乙酰胆碱脂酶活性抑制剂的新应用的制作方法

本发明涉及美白剂，特别是涉及乙酰胆碱脂酶活性抑制剂的新应用。

背景技术：

黑色素问题近来黑色素沉着等皮肤问题已经引起了社会的广泛关注，其中黑色素的生成与其密切相关。在皮肤的表皮结构中，黑色素细胞(melanocytes)被角质细胞(keratinocytes)所包围，并受封闭的旁分泌系统调控。众所周知，黑色素细胞的主要生理功能是合成黑色素(melanin)。黑色素是一种色素杂聚物，是在黑素体(melanosome)的这一特殊的细胞器中合成的。成熟的黑色素体会转移到相邻的角质细胞中。黑色素是决定我们皮肤、头发和眼睛颜色的主要因素，此外，黑色素的另一已知功能是通过吸收和散射紫外线辐射来保护细胞dna免受紫外线损伤。

过量的黑色素表达会导致雀斑、黄褐斑等皮肤疾病，严重的甚至会导致黑色素瘤。由于这些皮肤病会对患者的生活质量产生影响，因此制药和化妆品行业一直在不断寻求新的解决方案。目前研究发现许多天然以及合成来源的酪氨酸酶抑制剂，如熊果苷、曲酸等，但熊果苷因其具有一定的致癌风险而被禁用，因此，科学家也在不断寻找效果新异且安全无害的美白剂。

随着老龄化社会的日益发展，人们对于美容和健康的意识也在逐步提高，特别是女性，由于对白皙肤色的日益追求，以及预防治疗皮肤雀斑、褐斑等皮肤问题的需要，市场上涌现出大量含有美白成分的化妆品及准药品，但其美白效果并不能满足大众需求。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种乙酰胆碱脂酶活性抑制剂的新应用。本发明通过研究发现，乙酰胆碱酯酶抑制剂能够通过有效抑制与黑色素生成相关酶的表达，抑制紫外线诱导的黑色素生成作用，进而实现优良的皮肤美白效果。

具体技术方案如下：

乙酰胆碱脂酶活性抑制剂在制备美白剂中的应用。

在其中一个实施例中，所述美白剂用于抑制黑色素的生成。

在其中一个实施例中，所述美白剂用于抑制酪氨酸酶的表达。

在其中一个实施例中，所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂的活性成分选自具有如下结构的化合物：

在其中一个实施例中，所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂的活性成分选自具有如下结构的化合物：

在其中一个实施例中，所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂的活性成分选自具有如下结构的化合物：

在其中一个实施例中，所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂为bw284c51、多奈哌齐(donepezil)或加兰他敏(galantamine)。

本发明还提供乙酰胆碱脂酶活性抑制剂在制备美白用化妆品或美白用医药品中的应用，将所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂制成如上所述美白剂，并与化妆品或医药品可接受的辅料进行调配。

本发明还提供一种美白用化妆品，包括乙酰胆碱脂酶活性抑制剂制，以及化妆品可接受的辅料。

本发明还提供一种美白用医药品，包括乙酰胆碱脂酶活性抑制剂制，以及医药品可接受的辅料。

与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：

本发明通过应用生物活性和新型机理为筛选指标，发现了一类安全且美白效果优异的新型美白化合物—乙酰胆碱酯酶抑制剂，以其作为主要成分应用于美白剂，能够通过有效抑制与黑色素生成相关酶的表达，抑制紫外线诱导的黑色素生成作用，进而实现优良的皮肤美白效果，有效预防雀斑、褐斑等黑色素沉积。同时，还具有优异的皮肤渗透性，对黑色素细胞和角质层细胞无明显的毒害作用，安全性高，可以极大地有利于皮肤美白的化妆品及美白用医药商品的开发。

附图说明

图1乙酰胆碱酯酶抑制剂bw284c51对黑色素细胞melan-a的黑色素抑制结果图；

图2为乙酰胆碱酯酶抑制剂bw284c51对角质细胞与黑色素细胞共培养中黑色素生成抑制结果图；

图3为乙酰胆碱酯酶抑制剂bw284c51对小鼠皮肤中黑色素生成抑制结果图；

图4为乙酰胆碱酯酶抑制剂bw284c51对小鼠皮肤中酪氨酸酶蛋白表达水平降低的结果图；

图5为乙酰胆碱酯酶抑制剂bw284c51、donepezil及galantamine对小鼠皮肤中酪氨酸酶蛋白表达水平降低的结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的典型实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明，应当理解本发明实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本发明实施例以及实施例中的技术特征可以相互组合。

本发明的实施例提供乙酰胆碱脂酶活性抑制剂在制备美白剂中的应用。

本发明通过应用生物活性和新型机理为筛选指标发现，以乙酰胆碱酯酶抑制剂作为主要成分应用于美白剂，能够通过有效抑制与黑色素生成相关酶，特别是抑制酪氨酸酶的表达，进而抑制紫外线诱导的黑色素生成作用，实现优良的皮肤美白效果，有效预防雀斑、褐斑等黑色素沉积。同时，还具有优异的皮肤渗透性，对黑色素细胞和角质层细胞无明显的毒害作用，安全性高，可以极大地有利于皮肤美白的化妆品及美白用医药商品的开发。

在其中一个具体的实施例中，所述美白剂用于抑制黑色素的生成。相关原理描述如下：

突触(synapse)是两个神经元之间或神经元与效应器细胞之间相互接触、并借以传递信息的部位。突触前细胞借助化学信号，即神经递质，将信息转送到突触后细胞者，称化学突触，借助于电信号传递信息者，称电突触。在哺乳动物进行突触传递的几乎都是化学突触。化学突触由突触前膜、突触后膜以及两膜间的窄缝——突触间隙所构成。当轴突末梢与另一神经元的树突或胞体形成化学突触时，往往先形成膨大，称突触扣。扣内可见数量众多的直径在30～150纳米的球形小泡，称突触泡，还有较多的线粒体。递质贮存于突触泡内，例如乙酰胆碱(ach)或氨基酸类递质。在神经细胞中，乙酰胆碱是由胆碱和乙酰辅酶a在胆碱乙酰移位酶(胆碱乙酰化酶)的催化作用下合成的。由于该酶存在于胞浆中，因此乙酰胆碱在胞浆中合成，合成后由小泡摄取并贮存起来。进入突触间隙的乙酰胆碱作用于突触后膜，引起受体膜产生动作电位后，就被胆碱酯酶水解成胆碱和乙酸。乙酰胆碱酯酶(ache)，是生物神经传导中的一种关键性酶，在胆碱能突触间，该酶能降解乙酰胆碱(ach)，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。乙酰胆碱酯酶参与细胞的发育和成熟，能促进神经元发育和神经再生。

乙酰胆碱酯酶抑制剂，又称为抗胆碱酯酶药，通过对乙酰胆碱酯酶的可逆性抑制，达到使乙酰胆碱(ach)在突触处的积累，表现m样及n样作用增强而发挥兴奋胆碱受体的作用，由此延长并且增加乙酰胆碱的作用。乙酰胆碱酯酶抑制剂属于间接拟胆碱类药物，临床主要用于治疗重症肌无力、青光眼、抗老年性痴呆等。代表药物可如bw284c51、多奈哌齐(donepezil)或加兰他敏(galantamine)。

黑色素的生成过程受酪氨酸酶(tyr)、酪氨酸酶相关蛋白-1(trp-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(dct)等多种蛋白的调控。这一过程首先由酪氨酸酶催化酪氨酸(tyrosine)氧化为左旋多巴(l-dopa)，接着再由左旋多巴氧化为多巴喹酮，最终合成黑色素。由于酪氨酸酶在黑色素生成过程中起核心作用，因此它是筛选新的美白剂的关键靶点。酪氨酸是黑色素合成的起点，酪氨酸酶(tyr)、酪氨酸酶相关蛋白-1(trp-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(dct)通过酶促过程，将酪氨酸转换成黑色素。因此，黑色素生成是tyr、trp-1和dct来调控的一种级联反应。其中，trp-1不仅在黑色素生成过程中具有调节作用，而且对黑色素细胞的生长和调亡也具有一定的作用。此外，黑色素生成还受其它多种因素和信号通路的调控。其中，(小眼畸形相关转录因子)mitf是黑色素生成途径中的主要调控因子，它通过绑定tyr、trp-1和dct基因表达的启动因子区域调节tyr、trp-1和dct的转录。

本发明通过实验发现，具有抑制乙酰胆碱酯酶活性作用的化合物能够显著抑制melan-a细胞和小鼠皮肤中黑色素的生成。具体地，melan-a细胞或小鼠皮肤用乙酰胆碱酯酶活性抑制剂作用进行处理24小时后，检测其生成的黑色素总量，与对照组相比，黑色素生成的抑制率大约为30-80％。因此，本发明证实了乙酰胆碱酯酶抑制剂具有优异的抑制黑色素生成作用。

在其中一个具体的实施例中，所述美白剂用于抑制酪氨酸酶的表达。

根据优选的实施方案，本发明进一步研究发现，乙酰胆碱酯酶抑制剂显著抑制了melan-a细胞和小鼠皮肤中tyr(酪氨酸酶)的表达水平。酪氨酸酶是一种铜蛋白，是黑色素生成的关键酶，其活性中心的双核铜离子在酶催化中起重要作用。根据本发明，melan-a细胞或小鼠皮肤用乙酰胆碱酯酶抑制剂进行处理24小时后，提取蛋白并用蛋白质免疫印迹实验(westernblot)或免疫荧光染色实验(immunostaining)检测了酪氨酸酶的表达水平，结果显示，乙酰胆碱酯酶抑制剂显著抑制了酪氨酸酶的表达。

在其中一个具体的实施例中，所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂的活性成分选自具有如下结构的化合物：

与该化合物对应的乙酰胆碱脂酶活性抑制剂成品可为bw284c51。

在其中一个具体的实施例中，所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂的活性成分选自具有如下结构的化合物：

与该化合物对应的乙酰胆碱脂酶活性抑制剂成品可为多奈哌齐(donepezil)。

在其中一个具体的实施例中，所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂的活性成分选自具有如下结构的化合物：

与该化合物对应的乙酰胆碱脂酶活性抑制剂成品可为加兰他敏(galantamine)。

本发明的实施例还提供乙酰胆碱脂酶活性抑制剂在制备美白用化妆品或美白用医药品中的应用，具体方案为，将所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂制成如上所述美白剂，并与化妆品或医药品可接受的辅料进行调配。

在其中一个具体的实施例中，所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂为bw284c51、多奈哌齐(donepezil)或加兰他敏(galantamine)。所述化妆品或医药品可接受的辅料可采用相应领域的现有市售辅料，并根据剂型、剂量等进行相应配伍。

本发明的实施例还提供一种美白用化妆品，包括乙酰胆碱脂酶活性抑制剂制，以及化妆品可接受的辅料。

在其中一个具体的实施例中，所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂为bw284c51、多奈哌齐(donepezil)或加兰他敏(galantamine)。所述化妆品可接受的辅料可采用相应领域的现有市售辅料，并根据剂型、剂量等进行相应配伍。

本发明的实施例还提供一种美白用医药品，包括乙酰胆碱脂酶活性抑制剂制，以及医药品可接受的辅料。

在其中一个具体的实施例中，所述乙酰胆碱脂酶活性抑制剂为bw284c51、多奈哌齐(donepezil)或加兰他敏(galantamine)。所述医药品可接受的辅料可采用相应领域的现有市售辅料，并根据剂型、剂量等进行相应配伍。

如下为具体的实施例，如无特别说明，实施例中采用的原料均为市售获得。

实施例1：

本实施例为乙酰胆碱酯酶抑制剂对黑色素细胞中黑色素生成抑制试验。

使用乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)或乙酰胆碱处理黑色素细胞，然后测量黑色素的含量，检测其生成是否被抑制。具体方法如下：

melan-a细胞(来源于ximbio，london)在补充有10％fbs(胎牛血清)、1％青霉素/链霉素的dmem培养基进行培养，放入co2培养箱(5％co2、37℃)中培养24小时后，将melan-a细胞制成细胞浓度为3×10⁵个/ml的悬浮液并接种在6孔板上。再放入co2培养箱(5％co2、37℃)中培养24小时。分为3组，其中，ach组分别加入浓度为0mm、0.1mm、0.2mm、1.0mm、2.0mm的ach，ach+bw组加入10μmbw284c51，以及浓度为0mm、0.1mm、0.2mm、1.0mm、2.0mm的ach，空白组加入dmso溶剂对照。同条件继续培养24小时后，刮取细胞转移至ep管中，离心，离心机转速1000r/min。吸去培养基，加入1mol/lnaoh进行溶解，在450nm处测定吸光度。将吸光值减去背景噪音后，计算每组吸光值相对于对照组的百分比。

结果如图1所示，经过乙酰胆碱酯酶抑制剂和乙酰胆碱处理的melan-a细胞黑色素生成被显著抑制。随着ach浓度增大，黑色素抑制效果更明显。同时加有bw284c51的样品中黑色素抑制效果更明显。这些结果表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)可以通过抑制黑色素的生成从而达到美白肤色的目的。

实施例2：

本实施例为乙酰胆碱酯酶抑制剂对角质细胞与黑色素细胞共培养中黑色素生成抑制试验。

使用乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)处理角质细胞与黑色素细胞共培养，然后测量黑色素的含量，检测其生成是否被抑制。具体方法如下：

共培养的细胞melan-a细胞(来源于ximbio，london，uk)与hacat(来源于addexbio,sandiego，ca)细胞在补充有10％fbs(胎牛血清)、1％青霉素/链霉素的dmem培养基进行培养，放入co2培养箱(5％co2、37℃)中培养24小时后，将melan-a细胞制成细胞浓度为3×10⁵个/ml的悬浮液并接种在6孔板上。再放入co2培养箱(5％co2、37℃)中培养24小时。分为5组，其中，对照组——只加入溶剂dmso，光照组——光照10分钟，光照+bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51，光照+ach组——光照10分钟并加入0.1mmach，光照+bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51，光照+ach+bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51与0.1mmach。同条件继续培养24小时后，利用fontanamasson染色方法标记黑色素。计算其中黑色素黑色区域灰度值，并于对照组进行比较。

如图2所示，光照明显提高黑色素产量，经过ach或乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)处理的共培养中黑色素生成被显著抑制，这些结果表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)可以通过抑制黑色素的生成从而达到美白肤色的目的。

实施例3：

本实施例为乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)对小鼠皮肤中黑色素生成抑制试验。

取三周大c57bl/6小鼠，断颈处死后，取背部皮肤放入co2培养箱(5％co2、37℃)中培养，分为5组，其中，其中，对照组——只加入溶剂dmso，光照组——光照10分钟，光照+bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51，光照+ach组——光照10分钟并加入0.1mmach，光照+bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51，光照+ach+bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51与0.1mmach。同条件继续培养24小时后，利用fontanamasson染色方法标记黑色素。计算其中黑色素黑色区域灰度值，并于对照组进行比较。

如图3所示，光照明显提高皮肤表层黑色素产量，经过ach或乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)处理的小鼠皮肤中黑色素生成被显著抑制，这些结果表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)可以通过抑制黑色素的生成从而达到美白肤色的目的。

实施例4：

本实施例为乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)对小鼠皮肤中酪氨酸酶抑制试验。

使用免疫荧光染色实验(immunostaining)检测乙酰胆碱酯酶抑制剂是否会影响酪氨酸酶的表达水平。实验步骤如下：

取三周大c57bl/6小鼠，断颈处死后，取背部皮肤放入co2培养箱(5％co2、37℃)中培养，分为5组，其中，对照组——只加入溶剂dmos，光照组——光照10分钟，光照+bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51，光照+ach组——光照10分钟并加入0.1mmach，光照+bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51，光照+ach+bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51与0.1mmach，同条件继续培养24小时。收集皮肤，制作皮肤冷冻切片，并进行免疫荧光染色。先用一抗抗体分别为：鼠源anti-tyrosinase(1：100，santacruz)，兔源anti-cytokeratin(krt)(1：1：100，abcam)于4℃孵育16小时，之后用荧光二抗抗体抗小鼠alex-488，抗兔alex-647室温孵育2小时。之后再用核酸染料4′,6-diamidino-2-phenylindole(dapi)及封片剂封片。计算其各组中酪氨酸酶相对绿色荧光值表示蛋白相对含量与对照组比较。

如图4所示，光照明显提高皮肤表层酪氨酸酶产量，经过ach或乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)处理的小鼠皮肤中酪氨酸酶生成被显著抑制，这些结果表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂(bw284c51)可以通过抑制酪氨酸酶的生成从而达到美白肤色的目的。

实施例5：

本实施例为其它乙酰胆碱酯酶抑制剂(donepezil、galantamine)对小鼠皮肤中酪氨酸酶抑制试验。

为了进一步确认乙酰胆碱酯酶抑制剂对皮肤美白的活性，使用蛋白质免疫印迹实验(westernblot)检测多种乙酰胆碱酯酶抑制剂是否会影响酪氨酸酶的表达水平。实验步骤如下：

取三周大c57bl/6小鼠，断颈处死后，取背部皮肤放入co2培养箱(5％co2、37℃)中培养，分为6组，其中，空白对照组——只加入溶剂dmso，对照组——光照10分钟，bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51，donepezil组——光照10分钟并加入10μmdonepezil，galantamine组——光照10分钟并加入10μmgalantamin，ach+bw组——光照10分钟并加入10μmbw284c51与0.1mmach，同条件继续培养24小时。收集皮肤，加入裂解液在冰上裂解50分钟，于4℃以13200r/min离心10min，转移上清液于ep管中，以bradford法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行sds-page电泳并转移至硝酸纤维素膜上，采用化学发光法检测，并进行图像分析，用相对灰度值表示蛋白相对含量。先用一抗抗体分别为：鼠源anti-tyrosinase(1：100，santacruz)，anti-glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase(gapdh)(1：1,000，sigma)于4℃孵育16小时。之后再用过氧化物酶(hrp)缀合的抗小鼠二抗室温下孵育2小时。最后用显影液曝光。

如图5所示，光照明显提高皮肤表层酪氨酸酶产量，经过bw284c51，donepezil，galantamine或ach处理的小鼠皮肤中酪氨酸酶生成被显著抑制，这些结果表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂可以通过抑制酪氨酸酶的生成从而达到美白肤色的目的。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。