美他环素在制备防治牛副流感病毒3型病毒感染药物中的应用

本发明属于医药药物技术领域，具体涉及美他环素在制备防治bpiv3感染药物中的应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

牛副流感病毒3型(bovineparainfluenzavirustype3,bpiv3)属于副黏病毒科、呼吸道病毒属的成员，是牛呼吸道综合征(bovinerespiratorydiseasecomplex,brdc)最重要病原，临床上以发热、咳嗽、气喘、食欲减退、眼睛鼻部分泌物增多，少数伴有腹泻为特征，最终表现为肺炎，严重的能够引起流产。目前，bpiv3的感染已呈世界性分布，给世界养牛业造成严重的经济损失。1959年该病毒在美国被首次分离到，我国对bpiv3的报道比较晚。

bpiv3是引起犊牛和成年牛上呼吸道感染的重要病原体之一，bpiv3同属的成员还包括人副流感病毒3型(humanparainfluenzavirustype3,hpiv3)和仙台病毒(sendaivirus,sev)。在自然条件下，本病仅感染牛，多见于舍饲的肥育牛，病牛及带毒牛是主要的传染源，易感牛群因与排毒的牛接触，通过空气-飞沫经呼吸道而感染，也可以发生子宫内感染。曾从公牛精液和母牛生殖道中发现病毒，并可能导致不育。此外，也有研究者从奶牛临床乳房炎中分离到了bpiv3。本病常见于晚秋和冬季，感染bpiv3的牛只常因呼吸道上皮受损，而造成呼吸道黏膜的防御能力下降，引起免疫抑制，因此，bpiv3的患病牛经常容易继发感染严重的细菌性或支原体性疾病，从而引起严重的肺炎，使死亡率大大增加。

美他环素为半合成四环素，具广谱抗菌活性。抗菌机制与四环素相同，抗菌作用强于四环素，具有高效和长效性质。对革兰阳性或阴性菌有较强的抗菌活性；对立克次体、衣原体、支原体、非典型的分枝杆菌、阿米巴原虫有较强的拮抗作用，但迄今尚未有关于其用于预防或治疗牛副流感病毒3型的报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明提供美他环素在预防和/或治疗bpiv3相关疾病中的应用，本发明首次证实美他环素能够有效抑制bpiv3的增殖，且对细胞的毒性较小，因此具有开发成预防和/或治疗bpiv3感染药物的前景。本发明的应用为首次公开，且与美他环素已知的临床用药用途不同。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供美他环素在制备预防和/或治疗牛副流感病毒3型感染药物中的应用。

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗bpiv3相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

同时，所述预防和/或治疗牛副流感病毒3型感染药物中，美他环素取不低于半数有效浓度(ec50)的药物浓度，美他环素对bpiv3的半数有效浓度(ec50)为9.08μm；美他环素对bpiv3的治疗指数大于10。

本发明的第二个方面，提供美他环素在制备抗牛副流感病毒3型的药物中的应用。

本发明的第三个方面，提供美他环素在制备抑制和/或杀灭牛副流感病毒3型的药物中的应用。

根据本发明，不仅公开了美他环素在制备预防和/或治疗牛副流感病毒3型感染药物中的应用，而且还公开了，施用美他环素与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，美他环素还可以与其它非药物活性成分组合使用。

有鉴于此，本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗牛副流感病毒3型感染的药物组合物，所述药物组合物由美他环素与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

其中，美他环素取不低于半数有效浓度(ec50)的药物浓度，美他环素对bpiv3的半数有效浓度(ec50)为9.08μm；美他环素对bpiv3的治疗指数大于10。

在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的美他环素对bpiv3具有明显的抑制和/或杀灭作用，可以实现对bpiv3的直接灭活作用，并阻断bpiv3对细胞的吸附作用。

本发明的第五个方面，提供一种预防和/或治疗牛副流感病毒3型感染相关疾病的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效剂量的美他环素或上述药物组合物。

上述技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次发现化合物美他环素能够有效预防bpiv3的增殖，且对细胞的毒性相对较小，经实验证明，美他环素对mdbk细胞的半数细胞毒性浓度(cc50)大于100μm，而对bpiv3病毒的半数有效浓度(ec50)为9.08μm；美他环素对bpiv3的治疗指数大于10，表明其具有开发成为抗bpiv3药物的前景，为美他环素开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗bpiv3药物奠定实验基础并提供新的视野，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明美他环素预防bpiv3损伤细胞的作用图；

其中：其中a为病毒对照组；b为mdbk正常细胞组；c为感染细胞药物试验组(使用10μm美他环素)；

图2为实施例2中美他环素对mdbk细胞的半数细胞毒性浓度(cc50)图；

图3为实施例3中美他环素对bpiv3的半数有效浓度(ec50)图；

图4为实施例4中美他环素不同时间点给药对bpiv3抑制的效果图；

图5实施例5美他环素对bpiv3复制的阻断作用效果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

正如背景技术所介绍的，现有技术中，迄今尚未有关于美他环素用于预防和/或治疗bpiv3相关疾病的报道。

有鉴于此，本发明建立了bpiv3在细胞(mdbk细胞)水平上药物筛选体系，确定了美他环素对mdbk细胞的半数毒性浓度(cc50)大于100μm，对bpiv3的半数有效浓度(ec50)为9.08μm，美他环素对bpiv3的治疗指数大于10。

本发明还提供了根据病毒的致病机制，分别采用不同时间点给药实验以及先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供美他环素在制备预防和/或治疗bpiv3感染药物中的应用。并因此，美他环素对于预防和/或治疗bpiv3相关的疾病是有效的。

本发明所述化合物美他环素(cas号：914-00-1)，其结构式如下：

其中，预防和/或治疗bpiv3感染药物中，美他环素取不低于半数有效浓度(ec50)的药物浓度，美他环素对bpiv3的半数有效浓度(ec50)为9.08μm；

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗bpiv3相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

本发明的又一具体实施方式中，提供美他环素或包含美他环素的组合物或其制剂在制备抗bpiv3的药物中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供美他环素或包含美他环素的组合物或其制剂在制备抑制和/或杀灭bpiv3的药物中的应用。

根据本发明，不仅公开了美他环素在制备预防和/或治疗bpiv3感染药物中的应用，而且还公开了，施用美他环素与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，美他环素还可以与其它非药物活性成分组合使用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种预防和/或治疗bpiv3感染的药物组合物，所述药物组合物由美他环素与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

其中，美他环素可以取不低于半数有效浓度(ec50)的药物浓度，美他环素对bpiv3的半数有效浓度(ec50)为9.08μm；当然，当美他环素与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭bpiv3等与本发明上述相同应用的药物或活性成分联合使用时，其药物浓度理论上可以低于上述有效浓度，但也不排除特殊的例外情况。

根据本发明的实施方式，美他环素在药物浓度安全范围内，随着浓度的升高，抑制或杀灭效果随之提升。本发明所述的药物在浓度安全范围内即指药物在抑制或杀灭bpiv3时，对bpiv3的易感细胞没有伤害。

在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的美他环素对bpiv3具有明显的抑制和/或杀灭作用，可以实现对bpiv3的直接杀灭作用，并阻断bpiv3对细胞的吸附作用。

本发明的又一具体实施方式中，所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭bpiv3或者协助抑制和/或杀灭bpiv3的物质。

本发明的又一具体实施方式中，其他非药物活性成分包括药学上可接受的辅料和/或载体。

本发明中含有上述美他环素的药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。

本发明的药物组合或药物制剂中还可以含有常用的载体，这里所述可药用载体包括但不局限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酯，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛酯等。载体在药物组合物中的含量可以是1％重量-98％重量，通常大约占到80％重量。为方便起见，局部麻醉剂，防腐剂，缓冲剂等可直接溶于载体中。

口服片剂和胶囊可以含有赋形剂如粘合剂，如糖浆，阿拉伯胶，山梨醇，黄芪胶，或聚乙烯吡咯烷酮，填充剂，如乳糖，蔗糖，玉米淀粉，磷酸钙，山梨醇，氨基乙酸，润滑剂，如硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，硅土，崩解剂，如马铃薯淀粉，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐。片剂可以用制药学上公知的方法包衣。

口服液可以制成水和油的悬浮液，溶液，乳浊液，糖浆，也可以制成干品，用前补充水或其它合适的媒质。这种液体制剂可以包含常规的添加剂，如悬浮剂，山梨醇，纤维素甲醚，葡萄糖糖浆，凝胶，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，硬脂酸铝凝胶，氢化的食用油脂，乳化剂，如卵磷脂，山梨聚糖单油酸盐，阿拉伯树胶；或非水载体(可能包含可食用油)，如杏仁油，油脂如甘油，乙二醇，或乙醇；防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，山梨酸。如需要可添加调味剂或着色剂。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种预防和/或治疗牛副流感病毒3型感染相关疾病的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效剂量的美他环素或上述药物组合物。

所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指牛。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。

下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步阐述。需要说明的是，本申请实施例中使用的bpiv3由山东省农业科学院奶牛研究中心分离获得，经鉴定其属于bpiv3c型。

具体分离及鉴定方法如下：将新鲜的鼻拭子用pbs稀释，反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清液加入青霉素(200iu/ml)、链霉素(100μg/ml)，取200μl上清液，按照病毒基因组dna/rna提取试剂盒说明书提取bpiv3病毒基因组rna,反转录为cdna，用bpiv3特异性引物进行pcr扩增，将pcr鉴定为阳性的鼻拭子液体用0.22μm的滤膜过滤除菌，取1ml接种mdbk单层细胞，37℃吸附1h，弃去，加入含有2％fbs的dmem培养基中，在37℃、5％co2细胞培养箱中培养，每12h观察细胞病变情况，连续观察3d。将出现病变(cpe)的细胞反复冻融3次，收集细胞病毒液，同时鉴定获得的细胞病毒夜是否是bpiv3单一感染，若不是单一病毒感染，使用噬斑纯化的方法获得bpiv3单一感染的细胞病毒液。经bpiv3系统进化树分析鉴定，该分离株属于bpiv3c型。

实施例1病毒tcid50的测定

将mdbk细胞(山东省农业科学院奶牛研究中心保存)消化后以每孔1×10⁵个/ml的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％co2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将bpiv3连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10^-1～10^-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μl，放入37℃、5％co2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的cpe情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设8个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按karber法计算病毒tcid50。

表1tcid50ofbpiv3

注：tcid50，tissuecultureinfectivedose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,cpe)所需的病毒量。

结果：在显微镜下的形态学观察发现36h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现圆缩坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的cpe孔数,并计算出不同浓度的cpe比率，并按karber法计算bpiv3的tcid50值：

lgtcid50＝l-d(s-0.5)

(l:最高稀释度的对数；d:稀释度对数之间的差；s阳性孔比率总和)

lgtcid50＝l-d(s-0.5)＝-1-1×(5.75-0.5)＝-6.25

tcid50＝10^-6.25/0.1ml

即将该病毒稀释10^6.25接种100μl可使50％的细胞发生病变。

实施例2美他环素对mdbk细胞的毒性实验：

mdbk细胞是bpiv3的易感细胞。因此，首先检测美他环素对mdbk细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：

(1)在96孔板内接种100μl细胞(mdbk1×10⁴个/孔)。

(2)培养至mdbk单层后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μl含不同药物浓度的2％fbsdmem，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μl2％fbsdmem培养基。调零孔：不铺细胞。

(3)在37℃，5％co2条件下培养48h后，按cck-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的od值。

(4)37℃，5％co2条件下继续培养2h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的a450nm设为100％细胞对照。

(5)分析数据，利用graphpadprism5计算美他环素的半数细胞毒性浓度(cc50)值。其结果如图2所示。

结果：美他环素出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定美他环素半数中毒浓度大于100μm。

实施例3美他环素对bpiv3的抑制实验：

(1)在96孔板的每个孔中接种1×10⁴个mdbk细胞，37℃，5％co2培养箱中过夜培养；

(2)弃去培养基，每孔加入100μl2％dmem，按照25μm初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％co2培养箱中培养；药物孵育2h后，每孔加入100μl1000tcid50的bpiv3稀释液。

(3)48h后，按cck-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的od值。

(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组d450nm值-病毒对照组d450nm值)/(正常细胞对照组d450nm值-病毒对照组d450nm值)×100％，用graphpadprism5软件得化合物的半数有效浓度(ec50)值。其结果如图3所示。然后按公式ti＝cc50/ec50，计算相应的治疗指数ti值。

结果：通过cck-8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对bpiv3的有效抑制率。从结果可以看出，美他环素在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对bpiv3的半数有效浓度(ec50)为9.08μm。美他环素对bpiv3的治疗指数大于10。

实施例4作用机制的初步研究

通过不同的给药时间，即对应的时刻是先给药后感染病毒(0h之前)、先感染病毒后给药(0h之后)、病毒和药物同时加入细胞(0h)三个时间点，将待测化合物加入到接种了bpiv3的mdbk细胞中，进而初步判断美他环素的作用时期。具体实验步骤如下：

(1)在96孔板的每个孔中接种1×10⁴个mdbk细胞，37℃，5％co2培养箱中培养。

(2)根据已测得的相关药物的药效学评价结果，确定实验所需药物的浓度，并用维持培养基把药物稀释至所需浓度。

(3)细胞过夜培养后，将96孔板中第二列三个复孔的细胞上清吸走，用磷酸缓冲液清洗细胞2遍。然后加入50μl的待测药物，记为-2h。

(4)2h后，将其他孔的细胞上清全部吸走，将稀释好的bpiv3稀释液加到第2～11列的每孔中，每孔加样体积为50μl。同时在第3列的三个复孔中加入50μl相应待测物，此刻记为0h。

(5)以后每隔一定时间在下一列的三个复孔中加入相应待测化合物，标记好相应时间。以第11列的mdbk细胞作为病毒对照组。

(6)培养48h后，进行od值测定。分析数据，得出结论，其结果如图4所示。

结果：从不同时间点给药实验结果分析可知，美他环素在病毒感染细胞-2h时加药，对病毒均有明显的抑制作用。

实施例5化合物不同时间加入对bpiv3复制的影响

将美他环素分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。

(1)药物对病毒的直接杀伤作用

将等量的1000tcid50病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％co2培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μl/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h进行细胞活力检测，用graphpadprism5软件得化合物的ec50。

结果：美他环素与bpiv3预先作用的给药方式下，可以看出，25μm美他环素对bpiv3有40％的直接灭活作用，低于25μm美他环素对bpiv3没有直接灭活作用。

(2)药物对bpiv3吸附的阻断作用

按每孔1×10⁴个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μl/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用pbs洗两遍，加入等量的1000tcid50病毒液置于37℃、5％co2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。

结果：通过分析软件，美他环素对bpiv3的作用效果如图5所示，结果显示，在安全浓度范围内，9.08μm及以上浓度能完全有效抑制bpiv3的增殖，表明美他环素能阻止bpiv3对细胞的吸附作用。(3)药物对bpiv3复制的阻断作用

按每孔1×10⁴个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的1000tcid50病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％co2培养箱中预先作用2h后，然后弃去上清液，pbs将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μl/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％co2培养箱中培养，48h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。

结果：通过数据分析发现美他环素不能阻断bpiv3的复制。

本发明应用实施例以牛肾细胞(mdbk)为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现美他环素的新型抗病毒作用，对bpiv3有一定的抑制作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。