一种用于口腔脱落细胞直接PCR扩增的预处理方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种可对口腔脱落细胞直接进行pcr扩增的预处理方法及试剂盒。

背景技术：

对于分子诊断，最常用的临床检测方法是荧光定量pcr法。pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)是一种在生物体外放大扩增特定dna(deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸)片段的技术。pcr在扩增dna时一般需要经过高温解链反应、退火反应及延伸反应三个步骤，经过上述三个步骤后初始dna分子数量增加一倍，此时为一个循环；倍增后的dna分子继而成为下一个循环的模板，如此循环倍增下去，经过30-40个循环后，dna分子数目将放大至初始值的近10⁹-10¹⁰倍。由此，针对于分析和检验的目的，pcr能够将作为分析物的dna分子进行特异性的大规模放大，因此，pcr技术能够用于传染病、遗传性疾病及肿瘤等的早期诊断，同时，产前检查及法医鉴定中得到越来越广泛的应用。基于pcr技术的分子检测方法通常需要经历样本处理、核酸提取以及pcr反应体系构建、pcr扩增反应以及信号检测等过程。

荧光定量pcr方法一般分为探针法和染料法。探针法是pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探针结合在dna任意一条单链上；pcr扩增时，taq酶的5'端-3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。染料法是使用能与核酸进行结合的荧光染料。这些染料可以结合到双链dna上面，当体系中的模板被扩增时，荧光染料可以有效结合到新合成的双链上面，随着pcr的进行，结合的荧光染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量的目的。

pcr反应需要模板，常规的口腔脱落细胞模板对样本进行提取后获得的。样本的提取过程大多数繁琐费时，有研究者通过配方调整，实现了简易提取。但是由于简易提取并不能完全去除样本中抑制pcr反应的杂质，因此检出率偏低。

此外，对于目前经常使用的采样工具，如棉拭子、植绒拭子等，在采样过程中会采集到大量的无用蛋白和杂质，影响样本质量。如果使用这样的采样工具，由于样本杂质过多，至少需要简易的样本处理过程。

因此，仍然迫切需要更有效的采样工具以及更简单易行的方法，来进行pcr检测。

技术实现要素：

第一方面，本发明提供了一种口腔样本采集的方法，所述方法包括使用一种口腔采样拭子进行样本采集，所述口腔采样拭子包括手柄和采样拭子头，所述采样拭子头包括采样头本体，以及所述采样头本体上的用于增加表面积的凸起和/或凹陷，其中所述采样头本体和所述凸起和/或凹陷的外表未覆盖其他材料。

第二方面，本发明提供了一种对口腔样本直接进行pcr扩增的方法，所述方法包括：(1)使用一种口腔采样拭子进行样本采集；和(2)直接以所获得的样本作为模板进行pcr扩增；其中所述口腔采样拭子包括手柄和采样拭子头，所述采样拭子头包括采样头本体，以及所述采样头本体上的用于增加表面积的凸起和/或凹陷，其中所述采样头本体和所述凸起和/或凹陷的外表未覆盖其他材料。

第三方面，本发明提供了一种可采集口腔样本并直接进行pcr扩增的试剂盒，所述试剂盒包括口腔采样拭子以及用于pcr扩增的酶、缓冲液、dntp、引物和探针，其中所述口腔采样拭子包括手柄和采样拭子头，所述采样拭子头包括采样头本体，以及所述采样头本体上的用于增加表面积的凸起和/或凹陷，其中所述采样头本体和所述凸起和/或凹陷的外表未覆盖其他材料。

本发明的方法的优势在于，通过使用所述口腔采样拭子采集到口腔样本，可以直接进行pcr扩增，从而避免了复杂冗长的dna或rna提取过程，节约了样本保存和提取的耗材。另外，本发明中使用的所有pcr扩增试剂均可常温保存，无需冷藏冷冻。

附图说明

图1表示本发明所述的口腔采样拭子的示意图，其中(a)(b)(c)(d)分别表示本发明的口腔采样拭子的具体实例。

图2表示本发明所述的口腔采样拭子的拭子头的局部放大示意图，其中(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)(h)(i)分别表示本发明的口腔采样拭子的拭子头的具体实例。

图3a表示采用图2(e)所示的本发明的口腔采样拭子采集口腔样本后直接进行荧光定量pcr扩增所得的扩增曲线。

图3b表示采用图2(c)所示的本发明的口腔采样拭子采集口腔样本后直接进行荧光定量pcr扩增所得的扩增曲线。

图3c表示采用图2(d)所示的本发明的口腔采样拭子采集口腔样本后直接进行荧光定量pcr扩增所得的扩增曲线。

图3d表示采用图2(f)所示的本发明的口腔采样拭子采集口腔样本后直接进行荧光定量pcr扩增所得的扩增曲线。

图3e表示采用图2(g)所示的本发明的口腔采样拭子采集口腔样本后直接进行荧光定量pcr扩增所得的扩增曲线。

图3f表示采用图2(h)所示的本发明的口腔采样拭子采集口腔样本后直接进行荧光定量pcr扩增所得的扩增曲线。

图3g表示采用图2(i)所示的本发明的口腔采样拭子采集口腔样本后直接进行荧光定量pcr扩增所得的扩增曲线。

图4表示采用现有的口拭子采样棒采集口腔样本后直接进行荧光定量pcr扩增所得的扩增曲线。

图5表示采用现有的口拭子采样棒采集口腔样本并利用常规试剂盒进行样本dna提取，然后进行荧光定量pcr扩增所得的扩增曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种口腔样本采集的方法，所述方法包括使用一种口腔采样拭子进行样本采集，所述口腔采样拭子包括手柄和采样拭子头，所述采样拭子头包括采样头本体，以及所述采样头本体上的用于增加表面积的凸起和/或凹陷，其中所述采样头本体和所述凸起和/或凹陷的外表未覆盖其他材料。

优选地，所述采样头本体和所述凸起和/或凹陷的自身材料可以是聚丙烯材料、聚苯乙烯材料、尼龙、树脂。

在一个具体实施方案中，所述采样头本体的形状为扁平长方体，其一个水平面上分布有4-25个凸起，例如9个凸起、12个凸起、16个凸起等。特别地，所述9个凸起呈3×3阵列分布，所述12个凸起呈3×4阵列分布，所述16个凸起呈4×4阵列分布。

在另一个具体实施方案中，所述采样头本体的形状为扁平长方体，其一个水平面上分布有4-25个凸起，例如9个凸起、12个凸起、16个凸起等，所述每个凸起上设置有一个凹陷。特别地，所述9个凸起呈3×3阵列分布，所述12个凸起呈3×4阵列分布，所述16个凸起呈4×4阵列分布。

在另一个具体实施方案中，所述采样头本体的形状为圆柱体，在其侧面上分布有32-128个凸起，例如45个凸起、72个凸起、98个凸起等。特别地，所述45个凸起呈5×9阵列分布，所述72个凸起呈6×12阵列分布，所述98个凸起呈7×14阵列分布。

在另一个具体实施方案中，所述采样头本体的形状为圆柱体，在其侧面上分布有32-128个凸起，例如45个凸起、72个凸起、98个凸起等，所述每个凸起上设置有一个凹陷。特别地，所述45个凸起呈5×9阵列分布，所述72个凸起呈6×12阵列分布，所述98个凸起呈7×14阵列分布。

在又一个具体实施方案中，所述采样头本体的形状为长方体，其一个水平面上有一个凹陷。特别地，所述凹陷的一个侧面为长方形、梯形或三角形。

本发明还提供了一种对口腔样本直接进行pcr扩增的方法，所述方法包括：

(1)使用一种口腔采样拭子进行样本采集；和

(2)直接以所获得的样本作为模板进行pcr扩增；

其中所述口腔采样拭子包括手柄和采样拭子头，所述采样拭子头包括采样头本体，以及所述采样头本体上的用于增加表面积的凸起和/或凹陷，其中所述采样头本体和所述凸起和/或凹陷的外表未覆盖其他材料。

在一个具体实施方案中，所述pcr为荧光定量pcr。

在一个具体实施方案中，步骤(2)可通过以下操作来完成：将含有样本的口腔采样拭子放入纯水或缓冲溶液中涮洗；将涮洗后的液体加入到含有冻干pcr试剂的反应管中，震荡混匀；将所得反应管置于仪器上，进行pcr扩增。优选地，所述缓冲溶液为te缓冲液或tris-hcl缓冲液；所述冻干pcr试剂包含用于pcr扩增的酶、缓冲液、dntp、引物和探针。

本发明还提供了一种可采集口腔样本并直接进行pcr扩增的试剂盒，所述试剂盒包括口腔采样拭子以及用于pcr扩增的酶、缓冲液、dntp、引物和探针，其中所述口腔采样拭子包括手柄和采样拭子头，所述采样拭子头包括采样头本体，以及所述采样头本体上的用于增加表面积的凸起和/或凹陷，其中所述采样头本体和所述凸起和/或凹陷的外表未覆盖其他材料。

优选地，所述pcr为荧光定量pcr。

优选地，所述用于pcr扩增的酶、缓冲液、dntp、引物和探针为冻干的酶、缓冲液、dntp、引物和探针的混合物。

以下实施例用于示例性地说明本发明，而非对本发明进行限制。

实施例1采用本发明的口腔采样拭子采集口腔样本，然后直接进行pcr

1.实验材料和试剂

注：1号对应于图2(e)，2号对应于图2(c)，3号对应于图2(d)，4号对应于图2(f)，5号对应于图2(g)，6号对应于图2(h)，7号对应于图2(i)。

2.实验步骤和结果

本pcr实验中扩增的目的片段为adh1b与aldh2基因。

pcr反应体系中的引物探针详细信息如下表：

(1)样品采集

准备3个1.5ml离心管，管内加入50μl的纯水；使用3根本发明的口腔采样拭子分别刮取3人左右两侧口腔内壁数下；将3根口腔采样拭子的采样拭子头一端分别置入3个1.5ml离心管内，采样拭子头浸没于纯化水中，搅拌数下，取出口腔采样拭子丢弃，盖上1.5ml离心管盖分别标注①②③号管，完成采样。

(2)加样

分别将①②③号样本管中的液体，取40μl分别加入含有冻干试剂的pcr反应管中；盖上管盖，做好标记，完成加样。

(3)扩增

将3管做好标记的反应管置于仪器上，按照如下预设程序进行扩增。1-7号本发明的口腔采样拭子结果分别见图3a-图3g。根据实验结果可以看出，本方法操作简便，pcr扩增有明显的s型曲线，ct值≤35。

实施例2采用现有的口拭子采样棒采集口腔样本，然后直接进行pcr

1.实验材料和试剂

2.实验步骤和结果

本实施例中扩增的目的基因、使用的引物和探针与实施例1中相同。

(1)样品采集

准备3个1.5ml离心管，管内加入500μl的纯化水；使用3根口拭子采样棒分别刮取3人左右两侧口腔内壁数下；将3根采样棒的采样头一端分别置入3个1.5ml离心管内，采样头浸没于纯化水中，搅拌数下，取出采样棒丢弃，盖上1.5ml离心管盖分别标注①②③号管，完成采样。

(2)加样

分别将①②③号样本管中的液体，取40μl分别加入含有冻干试剂的pcr反应管中；盖上管盖，做好标记，完成加样。

(3)扩增

将3管做好标记的反应管置于仪器上，按照如下预设程序进行扩增，结果见图4。

根据实验结果可以看出，使用现有的口拭子采样棒采集口腔样品，然后直接进行荧光定量pcr，所得的扩增s型曲线不明显，部分ct值无法判读。实验结果不佳。

实施例3采用现有的口拭子采样棒采集口腔样本，并利用常规试剂盒进行样本dna提取，然后进行pcr

1.实验材料和试剂

2.实验步骤和结果

本实施例中扩增的目的基因、使用的引物和探针与实施例1中相同。

(1)样品采集

准备3个1.5ml离心管，管内加入500μl的纯化水；使用3根口拭子采样棒分别刮取3人左右两侧口腔内壁数下；将3根口拭子采样棒的采样头一端分别置入3个1.5ml离心管内，采样头浸没于纯化水中，搅拌数下，取出采样棒丢弃，盖上1.5ml离心管盖分别标注①②③号管，完成采样。

(2)样本提取

使用天根dp-362试剂盒对3个样本进行dna提取。

(3)加样

分别将提取完的①②③号样本加入含有冻干试剂的pcr反应管中；每管40μl，盖上管盖，做好标记，完成加样。

(4)扩增

将3管做好标记的反应管置于仪器上，按照以下程序进行扩增，结果见图5。

根据实验结果可以看出，采用现有的口拭子采样棒采集样品后，再使用常规试剂盒提取样本，然后进行荧光定量pcr扩增，得到明显s型曲线扩增，ct≤35，结果较好。但这一过程包括了样本提取步骤，较为繁琐、复杂。