低共熔溶剂法提取雀嘴茶提取物的方法及颗粒剂的制备和应用

【技术领域】

本发明涉及一种低共熔溶剂法提取雀嘴茶提取物的方法及颗粒剂的制备和应用。

背景技术：

高尿酸血症是一种由尿酸合成增加和(或)尿酸排泄减少所引起的代谢性疾病，指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平高于420μmol/l。对我国人群的高尿酸血症患病率进行meta分析，结果表明中国人群男性和女性高尿酸血症的患病率分别为21.6％和8.6％,总患病率为13.3％，患病人数超过1.3亿。

尿酸作为嘌呤代谢的最终产物，主要通过黄嘌呤氧化酶的催化作用在肝脏、肠道和肌肉、肾脏和血管内皮等其他组织中合成，其中三分之二通过肾脏尿酸转运体排泄，其余三分之一排泄到肠道。目前临床上降尿酸药物主要针对尿酸的产生和排泄，包括抑制黄嘌呤氧化酶药、促尿酸排泄药及分解尿酸的尿酸酶三类。临床使用的药物存在不同程度的副作用，寻找和开发新型降尿酸药物成为了迫在眉睫的工作。

雀嘴茶(vacciniumdunalianumw.)为杜鹃花科(ericaceae)越桔属(vaccinium)植物樟叶越桔(v.dunalianum)的顶芽或嫩叶。外形似鸟喙，汤色橙黄明亮，香气醇厚，回味甘甜，主要分布在云南楚雄一带，民间记载常饮用此茶具有降血脂、降血糖、降血压，健脾开胃、通便润肠、抗氧化、根治通风、祛风除湿、舒筋活络等功效。有研究表明雀嘴茶中含有大量的乌金苷、熊果苷、绿原酸、咖啡酸、咖啡酰奎宁酸等生物活性成分。雀嘴茶曾是明朝进贡佳品，并作为民间治疗高尿酸血症及痛风的保健茶在滇中地区广泛饮用。

目前,雀嘴茶的提取多使用传统的天然植物提取技术，主要采用甲醇、乙醇等有机溶剂进行提取,使用绿色安全的溶剂作为溶媒的研究相当有限。常规的提取方法，均存在溶剂具有毒性并在提取物中残留，后续去除工艺繁琐，提取效率低，提取时间长的问题，且制备过程中的溶剂挥发或排放会污染环境，使用后也不易被降解。以上种种限制了雀嘴茶得实际开发与利用。开发新的提取方法，使用低共熔方法提取雀嘴茶，提高雀嘴茶降尿酸组分的提取效率，有利于提高生产效益，保护环境。

此外，当前对于雀嘴茶提取物制备颗粒剂的方法及在治疗高尿酸血症的应用未见报道。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种低共熔溶剂法提取雀嘴茶提取物的方法，该提取工艺简单，操作方便，缩短提取周期，提高了提取效率。

本发明是这样实现上述技术问题之一的：

一种低共熔溶剂法提取雀嘴茶提取物的方法，包括如下步骤：

s1、使用粉碎机将干燥的雀嘴茶进行粉碎，转移到容器，放入干燥器中储存；

s2、将1,4-丁二醇、无水葡萄糖或丙三醇中的一种，与氯化胆碱按照摩尔比1：4-8放置于烧瓶中，油浴，不断加热搅拌，制成均一、稳定的低共熔溶剂；

s3、按每1g雀嘴茶粉末配合20ml低共熔溶剂的用量，将雀嘴茶粉末与低共熔溶剂混合，在40-80℃温度下，超声提取30-60min；

s4、提取完成后，采用nka-9树脂对以上提取液进行柱层析分离，将组分中的低共熔溶剂洗脱，再使用95％乙醇分离得雀嘴茶提取物。

本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种雀嘴茶提取物的颗粒剂的制备方法，所制得的雀嘴茶颗粒剂比较适合当前生产要求，质量检查方法方便且易于操作、产品合格率高。

本发明是这样实现上述技术问题之二的：

一种雀嘴茶提取物的颗粒剂的制备方法，采用的雀嘴茶提取物是基于上述一种低共熔溶剂法提取雀嘴茶提取物的方法提取得到的；所述制备方法如下：

将所得的浓稠的雀嘴茶提取物与淀粉、乳糖，以质量比2：1：1的比例混合均匀后，加入60％的乙醇作为润湿剂，制软材，直至能够手握成团，轻压即散，过14目筛，45℃下干燥5小时，整粒，即得。

本发明要解决的技术问题之三，在于提供一种雀嘴茶提取物的应用，所述雀嘴茶提取物在制备治疗高尿酸血症及其相关疾病的药物中的应用。本发明具有如下优点：

所用低共熔溶剂合成简单，原料价格低廉；提取工艺简单，操作方便，缩短提取周期，提高了提取效率；降低了处理能耗，方便经济；避免了传统工艺耗时、提取率低的问题。

本发明通过低共熔溶剂法对雀嘴茶的有效成分进行了充分的提取，并将其制作成了便于食用和保存的颗粒状，为新药来源奠定一定基础；所制得的雀嘴茶颗粒剂比较适合当前生产要求，质量检查方法方便且易于操作、产品合格率高。

本发明公开了雀嘴茶提取物在制备治疗高尿酸血症的药物中的新用途。该发明为雀嘴茶提取物在治疗高尿酸血症及其相关疾病(痛风、尿酸性肾结石等)提供了新的物质基础、制备方法及医药用途。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为本发明实施例5中不同提取物对降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸的作用的柱状分析图。

图2为本发明实施例5中不同提取物对血清肌酐水平的影响的柱状分析图。

图3为本发明实施例5中不同提取物对血清尿素氮水平的影响的柱状分析图。

图4为本发明实施例5中不同提取物对肾脏组织学的影响示意图，其中各主框图为h&e染色，100×；右上角小框图为h&e染色，200×。

【具体实施方式】

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

1、活性组分提取

实施例1

1)按照摩尔比1:4称取氯化胆碱和无水葡萄糖，制备天然低共熔溶剂(含水量为10％)。

2)利用得到的天然低共熔溶剂对雀嘴茶粉末进行提取，从雀嘴茶粉末中提取降尿酸组分，提取方法包括以下步骤：

3)取20ml低共熔溶剂与1g雀嘴茶粉末混匀，在40℃下进行超声提取，超声提取过程中使用超声波萃取仪功率为500w，提取时间为10分钟，过滤所得混合物。

4)通过柱层析将滤液中低共熔溶剂洗脱后，经95％乙醇分离得雀嘴茶组分，即可。

实施例2

1)按照摩尔比1:4称取氯化胆碱和丙三醇，制备天然低共熔溶剂(含水量为10％)；

2)利用得到的天然低共熔溶剂对雀嘴茶粉末进行提取，从雀嘴茶粉末中提取降尿酸组分，提取方法包括以下步骤：

3)取20ml低共熔溶剂与1g雀嘴茶粉末混匀，在50℃下进行超声提取，超声提取过程中使用超声波萃取仪功率为500w，提取时间为20分钟，过滤所得混合物。

4)通过柱层析将滤液中低共熔溶剂洗脱后，经95％乙醇分离得雀嘴茶提取物组分，即可。

实施例3

1)按照摩尔比1:4称取氯化胆碱和1,4-丁二醇，制备天然低共熔溶剂(含水量为10％)。

2)利用得到的天然低共熔溶剂对雀嘴茶粉末进行提取，从雀嘴茶粉末中提取降尿酸组分，提取方法包括以下步骤：

3)取20ml低共熔溶剂与1g雀嘴茶粉末混匀，在60℃下进行超声提取，超声提取过程中使用超声波萃取仪功率为500w，提取时间为25分钟，过滤所得混合物。

4)通过柱层析将滤液中低共熔溶剂洗脱后，经95％乙醇分离得雀嘴茶提取物组分，即可。

实施例4

1)按照摩尔比1:8称取氯化胆碱和1,4-丁二醇，制备天然低共熔溶剂(含水量为10％)。

2)利用得到的天然低共熔溶剂对雀嘴茶粉末进行提取，从雀嘴茶粉末中提取降尿酸组分，提取方法包括以下步骤：

3)取20ml低共熔溶剂与1g雀嘴茶粉末混匀，在80℃下进行超声提取，超声提取过程中使用超声波萃取仪功率为500w，提取时间为30分钟，过滤所得混合物。

4)通过柱层析将滤液中低共熔溶剂洗脱后，经95％乙醇分离得雀嘴茶组分，即可。

对比例1

对比例1是常规甲醇提取方法，具体如下：

1)将中药雀嘴茶用粉碎机进行粉碎之后，得雀嘴茶粉末。

2)取1)中制得的500g雀嘴茶粉末用60％甲醇水提取3次，每次浸泡24小时，料液比为1∶2，过滤，合并滤液，倒入锅中，在电磁炉上蒸发浓缩得浸膏，称量并记录所得的浸膏重，即可。

对比例2

对比例1是常规乙醇提取方法，具体如下：

1)将中药雀嘴茶用粉碎机进行粉碎之后，得雀嘴茶粉末。

2)取1)中制得的500g雀嘴茶粉末用60％甲醇水提取3次，每次浸泡24小时，料液比为1∶2，过滤，合并滤液，倒入锅中，在电磁炉上蒸发浓缩得浸膏，称量并记录所得的浸膏重，即可。

2、计算雀嘴茶提取率

计算实施例及对比例的雀嘴茶提取率，并使用hplc法测定实施例及对比例的雀嘴茶降尿酸目标组分得率。

实施例与对比例获得的雀嘴茶降尿酸组分的高效液相色谱检测结果检测结果如表1。

表1：实施例与对比例获得的降尿酸目标组分的高效液相色谱检测结果

从表1可知，使用本发明从雀嘴茶中提取降尿酸组分的较传统提取方法得率更高。

3、颗粒剂制备

处方的筛选：分别选择常用辅料，淀粉、乳糖、cmc-na、糊精、甘露醇，以提取物：辅料以一定的比例混，加适量的润湿剂60％乙醇制软材，过14号筛，在恒温干燥箱为45℃、干燥5h，过筛整粒。

取5份提取物，每份10g,将淀粉、乳糖、cmc-na、糊精、甘露醇等辅料:雀嘴茶提取物＝1:1混合制粒。

表2：处方辅料的筛选

从表2中可知，通过实验，以一次成型率进行评价，淀粉和糊精的制粒效果高于其他辅料；淀粉和乳糖的制粒的流动性最好；淀粉和cmc-na制粒溶化性较差，溶解静置后有较多沉淀；甘露醇制粒细粉较多，粘合度较低，颗粒质散，硬度较差。通过实验考察最终选择淀粉和乳糖分别作为填充剂和粘合剂，并对二者比例进一步考察及优化。

将乳糖:糊精按1:5、1:2、1:1、2:1、5:1比例混合，再分别与提取物按照1:1的比例混合

表3：处方混合辅料配比的筛选

从表3中可知，以提取物与淀粉和乳糖按2∶1∶1的比例制软材，制出的颗粒形状较好、颜色适宜，且成粒率最高。

4、质量检查

外观：所制得的雀嘴茶颗粒剂颜色一致，颗粒重量均匀，无结块、无软化现象。

粒度(一次成型率)：除另外规定，按照粒度和粒度分布测定法检查，将所得雀嘴茶颗粒分别过一号筛网(200μm)和五号筛网(180μm)进行测定，要求不能通过一号筛和能通过五号筛的总和不得超过供示量的15％。

溶化性：取供试品10g，加温水200ml，搅拌5分钟，立即观察，全部溶化或轻微浑浊。按上述方法检查，均不得有异物，中药颗粒还不得有焦屑。

水分：按照水分测定法测定，除另有规定外，本品含水量不得超过8.0％。

干燥失重：除另有规定外，化学药品和生物制品颗粒剂照干燥失重测定法测定，于105℃干燥(含糖颗粒应在80℃减压干燥)至恒重，减失重量不得超过2.0％。

综上所述雀嘴茶颗粒剂的最佳制备工艺如下：

s1、将雀嘴茶用粉碎机粉碎处理后，在油浴加热至80℃条件下，混合20ml的低共熔溶剂1,4-丁二醇-氯化胆碱，然后加入适量雀嘴茶粉末进行超声提取，所得混合物经过滤后通过柱层析回收低共熔溶剂，再用乙醇分离得雀嘴茶组分；

s2、将所得的雀嘴茶浓稠提取物与淀粉、乳糖，以质量比2：1：1的比例混合均匀后，加入60％的乙醇作为润湿剂，制软材，直至能够手握成团，轻压即散，过14目筛，45℃下干燥5小时，整粒，即得。将制好的颗粒剂进行质量检查。

雀嘴茶颗粒剂质量检查结果：

雀嘴茶颗粒剂颜色一致，颗粒重量均匀，无结块、无软化现象；成型率以淀粉和乳糖按1∶1的为最好达84％；溶化性按标准方法进行，供试品全部溶化，无异物，无焦屑；水分含量小于8.0％；经干燥失重后，损失质量均小于2.0％；均符合标准。

实施例5

雀嘴茶提取物降低高尿酸血症模型小鼠血清尿酸(ua)水平及改善高尿酸血症模型小鼠肾脏炎性情况

实验材料：icr小鼠购自福建省闽侯县吴氏实验动物有限公司。氧嗪酸钾，次黄嘌呤，别嘌呤醇，购自西格玛奥德里奇(sigma-aldrich，germany)。羧甲基纤维素钠购自国药集团化学试剂有限公司。尿酸试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。

溶液配制：将1％羧甲基纤维素钠溶解，煮沸，冷却后作为溶媒，将雀嘴茶提取物、氧嗪酸钾、次黄嘌呤、别嘌呤醇分别溶解配置成混悬液。

实验分组：雄性icr小鼠60只于动物房适应性饲养7天后，按照体重随机分为6组，即正常组、模型组、阳性对照药组(别嘌呤醇10mg/kg/d)、雀嘴茶提取物低、中、高剂量组(125、250、500mg/kg/d)，每组各10只。

实验处理：将小鼠在鼠房饲养7天，使其适应环境，1-5组每日上午9点连续21天灌胃给药次黄嘌呤500mg/kg以及氧嗪酸钾100mg/kg，正常对照组给予等量的蒸馏水。第22-36天每日上午照常9点给予灌胃次黄嘌呤500mg/kg以及氧嗪酸钾100mg/kg，下午15点1-3组(总提取物低、中、高剂量组)以及4组(别嘌呤醇组)，按照不同的剂量灌胃给药，第5组(模型组)及第6组(空白对照组)给予等量的生理盐水。

造模1小时后，乙醚吸入麻醉后，心脏取血，4000rpm离心10min后吸取上清，血清于4℃冰箱保存至检测，用以血清中尿酸，尿素氮，肌酐含量检测，根据试剂盒说明书来操作。取血后处死小鼠，于冰上迅速取小鼠的肝脏及肾脏，分装后先于液氮中速冻后立即置于-80℃冰箱保存。根据标准方法进行小鼠肾脏组织he染色。

实验结果：

1、血清尿酸的变化：采用别嘌呤醇10mg/kg/d、雀嘴茶提取物低、中、高剂量组(125、250、500mg/kg/d)对高尿酸血症小鼠灌胃给药。实验结果如图1所示，与空白对照组相比，模型组的血清尿酸明显增高，说明造模成功。雀嘴茶提取物低、中、高剂量组给药2周后，呈剂量依赖性的降低血清尿酸的水平。(注：与空白对照组比较，###p＜0.001；与模型组相比，***p＜0.001)。

2、血清肌酐的变化：采用别嘌呤醇10mg/kg/d、雀嘴茶提取物低、中、高剂量组(125、250、500mg/kg/d)对高尿酸血症小鼠灌胃给药。实验结果如图2所示，与空白对照组相比，模型组的血清肌酐明显增高。而雀嘴茶提取物低、中、高剂量组给药2周后，呈剂量依赖性的降低血清肌酐的水平。(注：与空白对照组比较，###p＜0.001；与模型组相比，***p＜0.001，**p＜0.005)。

3、血清尿素氮的变化：采用别嘌呤醇10mg/kg/d、雀嘴茶提取物低、中、高剂量组(125、250、500mg/kg/d)对高尿酸血症小鼠灌胃给药。实验结果如图3所示，与空白对照组相比，模型组的血清尿素氮明显增高。而雀嘴茶提取物低、中、高剂量组给药2周后，呈剂量依赖性的降低血清尿素氮的水平。(注：与空白对照组比较，###p＜0.001；与模型组相比，***p＜0.001，**p＜0.005)。

4、病理情况变化：光学显微镜下观察，细胞核呈紫色，细胞浆呈红色。实验结果如图4所示，与空白对照组相比，模型组的肾间质的炎症细胞的渗出、水肿等情况明显加重。而雀嘴茶提取物低、中、高剂量组给药2周后，呈剂量依赖性的改善肾间质的炎症细胞的渗出、水肿等情况。

综上所述，本发明采用高尿酸血症小鼠模型对雀嘴茶提取物抗高尿酸血症尤其是降低血尿酸水平作用进行了考察。结果显示，通过灌胃给药雀嘴茶提取物可显著降低小鼠血清尿酸水平，因此，雀嘴茶提取物有抗高尿酸血症作用。以雀嘴茶提取物为活性物质，单独使用或/与其他具有药理学活性的化合物和/或提取物组成复方使用，按照药学领域的常规制剂方法制成各种剂型的抗高尿酸血症药物和/或保健品，或与其他促尿酸排泄药物和/或黄嘌呤氧化酶抑制剂等制成复方制剂，用于在保持疗效的情况下减少药物作用中的不良反应，可为高尿酸血症的治疗预防与治疗提供了一种安全、有效、经济的解决办法。

需要说明的是，本发明的雀嘴茶提取物除了可应用于治疗高尿酸血症外，还可应用于治疗高尿酸血症的相关疾病，比如痛风、尿酸性肾结石等。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。