戊醣片球菌GKP4用于制备改善肌少症之口服组成物的用途的制作方法

【】本发明是有关于一种乳酸菌用于制备改善肌少 症之用途，特别是关于一种戊醣片球菌gkp4用于制备 改善肌少症之口服组成物的用途。【先前技术】肌少症(sarcopenia)是一种持续且全身性骨骼 肌的肌肉量及肌肉功能流失，伴随患者活动力及生活质量 的下降，还会增加失能、跌倒的风险。其次，由于肌肉与 人体蛋白储存及/或血糖代谢有关，肌少症还会增加其他 慢性疾病(如：糖尿病)。肌少症还可细分成急性肌少症及慢性肌少症，其 中急性肌少症常见于急性疾病、急性损伤及/或年长的住 院患者上，这些患者因为肌肉失用(disuse)导致肌肉恒 定性失衡，使得肌肉合成量减少，但肌肉分解量增加。急 性肌少症不仅会使患者的术后发炎的风险增加、回复期及 /或住院期延长，还可能导致急性器官功能丧失、呼吸衰 竭及/或死亡。其次，急性肌少症还可能发展成慢性肌少 症，影响个体愈后的生活质量。肌少症的成因可分为原发性成因及次发性成因， 其中原发性成因包含老化造成的肌肉流失。次发性成因包 含疾病(例如：器官衰竭、恶性肿瘤、骨关节炎)、活动减 少(例如：久坐不动、疾病导致的活动障碍或残疾)及营养 失调(例如：营养摄取不足、营养吸收不良、厌食、营养 过剩及/或肥胖)。目前肌少症无法以药物控制，需靠运动、 控制慢性疾病、改善发炎症状及/或补充特定营养素来缓 解或改善肌少症。因此，亟需一种戊醣片球菌gkp4用于制备改 善肌少症之口服组成物的用途，以改善肌少症。

背景技术：

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、因此，本发明之一态样是提供一种戊醣片球菌 (pediococcus pentosaceus)gkp4用于制备改善肌 少症之口服组成物的用途，藉以缓解受试者之肌肉流失量。

2、本发明之另一态样是提供一种戊醣片球菌 gkp4用于制备改善肌少症之口服组成物的用途，其中口 服组成物可包含但不限于有效剂量之戊醣片球菌gkp4 做为有效成分，且戊醣片球菌gkp4对成人之有效剂量 可例如为240mg/60kg体重/天至4800mg/60kg 体重/天。

3、本发明之又一态样是提供一种戊醣片球菌 gkp4用于制备改善肌少症之口服组成物的用途，其中口 服组成物可包含但不限于有效剂量之戊醣片球菌gkp4 做为有效成分，且戊醣片球菌gkp4对小鼠之有效剂量 可例如为50mg/kg体重/天至1000mg/kg体重/天。

4、本发明之再一态样是提供一种戊醣片球菌 gkp4用于制备改善肌少症之口服组成物的用途，其中口 服组成物可包含但不限于有效剂量之戊醣片球菌gkp4 的冻干粉做为有效成分，以连续施用于肌少症受试者达至 少14天，藉以缓解肌少症受试者之肌肉流失量。

5、根据本发明之上述态样，提供一种戊醣片球菌 gkp4用于制备改善肌少症之口服组成物的用途，其中口 服组成物可包含但不限于有效剂量之戊醣片球菌gkp4 做为有效成分，以连续施用于受试者达一期间，藉以缓解 受试者之肌肉流失量。此戊醣片球菌gkp4系于2020 年11月6日保藏于日本国家技术评估学会专利微生物保 藏中心，保藏编号可例如为nite bp-03317。依据本 发明之一实施例，上述期间可例如为至少14天。

6、根据本发明之另一态样，口服组成物可包含但不 限于有效剂量之戊醣片球菌gkp4做为有效成分，其中 戊醣片球菌gkp4的保藏编号可例如为nite bp-03317，且戊醣片球菌gkp4对成人之有效剂量可 例如为240mg/60kg体重/天至4800mg/60kg体 重/天。依据本发明之一实施例，肌少症可例如为急性肌 少症。根据本发明之又一态样，口服组成物可包含但不限 于有效剂量之戊醣片球菌gkp4做为有效成分，其中戊 醣片球菌gkp4的保藏编号可例如为nite bp-03317， 且戊醣片球菌gkp4对小鼠之有效剂量可例如为50 mg/kg体重/天至1000mg/kg体重/天。依据本发明之 一实施例，肌少症可例如为急性肌少症。

7、根据本发明之再一态样，提供戊醣片球菌gkp4 用于制备改善肌少症之口服组成物的用途，其中口服组成 物可包含但不限于有效剂量之戊醣片球菌gkp4的冻干 粉做为有效成分，且戊醣片球菌gkp4的保藏编号可例 如为nite bp-03317，以连续施用于肌少症受试者达 至少14天，藉以缓解肌少症受试者之肌肉流失量。

8、依据本发明之一实施例，连续施用口服组成物增 加肌少症受试者之肌力。依据本发明之一实施例，施用口 服组成物增加肌少症受试者之肌耐力。

9、应用本发明之戊醣片球菌gkp4用于制备改善 肌少症之口服组成物的用途，其中含戊醣片球菌gkp4 之口服组成物施用于受试者后，可增加受试者的肌肉量、 肌力及/或肌耐力，因此可改善肌少症。

10、戊醣片球菌gkp4(亦称菌株gkp4)系于2020 年11月6日保藏于日本国家高级工业科学技术学院，国 际专利生物保藏中心(ipod，nite)，保藏单位地址： 日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室，邮政编 码：292-0818，且保藏编号为nite bp-03317。

11、【图式简单说明】

12、为让本发明之上述和其他目的、特征、优点与实 施例能更明显易懂，所附图式之详细说明如下：

13、[图1]是绘示根据本发明一实施例之不同组别之小鼠后 肢之比目鱼肌的相对重量之柱形图。

14、[图2]是绘示根据本发明一实施例之不同组别之小鼠后 肢之腓肠肌的相对重量之柱形图。

15、[图3]是绘示根据本发明一实施例之不同组别的小鼠之 握力的柱形图。

16、[图4]是绘示根据本发明一实施例之不同组别的小鼠之 电击次数的柱形图。

17、【实施方式】

18、本发明所提到的单数形式“一”、“一个”和“所述” 包含复数引用，除非上下文另有明确规定。数值范围(如 10％～11％的a)若无特定说明皆包含上、下限值(即10％ ≦a≦11％)；数值范围若未界定下限值(如低于0.2％的 b，或0.2％以下的b)，则皆指其下限值可能为0(即0％ ≦b≦0.2％)。上述用语是用以说明及理解本发明，而非 用以限制本发明。

19、如前所述，本发明提供一种戊醣片球菌 (pediococcus pentosaceus)gkp4用于制备改善肌 少症之口服组成物的用途，其中口服组成物可包含但不限 于有效剂量之戊醣片球菌gkp4做为有效成分，藉以缓 解受试者之肌肉流失量。

20、在一实施例中，戊醣片球菌gkp4(亦称菌株 gkp4)系于2020年11月6日保藏于日本国家技术评 估学会(national institute of technology and evaluation，nite)专利微生物保藏中心(patent microorganisms depositary，地址：日本千叶县木 更津市上总镰足2-5-8 122号室，邮政编码： 292-0818)，且保藏编号为nite bp-03317。

21、在一实施例中，口服组成物可例如包含戊醣片球 菌gkp4的冻干粉。在一实施例中，戊醣片球菌gkp4 的冻干粉可例如为对戊醣片球菌gkp4进行酦酵培养步 骤、固液分离步骤、干燥步骤及研磨步骤后获得。上述酦 酵培养步骤可例如为于35℃至45℃下培养戊醣片球菌 gkp4于培养液达15小时至24小时，其中培养液为市 售之mrs培养液，其ph值可例如为6.5±0.2。上述固 液分离步骤可例如以习知方法进行，如离心处理及/或过 滤步骤。上述干燥步骤可以习知之除水处理方法进行，例 如：冷冻干燥法、真空干燥法或喷雾干燥法。上述研磨步 骤可以习知之研磨方法进行，例如：机械力研磨法、滚筒 式研磨法及流动气体研磨法。

22、上述口服组成物的剂型并无特别限制，只要含有 戊醣片球菌gkp4即可。在一实施例中，口服组成物的 剂型可例如为水溶液、悬浮液、分散液、乳液(单相或多 相分散体系、单室或多室脂质体)、水胶、凝胶、固体脂 质奈米粒、锭剂、颗粒剂、粉剂及/或胶囊剂等。在一实 施例中，含有戊醣片球菌gkp4之口服组成物可选择性 包含食品或药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅助 剂及/或添加剂，可例如为溶剂、乳化剂、悬浮剂、崩解 剂、黏合剂、安定剂、螫合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、 润滑剂及/或吸收推迟剂等。

23、上述口服组成物之投药量及投药回数不限，使戊 醣片球菌gkp4达到有效剂量即可。在一实施例中，戊 醣片球菌gkp4对小鼠之有效剂量可例如为50mg/kg 体重/天至1000mg/kg体重/天。在一具体例中，戊醣 片球菌gkp4对小鼠之有效剂量为500mg/kg体重/天。 在一实施例中，戊醣片球菌gkp4对成人之有效剂量可 例如为240mg/60kg体重/天至4800mg/60kg体 重/天。如果有效剂量系在上述范围，则口服组成物之改 善肌少症的功效较佳。如果有效剂量系大于上述范围，则 在制造成本上升的情况下，改善肌少症的功效未再有显著 的提升。

24、关于小鼠及对成人的有效剂量的换算，请参阅2005年美国食品药物管理局所公告之实验初期估算方 法(estimating the maximum safe starting dose in initialclinical trials for therapeutics in adulthealthy volunteers)，其以人体每日每公斤体 重之建议摄取量(kg体重/天)的12.3倍为小鼠1倍剂量 换算。在一实施例中，口服组成物可例如连续施用于受试 者达至少14天后，如14天至30天，可改善肌少症。 在一实施例中，口服组成物每日的施用次数不限，可例如 为1日1次。

25、前述「肌少症」可参酌2018年欧盟肌少症工作 小组2(european working groupon sarcopenia in older people 2，ewgsop2)的定义，肌少症的 判断指标包含受试者之肌力(如：握力)、肌肉量(如：四 肢骨骼肌质量)及体能表现(如：400公尺步行试验)。当 受试者的肌肉量及体能表现符合标准但肌力系低于标准 时，判断受试者患有「可能肌少症(probable sarcopenia)」。当受试者之体能表现符合标准但肌力 及肌肉量系低于标准时，判断受试者患有「肌少症 (sarcopenia)」。当受试者之肌力、肌肉量及体能表现 系低于标准时，判断受试者患有「严重肌少症(severe sarcopenia)」。其次，根据ewgsop2定义，如果在 6个月内，受试者之肌力及/或肌肉量大幅下降，则判断 受试者罹患急性肌少症，反之为慢性肌少症。

26、经动物实验证实，小鼠后肢经石膏固定处理1周 后，小鼠后肢的比目鱼肌及腓肠肌之肌肉量及小鼠前肢的 握力显著下降，显示小鼠出现固定诱导 (immobilization-induced)的急性肌肉萎缩，可做 为急性肌少症的动物模型。其次，在跑步机试验中，经石膏固定处理的小鼠受到的电击次数上升，证明石膏固定处 理还会降低小鼠的肌耐力，使得小鼠的体能表现下降，可 做为严重肌少症的动物模型。

27、上述「改善肌少症」系指相对于未施用含戊醣片 球菌gkp4之口服组成物，受试者施用含戊醣片球菌 gkp4之口服组成物后，可缓解受试者之肌肉流失量。换 言之，受试者之肌肉量、肌力及肌耐力增加。经动物实验 证实，相较于未施用含戊醣片球菌gkp4之口服组成物 的经石膏固定处理的小鼠，施用含戊醣片球菌gkp4之 口服组成物的经石膏固定处理的小鼠后肢之比目鱼肌增 加20％至25％，腓肠肌增加5％至10％，前肢之握力增 加15％至20％，且在跑步机试验中，小鼠受到的电击次 数下降80％至85％，证明含戊醣片球菌gkp4之口服 组成物具有改善肌少症的功效。

28、以下利用数个实施例以说明本发明之应用，然其 并非用以限定本发明，本发明技术领域中具有通常知识者， 在不脱离本发明之精神和范围内，当可作各种之更动与润 饰。

29、实施例一、菌株来源及制备

30、本发明使用之菌株gkp4，其系分离自市售之天 然酦酵的酸辣椒腌渍物，其中分离的方法如下：自上述酸 辣椒腌渍物稀释并均质化，以获得均质液。接着，将均质 液接种manrogosa and sharp(mrs)培养液中，并 于37℃下培养16小时，以筛选出偏好生长于弱酸(ph为6.5±0.2)环境的菌种(包含乳酸菌)，从而获得乳酸菌 培养液。然后，乳酸菌培养液系稀释并分别涂布于5种固 态培养基[包含：mrs培养基琼脂、双歧杆菌培养基(bifidobacterium iodoacetate medium-25， bim-25)琼脂、含马铃薯淀粉及酵母萃取物的琼脂、溴 甲酚绿mrs培养基琼脂及溴甲酚紫mrs培养基琼脂] 上，经37℃的培养40小时后，可获得多个分离的菌落， 且其中之一为菌株gkp4。

31、纯化出菌株gkp4之dna并进行基因定序，以 获得菌株gkp4之16s rrna基因的核酸片段序列，其 系如序列识别号(seq id no)：1所示。经序列比对后， 鉴定菌株gkp4为戊醣片球菌。dna的纯化、基因定序 及序列比对系利用习知方式进行，且不影响后续菌株 gkp4之改善肌少症的功效之评估，不再赘述。

32、戊醣片球菌菌株gkp4系于2020年11月6日 保藏在日本国家技术评估学会(national institute of technology and evaluation，nite)专利微生物保 藏中心(patent microorganisms depositary)，且 保藏编号为nitebp-03317。

33、将菌株gkp4接种至mrs培养液中，并于 37℃下进行酦酵步骤达16小时，以获得酦酵物。然后， 将上述酦酵物以10000rpm的转速进行离心，以获得菌 泥。接下来，混合菌泥及20重量百分比(wt％)的脱脂奶 粉，再进行冷冻干燥，以获得gkp4冻干粉。冷冻干燥 系使用习知方式进行，且不影响后续评估，不再赘述。 实施例二、建立肌肉萎缩动物模型

34、利用c57bl/6小鼠(以下简称为小鼠)建立肌 肉萎缩动物模型，其中小鼠的年龄为4周龄，且体重是 24g至26g。本试验遵照动物伦理委员会3r(替代、 减量、精致化)原则。小鼠是饲养于动物房中，其中动物 房的温度是控制在22℃±2℃，湿度是控制在55％至65％，且控制每日7时至19时为光照期，19时至隔日 7时为黑暗期。

35、首先，小鼠是饲养于动物房达1周，以使小鼠适 应动物房的环境、握力计(品名：grip strength meter， gsm；货号：cat.no.47200；制造商：ugo basile， 杰莫尼奥，意大利)及跑步机(品名：小动物跑步机；货号： cat.no.47300；制造商：ugobasile)。接着，将 小鼠随机分为3组：实验组、对照组及空白组，每组各5 只小鼠。

36、对实验组及对照组的小鼠进行石膏固定处理达7 天，以诱导肌肉萎缩。接着，拆下石膏，使实验组及对照 组的小鼠可自由活动达7天。空白组的小鼠则可自由活动 达14天。在石膏固定处理及自由活动的期间(共14天)， 每天管喂实验组的小鼠gkp4口服组成物，其中gkp4 口服组成物系含有gkp4冻干粉之水溶液。值得注意的 是，gkp4口服组成物的浓度系经适当调整，以管喂实验 组的小鼠500mg/kg体重/天的gkp4冻干粉，但控制 gkp4口服组成物之体积上限为10ml/kg体重/天。

37、然后，使用握力计及跑步机进行握力试验及跑步 机试验，以评估小鼠的肌力及肌耐力。接下来，牺牲小鼠， 以测量小鼠的体重及小鼠后肢之比目鱼肌及腓肠肌的重 量，从而评估小鼠的肌肉量。

38、实施例三、评估gkp4口服组成物对小鼠的肌肉量之影 响

39、计算小鼠后肢之比目鱼肌的重量对小鼠体重的 比值，以获得比目鱼肌的相对重量。图1是绘示根据本发 明一实施例之不同组别之小鼠后肢之比目鱼肌的相对重 量之柱形图，其中横轴为不同组别，且纵轴为比目鱼肌的 相对重量(单位：mg/g体重)。如图1所示，对照组的小 鼠后肢之比目鱼肌的相对重量系低于空白组之小鼠，证明 石膏固定处理可模拟固定诱导的肌肉萎缩。然而，实验组 的小鼠后肢之比目鱼肌的相对重量比对照组高0.06mg(相当于增加23％)，证明经石膏固定处理的小鼠之肌 肉量可在连续施用gkp4口服组成物后增加。

40、其次，计算小鼠后肢之腓肠肌的重量对小鼠体重 的比值，以获得腓肠肌的相对重量。图2是绘示根据本发 明一实施例之不同组别之小鼠后肢之腓肠肌的相对重量 之柱形图，其中横轴为不同组别，纵轴为腓肠肌的相对重 量(单位：mg/g体重)，且图号「*」表示经学生t检定 后，与对照组相比具有统计上的显著差异(p<0.05)。如 图2所示，对照组的小鼠后肢之腓肠肌的相对重量系低于 空白组之小鼠，证明石膏固定处理可模拟固定诱导的肌肉 萎缩。然而，实验组的小鼠后肢之腓肠肌的相对重量系显 著地高于对照组的小鼠(增加0.35mg，相当于增加7％)， 证明经石膏固定处理的小鼠的肌肉量可在连续施用 gkp4口服组成物后增加。

41、实施例四、评估gkp4口服组成物对小鼠的肌力之影响

42、利用上述握力计进行握力试验，以测量小鼠前肢 之握力。操作方法如下：使小鼠前肢握住拉环，并以手抓 住小鼠尾巴末端后，再沿着水平方向后拉，直到小鼠松开 前肢。连续测量握力三次，取最大值进行统计。

43、图3是绘示根据本发明一实施例之不同组别的 小鼠之握力的柱形图，其中横轴表示组别，纵轴表示握力 (单位：克力，gram-force，gf)，且图号「*」表示经 学生t检定后，具有统计上的显著差异(p<0.05)。如图3所示，相对于空白组，对照组的小鼠之握力下降，证明石膏固定处理可模拟固定诱导的肌肉萎缩。然而，实验组 的小鼠之握力系显著高于对照组(增加16.8gf，相当于 增加17％)，证明经石膏固定处理的小鼠的肌力可在连续 施用gkp4口服组成物后增加。

44、实施例五、评估gkp4口服组成物对小鼠的肌耐力之影 响

45、利用跑步机试验测量小鼠之肌耐力。操作方法如 下：将小鼠置于跑步机上，其中此跑步机的输送带是向上 倾斜，且输送带是以18m/分钟至20m/分钟之速率往 下输送。其次，跑步机之底部安装电击感应装置，当小鼠 碰到电击感应装置时，电击感应装置会给予小鼠电击。一 般而言，小鼠会往上爬，以避免遭受电击，但如果小鼠的 肌耐力不足，小鼠会无法克服输送带的速度而被输送到跑 步机底部，从而受到电击。

46、图4是绘示根据本发明一实施例之不同组别的 小鼠之电击次数的柱形图，其中横轴表示组别，纵轴表示 电击次数，且图号「*」表示经学生t检定后，与对照组 相比具有统计上的显著差异(p<0.05)。如图3所示，对 照组的小鼠受到的电击次数上升系高于空白组的小鼠，证 明石膏固定处理可导致肌耐力下降。然而，实验组的小鼠 受到的电击次数系显著低于对照组的小鼠(下降453次， 相当于下降82.5％)，证明经石膏固定处理的小鼠之肌耐力可在连续施用gkp4口服组成物后增加。

47、如上所示，经石膏固定处理之小鼠的比目鱼肌及 /或腓肠肌的相对重量下降(图1及图2)，握力下降(图 3)，且在跑步机试验中，此小鼠受到的电击次数上升(图 4)。然而，相较于未施用gkp4口服组成物的经石膏固 定处理之小鼠，施用gkp4口服组成物的经石膏固定处 理之小鼠之比目鱼肌及/或腓肠肌的对相对重量较高(图 1及图2)，握力较高(图3)，且在跑步机试验中，小鼠 受到的电击次数下降(图4)。上述结果证实gkp4口服 组成物可缓解固定诱导的肌肉萎缩之肌肉流失量，证明 gkp4口服组成物具有改善肌少症之功效，其中此肌少症 可为急性肌少症。

48、综言之，上述特定的剂型、特定的制程、特定的 剂量、特定的施用方式、特定的动物模型及特定的评估方 法仅用于例示说明本发明的戊醣片球菌gkp4用于制备 改善肌少症之口服组成物的用途。然而，本发明所属技术 领域中具有通常知识者应可理解，在不脱离本发明的精神 及范围内，其他的剂型、其他的制程、其他的剂量、其他 的施用方式、其他的动物模型及其他的评估方法亦可用于 说明本发明的戊醣片球菌gkp4用于制备改善肌少症之 口服组成物的用途，并不限于上述。举例而言，在不影响 戊醣片球菌gkp4的改善肌少症之功效的前提下，可使 用其他的剂型、其他的制程、其他的剂量、其他的施用方 式、其他的动物模型及其他的评估方法。

49、虽然本发明已以数个特定实施例揭露如上，但可 对前述揭露内容进行各种润饰、各种更动及替换，而且应 可理解的是，在不脱离本发明之精神和范围内，某些情况 将采用本发明实施例之某些特征但不对应使用其他特征。 因此，本发明的精神和权利要求范围不应限于以上例示实 施例所述。

50、序列表

51、<110> 葡萄王生技股份有限公司

52、<120> 戊醣片球菌gkp4用于制备改善肌少症之口服组成物的用途

53、<130> 无

54、<160> 1

55、<210> 1

56、<211> 1071

57、<212> dna

58、<213> 戊醣片球菌(pediococcus pentosaceus)gkp4的16srrna的dna片段

59、<400> 1

60、gccggtgggg acgcgctata catgcaagtc gaacgaactt ccgttaattg attatgacgt 60

61、acttgtactg attgagattt taacacgaag tgagtggcga acgggtgagt aacacgtggg 120

62、taacctgccc agaagtaggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg tataacagag 180

63、aaaaccgcat ggttttcttt taaaagatgg ctctgctatc acttctggat ggacccgcgg 240

64、cgtattagct agttggtgag gtaaaggctc accaaggcag tgatacgtag ccgacctgag 300

65、agggtaatcg gccacattgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 360

66、gggaatcttc cacaatggac gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt 420

67、ttcggctcgt aaagctctgt tgttaaagaa gaacgtgggt aagagtaact gtttacccag 480

68、tgacggtatt taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540

69、ggtggcaagc gttatccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt cttttaagtc 600

70、taatgtgaaa gccttcggct caaccgaaga agtgcattgg aaactgggag acttgagtgc 660

71、agaagaggac agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac 720

72、cagtggcgaa ggcggctgtc tggtctgcaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc 780

73、gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgattactaa gtgttggagg 840

74、gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagtaat ccgcctgggg agtacgaccg 900

75、caaggttgaa actcaaaaga attgacgggg gcccgcacaa gcgtggagca tgtggtttaa 960

76、ttcgaagcta cgcgagactt accagtcttg acatctctga cagtctagag atagagttcc 1020

77、cttcgggacg atgacagtgt gcatgatgtc 1050