心肌细胞缺氧损伤药物及其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及医疗领域，特别是涉及心肌细胞缺氧损伤药物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.铁筷子(hellebori radix et rhizoma)为毛茛科(ranunculaceae)铁筷子属植物铁筷子(helleborus thibetanus franch.)的干燥根及根茎。收载于《陕西省药材标准》]和《中华本草》维吾尔族药卷中。别名小桃儿七、黑毛七、黑哈而八吉、黑哈里吉。为我国秦岭地区特有的道地药材，是陕西著名的“七药”之一，多年生草本，茎高30～50cm，全株无毛。根茎短，其下着生多数暗褐色须根。茎直立，基部具膜质鳞片，上部少分支。基生叶1～2枚，具长柄，叶片轮廓心形，鸟足状3全裂，裂片具短柄，中央裂片3全裂，小裂片倒披针形，侧生裂片为不等2全裂；茎生叶具鞘状短柄或几无柄，叶片较基生叶为小，3全裂。花粉红色，单生，有时2朵生于枝端；萼片5，椭圆形，宿存。蓇葖果扁，近长圆形，长1.5
‑
3cm，具明显横脉。花期4月，果期5月，宜早春或者秋季采挖。分布于四川西北部、甘肃南部、陕西南部和湖北西北部等地，生于海拔1100
‑
3700米间山地林中或灌丛中。药材略卷曲成团，根茎呈短圆柱形或分枝呈结节状，长5～7cm，直径3～7mm，表面黑褐色或灰黑色。下部着多数干缩、微扁、扭曲状须根，其直径1～2mm，较老者已成圆柱状，多已脆断；质坚硬，难折断，断面黄白色，木质，颗粒状。气微腥，味苦，久嚼有麻舌感；有小毒。
3.现有技术中还尚未出现关于铁筷子与心肌细胞之间的作用。


技术实现要素：

4.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种心肌细胞缺氧损伤药物及其制备方法和用途，为现有技术中治疗心肌细胞的损伤提供新思路。
5.本发明的一方面提供了铁筷子提取物在制备治疗心肌细胞缺氧损伤药物中的用途。
6.进一步地，所述心肌细胞缺氧损伤药物具体是指用于治疗胸痹、心前区疼痛、心绞痛、心肌梗死等症的药物。
7.进一步地，所述药物具有抑制抑制细胞中ldh和/或mda的释放的作用或者提高缺氧心肌细胞存活率作用。
8.本发明的另一方面提供了一种心肌细胞缺氧损伤药物，所述药物的有效成分为铁筷子提取物。
9.进一步地，所述药物用于治疗胸痹、心前区疼痛、心绞痛、心肌梗死等症。
10.所述药物必然包括铁筷子中的药效组分。所述药效组分是指发挥治疗作用的组分。
11.所述药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为铁筷子药效成份，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
12.进一步地，所述药物具有抑制抑制细胞中ldh和/或mda的释放的作用或者提高缺
氧细胞存活率作用。
13.所述药物可以可为多成分物质。
14.所述药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
15.所述药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
16.进一步地，所述铁筷子为现有技术，本领域的技术人员可以市购获得。
17.进一步地，所述铁筷子提取物是指利用提取溶剂提取铁筷子制得的提取物。
18.所述提取溶剂，只要不损害本发明的效果，则没有特别的限制，可以为水；甲醇、乙醇等一元醇；1,3
‑
丁二醇、丙二醇等多元醇；醋酸乙酯等低级烷基酯；乙醚，丙酮等。在本发明中，也可以将上述溶剂组合使用。优选的提取溶剂为水、甲醇、乙醇、1,3
‑
丁二醇或其组合。尤其优选的提取溶剂为水、乙醇或其组合(即乙醇水溶液)。
19.进一步地，所述铁筷子提取物的制备方法为将药材加入6
‑
10倍量的溶剂，加热，回流，并过滤，滤渣加入4
‑
8倍量的溶剂回流提取，过滤，合并滤液并浓缩。进一步地，所述溶剂为水或者体积分数为30％
‑
50％的乙醇。也可以是40％
‑‑
50％的乙醇。
20.进一步地，所述制备方法为将药材加入8倍量的溶剂，加热沸腾，回流1h，趁热过滤，滤渣加入6倍量的溶剂回流1h，过滤，合并滤液并浓缩。
21.进一步地，所述药物中铁筷子提取的浓度为20
‑
80μg/ml，也可以是25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml。
22.本发明的另一方面提供了心肌细胞缺氧损伤保护药物组合，包括治疗有效量的铁筷子提取物和至少一种其他心肌保护性药物。
23.所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
24.一)将铁筷子提取物和其他心肌细胞缺氧损伤保护药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。
25.当其他心肌缺氧损伤保护药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。
26.二)将铁筷子提取物和其他心肌细胞缺氧损伤保护药物配置成复方制剂，在将铁筷子提取物和其他心肌保护药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
27.如上所述，本发明的心肌细胞缺氧损伤药物及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
28.本发明通过实验发现了铁筷子提取对治疗缺氧心肌细胞的是损伤具有治疗作用。fr1和fr3在较低浓度时即对缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放和mda的生成具有一定作用，且高浓度可提高缺氧损伤h9c2细胞存活率。
附图说明
29.图1t1910提取物对h9c2细胞存活率的影响
30.图2不同浓度na2s2o4作用h9c2细胞2h并复氧24h后细胞存活率的变化
31.con:空白组；
**
p<0.01，与空白组相比
32.图3t1910提取物对na2s2o4诱导缺氧损伤h9c2细胞存活率的影响
33.con:空白组；mod:模型组；pos:阳性药组；
34.##p<0.01，与空白组相比；**p<0.01，与模型组相比
35.图4t1910提取物对na2s2o4诱导缺氧损伤h9c2细胞ldh释放的影响
36.con:空白组；mod:模型组；pos:阳性药组；
37.##
p<0.01，与空白组相比；
*
p<0.05，
**
p<0.01，与模型组相比
38.图5t1910提取物对na2s2o4诱导缺氧损伤h9c2细胞no释放的影响
39.con:空白组；mod:模型组；pos:阳性药组
40.图6t1910提取物对na2s2o4诱导缺氧损伤h9c2细胞mda的影响
41.con:空白组；mod:模型组；pos:阳性药组；
42.#
p<0.05，与空白组相比；
*
p<0.05，与模型组相比
43.图7t1910提取物对na2s2o4诱导缺氧损伤h9c2细胞sod的影响
44.con:空白组；mod:模型组；pos:阳性药组；
45.#
p<0.05，
##
p<0.01，与空白组相比；
*
p<0.05，与模型组相比
具体实施方式
46.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
47.本发明所采用的原料药(或药材)均可从普通医药商店或中药材销售公司购买得到，其规格符合国家医药标准或符合中国药典等有关规定。所采用的药材除另有说明，均为中药材饮片，该中药材饮片也可以是获得后经加工而成。
48.本发明的疗效标准参照《中医病症判断疗效标准》中有关疗效标准。痊愈：临床症状全部消失，实验室检查正常。好转：临床症状减轻，实验室检查改善或正常。无效：临床症状无明显好转或加重。
49.本发明的制备工艺原则上运用《中药新药制备工艺研究的技术要求》，运用现代制剂新技术提取药物的主要有效成分入药，添加一些药学上可接受的辅料或载体。
50.实施例1中药提取物的制备
51.t1910药材基源植物唯一，分布于陕西南部、甘肃南部、四川西北部。生于海拔1100～3700m山地疏林中。以根状茎及根入药，被汉族、维吾尔族等民族所使用。
52.t1910浸膏制备
53.实验过程：粉碎t1910药材，药材粉末加入8倍量溶剂，水浴加热至沸腾，并保温回流提取1小时，趁热过滤；滤渣再加入6倍量溶剂，重复回流提取操作，回流提取1小时，趁热过滤，合并滤液，浓缩挥去溶剂得粗提物浸膏。信息如下：
54.表1不同乙醇浸膏信息表
55.编号提取溶剂t1910药材重量浸膏重量g收率frantion 1水80g2430％frantion 230％乙醇125g3528％frantion 350％乙醇200g5025％
frantion 480％乙醇250g5522％
56.t1910 80％乙醇提取物乙酸乙酯
‑
正丁醇
‑
水系统分配
57.实验过程：粉碎t1910药材，药材粉末加入8倍量80％乙醇，水浴加热至沸腾，并保温回流提取1小时，趁热过滤；滤渣加入6倍量80％乙醇，重复回流提取操作，回流提取1小时，趁热过滤；合并滤液，浓缩挥去溶剂得粗提物浸膏。加入550ml纯净水，使用乙酸乙酯萃取两次，250ml/次，合并乙酸乙酯相，浓缩挥干溶剂，得乙酸乙酯部分；水相使用水饱和正丁醇萃取两次，每次250ml，合并正丁醇相，浓缩挥干溶剂，得正丁醇部分；剩余水相浓缩。信息如下：
58.表2 80％乙醇浸膏溶剂分配信息表
[0059][0060][0061]
实施例2 t1910提取物对h9c2细胞毒性考察
[0062]
1、方法
[0063]
取对数生长期的h9c2细胞，使用含10％胎牛血清的dmem完全培养基，将h9c2细胞按每孔8
×
104个/ml接种于96孔板中。同时设置调零组、对照组和给药组，每孔加入100μl细胞悬液，在37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养24h。弃去孔内液体，对照组每孔加入100μl的dmem完全培养基，给药组加入100μl含不同浓度的t1910提取物的dmem完全培养基，每个浓度5个复孔，其中fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.6给药浓度为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、500μg/ml，fr.5给药浓度为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml。放入细胞培养箱37℃，5％co2培养24h。弃去培养液，每孔加入100μl的dmem基础培养基和10μl的cck
‑
8工作液，放入37℃、5％co2培养箱中孵育1.5h，1.5h后置于酶标仪450nm处检测吸光度值，计算细胞存活率。数据以mean
±
sd表示，采用spss 22软件进行统计分析，组间比较用anova检验，p<0.05认为具有统计学差异。
[0064]
细胞存活率＝(给药孔吸光度
‑
调零孔吸光度)/(对照孔吸光度
‑
调零孔吸光度)
×
100％
[0065]
2、结果与分析
[0066]
t1910提取物不同样品浓度和h9c2细胞存活率关系如图1所示。其中，fr.1浓度为50
‑
200μg/ml时，h9c2细胞存活率均大于90％；但随着给药浓度的逐渐增大，h9c2细胞存活率逐渐降低，当浓度为400μg/ml时细胞存活率为66.20
±
9.92％，表现出一定毒性。fr.2、fr.3、fr.4、fr.6浓度为50
‑
100μg/ml时，h9c2细胞存活率均大于90％；当该四个样品浓度增大到200μg/ml时，其细胞存活率为依次为80.25
±
14.13％、74.01
±
9.73％、60.23
±
2.76％和66.73
±
15.86％，表现出一定毒性。fr.5浓度为12.5
‑
25μg/ml时，h9c2细胞存活率均大于90％，当浓度为50μg/ml，其细胞存活率为63.67
±
4.33％，表现出一定毒性。
[0067]
3、结论
[0068]
t1910提取物中，fr.1浓度为400μg/ml以上时，对h9c2细胞产生一定的毒性作用。fr.2、fr.3、fr.4、fr.6浓度为200μg/ml以上时，对h9c2细胞具有明显的毒性作用。fr.5浓度为50μg/ml以上时，对h9c2细胞表现出明显的毒性作用。因此，后续t1910提取物中各样品对缺氧损伤h9c2细胞保护作用的考察在各样品毒性剂量之下进行。
[0069]
实施例3 na2s2o4对h9c2细胞缺氧损伤模型的建立
[0070]
1、方法
[0071]
取对数生长期的h9c2细胞，使用含10％胎牛血清的dmem完全培养基，将h9c2细胞按每孔8
×
104个/ml接种于96孔板中。同时设置调零组、对照组和模型组，每孔加入100μl细胞悬液，在37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养24h。弃去孔内液体，对照组每孔加入100μl dmem基础培养基，模型组加入100μl含不同浓度(8mmol/l、9mmol/l、10mmol/l、11mmol/l、12mmol/l)的na2s2o4的dmem基础培养，放入细胞培养箱37℃，5％co2，饱和湿度条件下缺氧培养2h。2h后，吸弃上清，每孔加入100μl的dmem完全培养基，复氧24h。24h后弃去培养液，每孔加入100μl的dmem基础培养基和10μl的cck
‑
8工作液，放入37℃、5％co2培养箱中孵育1.5h。1.5h后吸弃上清，置于酶标仪450nm处检测吸光度值并计算细胞存活率。数据以mean
±
sd表示，采用spss 22软件进行统计分析，组间比较用anova检验，p<0.05认为具有统计学差异。
[0072]
细胞存活率＝(给药孔吸光度
‑
调零孔吸光度)/(对照孔吸光度
‑
调零孔吸光度)
×
100％
[0073]
2、结果与分析
[0074]
na2s2o4对h9c2细胞缺氧损伤模型的考察结果如图2所示。随着造模剂na2s2o4浓度的逐渐增大(8mmol/l增加至12mmol/l)，h9c2细胞存活率逐渐降低(69.44
±
6.04％降低至14.34
±
5.00％)。当na2s2o4浓度为9mmol/l时，h9c2细胞的相对存活率为50％左右。实验重复三次，结果稳定，因此选择浓度为9mmol/l的na2s2o4做为h9c2细胞缺氧损伤模型建立的造模浓度。
[0075]
3、结论
[0076]
通过对造模剂浓度等条件的考察建立稳定的h9c2细胞缺氧损伤模型，确定造模条件为9mmol/l的na2s2o4作用于h9c2细胞2h，复氧24h。
[0077]
实施例4 t1910提取物对缺氧损伤h9c2细胞保护作用
[0078]
1、方法
[0079]
1.1 t1910提取物样品对缺氧损伤h9c2细胞存活率的检测
[0080]
取对数生长期的h9c2细胞，使用含10％胎牛血清的dmem完全培养基，将h9c2细胞按每孔8
×
104个/ml接种于96孔板中。同时设置调零组、对照组、模型组和给药组，每孔加入100μl细胞悬液，在37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养24h。吸弃上清液体，对照组每孔加入100μl的dmem基础培养基，模型组和给药组加入100μl浓度为9mmol/l的na2s2o4的dmem基础培养基，放入细胞培养箱37℃、5％co2、饱和湿度缺氧培养2h。2h后弃去培养基，对照组和模型组加入新鲜的dmem完全培养基，给药组每孔加入100μl不同浓度(具体给药浓度见表1)的含药培养基，置于细胞培养箱内培养24h。24h后弃去培养液，每孔加入100μl的dmem基础培养基和10μl的cck
‑
8工作液，放入37℃、5％co2培养箱中孵育1.5h，1.5h后置于酶标仪450nm
处检测吸光度值，并计算细胞存活率。
[0081]
细胞存活率＝(给药孔吸光度
‑
调零孔吸光度)/(对照孔吸光度
‑
调零孔吸光度)
×
100％
[0082]
表1
‑
1 t1910提取物不同样品对缺氧损伤h9c2细胞保护作用的给药浓度
[0083][0084]
表1
‑
2 t1910系列不同提取物分组及给药方案
[0085]
[0086][0087]
1.2 t1910提取物样品对缺氧损伤h9c2细胞ldh释放的检测
[0088]
取对数生长期的h9c2细胞，使用含10％胎牛血清的dmem完全培养基，将h9c2细胞按每孔8
×
104个/ml接种于96孔板中。同时设置调零组、对照组、模型组和给药组，每孔加入100μl细胞悬液，在37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养24h。24h后使用9mmol/l的na2s2o4作用2h后，给药组每孔加入200μl各浓度的t1910提取物样品复氧24h。24h后将细胞培养板在400rpm条件下离心5min，吸取上清液120μl转移至新的96孔板中。各孔分别加入60μl的ldh检测工作液，混匀后用铝箔包裹并置于水平摇床上缓慢摇动30min。将96孔板置于酶标仪490nm处测定吸光度，并计算ldh释放率。
[0089]
ldh释放率(％)＝(给药孔吸光度
‑
调零孔吸光度)/(空白孔吸光度
‑
调零孔吸光度)
×
100％
[0090]
1.3 t1910提取物样品对缺氧损伤h9c2细胞no释放的检测
[0091]
取对数生长期的h9c2细胞，使用含10％胎牛血清的dmem完全培养基，将h9c2细胞按每孔8
×
104个/ml接种于96孔板中。同时设置调零组、对照组、模型组和给药组，每孔加入100μl细胞悬液，在37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养24h。24h后使用9mmol/l的na2s2o4作用2h后，给药组每孔加入100μl各浓度的t1910提取物样品复氧24h。24h后将细胞培养板在400rpm条件下离心5min，吸取上清液50μl转移至新的96孔板中。按50μl/孔，在各孔中于室温避光条件下依次加入griess reagentⅰ和griess reagentⅱ，而后将96孔板室温避光放置5min使其反应充分。540nm处测定吸光度，并计算no相对释放率。
[0092]
no相对释放率(％)＝(给药孔吸光度
‑
调零孔吸光度)/(空白孔吸光度
‑
调零孔吸光度)
×
100％
[0093]
1.4 t1910提取物样品对缺氧损伤h9c2细胞中mda含量的检测
[0094]
取对数生长期的h9c2细胞，接种于60mm培养皿中，每皿加入5ml细胞悬液，细胞悬液密度为3
×
105个/ml。同时设置调零组、对照组、模型组和给药组，调零组只加5ml的dmem基础培养基。在37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养24h。弃去皿内液体，对照组中加入5ml的dmem基础培养基，模型组、给药组分别加入造模剂量的na2s2o4溶液，培养箱中培养2h。弃去皿内液体，对照组和模型组中分别加入5ml的dmem完全培养基，给药组分别加入相应剂量的t1910提取物样品，于培养箱中培养24h。弃去皿内液体，每皿加入1ml的dpbs，用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞悬液转移至1.5ml ep管中。于1000rpm，4℃条件下离心10min，弃去上清
液，加如mda试剂盒中的试剂五提取液250μl，混匀2min，取样50μl于1.5ml ep管中。按照表2加入不同体积测试样品和工作液，涡旋混匀液体，用注射器针头在管盖上刺一个小孔，100℃加热40min。取出后冷却，于4000rpm条件下离心10min，吸取液体250μl到96孔板中，530nm测定吸光度，bca试剂盒测定样品蛋白浓度，计算mda含量。
[0095]
mda含量(nmol/mgprot)＝(测定管吸光度
‑
空白管吸光度)/(标准管吸光度
‑
空白管吸光度)
×
标准品浓度(10nmol/ml)/待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)
[0096]
表2 mda含量检测试剂盒加样表
[0097][0098]
1.5 t1910提取物样品对缺氧损伤h9c2细胞中sod含量的检测
[0099]
取对数生长期的h9c2细胞，接种于60mm培养皿中，每皿加入5ml细胞悬液，细胞悬液密度为3
×
105个/ml。同时设置调零组、对照组、模型组和给药组，调零组只加5ml的dmem基础培养基。在37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养24h。弃去皿内液体，对照组中加入5ml的dmem基础培养基，模型组、给药组分别加入造模剂量的na2s2o4溶液，培养箱中培养2h。弃去皿内液体，对照组和模型组中分别加入5ml的dmem完全培养基，给药组分别加入相应剂量的t1910提取物样品，于培养箱中培养24h。24h后弃去皿内液体，用2ml pbs清洗细胞一次后，每皿加入250μl的sod样品制备液，用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞悬液转移至1.5ml ep管中。于12000rpm、4℃条件下离心5min后取上清。按照表3加入不同体积测试样品和工作液，37℃孵育30min，530nm测定吸光度，计算sod含量。
[0100]
抑制百分率(％)＝(a空白对照1
‑
样品)/(a空白对照1
‑
a空白对照2)
×
100％；
[0101]
待测样品中酶活力单位＝抑制百分率/(1
‑
抑制百分率)
[0102]
表3 sod含量检测试剂盒加样表
[0103][0104]
1.6数据处理与分析
[0105]
数据以mean
±
sd表示，采用spss 22软件进行统计分析，p<0.05认为具有统计学差异。实验数据绘图由graph prism 7.00软件完成。
[0106]
2、结果与分析
[0107]
2.1 t1910提取物样品对缺氧损伤h9c2细胞存活率的影响
[0108]
如图3所示，与空白组相比，给予造模剂9mmol/l的na2s2o4作用2h并复氧24h的模型
组细胞的存活率显著降低(p<0.01)，表明缺氧损伤h9c2细胞模型构建成功。与模型组相比，阳性药能够显著提高缺氧损伤h9c2细胞存活率，且有显著性差异(p<0.01)。t1910提取物中，与模型组相比，fr.1和fr.3能够明显提高缺氧损伤h9c2细胞存活率。其中，给药浓度为80μg/ml的fr.1和fr.3组细胞存活率分别为77.29
±
1.45％和75.54
±
2.18％，与模型组相比具有显著性差异(p<0.05)。此外，fr.2组随着给药浓度增大其细胞存活率逐渐上升，但给药80μg/ml的fr.2组细胞存活率与模型组相比无显著性差异，这可能与组内差异较大相关。不同给药浓度的fr.4、fr.5和fr.6组其细胞存活率与模型组相比均不同程度降低。以上结果表明，t1910提取物中fr.1和fr.3对缺氧损伤h9c2细胞具有一定保护作用；fr.2对缺氧损伤h9c2细胞表现出潜在的保护作用；fr.4、fr.5和fr.6对缺氧损伤h9c2细胞没有保护作用。
[0109]
2.2 t1910提取物样品对缺氧损伤h9c2细胞ldh释放的影响
[0110]
如图4所示，与空白组相比，模型组中缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放率显著升高(p<0.01)，其ldh释放率为91.01
±
3.57％。与模型组相比，阳性药组细胞ldh的释放率显著降低(p<0.01)，ldh释放率为57.38
±
2.74％。t1910提取物中，与模型组相比，给药浓度为40μg/ml的fr.1和fr.3能够明显降低缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放率，其ldh释放率分别为78.67
±
1.94％(p<0.05)和69.92
±
1.53％(p<0.01)，具有统计学差异。给药浓度为80μg/ml的fr.1和fr.3能够显著降低缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放率，其ldh释放率分别为79.21
±
0.58％和69.01
±
1.03％(p<0.01)。此外，给药浓度为80μg/ml的fr.2能够显著降低缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放率，ldh释放率为74.52
±
0.89％(p<0.01)。以上结果表明，fr.1、fr.2和fr.3对缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放均具有一定的抑制作用；其中fr.1和fr.3可能作用较为明显，其给药浓度在40μg/ml时，即表现出抑制缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放。
[0111]
2.3 t1910提取物样品对缺氧损伤h9c2细胞no释放的影响
[0112]
如图5所示，t1910提取物对缺氧损伤h9c2细胞no的相对释放率未见明显差异，这可能与缺氧损伤h9c2细胞模型中no含量较低有关。
[0113]
2.4 t1910提取物样品对缺氧损伤h9c2细胞中mda含量的影响
[0114]
如图6所示，与空白组相比，模型组中缺氧损伤h9c2细胞的mad含量显著增加(p<0.05)。与模型组相比，阳性药组细胞mda的含量显著降低，mda含量为14.38
±
0.19nmol/mg，具有统计学差异(p<0.05)。t1910提取物中，与模型组相比，给药浓度为20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml时，fr.1能够明显显著缺氧损伤h9c2细胞的mad含量，分别为8.02
±
0.75nmol/mg、8.83
±
0.60nmol/mg和7.35
±
0.84nmol/mg，具有统计学差异(p<0.05)。给药浓度为40μg/ml和80μg/ml的fr.3均能够显著降低缺氧损伤h9c2细胞中的mad含量，mda含量分别为14.20
±
0.59nmol/mg和14.42
±
0.49nmol/mg(p<0.05)。此外，fr.2虽均能够一定程度降低缺氧损伤h9c2细胞中mda的含量，但与模型组比无显著性差异，这可能与模型组组内差异过大有关。以上结果表明，fr.1和fr.3能够抑制缺氧损伤h9c2细胞mda的生成；其中fr.1可能表现出显著抑制作用，在20μg/ml时即能够显著抑制缺氧损伤h9c2细胞中mda的生成。
[0115]
2.5 t1910提取物样品对缺氧损伤h9c2细胞中sod含量的影响
[0116]
如图7所示，与空白组相比，缺氧损伤h9c2细胞的模型组其sod酶活力显著降低(p<0.05)。t1910提取物中，与模型组相比，给予80μg/ml的fr.1和fr.2可显著提高缺氧损伤h9c2细胞中sod的水平(p<0.05)；给予40μg/ml的fr.3可显著提高缺氧损伤h9c2细胞中sod的水平(p<0.05)。
[0117]
3、结论
[0118]
阳性药对na2s2o4诱导缺氧损伤h9c2细胞具有一定保护作用。t1910提取物中，fr.1、fr.2和fr.3对na2s2o4诱导缺氧损伤h9c2细胞具有一定保护作用。其中：
[0119]
(1)80μg/ml的fr.1能够提高缺氧损伤h9c2细胞存活率和sod水平，降低缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放和mda的生成；40μg/ml的fr.1能够降低缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放和mda的生成；20μg/ml的fr.1能够抑制缺氧损伤h9c2细胞mda的生成。
[0120]
(2)80μg/ml的fr.2能够降低缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放，提高缺氧损伤h9c2细胞sod水平。
[0121]
(3)80μg/ml的fr.3能够提高缺氧损伤h9c2细胞存活率，抑制缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放和mda的生成；40μg/ml的fr.3能够抑制缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放和mda的生成，提高缺氧损伤h9c2细胞的sod水平。
[0122]
综上，由于fr1和fr3在较低浓度时即对缺氧损伤h9c2细胞ldh的释放和mda的生成具有一定作用，且高浓度可提高缺氧损伤h9c2细胞存活率，因此其对缺氧损伤h9c2细胞的保护作用可能强于fr2。
[0123]
实施例5
[0124]
为了进一步了解铁筷子提取的功效，分别设计实验：
[0125]
实验一：实验过程：粉碎t1910药材，药材粉末加入6倍量溶剂，水浴加热至沸腾，并保温回流提取1小时，趁热过滤；滤渣再加入4倍量溶剂，重复回流提取操作，回流提取1小时，趁热过滤，合并滤液，浓缩挥去溶剂得粗提物浸膏。
[0126]
实验二：实验过程：粉碎t1910药材，药材粉末加入6倍量溶剂，水浴加热至沸腾，并保温回流提取1小时，趁热过滤；滤渣再加入4倍量溶剂，重复回流提取操作，回流提取1小时，趁热过滤，合并滤液，浓缩挥去溶剂得粗提物浸膏。
[0127]
实验三：实验过程：粉碎t1910药材，药材粉末加入10倍量溶剂，水浴加热至沸腾，并保温回流提取1小时，趁热过滤；滤渣再加入8倍量溶剂，重复回流提取操作，回流提取1小时，趁热过滤，合并滤液，浓缩挥去溶剂得粗提物浸膏。
[0128]
实验四：实验过程：粉碎t1910药材，药材粉末加入10倍量溶剂，水浴加热至沸腾，并保温回流提取1小时，趁热过滤；滤渣再加入8倍量溶剂，重复回流提取操作，回流提取1小时，趁热过滤，合并滤液，浓缩挥去溶剂得粗提物浸膏。
[0129]
分别采用上述制备获得提取物，考察对h9c2细胞毒性以及缺氧损伤h9c2细胞保护作用，实验结果与fr1和fr3类似。
[0130]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。