本发明属于医药领域，具体而言，本发明涉及5-甲基四氢叶酸及其药学上可接受的盐新的制备增强免疫力的药物的应用。
背景技术：
叶酸是人体必需的维生素，参与体内蛋白质和dna的合成，它是一碳代谢的重要甲基供体，补充叶酸对人体健康大有裨益，缺乏叶酸会导致红细胞dna合成原料的减少，造成造血系统的功能障碍，表现为红细胞mcv增大、粒细胞过度分叶、巨型杆状核增多以及骨髓内红系巨红细胞系列增生。
由于缺乏叶酸的种种不利影响，在生物学理论上补充叶酸应该有益于增强免疫力，一些研究[牛发良,侯亚利,尹秀玲，等。不同水平叶酸对雏鸡t细胞的影响[j].中华医学丛刊,2002,002(004):21,24.]也表明使用叶酸能够增强免疫力，在动物生产中，饲料中添加叶酸有助于提供机体免疫水平和繁殖能力。甲基化是至关重要的代谢过程，叶酸的缺乏会导致无效的甲基化反应，从而导致体内的高同型半胱氨酸水平升高，进而可能导致许多健康疾病，包括免疫功能障碍，叶酸缺乏会损害免疫力，这在丝氨酸/甘氨酸循环中会产生负面的影响，叶酸在甘氨酸转化为丝氨酸的过程中起着重要的中介作用，而叶酸的缺乏使甘氨酸无法产生丝氨酸，这可能导致代谢过程的执行不充分，包括rna和dna功能受损，低丝氨酸还可以通过阻止适当的抗体形成并干扰t细胞的正常功能来干扰免疫系统。
但是，临床上针对免疫低下的人群，却没有推荐使用叶酸补充剂，即使补充了叶酸对免疫力的改善作用也非常有限。
最近的几项项研究表明，叶酸的长期补充或者高剂量补充都会造成nk细胞的数量或者活性的降低。在2006年一项针对高龄妇女的调查研究表明，长期服用叶酸对免疫功能存在负面作用，特别是nk细胞活性会显著降低[troenam,mitchellb,sorensenb,etal.troen,a.m.etal.unmetabolizedfolicacidinplasmaisassociatedwithreducednaturalkillercellcytotoxicityamongpostmenopausalwomen.j.nutr.136,189-194[j].journalofnutrition,2006,136(1):189-194.]。进一步的研究也表明过量叶酸摄入与老年小鼠nk细胞活性降低之间的因果关系[sawaengsrih,wangj,reginaldoc,etal.highfolicacidintakereducesnaturalkillercellcytotoxicityinagedmice[j].journalofnutritionalbiochemistry,2016,30:102-107.]。在巴西针对成人的临床研究也发现，每日服用5mg的叶酸补充剂会导致细胞因子mrna表达的变化以及nk细胞数量和细胞活性的降低[panizc,bertinatojf,lucenamr,decarlie,amorimpmds,gomesgw,palchetticz,figueiredoms,pfeiffercm,faziliz,greenr,guerra-shinoharaem.adailydoseof5mgfolicacidfor90daysisassociatedwithincreasedserumunmetabolizedfolicacidandreducednaturalkillercellcytotoxicityinhealthybrazilianadults.jnutr.2017sep；147(9):1677-1685.]。
nk细胞是免疫系统中一类特殊的淋巴细胞，它可以被激活以介导细胞毒性活性，并产生高水平的细胞因子和趋化因子，参与非特异性的抗病毒防御机制。nk细胞是属于先天免疫系统的重要效应淋巴细胞，nk细胞作为血液循环中的监视细胞，其重要作用之一就是通过直接杀死感染的细胞和募集适应性反应来对抗病毒感染。同时，nk细胞还在改善造血和实体器官移植、促进抗肿瘤免疫治疗和控制炎症和自身免疫疾病方面具有广阔的前景。
nk细胞的活性降低，会导致人体感染病毒后，导致慢性，亚临床感染，部分是由于病毒的免疫规避策略降低nk细胞的活性进一步加剧了病毒的清除效率的降低。nk细胞严重的缺陷可能会导致过度的炎性细胞反应[cookkd,waggonersn,whitmirejk.nkcellsandtheirabilitytomodulatetcellsduringvirusinfections.critrevimmunol(2014)34(5):359–88.]，也可能导致类似胰岛自身免疫性反应的触发[braunerh,elemansm,lemoss,brobergerc,holmbergd,flodstrom-tullbergm,etal.distinctphenotypeandfunctionofnkcellsinthepancreasofnonobesediabeticmice.jimmunol(2010)184(5):2272–80.]诱发1型糖尿病，或者产生其他自身免疫性疾病。
有学者研究了高摄入量叶酸的小鼠模型对疟疾感染的反应，结果发现这些高摄入量叶酸的小鼠与正常组相比感染伯氏疟原虫后的存活率显著下降，并且生存时间也明显缩短(p＜0.01)，nk细胞与t细胞数量也低于正常组(p＜0.05)，高饮食叶酸会增加小鼠体内的寄生虫增殖，干扰免疫反应并降低对疟疾的抵抗力[meadows,d.n.,bahous,r.h.,best,a.f.,&rozen,r.(2015).highdietaryfolateinmicealtersimmuneresponseandreducessurvivalaftermalarialinfection.plosone,10(11),e0143738.]。
技术实现要素：
目前人们对于叶酸对免疫的作用，主要集中在营养不良对免疫功能产生的重大影响，慢性营养不良被普遍认为是免疫缺陷的主要原因。然而，对于需要增强免疫力的人群，补充叶酸并不是一个可接受的方案。在人体中高水平和低水平的叶酸状态都会导致免疫功能的负面影响。
之前的研究中发现高叶酸摄入对小鼠较低的nk细胞活性存在因果关系。有部分学者认为是由于未带谢的叶酸导致的nk细胞活性降低，但是在体外，却发现高剂量的5-甲基四氢叶酸或叶酸不会影响nk细胞的功能[hirschs,mirandad,estefaníamuoz,etal.naturalkillercellcytotoxicityisnotregulatedbyfolicacidinvitro[j].nutrition,2013,29(5):772-776.]。
进一步发现叶酸影响nk细胞的成熟，主要是有il-10表达下调导致的，il-10启动子区域的组蛋白修饰和甲基化会降低其表达[imsh,huebera,monticellis,kangkh,raoa.chromatin-levelregulationoftheil10geneintcells.jbiolchem.2004nov5；279(45):46818-25.]。dna甲基化是对正常基因调控和发育至关重要的表观遗传修饰，而叶酸与b12则是通过蛋氨酸合酶，生成s-腺苷甲硫氨酸，其是体内甲基的最重要的直接供体，因此可能是高叶酸饮食可能是通过对dna的甲基化的影响潜在影响il-10的产生，进一步的nk细胞收到该细胞因子的调控，从而导致nk细胞的活性下降。
6s-5-甲基四氢叶酸与叶酸的生理功能相同，因此如果过度甲基化同样也会影响nk细胞的活性，如前人研究所述，6s-5-甲基四氢叶酸在体外与叶酸一样不会影响nk细胞，本发明却首次意外发现高剂量的5-甲基四氢叶酸不仅不会降低nk细胞的活性或是不影响nk细胞，反而显著性的提高了nk细胞的活性。
本发明也发现，6s-5-甲基四氢叶酸在增强免疫方面并不是依靠改善营养不良状态，在高剂量下更显著的提高小鼠的免疫力，呈现较为明显的量效关系。
本发明也首次确定了6s-5-甲基四氢叶酸与叶酸在免疫方面存在的生物学效应的区别。
上述的发现，从而提供了针对需要提供免疫力的人群一种安全可靠的治疗方法，切实的提高nk细胞的活性，nk功能和受体激活的缺陷对于维持先天/适应性平衡和适当的免疫功能至关重要。nk失调导致放大的异常反应，细胞因子风暴和死亡，本发明的所述的应用具有显著的进步性。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明的目的是提供一种6s-5-甲基四氢叶酸在制备增强免疫力的药品或保健食品的应用。
本发明通过小鼠模型，证实了6s-5-甲基四氢叶酸具有改善小鼠碳廓清功能，显著增强nk细胞活性，显著提高小鼠淋巴细胞增殖能力、溶血空斑数、抗体生成和巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力。发明人发现6s-5-甲基四氢叶酸无未显著改变小鼠体重、脏器重量以及dth反应(迟发型超敏反应)，无明显的副作用。本发明提示6s-5-甲基四氢叶酸具有通过提升这些免疫相关细胞活性，从而提高机体的免疫能力，发挥治病防病的重要功能的作用。
本发明进一步发现6s-5-甲基四氢叶酸增强免疫力具有显著的量效关系，且仅在高剂量下才具有显著的增强免疫力的功能，发明人分别考察了6s-5-甲基四氢叶酸钙低(0.8mg/(kg·d))、中(1.7mg/(kg·d))、高(5.0mg/(kg·d))三个剂量，分别相当于人推荐量的9、19、57倍，约为人每日摄入4.8mg，10.2mg，30mg，远高于人体的叶酸的每日推荐摄入量(0.4mg/日)。
本发明所述的实验使用6s-5-甲基四氢叶酸钙，其分子量为497.5，由于其含有约14％的结晶水，因此，6s-5-甲基四氢叶酸钙乘以约0.796为折合6s-5-甲基四氢叶酸的量。
本发明的第一个目的在于提供一种已知化合物的新用途，即6s-5-甲基四氢叶酸在制备制备增强免疫力的药物或保健食品的应用。
本发明的第二个目的在于提供一种实现该应用的方法，即制备的药物或保健食品的单剂量6s-5-甲基四氢叶酸不低于1mg，优选不低于1.9.mg，优选的不低于4mg。
本发明所述药学上可接受盐包含5-甲基四氢叶酸的酸性基团与有机碱、无机碱反应所得到的的各种盐，示例性的包含5-甲基四氢叶酸钙盐、钠盐、镁盐、氨基葡萄糖盐、精氨酸盐。
根据本发明所述的应用，6s-5-甲基四氢叶酸在制备增强免疫力的药物或保健食品的应用。
根据本发明所述的应用，6s-5-甲基四氢叶酸在制备增加nk细胞活力，促进淋巴细胞增殖，提高抗体生成和巨噬细胞吞噬能力的药品或保健食品中的应用。
根据本发明所述的应用，所述的药物或保健食品，其特征在于单剂量所含6s-5-甲基四氢叶酸不低于1mg，优选不低于1.9mg，优选不低于4mg，。
本发明所述药物或保健食品包含有效量的6s-5-甲基四氢叶酸，所述6s-5-甲基四氢叶酸可以加一种或多种药学上可接受的辅料，制成各种制剂。用于口服时，可将其制成固体或液体制剂，如片剂、胶囊、软胶囊、分散片、口服液、颗粒、咀嚼片、滴丸等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、悬浮液、粉剂，如水针、冻干粉针、油针等。
本发明提供的药物或保健食品，其每日服用6s-5-甲基四氢叶酸量为2mg-24mg，优选的为3.8mg-24mg，更优选的为8mg-24mg。
在本发明的一个实验例中，小鼠灌胃给予6s-5-甲基四氢叶酸钙后，三个剂量组小鼠体重变化差别不大，脾脏/体重比、胸腺/体重比均低于阴性对照组，但差异无统计学意义(p＞0.05)。
在本发明的一个实验例中，服用6s-5-甲基四氢叶酸钙的小鼠脾淋巴细胞增殖能力od差值随剂量升高而增加，中、高剂量组显著高于阴性对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。各剂量组小鼠左后足跖部周长差值均有所增加，差异无统计学意义(p＞0.05)，显示6s-5-甲基四氢叶酸不会导致迟发性超敏反应。
在本发明的一个实验例中，抗体生成细胞检测试验和血清溶血素测定的试验中，6s-5-甲基四氢叶酸中、高剂量组显著高于阴性对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。
在本发明的另一个实验例中，6s-5-甲基四氢叶酸中、高剂量组的巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力均显著提高(p＜0.05)，另一个实验例中，显示6s-5-甲基四氢叶酸钙能显著提高小鼠碳廓清功能，提高单核巨噬细胞吞噬能力。
在本发明的一个实验例中，6s-5-甲基四氢叶酸低、中、高剂量组的nk细胞活性均显著增加(p＜0.05)。实验结果表明，高于人体推荐摄入量数倍的6s-5-甲基四氢叶酸钙具有显著的增强小鼠免疫力的作用，提示6s-5-甲基四氢叶酸钙能够通过提升这些免疫相关细胞活性，从而提高机体的免疫能力，发挥治病防病的重要功能。中剂量组与高剂量组二者对nk细胞活性影响差异不大，显示对小鼠模型来言，超过5mg/kg的剂量对nk细胞活性的提升不显著。折合人体(60kg)剂量约为每日服用30mg。
本发明的有益效果：
在本发明的实验例中，6s-5-甲基四氢叶酸钙低、高剂量组与等量有效酸的叶酸组进行对比，发现高剂量组的叶酸对nk细胞的活性有负面作用，等量有效酸的6s-5-甲基四氢叶酸钙则显著提高了nk细胞的活性。不仅如此，低剂量6s-5-甲基四氢叶酸组的小鼠nk细胞活性同样显著提高，而相对应的叶酸组则没有提高nk细胞活性的作用，与阴性对照组无显著性差异。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1
2g的6s-5-甲基四氢叶酸钙盐，与700g的微晶纤维素混合，干法制粒后，灌1000粒胶囊，制成每粒含2mg6s-5-甲基四氢叶酸钙的胶囊制剂。
实施例2
6s-5-甲基四氢叶酸钙5g，微晶纤维素500g，羧甲基纤维素钠5g，混匀后干法压片制得1000粒片剂，制成每粒含5mg6s-5-甲基四氢叶酸钙片。
实施例3
6s-5-甲基四氢叶酸钙13g，微晶纤维素500g，羧甲基纤维素钠5g，混匀后干法压片制得1000粒片剂，制成每粒含13mg6s-5-甲基四氢叶酸钙片。
实施例4
6s-5-甲基四氢叶酸钠盐15g，微晶纤维素500g，羧甲基纤维素钠5g，混匀后干法压片制得1000粒片剂，制成每粒含15mg6s-5-甲基四氢叶酸钠片。
实验例16s-5-甲基四氢叶酸钙对小鼠体重及脏器/体重比的影响
6s-5-甲基四氢叶酸钙由本发明申请人提供，性状为类白色结晶粉末，试验以饮用纯净水为溶媒。spf级icr小鼠，体重16～20g，均为雄性，试验前，动物在实验室内适应4天。
按照体重将动物随机分成阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别灌胃给予低(0.8mg/(kg·d))、中(1.7mg/(kg·d))、高(5.0mg/(kg·d))的样品液，阴性对照组灌胃给予同等容积的饮用纯净水。每日给药1次，连续37d。
动物按照分组分别灌胃给予低、中、高样品液和饮用纯净水，所有组连续给药，在第一次给样品之前(始重)、给样品的第15d(中重)、给样品的第30d(终重)，称量小鼠的体重并记录；试验第37d，取胸腺和脾脏称重，计算胸腺/体重比和脾脏/体重比。
数据采用spss19.0软件统计，测定结果以
结果如下：
表1小鼠体重及脏器/体重比值
各剂量组小鼠体重随着给药时间延长而增加，与阴性对照组比较差别不明显，差异无统计学意义(p＞0.05)；各剂量组小鼠的脾脏/体重比、胸腺/体重比均低于阴性对照组，差异无统计学意义(p＞0.05)。
实验例26s-5-甲基四氢叶酸对小鼠脾淋巴转化及迟发性超敏(delayedtypehypersensitivity,dth)
6s-5-甲基四氢叶酸钙由本发明申请人提供，性状为类白色结晶粉末，试验以饮用纯净水为溶媒。spf级icr小鼠，体重16～20g，均为雄性，试验前，动物在实验室内适应4天。
按照体重将动物随机分成阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别灌胃给予低(0.8mg/(kg·d))、中(1.7mg/(kg·d))、高(5.0mg/(kg·d))的样品液，阴性对照组灌胃给予同等容积的饮用纯净水。每日给药1次。
小鼠淋巴细胞转化试验
动物按照分组分别灌胃给予低、中、高样品液和饮用纯净水，所有组连续给药至试验第36d，处死动物，参照瞿飘飘等[瞿飘飘.保健食品紫皮石斛洋参片的功能和毒理学研究[d].浙江:浙江工业大学,2015:8.]的方法用刀豆蛋白a(concanavalina,cona)诱导小鼠脾淋巴细胞转化，mtt法检测细胞增殖情况，在570nm波长处测定吸光值(od值)，根据式(1)计算淋巴细胞的增殖能力。
淋巴细胞增殖能力＝加cona孔的od值-不加cona孔的od值式(1)
小鼠迟发型超敏反应试验
动物按照分组分别灌胃给予低、中、高样品液和饮用纯净水，所有组连续给药至试验第34d，腹腔注射0.2ml2％(v/v)压积绵羊红细胞(sheepredbloodcell,srbc)悬液，免疫后的第4d，参照何晓波等[何晓波,芦柏震,周俐斐,等.蝉花总多糖对细胞免疫和体液免疫反应的促进作用[j].中华中医药学刊,2010,28(7):1465-1468.]的方法皮下注射20％(v/v)srbc，测量攻击前后其足跖周长间的差值，以此来表示dth程度。
数据采用spss19.0软件统计，测定结果以
结果如下：
表2小鼠脾淋巴细胞转化试验和迟发型超敏(dth)反应试验
注：与阴性对照组比较，*p<0.05；**p<0.01。
各剂量组小鼠脾淋巴细胞增殖能力od差值随剂量升高而增加，中、高剂量组显著高于阴性对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)；各剂量组小鼠左后足跖部周长差值均有所增加，差异无统计学意义(p＞0.05)。
实验例3小鼠抗体生成细胞检测试验和血清溶血素测定试验
6s-5-甲基四氢叶酸钙由本发明申请人提供，性状为类白色结晶粉末，试验以饮用纯净水为溶媒。spf级icr小鼠，体重16～20g，均为雄性，试验前，动物在实验室内适应4天。
按照体重将动物随机分成阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别灌胃给予低(0.8mg/(kg·d))、中(1.7mg/(kg·d))、高(5.0mg/(kg·d))的样品液，阴性对照组灌胃给予同等容积的饮用纯净水。每日给药1次。
小鼠抗体生成细胞检测试验
动物按照分组分别灌胃给予低、中、高样品液和饮用纯净水，所有组连续给药至试验第31d，腹腔注射0.2ml2％(v/v)srbc悬液进行免疫，4d后处死动物，制备脾细胞悬液(5×106个/ml)，参照李咏梅等[李咏梅,王冰梅,艾金霞.龙葵浓缩汁对小鼠细胞免疫功能的影响[j].北华大学学报(自然科学版),2005,6(3):231-231.]方法混合琼脂糖培养基、10％srbc(v/v)和脾细胞悬液，并倾倒在玻片上，加入稀释后的补体温育1h，计数溶血的空斑数。
小鼠血清溶血素测定试验
动物按照分组分别灌胃给予低、中、高样品液和饮用纯净水，所有组连续给药至试验第34d，腹腔注射0.2ml2％(v/v)(srbc)悬液进行免疫，免疫5d后，收集血清作倍比稀释，参照[赵珺彦,周大兴,翟鹏贵.西洋参提取物增强免疫力作用的实验研究[j].浙江中医药大学学报,2011(5):755-757.]的方法将血清置于微量血凝板，并与等量0.5％srbc悬液混匀，37℃温箱中孵育3h，观察并记录血球凝集程度级数，根据式(2)计算出抗体积数。
抗体积数＝(s1+2s2+3s3......nsn)式(2)
式中：倍比稀释的指数用1、2、3……n代表，凝集程度级数用s代表。
数据采用spss19.0软件统计，测定结果以
结果如下：
表3小鼠抗体生成细胞检测试验和血清溶血素测定试验
注：与阴性对照组比较，*p<0.05；**p<0.01。
各剂量组溶血空斑数和血清溶血素抗体积数随剂量升高而增加，中、高剂量组显著高于阴性对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。
实验例4小鼠碳廓清试验
6s-5-甲基四氢叶酸钙由本发明申请人提供，性状为类白色结晶粉末，试验以饮用纯净水为溶媒。spf级icr小鼠，体重16～20g，均为雄性，试验前，动物在实验室内适应4天。
按照体重将动物随机分成阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别灌胃给予低(0.8mg/(kg·d))、中(1.7mg/(kg·d))、高(5.0mg/(kg·d))的样品液，阴性对照组灌胃给予同等容积的饮用纯净水。每日给药1次。
动物按照分组分别灌胃给予低、中、高样品液和饮用纯净水，所有组连续给药至试验第38d，尾静脉注入墨汁后立即计时，参照[邱红梅,张颖,周岐新,等.白芨多糖对小鼠免疫功能的调节作用[j].中国生物制品学杂志,2011,24(06):676-678.]的方法在墨汁注入后的2、10min眼眶取血，加入到2ml0.1％na2co3溶液中，在600nm波长处测定od值，而后称量肝重、脾重，根据式(3)、(4)计算吞噬指数。
数据采用spss19.0软件统计，测定结果以
结果如下：
表4小鼠碳廓清试验
注：与阴性对照组比较，*p<0.05；**p<0.01。
各剂量组吞噬指数随剂量升高而增加，显著高于阴性对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。
实验例5小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
6s-5-甲基四氢叶酸钙由本发明申请人提供，性状为类白色结晶粉末，试验以饮用纯净水为溶媒。spf级icr小鼠，体重16～20g，均为雄性，试验前，动物在实验室内适应4天。
按照体重将动物随机分成阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别灌胃给予低(0.8mg/(kg·d))、中(1.7mg/(kg·d))、高(5.0mg/(kg·d))的样品液，阴性对照组灌胃给予同等容积的饮用纯净水。每日给药1次。
动物按照分组分别灌胃给予低、中、高样品液和饮用纯净水，所有组连续给药至试验第37d，向小鼠腹腔内注射1ml20％(v/v)鸡红细胞悬液，间隔30min后处死，参照[陈丽芳,王会宾,叶克难.灵芝孢子粉蜂胶复合物对小鼠免疫功能的影响[j].食品工业科技,2019,040(006):294-297,302.]的方法取腹腔洗液滴加在载玻片上，37℃培养箱中孵育30min，giemsa染色后在油镜下计数巨噬细胞，依照下式(5)计算吞噬百分率。
数据采用spss19.0软件统计，测定结果以
结果如下：
表5小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
注：与阴性对照组比较，*p<0.05。
各剂量组的吞噬百分率(p)和吞噬指数x数值均增加，中、高剂量组显著高于阴性对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。
实验例6自然杀伤细胞(naturalkillercells,nkcells)活性测定试验
6s-5-甲基四氢叶酸钙由本发明申请人提供，性状为类白色结晶粉末，试验以饮用纯净水为溶媒。spf级icr小鼠，体重16～20g，均为雄性，试验前，动物在实验室内适应4天。
按照体重将动物随机分成阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别灌胃给予低(0.8mg/(kg·d))、中(1.7mg/(kg·d))、高(5.0mg/(kg·d))的样品液，阴性对照组灌胃给予同等容积的饮用纯净水。每日给药1次。
动物按照分组分别灌胃给予低、中、高样品液和饮用纯净水，所有组连续给药至试验第36d，处死动物，参照[朱鸿哲.芦荟多糖对免疫功能影响的实验研究[j].中医药信息,2018,035(004):34-37.]的方法制备靶细胞和脾细胞悬液(效应细胞)，按照效靶比50:1加入96孔板，放置在37℃、5％co2培养箱中培养4h，每孔取上清液100μl置于96孔板，同时，加入等量ldh基质液，反应7min后，每孔加入30μl1mol/l的盐酸溶液，在490nm处测od值，并根据式(6)计算nk细胞的活性。
数据采用spss19.0软件统计，测定结果以
表6自然杀伤细胞(nkcells)活性测定试验
注：与阴性对照组比较，*p<0.05；**p<0.01。
各剂量组小鼠nk细胞活性均增加，显著高于阴性对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。在文章[sawaengsrih,wangj,reginaldoc,etal.highfolicacidintakereducesnaturalkillercellcytotoxicityinagedmice[j].journalofnutritionalbiochemistry,2016,30:102-107.]中作者考察了雌性c57bl/6小鼠，高叶酸组摄入超剂量叶酸，持续3个月。之后对小鼠的nk细胞活性进行测定，结果发现在效应细胞与靶细胞比例为25：1和12.5：1的情况下，高叶酸饮食的小鼠的nk细胞活性显著低于对照饮食的小鼠，分别降低了14％和23％，高叶酸组动物的脾脏细胞产生il-10低于对照组，具有显著性差异。
实验例7自然杀伤细胞(naturalkillercells,nkcells)活性测定试验
6s-5-甲基四氢叶酸钙由本发明申请人提供，性状为类白色结晶粉末。叶酸，食品级，橙黄色结晶粉末，含量为96～102％。试验以饮用纯净水为溶媒。spf级icr小鼠，体重16～20g，均为雄性，试验前，动物在实验室内适应4天。
按照体重将动物随机分成阴性对照组、6s-5-甲基四氢叶酸钙低剂量组、6s-5-甲基四氢叶酸钙高剂量组、叶酸低剂量组和叶酸高剂量组，每组10只，6s-5-甲基四氢叶酸钙低剂量组和高剂量组分别灌胃给予低(0.8mg/(kg·d))、高(5.0mg/(kg·d))的样品液，叶酸组低剂量组和高剂量组分别灌胃给予低(0.61mg/(kg·d))、高(3.8mg/(kg·d))的样品液，阴性对照组灌胃给予同等容积的饮用纯净水。每日给药1次。叶酸组的有效酸含量与对应6s-5-甲基四氢叶酸钙组相当。
动物按照分组分别灌胃给予低、高样品液和饮用纯净水，所有组连续给药至试验第36d，处死动物，参照[朱鸿哲.芦荟多糖对免疫功能影响的实验研究[j].中医药信息,2018,035(004):34-37.]的方法制备靶细胞和脾细胞悬液(效应细胞)，按照效靶比50:1加入96孔板，放置在37℃、5％co2培养箱中培养4h，每孔取上清液100μl置于96孔板，同时，加入等量ldh基质液，反应7min后，每孔加入30μl1mol/l的盐酸溶液，在490nm处测od值，并根据式(6)计算nk细胞的活性。
数据采用spss19.0软件统计，测定结果以
结果如下：
表7自然杀伤细胞(nkcells)活性测定试验
注：与阴性对照组比较，*p<0.05；**p<0.01。
叶酸组低剂量组与阴性对照组无显著性差异，高剂量组nk活性降低，显示出显著性差异。6s-5-甲基四氢叶酸钙组小鼠nk细胞活性均增加，显著高于阴性对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。