血糖的药物提供新的选择。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种圆齿野鸦椿提取物在制备糖尿病药物中的应用。从圆齿野鸦椿植物体中通过水提法获得具有显著降血糖功效的圆齿野鸦椿提取物，将其应用于降血糖药物的制备中。

一种圆齿野鸦椿提取物在制备降血糖药物中的应用。

上述圆齿野鸦椿提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)取圆齿野鸦椿植物体，切碎、50℃烘干，粉碎得到圆齿野鸦椿植物体粉末；

(2)将圆齿野鸦椿植物体粉末按100g加入1l水的比例，煮沸回流提取三次，每一次提取2小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏，再将浸膏进行冷冻干燥后，得到圆齿野鸦椿提取物。

上述圆齿野鸦椿植物体是圆齿野鸦椿的枝、叶、根、花、种子、种皮、果实及果皮中的任意一种或多种。

本发明的有益效果在于：本发明的圆齿野鸦椿提取物，能显著抑制糖尿病小鼠的血糖升高，调节血清胰岛素浓度，提高小鼠肝糖原含量，降低糖化血清蛋白浓度，调节1型和2型糖尿病小鼠的糖代谢，改善1型和2型糖尿病小鼠的胰腺病理变化，可用于糖尿病的预防和治疗。

附图说明

图1圆齿野鸦椿各部位提取物对1型糖尿病小鼠胰腺组织的影响。a：正常对照组，b：模型组，c：阳性对照组，d:果皮提取物组，e：枝条提取物组，f：叶片提取物组，g：种子提取物组。

图2圆齿野鸦椿各部位提取物对2型糖尿病小鼠胰腺组织的影响。a：正常对照组，b：模型组，c：阳性对照组，d:果皮提取物组，e：枝条提取物组，f：叶片提取物组，g：种子提取物组。

具体实施方式

为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步详细说明。

下述实验用圆齿野鸦椿(euscaphiskonishii)来源于福建省邵武市天成岩。

实施例1

取干燥的圆齿野鸦椿果皮，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。将圆齿野鸦椿果皮粉末按100g加入1l水的比例进行煮沸回流提取三次，每次提取2小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏，再将浸膏冷冻干燥后，得圆齿野鸦椿果皮提取物。

实施例2

取干燥的圆齿野鸦椿枝条，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。将圆齿野鸦椿枝条粉末按100g加入1l水的比例进行煮沸回流提取三次，每次提取2小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏，再将浸膏冷冻干燥后，得圆齿野鸦椿枝条提取物。

实施例3

取干燥的圆齿野鸦椿叶片，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。将圆齿野鸦椿叶片粉末按100g加入1l水的比例进行煮沸回流提取三次，每次提取2小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏，再将浸膏冷冻干燥后，得圆齿野鸦椿叶片提取物。

实施例4

取干燥的圆齿野鸦椿种子，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。将圆齿野鸦椿种子粉末按100g加入1l水的比例进行煮沸回流提取三次，每次提取2小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏，再将浸膏冷冻干燥后，得圆齿野鸦椿种子提取物。

实施例5【药效学实验】

1试剂和药品

取实施例1-4制备所得的圆齿野鸦椿提取物，加入到0.5wt％羧甲基纤维素钠溶液中配制成1g/kg的圆齿野鸦椿提取物混悬液备用。阳性对照为盐酸二甲双胍，购自正大天晴药业集团。580型血糖测试仪购于江苏鱼跃医疗仪器有限公司。小鼠胰岛素elisa试剂盒和糖化血清蛋白含量测定试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司，肝糖原、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)试剂盒、总胆固醇(tc)试剂盒、甘油三酯(tg)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所公司。

2实验方法

2.1动物模型建立

雄性昆明小鼠适应性喂养一周后，随机挑选10只小鼠作为正常空白组，喂养普通饲料，其余小鼠分为两组，一组喂饲普通饲料，另一组喂饲高糖高脂饲料(猪油15％，蔗糖15％，胆固醇1％，蛋黄粉10％，胆盐0.2％，基础饲料58.8％)，一个月后，两组小鼠分别进行1型和2型糖尿病小鼠造模。

2.1.11型糖尿病模型小鼠建立

喂饲普通饲料的小鼠，禁食过夜后，采用四氧嘧啶溶液(250mg/kg)进行腹腔注射,72h后禁食过夜，剪尾取血测定小鼠血糖值，血糖值≥20mmol/l的小鼠确定为1型糖尿病造模成功的小鼠。

2.1.22型糖尿病模型小鼠建立

喂饲高糖高脂饲料的小鼠，禁食过夜后，采用链脲佐菌素溶液(60mg/kg)进行腹腔注射,继续给予高糖高脂饲料喂养15d后，尾静脉取血测定小鼠血糖值，血糖值≥16mmol/l的小鼠确定为2型糖尿病造模成功的小鼠。

2.2动物实验

造模成功的1型、2型糖尿病小鼠分别设置模型组、阳性对照组(二甲双胍250mg/kg)、圆齿野鸦椿果皮提取物、枝条提取物、叶片提取物和种子提取物(1g/kg)给药组，每组10只。正常空白组和1型糖尿病小鼠均喂饲普通饲料，2型糖尿病小鼠喂饲高糖高脂饲料。圆齿野鸦椿果皮提取物、枝条提取物、叶片提取物、种子提取物给药组和阳性对照组按0.1ml/10g进行灌胃给药，正常对照组和模型组按0.1ml/10g灌胃给予0.5wt％羧甲基纤维素钠溶液，每天给药一次，每周测定一次血糖。

2.3血液指标检测

血糖检测前禁食过夜，第二天早上剪尾取血检测小鼠空腹血糖。给药最后一天，小鼠禁食不禁水过夜后，摘除眼球取血，颈椎脱臼处死动物。小鼠全血用1wt％肝素钠包被过的ep管收集，静置45min后，以3000转/min离心10min后取血清，按照试剂盒说明进行血清胰岛素水平和糖化蛋白含量的测定。

2.4肝匀浆指标检测

小鼠脱臼处死后，取肝脏用冰生理盐水清洗、滤纸拭干，称取0.1g肝脏加入900ml冰生理盐水制成10％肝匀浆，5000转/min离心10min后取清液，按试剂盒方法，测定肝糖原、超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和丙二醛(mda)含量。

2.5数据处理

数据结果以表示，采用spss21.0对实验数据进行one-wayanova统计学分析。

2.6组织病理学研究

小鼠胰腺组织固定于10wt％福尔马林中，以流水冲洗过夜，在组织脱水机(leicatp1020)中进行脱水包埋，并进行切片和he染色。具体步骤如下：(1)脱水：按照60vol％乙醇1h、70vol％乙醇1h、85vol％乙醇2h、95vol％乙醇2h、95vol％乙醇2h、100vol％乙醇i1h和100vol％乙醇ⅱ1h进行脱水。(2)透明：二甲苯i45min和二甲苯ⅱ45min进行透明。(3)包埋：石蜡i1h和石蜡ⅱ1h(56-62℃)进行包埋，再置于冷台上凝固。(4)切片和烤片：包埋好的蜡块用切片机(leicarm2235)进行切片，切片厚度5μm，用毛笔轻轻在50℃的温水中展开，并平铺于载玻片上，置于60℃温箱中干燥。(5)脱蜡：干燥后的切片置于二甲苯ⅰ、ⅱ各10min，无水乙醇、95vol％乙醇各5min，80vol％乙醇3min，70vol％乙醇3min，进行脱蜡。(6)染色：切片放入苏木素染色液中染色5min，置于流水冲洗后，放入1vol％盐酸中分化几秒，用流水浸洗15min，使细胞核染色；再用伊红染色液染1-2min，在放入流水中冲洗。(7)脱水、透明和封片：按80vol％乙醇、95vol％乙醇、无水乙醇依次浸泡3min进行脱水，再用二甲苯ⅰ和ⅱ分别浸泡5min进行透明，滴一滴树脂进行封片。晾干后即可在显微镜下观察切片。

3实验结果：

3.1圆齿野鸦椿提取物对1型糖尿病小鼠模型的影响

小鼠腹腔注射四氧嘧啶后，将引起胰岛β细胞损伤。与正常组相比，0d时模型组和各给药组小鼠的血糖浓度均很高(p＜0.01)，说明1型糖尿病模型构建成功。造模后的小鼠出现多饮、多食、多尿及体质量减轻的“三多一少”症状，但阳性二甲双胍组和圆齿野鸦椿提取物给药组小鼠在实验进程中症状逐渐缓解，各组小鼠均未出现死亡现象。14d后圆齿野鸦椿各给药组小鼠血糖浓度出现明显的下降(p＜0.05)，灌胃21d后圆齿野鸦椿果皮提取物给药组的小鼠血糖浓度与二甲双胍组效果相当(p＞0.05)，提示圆齿野鸦椿提取物具有较好的降血糖作用。

表1圆齿野鸦椿提取物对1型糖尿病模型小鼠血糖的影响(n＝10)

注：与模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01；与正常对照组相比：^#p＜0.05，^##p＜0.01。

模型组小鼠的血清胰岛素和肝糖元含量明显低于正常组，而血清糖化蛋白的浓度却高于正常组，反映了1型糖尿病小鼠胰岛结构受到四氧嘧啶破坏而引起糖代谢障碍。圆齿野鸦椿提取物给药后，能显著提高糖尿病小鼠血清胰岛素浓度和肝糖元含量，降低糖化血清蛋白水平，说明圆齿野鸦椿提取物能缓解1型糖尿病小鼠的糖代谢紊乱。

表2圆齿野鸦椿提取物对1型糖尿病模型小鼠糖代谢的影响(n＝10)

注：与模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01；与正常对照组相比：^#p＜0.05，^##p＜0.01。

由图1可知，正常对照组小鼠胰腺组织胰岛形态正常、边界整齐，呈圆形或类圆形，胞浆丰富，细胞界限清晰；四氧嘧啶诱导的1型糖尿病模型组小鼠胰腺组织胰岛数量减少，形态不规则，边缘不整齐、界限不清晰，并且出现严重的炎性浸润现象；圆齿野鸦椿各提取物给药组小鼠的胰腺组织中胰岛形态较为规则，与模型组相比，外分泌腺与胰岛的边界较为清晰，胰岛内细胞数目有所增加，细胞排列也有所改善，提示圆齿野鸦椿提取物对1型糖尿病小鼠的胰岛细胞具有保护作用。

3.2圆齿野鸦椿提取物对2型糖尿病小鼠模型的影响

采用高糖高脂饲料喂养，再注射小剂量链脲佐菌素造成胰腺损伤，构建2型糖尿病小鼠。采用圆齿野鸦椿提取物给药4周，分别检测小鼠的血糖和血脂水平(见表3和表4)。

给药0d，与正常组相比，模型组和各给药组小鼠的血糖浓度均显著增高(p＜0.01)，且模型组在实验期间血糖浓度均维持在较高的水平，说明2型糖尿病模型造模成功。给药21d后，圆齿野鸦椿果皮和叶片提取物给药组小鼠血糖与模型组相比有显著性差异(p＜0.05)，给药28d后，圆齿野鸦椿各给药组小鼠血糖浓度与模型组相比均有非常显著性差异(p＜0.01)，结果提示，圆齿野鸦椿提取物具有良好的降血糖作用，并具有一定的时效关系。

表3圆齿野鸦椿提取物对2型糖尿病模型小鼠血糖的影响(n＝10)

注：与模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01；与正常对照组相比：^#p＜0.05，^##p＜0.01。

测量各组小鼠的血清胰岛素、糖化血清蛋白和肝糖元含量，发现模型组小鼠出现了高胰岛素血症，其糖化血清蛋白的浓度高于正常组，而肝糖元的含量却低于正常小鼠，反映了2型糖尿病小鼠胰岛功能损伤引起糖代谢的障碍。圆齿野鸦椿提取物给药后，能显著降低糖尿病小鼠血清胰岛素浓度，提高肝糖元含量，降低糖化血清蛋白水平，说明圆齿野鸦椿提取物对2型糖尿病小鼠的糖代谢紊乱也具有调节作用。

表4圆齿野鸦椿提取物对2型糖尿病模型小鼠糖代谢的影响(n＝10)

注：与模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01；与正常对照组相比：^#p＜0.05，^##p＜0.01。

另外，按照试剂盒说明进行血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白(hld-c)和低密度脂蛋白(ldl-c)的含量测定发现，与正常组相比，模型组小鼠的tg、tc和ldl-c显著增高(p＜0.05或p＜0.01)，hdl-c明显下降，说明高糖高脂饲料可引起2型糖尿病小鼠高血脂症状。圆齿野鸦椿各提取物给药后可显著抑制tg、tc和ldc-c的升高，提高血清中hdl-c含量(p＜0.05或p＜0.01)，说明圆齿野鸦椿提取物亦能有效改善糖尿病小鼠的脂代谢紊乱。

表5圆齿野鸦椿提取物对2型糖尿病模型小鼠血脂的影响(n＝10)

注：与模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01；与正常对照组相比：^#p＜0.05，^##p＜0.01。

由图2可知，正常对照组小鼠胰腺组织胰岛形态正常、边界整齐，呈圆形或类圆形，胞浆丰富，细胞界限清晰；stz合并高糖高脂诱导的2型糖尿病模型组小鼠胰腺组织胰岛形态不规则，出现空泡和炎性浸润现象；与模型组相比，圆齿野鸦椿各提取物给药组小鼠的胰腺组织中胰岛形态较为规则，空泡和炎性浸润现象减轻，提示圆齿野鸦椿提取物对2型糖尿病小鼠胰岛细胞具有保护作用。

4结论

圆齿野鸦椿提取物能显著抑制1型和2型糖尿病小鼠的血糖升高，提高小鼠肝糖原含量和血清胰岛素浓度，降低糖化血清蛋白浓度，调节1型和2型糖尿病小鼠的糖代谢，改善1型和2型糖尿病小鼠的胰腺病理变化，可用于糖尿病的预防和治疗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。