大麻多糖及其组合物在制备促进皮肤损伤修复的药物或护肤品中的应用的制作方法

1.本发明属于大麻提取物技术领域，涉及一种大麻多糖的新应用，具体涉及大麻多糖及其组合物在制备促进皮肤损伤修复的药物或护肤品中的应用。


背景技术：

2.工业大麻是经过遗传改良的大麻品种，其毒性成分四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，thc)＜0.3％，经许可后可以合法种植加工利用。它是一种集食用、药用、纤维用为一体的高经济价值的作物，其茎秆纤维可用于纺织、建材和造纸，籽实可用于食品和药物，在云南、内蒙古、黑龙江等多个省份均有广泛的种植分布。
3.研究表明，大麻植株中主要的大麻酚类化合物有四氢大麻酚(thc)、大麻酚(cbn)、大麻二酚(cbd)、大麻萜酚(cbg)、大麻环萜酚(cbc)等。其中前三者占大麻酚类化合物的90％以上。目前关于工业大麻相关研究主要集中在大麻酚类化合物药理的研究和工业大麻纤维应用方面的研究，大麻酚类化合物为非水溶性组分，提取过程属于有机溶剂提取，在生产提取的过程中，工业大麻的水溶性组分被视为废弃物处理。然而，工业大麻的水溶性组分中含有的多糖等物质也具有活性作用，但是现有技术中关于大麻多糖的活性方面的研究甚少。
4.cn111978417a公开了一种大麻多糖的提取方法及其产品和应用。其提取到的大麻多糖具有清除dpph自由基、抗氧化的效果。除此之外，现有技术中未见其他关于大麻多糖的应用方面的研究。
5.因此对大麻多糖的活性进行深入研究，挖掘大麻多糖的其他用途、拓宽大麻多糖的应用领域、从而提升工业大麻的经济价值具有重要的意义。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种大麻多糖的新应用，具体提供大麻多糖及其组合物在制备促进皮肤损伤修复的药物或护肤品中的应用。
7.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供大麻多糖在制备促进皮肤损伤修复的药物或护肤品中的应用。
9.本发明创造性地发现大麻多糖能够显著地促进人原代皮肤角质细胞增殖、人皮肤成纤维细胞增殖以及人皮肤成纤维细胞迁移，进而发现其在促进皮肤损伤修复、促进皮肤创口愈合方面具有显著功效，拓宽了大麻多糖的应用领域，大大提升了工业大麻的经济价值。
10.优选地，所述药物的剂型包括溶液剂、气雾剂、喷雾剂、软膏剂或膜剂中的任意一种。
11.优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
12.优选地，所述辅料包括稀释剂、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如粘合剂和稀释剂的组合、粘合剂和调味剂的组合、粘合剂和填充剂的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
13.优选地，所述护肤品包括化妆水、精华水、精华液、面霜、乳液或面膜中的任意一种。
14.优选地，所述护肤品的组成成分还包括添加剂。
15.优选地，所述添加剂包括乳化剂、柔润剂、保湿剂、抗敏剂、抗氧化剂、防腐剂或ph调节剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如乳化剂与柔润剂的组合、保湿剂与抗敏剂的组合、抗敏剂与抗氧化剂的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
16.在本发明中，所述大麻多糖是由包括如下步骤的制备方法制得的：
17.(1)将工业大麻花叶原料与水混合，加酸调ph至3.0-3.5，回流提取1-3次，每次回流1-3h，合并提取液，得大麻多糖初提物；
18.(2)步骤(1)得到的大麻多糖初提物过阴离子交换树脂d900柱层析纯化，用水洗脱，收集流出液，喷雾干燥，得到所述大麻多糖；
19.以所述工业大麻花叶原料的质量为1kg计，步骤(1)所述水的体积为5-10l；所述酸为甲酸、乙酸、草酸、柠檬酸、盐酸、硝酸或硫酸中的一种或至少两种的组合；步骤(2)所述树脂的质量为工业大麻花叶原料质量的1/30-1/100。
20.上述3.0-3.5中的具体数值可以为3.0、3.05、3.1、3.15、3.2、3.25、3.3、3.35、3.4、3.45、3.5等。
21.上述1-3h中的具体数值可以为1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h等。
22.上述5-10l中的具体数值可以为5l、5.5l、6l、6.5l、7l、7.5l、8l、8.5l、9l、9.5l、10l等。
23.上述1/30-1/100中的具体数值可以为1/30、1/35、1/40、1/45、1/50、1/55、1/60、1/65、1/70、1/75、1/80、1/85、1/90、1/95、1/100等。
24.上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
25.本发明提供的大麻多糖制备方法工艺简单，其中加酸调节ph至3.0-3.5可以增加植物的细胞壁通透性，有利于多糖浸出，提高大麻多糖的产量。利用本发明提供的制备方法制备得到的大麻多糖可用于制备促进皮肤损伤修复的药物或护肤品。
26.第二方面，本发明提供大麻多糖在制备皮肤角质细胞增殖促进剂中的应用。
27.本发明创造性地发现大麻多糖能够显著地促进人原代皮肤角质细胞的增殖。人皮肤表皮中存在一层角质保护层，该保护层由皮肤角质细胞组成，其作用是阻止皮肤水分的过度流失，并防止皮肤在正常摩擦时受到外伤。因此本发明这一发现可以进一步地被应用于促进皮肤新陈代谢、保护皮肤、使皮肤免受损伤、促进皮肤创伤愈合、防止皮肤水分流失等相关机制的研究以及相关产品的研发中。
28.第三方面，本发明提供大麻多糖在制备皮肤成纤维细胞增殖促进剂中的应用。
29.本发明创造性地发现大麻多糖能够显著地促进人原代皮肤成纤维细胞增殖。人皮肤成纤维细胞在人体内的作用是修复受损皮肤，并降低年龄老化对皮肤的影响。因此本发
明这一发现可以进一步地被应用于促进皮肤新陈代谢、促进皮肤创伤愈合、防止皮肤水分流失等相关机制的研究以及相关产品的研发中。
30.第四方面，本发明提供大麻多糖在制备皮肤成纤维细胞迁移促进剂中的应用。
31.本发明创造性地发现大麻多糖能够显著地促进人原代皮肤成纤维细胞迁移。人皮肤成纤维细胞在人体内的作用是修复受损皮肤，并降低年龄老化对皮肤的影响。因此本发明这一发现可以进一步地被应用于促进皮肤新陈代谢、促进皮肤创伤愈合、防止皮肤水分流失等相关机制的研究以及相关产品的研发中。
32.第五方面，本发明提供一种大麻多糖组合物在制备促进皮肤损伤修复的药物或护肤品中的应用，所述大麻多糖组合物包括纤连蛋白、透明质酸钠和大麻多糖。
33.本发明创造性地将大麻多糖、纤连蛋白与透明质酸钠进行组合形成一种全新的组合物，该组合物中的大麻多糖、纤连蛋白与透明质酸钠三者相互配合，在促进皮肤损伤修复、促进皮肤创口愈合方面具有协同增效功效，可用于制备促进皮肤损伤修复药物或护肤品。其中纤连蛋白可增强细胞间及细胞与基质间的粘连，还具有促进细胞迁移、促进成纤维细胞增殖、促进细胞分化等功能，在促进细胞分化、加速伤口愈合方面功效显著。透明质酸钠广泛存在于机体中，在关节腔、皮肤、眼玻璃体、软骨、脐带和公鸡冠等组织中的含量较高。透明质酸钠具有调控细胞与细胞间的黏附、定位、分化，促进细胞的增生和移动等生理功能，能够参与保湿、润滑、伤口愈合、组织修复和再生、炎症反应、胚胎发育及肿瘤等生物进程。本发明在发现大麻多糖在促进皮肤损伤修复方面的显著效果的基础上，创造性地将纤连蛋白、透明质酸钠与大麻多糖进行组合，三者配合使用在促进皮肤损伤修复方面具有比任意单独的成分或任意两两组合具有更优异的效果。
34.优选地，所述大麻多糖组合物包括大麻多糖1-5份、纤连蛋白3-15份和透明质酸钠5-20份。
35.上述1-5份中的具体数值可以选择1份、1.2份、1.5份、1.7份、2份、2.2份、2.5份、2.7份、3份、3.2份、3.5份、3.7份、4份、4.2份、4.5份、4.7份、5份等。
36.上述3-15份中的具体数值可以选择3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份、15份等。
37.上述5-20份中的具体数值可以选择5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份、20份等。
38.上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
39.优选地，所述药物的剂型包括溶液剂、气雾剂、喷雾剂、软膏剂或膜剂中的任意一种。
40.优选地，所述护肤品包括化妆水、精华水、精华液、面霜、乳液或面膜中的任意一种。
41.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
42.首先，本发明创造性地发现大麻多糖能够显著地促进人原代皮肤角质细胞增殖、人皮肤成纤维细胞增殖以及人皮肤成纤维细胞迁移，进而发现其在促进皮肤损伤修复、促进皮肤创口愈合方面具有显著功效，拓宽了大麻多糖的应用领域，大大提升了工业大麻的经济价值。其次，本发明创造性地将大麻多糖、纤连蛋白与透明质酸钠进行组合形成一种全新的组合物，该组合物中的大麻多糖、纤连蛋白与透明质酸钠三者相互配合，在促进皮肤损
伤修复、促皮肤创口愈合方面具有协同增效功效，可用于制备促进皮肤损伤修复药物或护肤品。
具体实施方式
43.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选制备例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在制备例范围内。
44.下述制备例、对比制备例所涉及的原料信息如下：人原代皮肤角质细胞采购自promocell公司；人原代皮肤成纤维细胞和培养基采购自美国sciencell公司；普通96孔板和12孔板采购自corning；cck-8细胞活力检测试剂盒采购自日本同仁生物；纤连蛋白(型号为43243)采购自广州启点生物科技有限公司。
45.制备例1
46.本制备例提供一种大麻多糖的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
47.(1)将10kg工业大麻花叶原料与50l水混合，加乙酸调ph至3.0，回流提取3次，每次回流1h，合并提取液，得大麻多糖初提物；
48.(2)步骤(1)得到的大麻多糖初提物过阴离子交换树脂d900柱层析(树脂用量350g)，用水洗脱至流出液近无色，收集流出液，喷雾干燥，得所述大麻多糖共758.09g，将得到的大麻多糖利用苯酚-硫酸法进行多糖含量的检测，得到多糖含量为18.78％。
49.制备例2
50.本制备例提供一种大麻多糖的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
51.(1)将10kg工业大麻花叶原料与100l水混合，加甲酸调ph至3.5，回流提取1次，回流时间为3h，收集提取液，得大麻多糖初提物；
52.(2)步骤(1)得到的大麻多糖初提物过阴离子交换树脂d900柱层析(树脂用量100g)，用水洗脱至流出液近无色，收集流出液，喷雾干燥，得所述大麻多糖560.67g，将得到的大麻多糖利用苯酚-硫酸法进行多糖含量的检测，得到多糖含量为24.35％。
53.制备例3
54.本制备例提供一种大麻多糖的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
55.(1)将10kg工业大麻花叶原料与80l水混合，加草酸调ph至3.2，回流提取2次，每次回流2h，合并提取液，得大麻多糖初提物；
56.(2)步骤(1)得到的大麻多糖初提物过阴离子交换树脂d900柱层析(树脂用量500g)，用水洗脱至流出液近无色，收集流出液，喷雾干燥，得所述大麻多糖630.24g，将得到的大麻多糖利用苯酚-硫酸法进行多糖含量的检测，得到多糖含量为22.89％。
57.制备例4
58.本制备例提供一种大麻多糖组合物，以重量份数计，所述大麻多糖组合物包括大麻多糖2份、纤连蛋白8份和透明质酸钠10份。
59.所述大麻多糖的制备方法与制备例1相同。
60.所述大麻多糖组合物的制备方法仅需要各组分简单物理混合均匀即可。
61.制备例5
62.本应用例提供一种大麻多糖组合物，以重量份数计，所述大麻多糖组合物包括大麻多糖2份、纤连蛋白4份和透明质酸钠14份。
63.所述大麻多糖的制备方法与制备例2相同。
64.所述大麻多糖组合物的制备方法参照制备例4。
65.制备例6
66.本制备例提供一种大麻多糖组合物，以重量份数计，所述大麻多糖组合物包括大麻多糖2份、纤连蛋白4份和透明质酸钠14份。
67.所述大麻多糖的制备方法与制备例3相同。
68.所述大麻多糖组合物的制备方法参照制备例4。
69.对比制备例1
70.本对比制备例提供一种单一的纤连蛋白组分。
71.对比制备例2
72.本对比制备例提供一种单一的透明质酸钠组分。
73.对比制备例3
74.本对比制备例提供一种大麻多糖组合物，其与制备例4的区别仅在于将“大麻多糖2份、纤连蛋白8份和透明质酸钠10份”替换为“大麻多糖与纤连蛋白的组合20份”其中大麻多糖与纤连蛋白的质量比为1:4。
75.其制备方法参照制备例4。
76.对比制备例4
77.本对比制备例提供一种大麻多糖组合物，其与制备例4的区别仅在于将“大麻多糖2份、纤连蛋白8份和透明质酸钠10份”替换为“大麻多糖与透明质酸钠的组合20份”其中大麻多糖与透明质酸钠的质量比为1:5。
78.其制备方法参照制备例4。
79.对比制备例5
80.本对比制备例提供一种组合物，其与制备例4的区别仅在于将“大麻多糖2份、纤连蛋白8份和透明质酸钠10份”替换为“纤连蛋白与透明质酸钠的组合20份”其中纤连蛋白与透明质酸钠的质量比为4:5。
81.其制备方法参照制备例4。
82.测试例1
83.大麻多糖对人原代皮肤角质细胞的促增殖作用评价
84.受试样品：制备例1-3制得的大麻多糖，测试方法如下：
85.将人原代皮肤角质细胞在含5％二氧化碳、37℃的培养条件下，利用人原代皮肤角质细胞专用的培养基进行常规培养。当细胞长到90％密度时，将细胞悬浮液密度调整至1
×
105个细胞/ml，将细胞接种于96孔板中(每孔100μl细胞悬液)，贴壁48h后，在各实验组的细胞悬液中加入不同浓度的受试样品处理24h，空白组的细胞悬液中不加受试样品。随后按照cck-8试剂盒说明书中操作，加入cck-8试剂孵育2h，在450nm处测量吸光度。
[0086][0087]
结果见表1：
[0088]
表1
[0089][0090][0091]
结果表明：制备例1-3制得的大麻多糖能够显著地增强人原代皮肤角质细胞活性，进而说明其具有显著促进人原代皮肤角质细胞增殖的效果，而且大麻多糖对人原代皮肤角
质细胞的增殖促进作用具有显著的浓度依赖性。
[0092]
测试例2
[0093]
大麻多糖对人原代皮肤成纤维细胞的促增殖作用评价
[0094]
受试样品：制备例1-3制得的大麻多糖，测试方法如下：
[0095]
将人原代皮肤成纤维细胞在含5％二氧化碳、37℃的培养条件下，利用sciencell公司的培养基进行常规培养。当细胞长到90％密度时，将其按照2
×
104个细胞/ml的密度接种于96孔板，贴壁48h后，在各实验组的细胞悬液中加入不同浓度的受试样品处理24h，空白组的细胞悬液中不加受试样品。随后按照cck-8试剂盒说明书中操作，加入cck-8试剂孵育2h，在450nm处测量吸光度。
[0096][0097]
结果见表2：
[0098]
表2
[0099]
[0100][0101]
结果表明：制备例1-3制得的大麻多糖能够显著地增强人原代皮肤成纤维细胞活性，进而说明其具有显著促进人原代皮肤成纤维细胞增殖的效果，而且大麻多糖对人原代皮肤成纤维细胞的增殖促进作用具有显著的浓度依赖性。
[0102]
测试例3
[0103]
大麻多糖及其组合物对人原代皮肤成纤维细胞的促迁移作用评价
[0104]
受试样品：制备例1的大麻多糖、制备例4-6的组合物、对比制备例1和2的单一组分、对比制备例3-5的组合物，测试方法如下：
[0105]
将人原代皮肤成纤维细胞在含5％二氧化碳、37℃的培养条件下用完全培养基进行常规培养，培养完成后将细胞悬浮液密度调整到1
×
105个/ml，接种于12孔细胞板中，贴壁48h后，用针头在细胞层上造出一条划痕，用pbs清洗细胞碎片，在各实验组的细胞悬液中加入受试样品使其在体系中的浓度为200μg/ml，对照组的细胞悬液中加入0.02μg/ml tgf-β作为阳性对照，空白组的细胞悬液中不加受试样品，24h后观察细胞层划痕的愈合情况。
[0106][0107]
表3
[0108]
组别愈合率(％)空白组45.13对照组62.29制备例166.21制备例469.21制备例569.46制备例669.79
对比制备例138.03对比制备例231.11对比制备例367.26对比制备例467.83对比制备例544.51
[0109]
结果表明：制备例1的大麻多糖、制备例4-6、对比制备例3和4的大麻多糖组合物具有显著促进人原代皮肤成纤维细胞迁移的效果，其中制备例4-6的大麻多糖组合物相较于制备例1的大麻多糖单一组分促人原代皮肤成纤维细胞迁移的效果更好。对比制备例1和2的单一组分、对比制备例5的组合物促人原代皮肤成纤维细胞迁移的效果较差。
[0110]
测试例4
[0111]
大麻多糖及其组合物对皮肤伤口愈合的促进作用评价
[0112]
取制备例1的大麻多糖20重量份、制备例4-6的大麻多糖组合物、对比制备例1的单一组分20重量份、对比制备例2的单一组分20重量份、对比制备例3-5的大麻多糖组合物作为受试样品，用无菌生理盐水溶解成1mg/ml受试样品溶液。对受试样品的促进皮肤伤口愈合的效果进行测试，测试方法如下：
[0113]
(1)小鼠模型：
[0114]
建立小鼠全层皮损创伤模型：采用5-6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。实验小鼠共40只，随机分为10组，第2-10组分别于创伤处涂抹等量的制备例1、4-6以及对比制备例1-5的受试样品溶液，第一组为对照组，于创伤处涂抹等量的无菌生理盐水，每天早晚各涂抹一次，连续涂抹10天，并于第0天和第10天在同一固定高度拍照记录伤口创面情况，计算伤口愈合率，公式如下：
[0115][0116]
结果列于表4。
[0117]
表4
[0118][0119][0120]
(2)人体试验：
[0121]
选取腿部或胳膊处皮肤有创伤，且伤口大小接近的社会志愿者100名，年龄20-30岁，随机分成10组，每组10人，第2-10组每人每天(早晚各一次)于伤患处涂覆等量的制备例1、4-6以及对比制备例1-5的受试样品溶液，第1组为对照组，于创伤处涂抹等量的无菌生理盐水，于试验一周后比较各组志愿者的伤口愈合情况(试验期间各组均不给予其他促进伤口愈合的药物或试剂)，结果列于表5。
[0122]
表5
[0123][0124][0125]
结果显示：制备例1的大麻多糖、制备例4-6、对比制备例3和4的大麻多糖组合物具有显著促进皮肤伤口愈合的效果，其中制备例4-6的大麻多糖组合物相较于制备例1的大麻多糖单一组分促进皮肤伤口愈合的效果更好。对比制备例1和2的单一组分、对比制备例5的组合物促进皮肤伤口愈合的效果较差。
[0126]
综上所述，首先，本发明创造性地发现大麻多糖能够显著地促进人原代皮肤角质细胞增殖、人皮肤成纤维细胞增殖以及人皮肤成纤维细胞迁移，进而发现其在促进皮肤损伤修复、促进皮肤创口愈合方面具有显著功效，拓宽了大麻多糖的应用领域，大大提升了工业大麻的经济价值。其次，本发明创造性地将大麻多糖、纤连蛋白与透明质酸钠进行组合形成一种全新的组合物，该组合物中的大麻多糖、纤连蛋白与透明质酸钠三者相互配合，在促进皮肤损伤修复、促进皮肤创口愈合方面具有协同增效功效，可用于制备促进皮肤损伤修复药物或护肤品。
[0127]
申请人声明，本发明通过上述制备例来说明本发明的大麻多糖及其组合物在制备促进皮肤损伤修复的药物或护肤品中的应用，但本发明并不局限于上述制备例，即不意味着本发明必须依赖上述制备例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0128]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0129]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可
能的组合方式不再另行说明。