查尔酮化合物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用及药物组合物的制作方法

[0001]
本发明属于查尔酮化合物药物应用技术领域，具体涉及一种查尔酮化合物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用及药物组合物。


背景技术：

[0002]
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]
阿尔茨海默病是一种起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病，主要发生于老年人群，且随着年龄的增长患病率显著升高。患者主要表现为记忆等认知或行为(神经精神的)的改变。阿尔茨海默病是不断发展的：轻度症状主要表现为记忆力下降；中度症状表现为记忆力继续衰退，存在明显的认知缺陷；重度症状表现为智力严重衰退，不能独立进行室外活性，生活不能自理等。在疾病的进展过程中，患者还会出现情绪和人格上的改变，发生异常的情绪波动，如激越、易怒、冲动、动机缺乏、淡漠及徘徊等症状。
[0004]
目前，乙酰胆碱酯酶抑制剂通过抑制阿尔茨海默病患者乙酰胆碱酯酶的活性，延长脑内乙酰胆碱的存在时间，使乙酰胆碱在脑内的含量增加，成为当前阿尔茨海默病治疗手段之一。但是发明人发现现有的药物对乙酰胆碱酯酶的抑制效率较低，进而对阿尔茨海默病的治疗效果欠佳。


技术实现要素：

[0005]
针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种查尔酮化合物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用及药物组合物。
[0006]
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
[0007]
第一方面，本发明提供一种查尔酮化合物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用，所述查尔酮化合物的结构式，如式(i)所示：
[0008]
其中，r＝bn，
[0009]
(i)。
[0010]
第二方面，本发明提供一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物，其中的活性物质为查尔酮化合物，其结构式如式(i)所示：
[0011]
其中，r＝bn，
[0012]
(i)。
[0013]
第三方面，本发明提供一种治疗阿尔茨海默病的药物制剂，由所述药物组合物制备而成。
[0014]
与现有技术相比，本发明的有益技术效果为：
[0015]
该查尔酮化合物具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其ki值为5.39μm，ki'值为3.54μm，在制备阿尔茨海默病的治疗药物中具有较好的应用前景。
附图说明
[0016]
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
[0017]
图1为本发明实施例中制备的新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin的cosy和hmbc相关谱；
[0018]
图2为本发明实施例中cornish
–
bowden(a)and dixon(b)plots法测定新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin对乙酰胆碱酯酶抑制作用的谱图；
[0019]
图3为本发明实施例中制备的新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin(化合物1)与乙酰胆碱酯酶的对接和结合模式图；
[0020]
图4为本发明实施例中制备的新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin的1h nmr谱图(400mhz,cdcl3)；
[0021]
图5为本发明实施例中制备的新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin的
13
c nmr谱图(400mhz,cdcl3)；
[0022]
图6为本发明实施例中制备的新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin的cosy谱图(400mhz,cdcl3)；
[0023]
图7为本发明实施例中制备的新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin的hsqc谱图(400mhz,cdcl3)；
[0024]
图8为本发明实施例中制备的新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin的hmbc谱图(400mhz,cdcl3)；
[0025]
图9为本发明实施例中制备的新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin的hresims谱图。
具体实施方式
[0026]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0027]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根
据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0028]
第一方面，本发明提供一种查尔酮化合物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用，所述查尔酮化合物的结构式，如式(i)所示：
[0029]
其中，r＝bn，
[0030]
(i)。
[0031]
在一些实施例中，在治疗阿尔茨海默病药物，所述查尔酮化合物为乙酰胆碱酯酶抑制剂。
[0032]
进一步的，所述查尔酮化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制率达到50％的最低浓度为1.6μm。
[0033]
第二方面，本发明提供一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物，其中的活性物质为查尔酮化合物，其结构式如式(i)所示：
[0034]
其中，r＝bn，
[0035]
(i)。
[0036]
在一些实施例中，所述药物组合物由所述查尔酮化合物及药学上必须的辅料组成。
[0037]
在一些实施例中，所述药物组合物包括所述查尔酮化合物、其他具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的成分和/或辅助乙酰胆碱酯酶抑制活性成分及药学上所必须的辅料。
[0038]
进一步的，所述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的成分为黄酮类或原花青素类。
[0039]
进一步的，所述辅助乙酰胆碱酯酶抑制活性成分为花生壳中黄酮类成分木犀草素、圣草酚和5,7-二羟基色原酮中一种或者组合物，以及花生红衣中原花青素类成分。
[0040]
第三方面，本发明提供一种治疗阿尔茨海默病的药物制剂，由所述药物组合物制备而成。
[0041]
在一些实施例中，所述药物制剂为口服制剂、透皮制剂或注射剂。
[0042]
实施例
[0043]
实验设备
[0044]
nicolet-510p型红外光谱仪(美国)，v
max
以cm-1
为单位；核磁共振仪为bruker amx-400型，tms为内标，化学位移以δ表示，耦合常数以j表示。
[0045]
提取和分离方法
[0046]
3.4kg刺果毛茛粉碎，10l乙醇室温浸提，过滤滤液，减压浓缩，得到6.5g总提取物。
将总提取物采用硅胶柱色谱分离，采用正己烷/乙酸乙酯体系梯度洗脱，梯度洗脱为依次用正己烷/乙酸乙酯体积比为10:90、7.5:92.5和5:95的混合溶剂进行洗脱，得到8个组分(f1-8)，其中，将组分f3(120mg)经正己烷/乙酸乙酯体系反复硅胶层析(1.8:8.2，v/v)，得到4-benzyloxylonchocarpin(新查尔酮化合物，7.9mg)和4-methoxylonchocarpin(5.3mg)。
[0047]
新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin的结构解析：
[0048]
4-benzyloxylonchocarpin(新查尔酮化合物)：黄色固体，ir(kbr)v
max
：3310、1655、1610、1420、1000cm-1
，hresims：m/z 413.1711[m+h]
+
：(calcd for c
27
h
25
o
4+
，413.1747，m 8.8ppm)。1h-nmr显示在δ7.45和7.86处具有16.0hz耦合常数的1质子双峰信号，为反式查尔酮的h-α和h-β的典型特征，从耳酮在δ27.8(c-β)，144.0(c-α)和191.9(共轭酮)处的
13
c-mr信号进一步证实了这一点。此外，氢谱在δ6.76(j＝10hz，h-1”)和5.59(j＝10hz，h-2”)处显示了双峰，在δ1.47处显示了6质子单峰。通过典型的异戊二烯基与相邻羟基的环化形成吡喃环。1h(400mhz,cdcl3)和
13
c nmr(100mhz,cdcl3)结果见表1。
[0049]
新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin和化合物4-methoxylonchocarpin的结构式为：
[0050][0051]
其中，4-benzyloxylonchocarpin，r＝bn，
[0052]
4-methoxylonchocarpin，r＝me。
[0053]
表1 4-benzyloxylonchocarpin的1h nmr(400mhz)和
13
c nmr(100mhz)结果
[0054][0055][0056]
生物评估
[0057]
通过ellman方法，对所选化合物(4-benzyloxylonchocarpin和4-methoxylonchocarpin)的酶抑制作用进行了评价，其中乙酰胆碱酯酶来自嗜电菌，丁酰胆碱酯酶来自于马血清(如表2和图2所示)。以临床上使用的胆碱酯酶抑制剂氢溴酸甘蓝胺作为标品。
[0058]
相关溶液的制备方法：
[0059]
50mm tris-hcl缓冲液的制备：将606mg的三羟甲基氨基甲烷溶解于100ml纯水中，并且将溶液的ph用盐酸调至8.0
±
0.1，然后将调至好的溶液保存在冰箱里。
[0060]
2.005u/ml乙酰胆碱酯酶溶液的制备：将0.037mg的酶溶解在5ml的ph为8.0的nan3缓冲液。2.040u/ml丁酰胆碱酯酶溶液制备：将1.353mg的酶溶解在5ml的ph为8.0的nan3缓冲液。
[0061]
3mm dtnb(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))溶液的制备：将23.8mg的dtnb溶解于20ml的ph为8.0的含有116.8mg的nacl和38mg的mgcl2氯化镁缓冲液。
[0062]
15mm atchi(碘化硫代乙酰胆碱)溶液的制备：将43.4mg atchi溶解于20ml纯水中。
[0063]
所有溶液放置于微量离心管中并保存于冰箱中。
[0064]
4-benzyloxylonchocarpin和4-methoxylonchocarpin起先溶解于二甲基亚砜中，浓度为100μm。
[0065]
氢溴酸加兰他敏作为标品溶解于纯水中。
[0066]
酶溶液通过纯水进行稀释，残留的dmso未检测到抑制作用(<0.5％)。
[0067]
胆碱酯酶抑制率测定方法
[0068]
25μl样品溶液(3个不同浓度和1个空白)，125μl的dtnb溶液和25μl酶溶液(乙酰胆碱酯酶为2.005u/m或者丁酰胆碱酯酶2.040u/ml)在96孔板中在30℃下孵育20min。加入25μl底物(atchi)开始酶反应。最终底物浓度是[atchi]＝0.9375mm、0.625mm、0.325mm和0.1875mm。在30℃内每30min测一次吸光度，测一次需要1min，所有反应需要平行三次。
[0069]
氢溴酸加兰他敏作为标准抑制剂。通过lineweaver-burk dixon和cornish-bowden方法测定ki和ki
’
。相对抑制率为化合物和空白两者吸光度的商，每个化合物的浓度为10μm。底物浓度为[atchi]＝0.625mm。在30℃下，每10min测量415nm下的吸光值。ic
50
值通过graphpad prism 5软件计算。
[0070]
实验结果表明，标品氢溴酸甘蓝胺可以作为乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶两者的竞争性抑制剂。化合物4-benzyloxylonchocarpin是乙酰胆碱酯酶的优良抑制剂，在该酶浓度为10μm时抑制率为97.4％(ki＝5.39μm；ki'＝3.54μm)(见表2)，因此，该化合物4-benzyloxylonchocarpin可以作为乙酰胆碱酯酶的混合型抑制剂，然而，对于丁酰胆碱酯酶，新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin仅降低了其抑制效果(在10μm浓度下抑制27.3％)。
[0071]
此外，还对化合物4-methoxylonchocarpin进行了酿酒酵母α-葡萄糖苷酶的抑制率检测。α-葡萄糖苷酶抑制率测定方法具体为：
[0072]
100mm磷酸缓冲液的制备：将2.65g无水磷酸氢钠，4.7g磷酸二钠和0.1g硝酸钠溶液溶解于nan3缓冲液中，并调ph至7.5。每个孔中加入10μl的2mg/ml二甲基亚砜样品溶液，90μl的100mm磷酸缓冲液和80μl的α-葡萄糖苷酶溶液。微板摇动2min，在28℃孵育10min。然后，在每孔中加入20μl底物(10mmp-npg)开始反应，酶活力通过测定每35min内405nm下的吸光度获得，每次测30s，抑制率通过如下公式计算：
[0073][0074]
其中，斜率(空白)包含缓冲液，酶和底物的孔中的酶活性，斜率(样品)包含缓冲液、酶、底物和样品孔中的酶活性。
[0075]
实验结果表明，化合物4-methoxylonchocarpin对于α-葡萄糖苷酶的抑制效果不
明显，抑制率为36.1％。
[0076]
对化合物4-methoxylonchocarpin和新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin的细胞毒性进行了测定：
[0077]
细胞毒性测定方法为：
[0078]
用硫酸胺b微培养比色法测定了化合物的细胞毒性。在第0天，在适当的细胞密度下，将细胞接种到96孔板中，实验期间防止细胞融合。24小时后，用6种不同浓度(1、3、7、12、20和30μm)处理细胞。终浓度不超过0.5％的dmso/dmf对细胞无毒。96h处理后，将96孔板上清液丢弃，细胞中加入10％(tca)并放于4℃中。固定24h后，在条形垫圈中洗涤细胞，用srb溶液(100μl，0.4％乙酸)染色20min。干燥之后用1％乙酸洗涤4次除去多余的染料并放在干燥的空气中过夜。每孔加入缓冲碱液(200μl，10mm)，用96孔板阅读器在λ＝570nm处测量吸光度值。ec
50
值取三个平均值，每个实验一式三份，使用非线性四参数hills-slope方程(graphpad prism5；变量top和bottom分别设置为100和0)从半对数剂量响应曲线计算得出。
[0079]
实验结果表明，化合物4-methoxylonchocarpin对卵巢癌(a2780：ic
50
：25.4μm)、结直肠腺癌(ht29：ic
50
：20.2μm)、乳腺癌(mcf7：ic
50
：23.7μm)和甲状腺癌(sw1736：ic
50
：26μm)具有中度的细胞毒性，而对咽癌无细胞毒性(fadu：ic50：>30μm)。新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin对fadu、a2780、ht29、mcf7和sw1736没有细胞毒性(ic
50
：>30μm)。
[0080]
表2胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性的结果
[0081][0082]
a
为10μm浓度时的抑制率(％)。
[0083]
其中，化合物1是指新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin；
[0084]
化合物2是指化合物4-methoxylonchocarpin。
[0085]
分子对接实验
[0086]
为了研究所提出的4-benzyloxylonchocarpin(新查尔酮化合物)的可能抑制模式，分别用乙酰胆碱脂酶进行分子对接。目标蛋白小分子之间的分子对接是了解它们相互作用的重要工具。但是，ache的晶体结构(pdb代码4ey6)是从蛋白质数据库中检索到的。通过使用分子操作环境(moe2016.0802版)，通过去除水和除共结晶配体以外的配体分子来制备蛋白质。然后使用默认参数进行质子化，并通过amber：10eht力场将能量最小化。
[0087]
在chembiodraw ultra14.0中绘制了命中的化合物结构。然后用moe进行制备，计算质子化状态，通过施加mmff94x力场分配部分电荷使得能量最小化。应用相同的方案制备
共结晶的配体，以进行重新计算。为了验证分子操作环境(moe)软件的可重复性，重新对接了相关配体。在对软件进行基准测试后，将选定的配体对接在结合袋中，并在伦敦dg上设置评分，同时使用gbvi/wsa dg评分功能进行完善。采用诱导拟合方案对产生的前30个姿态进行细化。为了研究这些相互作用，使用plif模块进行了后对接分析在moe实施。
[0088]
新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin与乙酰胆碱酯酶的对接研究表明，其形成了两个氢键(如图3所示)，这可能是所观察到的亲和力的原因。苄氧基的氧原子作为tyr124侧链的氢键受体，键距为另一个氢键是在ser203的-oh基团和苯基环c-2位的-oh基团之间形成的，键距为与标准化合物加兰他敏中各种氨基酸残基例如trp86，tyr124，trp286，leu289，phe297，tyr337，phe338和tyr449相比，新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin显示出多种疏水相互作用。
[0089]
该实施例中分离提取的新查尔酮化合物4-benzyloxylonchocarpin对乙酰胆碱酯酶具有显著的抑制作用(ki 5.39
±
0.51μm，ki'3.54
±
0.24μm)。而4-methoxylonchocarpin对于乙酰胆碱酯酶具有较弱的抑制作用(49.9％)，这表明c-4的苄基对抑制ache起着至关重要的作用。查尔酮在阿尔茨海默病治疗中可以发挥多向功能，因为这些化合物能抑制淀粉样β(aβ)的内部拼接以及aβ寡聚体的断裂。目前对阿尔茨海默病这类疾病的潜在治疗效率低下。ad与胆碱神经传递障碍的相互关系为开发乙酰胆碱酯酶抑制剂作为治疗药物提供了较好的基础。此外，使用乙酰胆碱酯酶抑制剂可以缓解阿尔茨海默病疾病中的一些不良的行为和认知症状。
[0090]
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。