一种抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料及制备方法与流程

1.本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料及制备方法。


背景技术：

2.皮肤创伤的医疗和护理中，止血用品是必备材料之一，市场上可获得的止血材料主要有两类：
①
有机类胶原蛋白、明胶和壳聚糖等；
②
无机类多孔沸石和高岭土等。这些材料均具有良好的止血作用，但也存在一定的缺点。如胶原蛋白仅依靠激活血小板来止血，作用方式单一且黏附性差；壳聚糖是甲壳素脱除部分乙酰基的产物，具有无毒、安全、可生物降解的特点，易于获取并具有广泛的应用前景，然而，壳聚糖因其分子内氢键和大分子空间构型不易溶于水和有机溶剂，因而应用受到了限制。多孔沸石用于止血时吸水会释放大量热量，有伤口灼伤的风险；羧甲纤维素敷料在创面内不能降解，移除时易产生疤痕。
3.其实，早在1972年roveeti通过研究便发现湿润的创面环境能使上皮细胞的移行速度加快，促进创面的愈合。因此，创面上覆盖的敷料需能防止水分损失，传统的敷料如纱布、绷带等对创面虽有保护作用，但保湿吸液能力差，只能吸收自身重量的4
‑
5倍的液体，而且对于一些伤口在移除传统敷料时，敷料容易黏连伤口组织，造成二次伤口破坏，因此在外科手术中，常常还需要一些可降解、生物相容性好的敷料来防止器官黏连。
4.所以基于创面修复的四个阶段：止血期、炎症期、增殖期及成熟期，需要敷料作用于伤口时能满足各个阶段的需求，不仅能及时制止出血，还能抗菌抗炎，同时不会与创面黏连，从而完美的修复创面。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料及其制备方法，本发明的敷料作用于创面可快速止血，且具有抗菌抗炎作用，可促进创面愈合，更换时不会与创面黏连。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
7.一种抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料，所述敷料从贴创伤面起依次为快速止血层、抗菌复合层以及外保护层；所述快速止血层为吸附钙离子的改性壳聚糖凝胶薄膜，所述改性壳聚糖凝胶薄膜为红薯不溶性膳食纤维与壳聚糖交联改性后制得；所述抗菌复合层为负载有机累托石微球的藻酸盐/红薯淀粉复合膜，所述有机累托石微球包含碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白；所述外保护层为壳聚糖接枝于无纺布或脱脂棉上制成；所述快速止血层、抗菌复合层与外保护层通过物理化学作用连接在一起。
8.优选地，所述红薯淀粉为将红薯清洗干净后采用传统的方法提取红薯淀粉；所述红薯不溶性膳食纤维为从提取淀粉后的红薯滤渣中提取红薯不溶性膳食纤维。
9.优选地，所述红薯不溶性膳食纤维的提取方法为：将提取淀粉后的红薯滤渣烘干并粉碎，过100目筛，然后按料液比1:10(g/ml)加入0.2mol/l的氢氧化钠水溶液浸泡1小时，
洗涤、过滤，之后加入磷酸缓冲液调节ph为6.0～6.5，加α
‑
淀粉酶(用量为0.8ml/g)在85℃下水解1小时、胰蛋白酶(用量为0.6ml/g)在45℃下水解1小时，再次调节ph为5.0，加入糖化酶(用量为4.0ml/g)在60℃下水解1小时，使滤渣中的淀粉和蛋白质充分水解后抽滤，抽滤物洗涤并再次抽滤干燥，粉碎过100目筛即得红薯不溶性膳食纤维。
10.一种抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)将红薯不溶性膳食纤维与壳聚糖混合溶于醋酸溶液中，混合液充分搅拌混合均匀，加入戊二醛，50℃先反应1小时，之后将混合液浇筑于模具中、流延，静置，真空冷冻干燥得到改性壳聚糖凝胶薄膜；
12.(2)将步骤(1)制备的改性壳聚糖薄膜浸泡于氯化钙溶液中，搅拌并加入氢氧化钠溶液调节ph值，一定时间后取出，去离子水洗涤除去表面的混合液，并真空冷冻干燥得到吸附钙离子的改性壳聚糖凝胶薄膜，即快速止血层；
13.(3)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，搅拌均匀得到壳聚糖醋酸溶液；取有机累托石溶于醋酸等体积去离子水中，得悬浮液，然后将壳聚糖醋酸溶液加入悬浮液中得混合溶液，70～80℃搅拌20～25小时，冷至室温，加入氢氧化钠溶液调节混合液ph为7～8，然后加入碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白，并加入氯化钙溶液，室温下继续反应5～8小时，抽滤、去离子水洗涤、室温下真空干燥，得到含碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白的有机累托石/壳聚糖复合微球；
14.(4)将藻酸盐与红薯淀粉混合溶于去离子水中，95℃下搅拌10分钟，冷却至室温后将步骤(2)制备的复合微球加入溶液中，充分搅拌，之后将混合液浇筑于模具中、流延成膜、静置，室温下真空干燥得到负载有机累托石微球的藻酸盐/红薯淀粉复合膜，即抗菌复合层；
15.(5)将引发剂、交联剂溶于去离子水中，混合搅拌，将无纺布或脱脂棉浸泡于混合液中，50～70℃下反应4～6小时，之后加入壳聚糖继续反应6～10小时，使壳聚糖接枝于无纺布或脱脂棉上，去离子水洗涤，真空冷冻干燥得到外保护层；
16.(6)将步骤(2)制备的快速止血层薄膜、步骤(4)制备的抗菌复合层及步骤(5)制备的外保护层依次叠加平铺，挤压干燥成型即得抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料。
17.优选地，步骤(1)所述红薯不溶性膳食纤维与壳聚糖的质量比1～2:2～3，所述醋酸溶液为2％的醋酸溶液，所述红薯不溶性膳食纤维与壳聚糖的混合液的浓度为15％～25％，所述戊二醛的为2％戊二醛溶液，所述戊二醛溶液与红薯不溶性膳食纤维、壳聚糖混合液的体积比为1:15，所述真空冷冻干燥为
‑
20～
‑
40℃下真空冷冻干燥，温度由低至高，每半小时升温5℃。
18.优选地，步骤(2)所述氯化钙溶液的浓度为0.1mol/l，所述改性壳聚糖薄膜与氯化钙溶液的质量体积比为5～8g:600ml，所述氢氧化钠的浓度为1mol/l，所述溶液调节后的ph为8～10，处理时间为40
‑
60分钟；步骤(2)所述真空冷冻干燥为
‑
20～
‑
40℃下真空冷冻干燥，温度由低至高，每半小时升温5℃。
19.优选地，步骤(3)中所述有机累托石的制备方法为：所述有机累托石为十六烷基三甲基溴化铵改性的累托石，将累托石溶于去离子水中，溶胀10～20小时，之后将配制的浓度1％～2％的十六烷基三甲基溴化铵的水溶液滴于累托石的水溶液中，90℃搅拌5～6小时，离心、去离子水洗涤、离心、干燥、粉碎得到有机累托石；所述累托石与十六烷基三甲基溴化
铵的质量比为1:0.4～0.6。
20.优选地，步骤(3)中所述醋酸为2％的次酸溶液，所述壳聚糖醋酸溶液的浓度为4％～6％；步骤(3)所述壳聚糖与有机累托石的质量比为1～3:1，所述氯化钙溶液的浓度为0.6～1.0mol/l，所述氯化钙溶液与混合溶液的体积比为1:20～30，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/l，所述碱性成纤维细胞生长因子与蚯蚓活性蛋白的比例为1:0.28～0.31，所述碱性成纤维细胞、蚯蚓活性蛋白总量与壳聚糖、有机累托石的总量比为0.05～0.10:2～3。
21.优选地，步骤(4)所述藻酸盐与红薯淀粉的质量比为3～4:1～2，所述藻酸盐与红薯淀粉的混合液浓度为15～25wt％，所述为微球与藻酸盐、红薯淀混合物的质量比为1:10～15，所述真空干燥通过控制干燥时间使其不完全干燥。
22.优选地，步骤(5)所述引发剂为过硫酸铵，所述交联剂为n,n
‑
亚甲基
‑
双丙烯酰胺，所述引发剂、交联剂、无纺布或脱脂棉与壳聚糖的质量比为0.5～2:10～20:20～30:10～20，所述真空冷冻干燥为
‑
20℃下干燥。
23.本发明抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料由三层材料组成，分别为快速止血层、抗菌复合层及外保护层，快速止血层与创面贴合时可以快速制止血液流失；抗菌复合层中藻酸盐与红薯淀粉协同作用，不仅增加复合层薄膜的粘性，一方面使其通过挤压可与快速止血层及外保护层连接起来，另一方面各层之间通过化学物质之间的氢键作用键合，而且使复合层的抗炎、抗感染性能增加，同时其多孔物质吸收结构可将伤口积液吸附，使积液不会在伤口聚集，又保持了创面的湿润环境，利于伤口的愈合；外保护层为壳聚糖改性的无纺布或脱脂棉，可以抵抗外源性细菌感染；整个敷料具有透气性，使氧气和水蒸气能进行自由交换，伤口渗出液不会溢出敷料，外界的颗粒状异物、灰尘和细菌也能被有效阻隔。
24.本发明抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料贴敷于创面首先可以达到快速止血的目的，快速止血层的凝胶敷料中含有大量钙离子，创面血液外流时大量血小板也顺流而出，外部高浓度的钙离子促进血小板快速凝集，血小板与受伤变得粗糙的血管和附近组织摩擦、碰撞，释放出里面的血小板因子，启动人体止血过程；血小板因子随即激活凝血因子，后者又激活另一凝血因子，最终催化血液中的纤维蛋白原变成纤维蛋白，众多纤维蛋白迅速组成肉眼看不见却十分致密的“网”，堵住血管裂口，达到快速止血目的；其次，红薯不溶性膳食纤维交联改性的壳聚糖使快速止血层能吸收大量水分，其通过吸收血液及渗液后快速膨胀压迫止血，对创面的有害物质有较强的吸附和清除能力，并且凝胶薄膜吸收大量水分后形成水凝胶不会与创面黏连，避免更换敷料时创面新生肉芽组织与敷料黏连造成二次伤害，同时壳聚糖具有抗炎作用，且可以抑制细菌的生长，红薯不溶性膳食纤维改性壳聚糖制备的薄膜具有生物相容性且可生物降解，质子化后的壳聚糖能溶于水，与不溶性膳食纤维交联后，水溶解性降低，而红薯不溶性膳食纤维可降解为人体可吸收的葡糖糖、果糖及半乳糖。
25.本发明抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料的抗菌复合层是由亲水性的藻酸盐负载有机累托石/壳聚糖复合微球制成的，藻酸盐及复合微球都具有良好的吸附积液的功能，不仅吸收伤口渗出液，同时吸收敷料自溶清创时产生的液化坏死组织，且微球中含有的碱性成纤维细胞生长因子、蚯蚓活性蛋白可促进成纤维细胞的增殖，在伤口愈合的纤维组织增生过程中通过微球缓释促进成纤维细胞增殖进而加速创面愈合。
26.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
27.(1)本发明抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料能够快速止血，避免敷料贴敷于创面后还不能及时控制出血量，延误控制伤患伤势的最佳时机，且本发明敷料快速止血层为红薯不溶性膳食纤维改性的壳聚糖，增强了凝胶的抗水解性能，避免敷料的频繁更换及黏连。
28.(2)本发明抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料，抗菌复合层含有的碱性成纤维细胞与蚯蚓活性蛋白协同作用，促进了成纤维细胞的增殖，进一步促进创面的愈合，且碱性成纤维细胞生长因子与蚯蚓活性蛋白的比例必须在1:0.28～0.31范围内时才能在本发明的添加量下呈现出良好的促成纤维细胞增殖性能，且在该比例范围内的蚯蚓活性蛋白与碱性成纤维细胞生长因子的作用下，对成纤维细胞的增殖效果超过两种物质作用之和。
29.(3)本发明抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料不仅抗炎、抗感染，使创面在愈合的炎症期也能够良好的恢复，同时该敷料也能抵抗外源性细菌的感染。
30.(4)本发明抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料更换敷料时不会与伤口黏连，避免了二次损伤，且快速止血层、抗菌复合层及外保护层三层作用下，极好的防止了渗液外漏，给予创面良好的修复环境。
附图说明
31.图1为不同比例的碱性成纤维细胞生长因子与蚯蚓活性蛋白对成纤维细胞增殖的影响。
具体实施方式
32.下面结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步的详细描述，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
33.一种抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料，所述敷料从贴创伤面起依次为快速止血层、抗菌复合层以及外保护层；所述快速止血层为吸附钙离子的改性壳聚糖凝胶薄膜，所述改性壳聚糖凝胶薄膜为红薯不溶性膳食纤维与壳聚糖交联改性后制得；所述抗菌复合层为负载有机累托石微球的藻酸盐/红薯淀粉复合膜，所述有机累托石微球包含碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白；所述外保护层为壳聚糖接枝于无纺布或脱脂棉上制成；所述快速止血层、抗菌复合层与外保护层通过物理化学作用连接在一起。
34.其中，所述红薯淀粉为将红薯清洗干净后采用传统的方法提取红薯淀粉；所述红薯不溶性膳食纤维为从提取淀粉后的红薯滤渣中提取红薯不溶性膳食纤维。
35.所述红薯不溶性膳食纤维的提取方法为：将提取淀粉后的红薯滤渣烘干并粉碎，过100目筛，然后按料液比1g:10ml加入0.2mol/l的氢氧化钠水溶液浸泡1小时，之后加入磷酸缓冲液调节ph为6.0～6.5，按滤渣重量加入0.8ml/g的α
‑
淀粉酶在85℃下水解1小时、0.6ml/g的胰蛋白酶在45℃下水解1小时，再次调节ph为5.0，加入4.0ml/g糖化酶在60℃下水解1小时，使红薯滤渣中的淀粉和蛋白质充分水解后抽滤，抽滤物洗涤、再次抽滤干燥并粉碎，过100目筛即得红薯不溶性纤维。
36.实施例1
37.一种抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料的制备方法，包括以下步骤：
38.(1)将红薯不溶性膳食纤维与壳聚糖以质量比为1:2混合溶于2％的醋酸溶液中，
充分搅拌混合均匀，混合液的浓度为15％，加入2％的戊二醛，戊二醛溶液与红薯不溶性膳食纤维、壳聚糖混合物的体积比为1:15，50℃先反应1小时，之后将混合液浇筑于模具中、流延、静置，之后于
‑
20～
‑
40℃下真空冷冻干燥，温度由低至高，每半小时升温5℃得到改性壳聚糖凝胶薄膜；
39.(2)取5g步骤(1)制备的改性壳聚糖凝胶薄膜浸泡于600ml的0.1mol/l氯化钙溶液中，搅拌并滴加1mol/l的氢氧化钠调节ph为8，40分钟后取出，去离子水洗涤除去表面的混合液，于
‑
20～
‑
40℃下真空冷冻干燥，温度由低至高，每半小时升温5℃，得到吸附钙离子的改性壳聚糖薄膜，即快速止血层；
40.(3)将壳聚糖溶于2％的醋酸溶液中，搅拌均匀得到4wt％的壳聚糖醋酸溶液；取与壳聚糖等量的有机累托石溶于与醋酸等体积的去离子水中，得悬浮液，然后将壳聚糖醋酸溶液加入悬浮液中得混合溶液，70℃搅拌25小时，冷至室温，之后加入1mol/l氢氧化钠溶液调节混合液ph为7，然后按壳聚糖、有机累托石的总量与碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白的比例为2:0.05加入碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白，其中碱性成纤维细胞与蚯蚓活性蛋白的比例为1:0.28，再加入0.6mol/l的氯化钙溶液，氯化钙溶液的添加量与混合溶液的体积为1:20，室温下继续反应5小时，抽滤、去离子水洗涤、室温下真空干燥，得到含碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白的有机累托石/壳聚糖复合微球。
41.(4)将藻酸盐与红薯淀粉以质量比为3:1混合溶于去离子水中，混合液浓度为15wt％，95℃下搅拌10分钟，冷却至室温后将步骤(2)制备的复合微球加入溶液中，微球与藻酸盐、红薯淀粉混合物的质量比为1:10，充分搅拌，之后将混合液浇筑于模具中、流延成膜、静置，室温下真空干燥得到负载有机累托石微球的藻酸盐/红薯淀粉复合膜，同时观察使其不完全干燥，即抗菌复合层；
42.(5)将过硫酸铵、n,n
‑
亚甲基
‑
双丙烯酰胺溶于去离子水中，混合搅拌，将无纺布浸泡于混合液中，50℃下反应4小时，之后加入壳聚糖，其中过硫酸铵、n,n
‑
亚甲基
‑
双丙烯酰胺、无纺布与壳聚糖的质量比为0.5:10:20:10，继续反应6小时，使壳聚糖接枝于无纺布上，去离子水洗涤，
‑
20℃下真空冷冻干燥得到外保护层；
43.(6)将步骤(2)制备的快速止血层薄膜、步骤(4)制备的抗菌复合层及步骤(5)制备的外保护层依次叠加平铺，挤压干燥成型即得抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料。
44.其中，步骤(3)所述有机累托石为十六烷基三甲基溴化铵改性的累托石，其制备方法为：将累托石溶于去离子水中，溶胀10小时，之后将配制的浓度为1％的十六烷基三甲基溴化铵的水溶液滴于累托石的水溶液中，其中累托石与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1:0.4，然后于90℃搅拌5小时，离心、去离子水洗涤、离心、干燥，磨碎得到有机累托石。
45.实施例2
46.一种抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料的制备方法，包括以下步骤：
47.(1)将红薯不溶性膳食纤维与壳聚糖以质量比为1:3混合溶于2％的醋酸溶液中，充分搅拌混合均匀，混合液的浓度为18％，加入2％的戊二醛，戊二醛溶液与红薯不溶性膳食纤维、壳聚糖混合物的体积比为1:15，50℃先反应1小时，之后将混合液浇筑于模具中、流延、静置，之后于
‑
20～
‑
40℃下真空冷冻干燥，温度由低至高，每半小时升温5℃得到改性壳聚糖凝胶薄膜；
48.(2)取6g步骤(1)制备的改性壳聚糖凝胶薄膜浸泡于600ml的0.1mol/l氯化钙溶液
中，搅拌并滴加1mol/l的氢氧化钠调节ph为9，50分钟后取出，去离子水洗涤除去表面的混合液，于
‑
20～
‑
40℃下真空冷冻干燥，温度由低至高，每半小时升温5℃，得到吸附钙离子的改性壳聚糖薄膜，即快速止血层；
49.(3)将壳聚糖溶于2％的醋酸溶液中，搅拌均匀得到5wt％的壳聚糖醋酸溶液；取壳聚糖一半量的有机累托石溶于醋酸等量的去离子水中，得悬浮液，然后将壳聚糖醋酸溶液加入悬浮液中得混合溶液，70℃搅拌25小时，冷至室温，加入1mol/l氢氧化钠溶液调节混合液ph为7，然后按壳聚糖、有机累托石的总量与碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白的比例为3:0.05加入碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白，其中碱性成纤维细胞与蚯蚓活性蛋白的比例为1:0.29，再加入0.8mol/l的氯化钙溶液，氯化钙溶液的添加量与混合溶液的体积为1:25，室温下继续反应5小时，抽滤、去离子水洗涤、室温下真空干燥，得到含碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白的有机累托石/壳聚糖复合微球。
50.(4)将藻酸盐与红薯淀粉以质量比为3:2混合溶于去离子水中，混合液浓度为18wt％，95℃下搅拌10分钟，冷却至室温后将步骤(2)制备的复合微球加入溶液中，微球与藻酸盐、红薯淀粉混合物的质量比为1:13，充分搅拌，之后将混合液浇筑于模具中、流延成膜、静置，室温下真空干燥得到负载有机累托石微球的藻酸盐/红薯淀粉复合膜，同时观察使其不完全干燥，即抗菌复合层；
51.(5)将过硫酸铵、n,n
‑
亚甲基
‑
双丙烯酰胺溶于去离子水中，混合搅拌，将无纺布浸泡于混合液中，60℃下反应5小时，之后加入壳聚糖，其中过硫酸铵、n,n
‑
亚甲基
‑
双丙烯酰胺、无纺布与壳聚糖的质量比为1:15:25:15，继续反应6小时，使壳聚糖接枝于无纺布上，去离子水洗涤，
‑
20℃下真空冷冻干燥得到外保护层；
52.(6)将步骤(2)制备的快速止血层薄膜、步骤(4)制备的抗菌复合层及步骤(5)制备的外保护层依次叠加平铺，挤压干燥成型即得抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料。
53.其中，步骤(3)所述有机累托石为十六烷基三甲基溴化铵改性的累托石，其制备方法为：将累托石溶于去离子水中，溶胀15小时，之后将配制的浓度为1.5％的十六烷基三甲基溴化铵的水溶液滴于累托石的水溶液中，其中累托石与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1:0.5，然后于90℃搅拌5小时，离心、去离子水洗涤、离心、干燥，磨碎得到有机累托石。
54.实施例3
55.一种抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料的制备方法，包括以下步骤：
56.(1)将红薯不溶性膳食纤维与壳聚糖以质量比为1:1混合溶于2％的醋酸溶液中，充分搅拌混合均匀，混合液的浓度为22％，加入2％的戊二醛，戊二醛溶液与红薯不溶性膳食纤维、壳聚糖混合物的体积比为1:15，50℃先反应1小时，之后将混合液浇筑于模具中、流延、静置，之后于
‑
20～
‑
40℃下真空冷冻干燥，温度由低至高，每半小时升温5℃得到改性壳聚糖凝胶薄膜；
57.(2)取6g步骤(1)制备的改性壳聚糖凝胶薄膜浸泡于600ml的0.1mol/l氯化钙溶液中，搅拌并滴加1mol/l的氢氧化钠调节ph为9，50分钟后取出，去离子水洗涤除去表面的混合液，于
‑
20～
‑
40℃下真空冷冻干燥，温度由低至高，每半小时升温5℃，得到吸附钙离子的改性壳聚糖薄膜，即快速止血层；
58.(3)将壳聚糖溶于2％的醋酸溶液中，搅拌均匀得到5wt％的壳聚糖醋酸溶液；取壳聚糖1/3量的有机累托石溶于醋酸等量去离子水中，得悬浮液，然后将壳聚糖醋酸溶液加入
悬浮液中得混合溶液，80℃搅拌20小时，冷至室温，之后加入1mol/l氢氧化钠溶液调节混合液ph为7，然后按壳聚糖、有机累托石的总量与碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白的比例为2:0.1加入碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白，其中碱性成纤维细胞与蚯蚓活性蛋白的比例为1:0.30，再加入1.0mol/l的氯化钙溶液，氯化钙溶液的添加量与混合溶液的体积为1:25，室温下继续反应5小时，抽滤、去离子水洗涤、室温下真空干燥，得到含碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白的有机累托石/壳聚糖复合微球。
59.(4)将藻酸盐与红薯淀粉以质量比为4:1混合溶于去离子水中，混合液浓度为22wt％，95℃下搅拌10分钟，冷却至室温后将步骤(2)制备的复合微球加入溶液中，微球与藻酸盐、红薯淀粉混合物的质量比为1:15，充分搅拌，之后将混合液浇筑于模具中、流延成膜、静置，室温下真空干燥得到负载有机累托石微球的藻酸盐/红薯淀粉复合膜，同时观察使其不完全干燥，即抗菌复合层；
60.(5)将过硫酸铵、n,n
‑
亚甲基
‑
双丙烯酰胺溶于去离子水中，混合搅拌，将无纺布浸泡于混合液中，70℃下反应5小时，之后加入壳聚糖，其中过硫酸铵、n,n
‑
亚甲基
‑
双丙烯酰胺、无纺布与壳聚糖的质量比为2:20:30:15，继续反应6小时，使壳聚糖接枝于无纺布上，去离子水洗涤，
‑
20℃下真空冷冻干燥得到外保护层；
61.(6)将步骤(2)制备的快速止血层薄膜、步骤(4)制备的抗菌复合层及步骤(5)制备的外保护层依次叠加平铺，挤压干燥成型即得抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料。
62.其中，步骤(3)所述有机累托石为十六烷基三甲基溴化铵改性的累托石，其制备方法为：将累托石溶于去离子水中，溶胀20小时，之后将配制的浓度为2％的十六烷基三甲基溴化铵的水溶液滴于累托石的水溶液中，其中累托石与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1:0.6，然后于90℃搅拌6小时，离心、去离子水洗涤、离心、干燥，粉碎得到有机累托石。
63.实施例4
64.一种抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料的制备方法，包括以下步骤：
65.(1)将红薯不溶性膳食纤维与壳聚糖以质量比为2:3混合溶于2％的醋酸溶液中，充分搅拌混合均匀，混合液的浓度为25％，加入2％的戊二醛，戊二醛溶液与红薯不溶性膳食纤维、壳聚糖混合物的体积比为1:15，50℃先反应1小时，之后将混合液浇筑于模具中、流延、静置，之后于
‑
20～
‑
40℃下真空冷冻干燥，温度由低至高，每半小时升温5℃得到改性壳聚糖凝胶薄膜；
66.(2)取8g步骤(1)制备的改性壳聚糖凝胶薄膜浸泡于600ml的0.1mol/l氯化钙溶液中，搅拌并滴加1mol/l的氢氧化钠调节ph为10，60分钟后取出，去离子水洗涤除去表面的混合液，于
‑
20～
‑
40℃下真空冷冻干燥，温度由低至高，每半小时升温5℃，得到吸附钙离子的改性壳聚糖薄膜，即快速止血层；
67.(3)将壳聚糖溶于2％的醋酸溶液中，搅拌均匀得到6wt％的壳聚糖醋酸溶液；取壳聚糖1/3量的有机累托石溶于醋酸等量的去离子水中，得悬浮液，然后将壳聚糖醋酸溶液加入悬浮液中得混合溶液，80℃搅拌20小时，冷至室温，之后加入1mol/l氢氧化钠溶液调节混合液ph为7，然后按壳聚糖、有机累托石的总量与碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白的比例为3:0.1加入碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白，其中碱性成纤维细胞与蚯蚓活性蛋白的比例为1:0.31，再加入1.0mol/l的氯化钙溶液，氯化钙溶液的添加量与混合溶液的体积为1:30，室温下继续反应5小时，抽滤、去离子水洗涤、室温下真空干燥，得到含
碱性成纤维细胞生长因子及蚯蚓活性蛋白的有机累托石/壳聚糖复合微球。
68.(4)将藻酸盐与红薯淀粉以质量比为2:1混合溶于去离子水中，混合液浓度为25wt％，95℃下搅拌10分钟，冷却至室温后将步骤(2)制备的复合微球加入溶液中，微球与藻酸盐、红薯淀粉混合物的质量比为1:15，充分搅拌，之后将混合液浇筑于模具中、流延成膜、静置，室温下真空干燥得到负载有机累托石微球的藻酸盐/红薯淀粉复合膜，同时观察使其不完全干燥，即抗菌复合层；
69.(5)将过硫酸铵、n,n
‑
亚甲基
‑
双丙烯酰胺溶于去离子水中，混合搅拌，将无纺布浸泡于混合液中，70℃下反应5小时，之后加入壳聚糖，其中过硫酸铵、n,n
‑
亚甲基
‑
双丙烯酰胺、无纺布与壳聚糖的质量比为2:20:30:20，继续反应6小时，使壳聚糖接枝于无纺布上，去离子水洗涤，
‑
20℃下真空冷冻干燥得到外保护层；
70.(6)将步骤(2)制备的快速止血层薄膜、步骤(4)制备的抗菌复合层及步骤(5)制备的外保护层依次叠加平铺，挤压干燥成型即得抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料。
71.其中，步骤(3)所述有机累托石为十六烷基三甲基溴化铵改性的累托石，其制备方法为：将累托石溶于去离子水中，溶胀20小时，之后将配制的浓度为2％的十六烷基三甲基溴化铵的水溶液滴于累托石的水溶液中，其中累托石与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1:0.6，然后于90℃搅拌6小时，离心、去离子水洗涤、离心、干燥，磨碎得到有机累托石。
72.对比例11～12
73.与实施例4相比，对比例11、12中，敷料中快速止血层的壳聚糖不经过红薯不溶性膳食纤维改性或将红薯不溶性膳食纤维改为红薯可溶性膳食纤维，直接溶于醋酸溶液真空冷冻干燥制成薄膜，其余组成配比及制备方法与实施例4相同。
74.对比例21～24
75.与实施例4相比，对比例21～24中，敷料中抗菌复合层的微球只含有碱性成纤维细胞生长因子或只含有蚯蚓活性蛋白或者碱性成纤维细胞生长因子与蚯蚓活性蛋白比例为1:0.27或者碱性成纤维细胞生长因子与蚯蚓活性蛋白比例为1:0.32，其余组成配比及制备方法与实施例4相同。
76.对比例3
77.与实施例4相比，对比例3中，敷料中抗菌复合层微球制备时不添加有机累托石，其余组成配比及制备方法与实施例4相同。
78.对比例4
79.与实施例4相比，对比例4中，敷料中抗菌复合层不添加红薯淀粉，其余组成配比及制备方法与实施例4相同。
80.细胞毒性检测：通过gb/t14233.2
‑
2005检测方法对实施例1～4及对比例1～4的敷料进行检测，敷料均无细胞毒性。
81.体外抗菌实验：将实施例1～4、对比例1～4制备的敷料剪成直径为5mm的圆片，分别放置于20ml活菌浓度为105cfu/ml的菌液已凝固的培养基平板中央，每个实验重复三次，通过观察并测量48h时抑菌圈的大小检测敷料的抗菌性能，抑菌圈直径小于或等于7mm的视为无抑菌作用，测量方法为十字交叉测量法。
82.表1不同敷料对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抗菌试验(单位均为mm)
[0083][0084]
由表1数据可知，与实施例4相比，对比例11、21及对比例3、4制备的敷料抗菌性能减弱，对比例12、22、23、24敷料的抗菌性能几乎不变；对比例11、12说明红薯不溶性膳食纤维及可溶性膳食纤维均具有一定的抗菌性能，对比例21～24的数据说明蚯蚓活性蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌抗菌作用较明显，对比例4敷料不含有机累托石，抑菌实验中得到抑菌圈直径均减小，说明有机累托石具有较好的抗菌性能，对比例4相较于实施例4虽然抗菌性能有一定减弱，但是变化不大，说明红薯淀粉对敷料的抗菌性能印象不大。
[0085]
小鼠断尾止血实验：取5周龄昆明小白鼠84只，体重25
±
2g，随机分为14组，雌雄各半，每组6只，每只小鼠注射3％的戊巴比妥钠，以30mg/kg的剂量进行麻醉，将小鼠固定，用手术剪将小鼠尾部末端1cm处剪断，有血液溢出立即采用止血材料处理，空白组不采用任何药物处理，组1～4采用实施例1～4的止血敷料处理，组5～12采用对比例1～4的止血敷料处理，另外一组采用云南白药粉处理，计时从剪断尾部开始，超过20min即为不止血，结果见下表。
[0086]
表2不同材料对小鼠止血时间的影响(数据以表示，n＝6)
[0087][0088]
由上表数据可知，小鼠断尾后采用云南白药粉进行处理需时165s可以止血；组1～4小鼠断尾后，分别采用实施例1～4的敷料处理，在120～140s之间即可达到止血效果，组5小鼠采用对比例11的敷料，止血效果不及实施例1～4，需167s才可以止血，组6～组10小鼠分别采用对比例12、对比例21～24的敷料，止血效果也比较显著，组11、12小鼠采用对比例3、对比例4的敷料，需140s以上才能止血。说明本发明抗感染、防黏连改性壳聚糖止血敷料具有快速止血的效果，效果比云南白药粉显著，且采用云南白药粉止血，需在稳定后重新将伤口药粉洗干净，以避免长期存留在伤口表面导致伤口分泌物出不来，积累在伤口里面，导致细菌感染，但是采用本发明敷料时不需要这些操作；组5小鼠止血慢是因为对比例11敷料中不含有红薯不溶性膳食纤维，以致于快速吸血层吸附钙离子量少，且洗液膨胀性能减弱，
所以使止血速度减慢；相比于实施例4，对比例1～4对敷料的快速止血功能没有多大影响，所以组6～12的小鼠也可以快速止血。
[0089]
小鼠伤口愈合实验：取40
±
2g的昆明小鼠72只，雌雄各半，均分为12组，注射戊巴比妥钠麻醉后，在小鼠的背部做8mm
×
8mm的创口，分别贴敷实施例及对比例制成的敷料并用绷带固定，实施例1～4敷料分别对应组1～4，对比例1～4敷料分别对应组5～12，并分别在第1、3、7、12、15、18、22天观察伤口情况，若渗液吸满立刻更换敷料，其它则两天更换一次敷料，直至创口完全愈合。
[0090]
表3不同敷料对创面愈合情况的影响
[0091][0092][0093]
(临床上认为创面愈合率达到95％即可认为完全愈合；疤痕等级：0级为几乎观察不到，1级可观察到轻微疤痕，2级疤痕颜色明显面积较大。)
[0094]
在小鼠伤口愈合实验中，观察发现敷料均无渗液外漏现象，且由上表数据可知，组1～4的小鼠在12天时伤口愈合率达80％以上，18天时伤口已完全愈合，且疤痕几乎观察不到，而组5小鼠12天时愈合率不到65％，是由于前期止血慢，小鼠体质相对变弱导致前期恢复也变慢；组6小鼠由于每次更换敷料时都会黏连，也导致创口恢复慢，创面疤痕明显；组7与组8相比于组4，创面愈合速度较慢，与组9、组10比较说明敷料中碱性成纤维细胞生长因子、蚯蚓活性蛋白复合作用时，效果更高；组9、组10小鼠12天时的创面愈合率胶组4小鼠低，且组10小鼠18天时依旧没有无安全愈合，说明敷料中适当比例的碱性成纤维细胞生长因子、蚯蚓活性蛋白促成纤维细胞增殖能力更强，对创面愈合效果更好；组12小鼠创面不黏连，但是更换敷料时，敷料易分层，有时贴肤侧敷料粘附在创面上，需进一步剥离创面，对创口的多次拉扯不利于恢复。
[0095]
组11小鼠创面愈合也较慢，且个别小鼠观察到炎症现象，说明敷料中有机累托石抗菌消炎作用，同时对于对比例3的敷料又另外做实验：取40
±
2g的昆明小鼠12只，雌雄各半，均分为2组，做同样创口处理后，将实施例4与对比例3的敷料分别敷在创面，第二天更换敷料后，不再更换敷料，同样第1、3、7、12、15、18、22天观察伤口情况，第7天时实施例4与对比例3敷料处理的小鼠创面愈合率分别为36.5％、47.9％，12天时愈合率分别为55.8％、58.3％，18天时愈合率分别为77.9％、66.2％，说明对比例3敷料前期可以快速促进创面愈合，之后创面愈合速率急速减慢，而实施例4的敷料可以稳定促进创面恢复，说明有机累托
石/壳聚糖微球具有良好的缓释作用，而不含有机累托石的壳聚糖微球，缓释性能减弱，造成前期成纤维细胞迅速增殖，后续乏力，创面愈合速率减慢。
[0096]
图1为不同比例的碱性成纤维细胞生长因子与蚯蚓活性蛋白对成纤维细胞增殖的影响，采用mtt比色法检测：培养条件均为：37℃、5％的co2下，将培养好浓度为1
×
105～5
×
105个/ml的成纤维细胞接种于48孔细胞培养板中，每孔100μl，培养24h更换维持培养液，继续培养24h后弃去培养液并分别加入100μl不同比例的两种物质，每个比例设置四个复孔，并设置空白对照组，浓度均为200μg/ml，培养72h后，加10μlmtt溶液进行处理，继续培养5小时后，弃去培养板中液体，向每孔中加入dmso 100μl，之后以630nm为参比波长，在570nm处测吸光度，计算的od平均值，成纤维细胞增殖率的计算方法为：增值率(％)＝od
实验
/od
对照
×
100％。
[0097]
由图1数据可知，当碱性成纤维细胞生长因子与蚯蚓活性蛋白的比例为1:0.28～1:0.31之间时，其对成纤维细胞的增殖有更好的促进作用，而当超出该范围时，对成纤维细胞的促进作用急剧下降，单独的碱性成纤维细胞生长因子与单独的蚯蚓活性蛋白对成纤维细胞的增殖效果也不及二者以1:0.28～1:0.31的比例混合作用。
[0098]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。