止咳平喘的白果仁提取物及其组合物、提取方法及应用与流程

本发明涉及中药技术领域。更具体地说，本发明涉及一种止咳平喘的白果仁提取物、其组合物、提取方法及应用。

背景技术：

白果为银杏科植物银杏ginkgobilobal.的干燥成熟种子。秋季种子成熟时采收，除去肉质外种皮，洗净，稍蒸或略煮后，烘干。在传统临床应用中，白果均以配伍使用，未见单一应用的报道。而且在实际应用中，白果多以煎剂使用。因而白果中所含的多糖、蛋白、油脂、银杏酸等无效甚至是有毒成分均被服用，导致临床服用剂量过大，存在安全隐患。目前白果的开发利用存在局限性，白果的毒副作用较大，如何实现服用较少量的白果能够达到较好的药用效果且较小的毒性，是目前的开发研究方向。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种止咳平喘的白果仁提取物、其组合物、提取方法及应用，其具有止咳平喘作用的有效组分，明确其主要成分含量，具有较小的毒性。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种白果仁提取物的提取方法，包括：

步骤a、破碎：将白果仁破碎，得碎白果仁；

步骤b、醇提：步骤a得到的碎白果仁用20-60vol.％乙醇溶液回流提取，过滤，将滤液浓缩至无醇味，得初提液；

步骤c、大孔树脂富集：调节步骤b得到的初提液ph至3-4，离心，取上层药液，上样，用30-45vol.％乙醇溶液冲洗树脂柱，收集洗脱液，调节ph至6-7，减压浓缩，干燥，得纯化产物；

步骤d、干燥：用醇溶解步骤c得到的纯化产物，过滤，将滤液浓缩至无醇味，得浸膏粉，即白果仁提取物。

优选的是，步骤b包括：取料液比为1:6，步骤a得到的碎白果仁用40vol.％乙醇溶液，重复回流提取2-3次，每次1小时，合并提取液，过滤，将滤液浓缩至无醇味，定容至每克生药对应每毫升提取液，得初提液。

优选的是，步骤c使用的大孔树脂为弱极性或非极性大孔树脂。

优选的是，步骤c包括：用盐酸溶液步骤b得到的初提液ph至3-4，离心，取上层药液，取大孔树脂湿法装柱，将上层药液上样，先用纯水冲洗树脂柱，然后用30vol.％乙醇溶液洗脱，最后用90vol.％乙醇溶液冲洗树脂柱，冲洗流速为液滴成串不成线的滴下，收集30vol.％乙醇溶液的洗脱液，减压浓缩，干燥，得纯化产物。

优选的是，步骤c中，用氢氧化钠溶液调节ph。

优选的是，红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸的重量比为2:3:1。

所述的提取方法得到的提取物在制备止咳平喘的药品或保健品中的应用。

优选的是，所述的应用，所述白果仁提取物制成药学上允许的剂型。

止咳平喘的组合物，其含有治疗有效量的所述的提取方法得到的提取物和药学上可接受的载体。

优选的是，所述的组合物，其制成药学上允许的剂型。

本发明至少包括以下有益效果：通过对白果药材进行提取、除杂、富集处理，能得到止咳平喘、肝肾毒性小的提取物。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实例2的谱图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

药材来源：白果购于北京知百草药业有限公司

主要试剂：分析级乙醇购于国药集团化学试剂有限公司；ab-8、d101、nka-2、sp700分别购于天津南开大学树脂有限公司、日本三菱化学填料公司等；水为娃哈哈纯净水。

<实例1>

干燥的白果仁500公斤，破碎，得碎白果仁，取料液比为1:5，用2500l的20vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，滤渣再用2500l的20vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，滤渣再用2500l的20vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，合并三次的提取液，过滤，将滤液浓缩至无醇味，定容至500l(1.0g生药/1ml提取液)，得初提液，此时，红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸的重量比为步骤a，b约为1:2:1，用盐酸溶液调节ph至3，6000r离心5min，取上层药液，取ab-8型大孔树脂50公斤(湿质量，约75l)，以湿法缓慢装入柱中(径高比范围1:2-5)，将上层药液500l(1.0g生药/1ml提取液)上样，以1.5bv/h的体积流速通过树脂柱，先用150l纯水冲洗树脂柱，流速4bv/h，以除去多糖等水溶性杂质，洗脱液弃去，再用150l10vol.％乙醇溶液冲洗树脂柱，流速4bv/h，洗脱液弃去，然后用225l的45vol.％乙醇溶液富集，流速3bv/h，最后用90vol.％乙醇溶液冲洗树脂柱，冲洗流速为液滴成串不成线的滴下，收集45vol.％乙醇溶液的洗脱液，用氢氧化钠溶液调节纯化产物ph至6，减压浓缩，干燥，纯化产物，用无水乙醇溶解，过滤，将滤液浓缩至无醇味，得浸膏粉，约3公斤，即白果仁提取物，其中红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸总含量为45％，红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸的重量比为步骤a，b约为2:3:1。将白果仁提取物搭配常规辅料制成丸剂，每粒丸剂的白果仁提取物的有效含量为45％。

<实例2>

干燥的白果仁500公斤，破碎，得碎白果仁，取料液比为1:6，用3000l的35vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，滤渣再用3000l的35vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，滤渣再用3000l的35vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，合并三次的提取液，过滤，将滤液浓缩至无醇味，定容至500l(1.0g生药/1ml提取液)，得初提液，此时，红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸的重量比为步骤a，b约为1:2:1，用盐酸溶液调节ph至3.5，6000r离心5min，取上层药液，取sp700型大孔树脂50公斤(湿质量，约75l)，以湿法缓慢装入柱中(径高比范围1:2-5)，将上层药液500l(1.0g生药/1ml提取液)上样，以1.5bv/h的体积流速通过树脂柱，先用150l纯水冲洗树脂柱除杂，流速4bv/h，洗脱液弃去，再用150l15vol.％乙醇溶液冲洗树脂柱，流速4bv/h，洗脱液弃去，然后用225l的30vol.％乙醇溶液富集，流速3bv/h，最后用90vol.％乙醇溶液冲洗树脂柱，冲洗流速为液滴成串不成线的滴下，收集30vol.％乙醇溶液的洗脱液，用氢氧化钠溶液调节纯化产物ph至6.5，减压浓缩，干燥，纯化产物，用醇溶解，过滤，将滤液浓缩至无醇味，得浸膏粉，约3公斤，即白果仁提取物，其中红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸总含量为55％，红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸的重量比为步骤a，b约为2:3:1。将白果仁提取物搭配常规辅料制成胶囊，每颗胶囊的白果仁提取物的有效含量为45％。谱图如图1所示。a：白果中3种活性成分对照品溶液；b：白果药材供试品溶液，1：n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸，2：n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸，3：红果酸。

<实例3>

干燥的白果仁500公斤，破碎，得碎白果仁，取料液比为1:7，用3500l的60vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，滤渣再用3500l的60vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，合并两次的提取液，过滤，将滤液浓缩至无醇味，定容至500l(1.0g生药/1ml提取液)，得初提液，此时，红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸的重量比为步骤a，b约为1:2:1，用盐酸溶液调节ph至4，6000r离心5min，取上层药液，取nka-2大孔树脂50公斤(湿质量，约75l)，以湿法缓慢装入柱中(径高比范围1:2-5)，将上层药液500l(1.0g生药/1ml提取液)上样，以1.5bv/h的体积流速通过树脂柱，先用150l纯水冲洗树脂柱除杂，流速4bv/h，洗脱液弃去，再用150l20vol.％乙醇溶液冲洗树脂柱，流速4bv/h，洗脱液弃去，然后用225l的40vol.％乙醇溶液富集，流速3bv/h，最后用90vol.％乙醇溶液冲洗树脂柱，冲洗流速为液滴成串不成线的滴下，收集40vol.％乙醇溶液的洗脱液，用氢氧化钠溶液调节纯化产物ph至7，减压浓缩，干燥，纯化产物，用醇溶解，过滤，将滤液浓缩至无醇味，得浸膏粉，约3公斤，即白果仁提取物，其中红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸总含量为42％，红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸的重量比为步骤a，b约为2:3:1。将白果仁提取物搭配常规辅料制成片剂，每颗片剂的白果仁提取物的有效含量为40％。

<实例4>

干燥的白果仁500公斤，破碎，得碎白果仁，取料液比为1:6，用3000l的40vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，滤渣再用3000l的40vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，合并两次的提取液，过滤，将滤液浓缩至无醇味，定容至500l(1.0g生药/1ml提取液)，得初提液，此时，红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸的重量比为步骤a，b约为1:2:1，用盐酸溶液调节ph至3.5，6000r离心5min，取上层药液，取sp700型大孔树脂50公斤(湿质量，约75l)，以湿法缓慢装入柱中(径高比范围1:2-5)，将上层药液500l(1.0g生药/1ml提取液)上样，以1.5bv/h的体积流速通过树脂柱，先用150l纯水冲洗树脂柱除杂，流速4bv/h，洗脱液弃去，然后用225l的35vol.％乙醇溶液富集，流速3bv/h，最后用90vol.％乙醇溶液冲洗树脂柱，冲洗流速为液滴成串不成线的滴下，收集35vol.％乙醇溶液的洗脱液，用氢氧化钠溶液调节纯化产物ph至6.5，用醇溶解，减压浓缩，干燥，纯化产物，过滤，将滤液浓缩至无醇味，得浸膏粉，约3公斤，即白果仁提取物，其中红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸总含量为51％，红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸的重量比为步骤a，b约为2:3:1。将白果仁提取物搭配常规辅料制成糖浆，每瓶糖浆的白果仁提取物的有效含量为50％。

<实例5>

干燥的白果仁500公斤，破碎，得碎白果仁，取料液比为1:6，用3000l的40vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，滤渣再用3000l的40vol.％乙醇溶液，加热回流1小时，分离得滤渣与提取液，合并两次的提取液，过滤，将滤液浓缩至无醇味，得浸膏粉，约4公斤，即白果仁提取物，其中红果酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-天冬氨酸、n-(1-葡萄糖基-吲哚3-乙酰)-谷氨酸总含量为31％。

白果仁提取物的药理实验

1.1实验材料

1.1.1实验试剂

氨水(广东省化学试剂工程研发中心)，磷酸可待因(青海制药有限公司)。

1.1.2实验动物

km小鼠120只(雌雄各半)，体重24±4g，spf级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.1.3主要仪器

超声雾化器(粤华wh-2000)

1.2实验方法

1.2.1动物筛选

预热超声雾化器后，加入现配的40ml氨水溶液(12.5％)。将小鼠放入容积为1000ml的烧杯中，烧杯口用保鲜膜密闭，并开两个口(其一用于插入超声雾化器出口管，另一为通风小孔)。将超声雾化器以最小喷雾力度持续通入氨气60s后，立即关闭并迅速打开保鲜膜，使其中氨气自然扩散。在通入氨气的同时，用秒表计时，记录小鼠咳嗽潜伏期(s)和三分钟内咳嗽次数(次)。咳嗽的表现为：张大口或张小口时伴有咳嗽声，均可见腹肌收缩。

小鼠咳嗽敏感性剔除标准如下：①三分钟内咳嗽次数少于10次及多于80次者；②喷雾后潜伏期小于15秒及大于50秒者；③其它：动物死亡、状态不佳、反应异常剧烈者等；符合三者其中任何一项者，即为剔除对象，不纳入后续实验。

1.2.2白果仁提取物对浓氨水诱导小鼠咳嗽模型的影响

120只小鼠筛选出93只(雌性40只，雄性53只)，将筛选合格的动物按体重随机分成对照组、阳性组(磷酸可待因)(15mg/kg)、实例1-5组(40mg/kg)，对照组、阳性组(磷酸可待因)14只，其余各组13只，对照组灌胃等体积生理盐水，给药组灌胃相应的药液(20ml/kg)，给药3次，每天一次，最后一次给药后1h，采用12.5％氨水刺激，记录小鼠咳嗽潜伏期(s)和三分钟内咳嗽次数(次)。

1.3统计学方法

数据以平均值±标准差(±s)表示，统计分析使用spss17.0统计分析软件，采用单因素方差分析进行分析统计，p＜0.05为有统计学差异。

1.4实验结果

给药三次的情况下，实例1-5组均有延长咳嗽潜伏期的趋势，但与对照组比较有显著性差异；实例1-5组及阳性组(磷酸可待因)3min内咳嗽次数明显减少，与对照组比较有显著性差异。

表1给药三次对氨水致小鼠咳嗽潜伏期(s)和三分钟内咳嗽次数(次)的影响

注：与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

结论：在实验动物模型中，实例1-5组(40mg/kg)均有明显止咳作用，且实例4与磷酸可待因效果相近。

2.平喘效果实验

2.1实验材料

2.1.1实验试剂

磷酸组胺(国药集团化学试剂有限公司)，氨茶碱溶液(昆明制药集团股份有限公司)，肾上腺素注射液(北京双鹤药业股份有限公司)。

2.1.2实验动物

豚鼠49只(雌性25只，雄性26只)，体重450±50g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

2.1.3主要仪器

超声雾化器(粤华wh-2000)

2.2实验方法

随机将豚鼠按体重随机分成对照组、阳性组(氨茶碱)(12.5％)和实例1-5组(40mg/kg)，每组各7只。对照组灌胃等体积生理盐水，给药组灌胃相应的药液(20ml/kg)，给药每天一次连续3天，末次给药1h后，使豚鼠吸入0.4％磷酸组胺，记录豚鼠出现抽搐、跌倒的时间为潜伏期(喷雾开始到跌倒时间)，连续观察6min，6min内不跌倒的以360s计。

2.3统计学方法

数据以平均值±标准差(±s)表示，统计分析使用spss17.0统计分析软件，采用单因素方差分析进行分析统计，p＜0.05为有统计学差异。

2.4实验结果

在给药三天的情况下，实例1-5组及阳性组(氨茶碱)引喘出现潜伏期均明显长于对照组，与对照组比较有显著性差异。

表2给药三天对组胺致小鼠哮喘潜伏期(s)的影响

注：与对照组比较，*p＜0.05

结论：在实验动物模型中，实例1-5组(40mg/kg)均有明显平喘作用，且实例2和4组与氨茶碱效果相近。

3.祛痰效果实验

3.1实验材料

3.1.1实验试剂

磷酸可待因(青海制药有限公司)，酚红(上海三爱思试剂有限公司)

3.1.2实验动物

km小鼠70只(雄性)，体重18±3g，spf级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

3.1.3主要仪器

分光光度计、酶标仪(thermo)

3.2实验方法

随机将小鼠按体重分成对照组、阳性组(磷酸可待因)(20mg/kg)和实例1-5组(40mg/kg)，每组各10只。对照组灌胃等体积生理盐水，给药组灌胃相应的药液(20ml/kg)，30min后腹腔注射2.5％酚红生理盐水溶液(500mg/kg)，注射后用脱臼处死动物。低温放置1h，待小鼠僵硬时解剖气管，取喉结下至肺门的主气管，每一气管放置一只试管内，加生理盐水1.5ml震荡30min后，加入0.1ml的1mol/lnaoh，混合均匀，2000rpm离心10min，取上清液于540nm检测吸光度，与酚红标准曲线比较，计算酚红量。

3.3统计学方法

数据以平均值±标准差(±s)表示，统计分析使用spss17.0统计分析软件，采用单因素方差分析进行分析统计，p＜0.05为有统计学差异。

3.4实验结果

酚红分泌量间接反映机体祛痰能力的强弱。实例1-5组及阳性组(磷酸可待因)均可使呼吸道酚红分泌量增加，且与对照组比较有显著性差异。

表3药物对小鼠呼吸道分泌酚红的影响

注：与对照组比较，*p＜0.05

结论：在实验动物模型中，实例1-5组(40mg/kg)均有明显祛痰作用，且实例1-5组均与磷酸可待因效果相近。

4.肝肾毒性实验

4.1实验材料

4.1.1实验试剂

乌拉坦(郑州杰克斯化工产品有限公司)

4.1.2实验动物

km小鼠60只(雄性)，体重18±3g，spf级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

4.1.3主要仪器

光镜

4.2实验方法

随机将小鼠按体重分成对照组、和实例1-5组(40mg/kg)，每组各10只。对照组灌胃等体积生理盐水，给药组灌胃相应的药液(20ml/kg)，连续给药7d，，给药前称重并记录，处死前禁食12h，称重，15％乌拉坦腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，分离血清，测定各组小鼠血清氨酸氨基转移酶(alt)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)、尿素氮(bun)、肌酐(cr)四项生化指标。处死小鼠，取肝、肾脏，分别测定肝脏系数、肾脏系数，肝脏系数＝肝脏质量/体质×100％，肾脏系数＝肾脏质量/体质×100％，取肝脏和肾脏的组织，分别用4％的甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，he染色，光镜下观察肝脏和肾脏组织的显微结构。

4.3统计学方法

数据以平均值±标准差(±s)表示，统计分析使用spss17.0统计分析软件，采用单因素方差分析进行分析统计，p＜0.05为有统计学差异。

4.4实验结果

实例1-4组相较于对照组各项生化指标以及肝脏、肾脏系数优于实例5组。

表4药物对小鼠生化指标的影响

注：与对照组比较，*p＜0.05

表5药物对小鼠肝脏系数、肾脏系数的影响

注：与对照组比较，*p＜0.05

实例1-4组的病理切片观察与对照组基本相似，未见肝肾细胞有明显变性、坏死及病理异常；实例5组出现肝肾肿大，病理切片有出血、变性、坏死等病理变化。

临床实验

实施例2制得的白果仁提取物胶囊经过临床实验，其中有慢性咳嗽患者20例和急性咳嗽患者20例，通过每日服用实例4制得的胶囊3次，连续服用1-2周，总有效率为100％，

表6药物临床试验结果

典型病例：

病例1：王某，女，40岁，持续咳嗽3个月，刺激性干咳，咳嗽剧烈，痰少，诊断为咳嗽变异型哮喘，服用实例4制得糖浆一周后，咳嗽次数减少。

病例2：张某，男，62岁，咳嗽、咳痰2年，伴有喘息气急，诊断为慢性支气管炎，服用实例4制得糖浆两周后，咳嗽好转，咳嗽次数较少，喘息气急症状缓解。

病例3，刘某，男，28岁，咳嗽、咳痰1周，伴有鼻塞、咽痛，诊断为急性支气管炎，服用实例4制得糖浆第二天开始起效，咳嗽减少，服用完1瓶糖浆后咳嗽、咳痰症状完全缓解。

本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。

所述药物制剂含有治疗有效量的本发明白果仁提取物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或者注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂(纳米制剂)、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。