一种具有抗衰功能的羊胎盘提取液及其制备方法和应用与流程

本发明属于提取物制备
技术领域：
，尤其涉及一种具有抗衰功能的羊胎盘提取液及其制备方法和应用。
背景技术：
：衰老是任何生物体在生命活动进程中必经的阶段。随着年龄增长，人们受机体内外各种因素的影响，机体必将出现全身的形态结构与生理功能的衰老过程。皮肤作为机体最大最易显露于环境中的器官，担负着机体保护、感觉、调节体温、分泌、排泄和免疫等诸多方面的作用，也是机体衰老中表现最为明显的器官之一。近年来紫外线引起肌肤光老化的结论已被广泛接受。紫外线按波长可划分为短、中、长波紫外线。紫外线过量照射可引起皮肤炎症浸润，诱导迟发型过敏反应，dna合成异常，透明质酸量下降及成纤维细胞损伤。皮肤抗衰老已成为药品和护肤化妆品研究的热点，市场上出现很多宣传可以延缓皮肤衰老的产品，其中包括一些添加了羊胎素或羊胚胎/羊胎盘提取液的化妆品，认为羊胎素或羊胚胎/羊胎盘提取液可以有效淡化皱纹,增强皮肤弹性,延缓皮肤衰老。在现有羊胎盘提取方法中，大多在工艺过程中采用酶解和高温灭菌的工艺手段，酶解和高温会破坏胎盘中的天然活性物质，致使天然活性物质的种类和含量难以保证，不利于保证羊胎盘提取液的质量，同时提取效率也不高。且现有技术中关于羊胚胎/羊胎盘提取液的抗衰老功效过于笼统，没有充分提取出具有抗衰作用的生物活性成分。技术实现要素：本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的不足，提供一种具有抗衰功能的羊胎盘提取液及其制备方法和应用。本发明采用的技术方案如下：一种具有抗衰功能的羊胎盘提取液的制备方法，包括以下步骤：s1.取胚胎时期的羊胎盘，分离子叶并弃胎膜，用生理盐水清洗子叶，然后将子叶切块；s2.将s1所得子叶块在过氧乙酸溶液中浸泡10-15min，然后用纯化水清洗；s3.向s2处理后的子叶块中加入牛磺酸溶液，破碎均质，得到浆液；s4.将s3所得浆液于30-50℃振荡，然后离心10-15min，分别收集上清液和沉淀；s5.向s4所得沉淀中加入牛磺酸，再进行负压空化提取，然后离心10-15min，收集上清液；s6.将s4和s5所得上清液混合，调节ph为5.0，再于30-50℃振荡，然后离心10-15min，收集上清液；s7.调节s6所得上清液的ph6.3-6.4，再进行补体灭活，然后调节ph为7.0，置于4℃离心，收集上清液；s8.将s7所得上清液超滤浓缩，直至蛋白浓度为2.0-2.5mg/ml，过滤除菌，即得。进一步地，包括以下步骤：s1.取胚胎时期的羊胎盘，分离子叶并弃胎膜，用生理盐水清洗子叶，然后将子叶切块；s2.将s1所得子叶块在过氧乙酸溶液中浸泡10min，然后用纯化水清洗；s3.向s2处理后的子叶块中加入牛磺酸溶液，破碎均质，得到浆液；s4.将s3所得浆液于40℃、100-150rpm振荡，然后5000-6000rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀；s5.向s4所得沉淀中加入牛磺酸，再进行负压空化提取，然后5000-6000rpm离心10-15min，收集上清液；s6.将s4和s5所得上清液混合，调节ph为5.0，再于40℃振荡，然后10000rpm离心10min，收集上清液；s7.调节s6所得上清液的ph6.3-6.4，再进行补体灭活，然后调节ph为7.0，置于4℃、10000rpm离心，收集上清液；s8.将s7所得上清液超滤浓缩，直至蛋白浓度为2.0-2.5mg/ml，过滤除菌，即得。进一步地，s1中生理盐水中含有90-110u/ml卡那霉素；优选为100u/ml。进一步地，s2中过氧乙酸溶液的浓度为0.05-0.2vt％；优选为0.1vt％。进一步地，s3和s5中牛磺酸溶液的浓度均为0.5-2wt％，优选为1wt％；子叶块与牛磺酸溶液的比为1g:2-4ml，优选为1g:3ml；沉淀与牛磺酸溶液的比为1g:2-4ml，优选为1g:3ml。进一步地，s3中均质转速为10000-20000rpm，均质2-3次，每次3min。进一步地，s5中负压空化提取条件为：温度20℃-55℃，提取压力为-0.01mpa～-0.1mpa，提取20-50min。进一步地，s7中补体灭活具体为：置于60℃水浴锅中10-15min。进一步地，s8中采用3-5kd超滤膜包进行超滤浓缩；采用0.22μm过滤器过滤除菌。采用上述的方法制备得到的具有抗衰功能的羊胎盘提取液。上述的具有抗衰功能的羊胎盘提取液在制备化妆品中的应用。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：1、本发明中，以新鲜羊胎盘为原料，用牛磺酸做为提取溶剂，通过两次浸提与空化提取结合，而不采用高温和酶解，充分保留和提取有效成分，制备得到具有显著抗衰功能的羊胎盘提取液；2、本发明中，第一次均质浸提得到的生物活性物质有限，通过对沉淀的负压空化提取，进一步释放胞内活性成分，充分提取，调节ph后有部分物质沉淀，通过第二次浸提再次充分提取沉淀里的有效活性物质；牛磺酸是非必需氨基酸，本身就有营养皮肤加强皮层细胞活性的作用，结合其抗氧性，本身就可用作抗衰抗皱剂；另外其化学性质稳定，是酸性氨基酸，并且以两性离子形式存在的特性，有利于组织内多种蛋白提取，并且可以保护蛋白活性使其不易被破坏，提取率更高；3、本发明的羊胎盘提取液，与uva辐照损伤后的细胞共培养后，活细胞数量明显增多，因此，本发明方法得到提取液相较于对比例方法得到的提取液，对经紫外损伤的人脐带间充质干细胞起到明显的保护作用，活化受损细胞，修复紫外线过量照射引起的皮肤问题，通过修复细胞损伤来延缓衰老，具有显著的抗衰效果；4、本发明的羊胎盘提取液，具有很强的抗氧化性，清除自由基，淡化老化迹象，淡化皱纹，改善皮肤底层结构，促进细胞增殖，增强皮肤弹性，延缓皮肤衰老；5、本发明的羊胎盘提取液，应用于化妆品中具有保湿、抗皱、延缓衰老、增强皮肤免疫功能的作用，具有广阔的市场前景。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为实施例细胞形态图；图2为对比例细胞形态图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本发明较佳的实施例提供一种具有抗衰功能的羊胎盘提取液的制备方法，具体步骤如下：1.清洗剪碎：取胚胎时期的羊胎盘分离出子叶，舍弃胎膜，用含有100u/ml卡那霉素的生理盐水将子叶清洗5遍直至血液去除干净，将子叶剪成约1cm3大小的组织块待用。2.病毒灭活：用0.1vt％的过氧乙酸溶液浸泡处理10min，处理结束用纯化水反复清洗3遍去除过氧乙酸残留。3.破碎均质：按质量体积比为1：3的比例向浸泡处理后的子叶组织块中加入已预冷的1wt％牛磺酸溶液进行破碎均质，转速为15000rpm，均质2次，每次3min。4.浸提离心：将均质好的羊胎盘浆液置于40℃恒温震荡水浴锅中，120rpm震荡浸提3h，浸提结束，5000rpm离心10min收集上清液；沉淀加入1wt％牛磺酸溶液摇匀，采用负压空化提取，负压空化提取的提取温度为20℃～55℃，提取压力为-0.01mpa～-0.03mpa，25min后提取液离心10min收集上清液，弃去沉淀。5.ph调节：混合上清液，用3m的柠檬酸溶液调节ph至5.0。6.第二次浸提离心：将调好ph的上清液置于40℃恒温震荡水浴锅中，120rpm震荡浸提3h，浸提结束，4℃条件下10000rpm离心10min收集上清液，弃去沉淀。7.补体灭活：用20wt％的碳酸钾溶液调节ph至6.3-6.4，置于60℃水浴锅中处理10min进行补体灭活，处理完毕用20wt％的碳酸钾溶液将上清液ph调至7.0。8.离心：在4℃条件下10000rpm离心10min收集上清液，弃去沉淀。9.超滤浓缩：将已过滤除菌的提取液用3kd的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩至蛋白浓度为2.4mg/ml，得到浓缩液；用0.22μm滤器过滤除菌，冻存。实施例2本发明较佳的实施例提供一种具有抗衰功能的羊胎盘提取液的制备方法，具体步骤如下：1.清洗剪碎：取胚胎时期的羊胎盘分离出子叶，舍弃胎膜，用含有90u/ml卡那霉素的生理盐水将子叶清洗3遍直至血液去除干净，将子叶剪成约1cm3大小的组织块待用。2.病毒灭活：用0.08vt％的过氧乙酸溶液浸泡处理10min，处理结束用纯化水反复清洗3遍去除过氧乙酸残留。3.破碎均质：按质量体积比为1：2.5的比例向浸泡处理后的子叶组织块中加入已预冷的1wt％牛磺酸溶液进行破碎均质，转速为15000rpm，均质2次，每次3min。4.浸提离心：将均质好的羊胎盘浆液置于40℃恒温震荡水浴锅中，120rpm震荡浸提3h，浸提结束，5000rpm离心10min收集上清液；沉淀加入1wt％牛磺酸溶液摇匀，采用负压空化提取，负压空化提取的提取温度为20℃～55℃，提取压力为-0.01mpa～-0.03mpa，25min后提取液离心10min收集上清液，弃去沉淀。5.ph调节：混合上清液，用3m的柠檬酸溶液调节ph至5.0。6.第二次浸提离心：将调好ph的上清液置于40℃恒温震荡水浴锅中，120rpm震荡浸提3h，浸提结束，4℃条件下10000rpm离心10min收集上清液，弃去沉淀。7.补体灭活：用20wt％的碳酸钾溶液调节ph至6.3-6.4，置于60℃水浴锅中处理10min进行补体灭活，处理完毕用20wt％的碳酸钾溶液将上清液ph调至7.0。8.离心：在4℃条件下10000rpm离心10min收集上清液，弃去沉淀。9.超滤浓缩：将已过滤除菌的提取液用3kd的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩至蛋白浓度为2.3mg/ml，得到浓缩液；用0.22μm滤器过滤除菌，冻存。实施例3本发明较佳的实施例提供一种具有抗衰功能的羊胎盘提取液的制备方法，具体步骤如下：1.清洗剪碎：取胚胎时期的羊胎盘分离出子叶，舍弃胎膜，用含有110u/ml卡那霉素的生理盐水将子叶清洗4遍直至血液去除干净，将子叶剪成约1cm3大小的组织块待用。2.病毒灭活：用0.12vt％的过氧乙酸溶液浸泡处理10min，处理结束用纯化水反复清洗3遍去除过氧乙酸残留。3.破碎均质：按质量体积比为1：3.2的比例向浸泡处理后的子叶组织块中加入已预冷的1wt％牛磺酸溶液进行破碎均质，转速为15000rpm，均质2次，每次3min。4.浸提离心：将均质好的羊胎盘浆液置于40℃恒温震荡水浴锅中，120rpm震荡浸提3h，浸提结束，5000rpm离心10min收集上清液；沉淀加入1wt％牛磺酸溶液摇匀，采用负压空化提取，负压空化提取的提取温度为20℃～55℃，提取压力为-0.01mpa～-0.03mpa，25min后提取液离心10min收集上清液，弃去沉淀。5.ph调节：混合上清液，用3m的柠檬酸溶液调节ph至5.0。6.第二次浸提离心：将调好ph的上清液置于40℃恒温震荡水浴锅中，120rpm震荡浸提3h，浸提结束，4℃条件下10000rpm离心10min收集上清液，弃去沉淀。7.补体灭活：用20wt％的碳酸钾溶液调节ph至6.3-6.4，置于60℃水浴锅中处理10min进行补体灭活，处理完毕用20wt％的碳酸钾溶液将上清液ph调至7.0。8.离心：在4℃条件下10000rpm离心10min收集上清液，弃去沉淀。9.超滤浓缩：将已过滤除菌的提取液用3kd的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩至蛋白浓度为2.2mg/ml，得到浓缩液；用0.22μm滤器过滤除菌，冻存。对比例1.清洗剪碎：取胚胎时期的羊胎盘分离出子叶，舍弃胎膜，用含有100u/ml卡那霉素的生理盐水将子叶清洗3-5遍直至血液去除干净，将子叶剪成约1cm3大小的组织块待用。2.病毒灭活：用0.1wt％的过氧乙酸溶液浸泡处理10min，处理结束用纯化水反复清洗3遍去除过氧乙酸残留。3.破碎均质：按质量体积比为1：3的比例向浸泡处理的组织块中加入已预冷的1wt％牛磺酸溶液进行破碎均质，转速为15000rpm，均质2次，每次3min。4.浸提离心：将均质好的羊胎盘浆液置于40℃恒温震荡水浴锅中，120rpm震荡浸提3h，浸提结束，5000rpm离心10min收集上清液，弃去沉淀。5.ph调节：上清液用3m的柠檬酸溶液调节ph至5.0。6.第二次浸提离心：将调好ph的上清液置于40℃恒温震荡水浴锅中，120rpm震荡浸提3h，浸提结束，4℃条件下10000rpm离心10min收集上清液，弃去沉淀。7.补体灭活：用20wt％的碳酸钾溶液调节ph至6.3-6.4，置于60℃水浴锅中处理10min进行补体灭活，处理完毕用20wt％的碳酸钾溶液将上清液ph调至7.0。8.离心：在4℃条件下10000rpm离心10min收集上清液，弃去沉淀。9.超滤浓缩：将已过滤除菌的提取液用3kd的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩至蛋白浓度为2.0-2.5mg/ml，得到浓缩液；用0.22μm滤器过滤除菌，冻存。实验例1建立人脐带间充质干细胞(ucmscs)体外老化损伤模型，评价本发明实施例1(及对比例)制得的羊胚胎或羊胎盘提取液的抗衰老功能。1、细胞接种：a)取1个t75瓶收获细胞，细胞代数不超过5代，用培养基稀释50ml细胞悬液，细胞浓度为5×104个/ml，取4个无菌6孔板进行细胞接种。b)每孔加2ml细胞悬液，细胞数量1×105个/孔，孵育24h。2、受试物预孵育2h：a)受试物配置：吸取提取液原液1ml为t1，充分溶于1mlpbs中得浓度t2，取t21ml按恒量稀释法稀释4次，稀释液为pbs，稀释倍数为2，得到4个不同浓度的受试物。分别加入4ml完全培养基(dl+10％fbs)即得目标受试物。b)受试物添加：弃去旧培养基，添加不同浓度受试物，每孔2ml，空白对照和损伤对照加相应等体积的80％(dl+10％fbs)+20％(pbs)；添加完成后轻轻混匀，转移至37℃，5％co2的培养箱中进行培养。如下表1所示：表1培养体系表3、uva辐照：a)辐照条件：按10-15j/cm2的强度设计辐照条件参数。b)受试物预孵育2h后，弃去旧培养基，加2mlpbs溶液清洗后弃去，然后加1mlpbs溶液，轻轻混匀，进行辐照；空白对照组除不进行辐照外，其他操作相同。4、受试物孵育48h：辐照结束后，弃去pbs，每孔对应加入配置好的培养基，添加完成后轻轻混匀，转移至37℃，5％co2的培养箱中进行培养。5、数据采集：a)形态观察：受试物干预后第24h、48h，每天观察各组细胞形态，拍照并保存。实施例组结果如图1所示，由图可知，阴性对照组细胞形态正常，损伤组细胞数量明显减少，细胞老化，实验组细胞形态均正常，数量较阴性对照组更多。对比例组结果如图2所示，由图可知，阴性对照组细胞形态正常，损伤组细胞数量明显减少，细胞老化，实验组细胞数量明显减少，细胞老化。b)细胞活性检测：受试物干预后第48h，将细胞消化下来并进行活细胞计数。结果如下表2所示：表2细胞活性表结果显示，本发明方法的提取液对经紫外损伤的人脐带间充质干细胞有明显的保护作用；而对比例的方法的提取液并不能对经紫外损伤的人脐带间充质干细胞起到保护作用。实验例2对实施例1方法制得的提取液进行抗氧化检测，分别进行dpph自由基清除实验、羟基自由基清除实验和超氧阴离子清除实验。dpph自由基清除实验实验原理1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(简称dpph)是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使dpph乙醇溶液光吸收减弱。dpph乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系，由此可评价试验样品清除自由基的能力，即抗氧化活性的大小。实验方法标准曲线制作维生素e用95％乙醇溶解稀释成：0.08mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml系列浓度梯度用以验证试验系统。样品加样要求表3样品加液要求参照表1，使用15ml离心管设立样品管(t)、样品本底(t0)、dpph管(c)和溶剂本底(c0)，每一样品的每个受试浓度的样品管(t)需设立3支平行管，同时dpph管(c)也需设立3支平行管。在样品管(t)和样品本底(t0)中各加入1ml相同浓度的样品溶液。在所有试管中(t、t0、c、c0)补充溶剂，水溶性样品用水，油溶性样品用95％乙醇，补足3ml混匀。在样品管(t)和dpph管(c)中加入dpph乙醇溶液1ml，样品本底(t0)和溶剂本底(c0)用95％乙醇代替，轻轻摇匀，室温下避光静置5分钟。将各支反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值。结果计算计算dpph自由基清除率：t—样品管吸光值3次平均值，即样品与dpph反应后溶液吸光值；t0—样品本底吸光值；c—dpph管吸光值3次平均值，即未加样品时dpph溶液吸光值；c0—溶剂本底吸光值。表4dpph自由基清除结果表羟基自由基清除能力检测实验实验原理采用fe2+/h2o2法测定羟基自由基清除能力(hrsa)，邻二氮菲-fe2+在536nm处有强吸收，·oh可将邻二氮菲-fe2+氧化成为邻二氮菲-fe3+，使536nm处的吸收减弱。抗氧化剂有清除和中和·oh作用，可以抑制此氧化过程。用fn表示邻二氮菲，反应式：feso4+3fn→[fe(fn)3]so4。检测步骤阴性对照：依次加入0.5ml1.0mmol/l邻二氮菲乙醇溶液、0.5ml去离子水、1.0ml0.15mol/lph7.4的pbs及0.5ml0.75mmol/l的feso4，最后加入0.5ml去离子水，放入37℃水浴锅中恒温60min，反应充分后在536nm测其吸光度a0。阳性对照：依次加入0.5ml1.0mmol/l邻二氮菲乙醇溶液、0.5ml去离子水、1.0ml0.15mol/lph7.4的pbs及0.5ml0.75mmol/l的feso4，最后加入0.5ml0.01％(v/v)h2o2，放入37℃水浴锅中恒温60min，反应充分后在536nm测其吸光度ai。样本检测：依次加入0.5ml1.0mmol/l邻二氮菲乙醇溶液、0.5ml样本溶液、1.0ml0.15mol/lph7.4的pbs及0.5ml0.75mmol/l的feso4，最后加入0.5ml0.01％(v/v)h2o2，放入37℃水浴锅中恒温60min，反应充分后在536nm测其吸光度aj。按下表5加样结果计算按以下公式计算羟基自由基(·oh)清除率。表6羟基自由基清除结果表超氧阴离子自由基清除能力检测实验原理碱性条件下，邻苯三酚会迅速氧化释放出超氧化物阴离子(自氧化过程)，生成有色中间产物(反应刚开始变成黄绿色，几分钟后转为黄色)，在320nm波长处有吸收，吸光度随之增加，使得吸光度值与反应时间呈良好的线性关系。当有抗氧化物质存在时，会抑制其自氧化速率，导致吸光度值下降，邻苯三酚自氧化速率降低。操作步骤邻苯三酚自氧化速率(a0)：取2.9mla液，25℃水浴30min，迅速加入0.1ml25℃恒温的b液，摇匀后在320nm处每隔30s读取吸光度值a，连续测定3min，以a对时间作图(以a为纵坐标，时间为横坐标)，斜率即为邻苯三酚自氧化速率a0。样本测定：取0.1ml样本测定液，加入2.8mla液，25℃水浴30min，迅速加入0.1ml25℃恒温的b液，摇匀后在320nm处每隔30s读取吸光度值a，连续测定3min，以a对时间作图(以a为纵坐标，时间为横坐标)，斜率即为样本的邻苯三酚氧化速率as。结果计算按以下公式计算超氧阴离子自由基清除率(srsa)。表7超氧阴离子清除结果表时间a0羊胎盘提取液300.4580.402600.4750.407900.4920.411200.510.4131500.5270.4151800.5430.417a00.0006as0.0001清除率％83.33333333由上表结果可知，本发明方法得到的提取液具有很强的抗氧化性。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12