特异性结合至非天然存在的修饰的Fc受体的人非天然存在的修饰的IgG的Fc区的制作方法

背景技术：

技术实现思路

1、本发明涉及包含修饰的fc区的多肽和特异性结合该多肽的修饰的fcγ受体，其可用作免疫治疗。本发明的一个目的是提供一种内源性分子不会降低其药效的免疫治疗。

2、本发明是基于(至少部分基于)非天然存在的fcγ受体突变体和非天然存在的fc区的发现，所述fcγ受体突变体不结合内源性免疫球蛋白，所述非天然存在的fc区突变体不结合内源性fcγ受体，其组合以特异性地结合非天然存在的fcγ受体突变体和非天然存在的fc区突变体作为免疫治疗用于治疗对象的用途，以及制备这些组合的方法。例如，本发明人在计算机上提取影响cd16a和抗体的fc区之间结合活性的氨基酸位点，制备在cd16a和抗体的fc区中引入了突变的突变体，并评估对野生型结合活性的改变，发现对野生型结合活性有所降低(实施例1-4)。基于该发现，本发明人鉴定了非天然存在的fc区突变体，所述非天然存在的fc区突变体对野生型cd16a没有表现出结合活性，但对非天然存在的突变的cd16a保持高结合活性。本发明人还鉴定了不结合野生型cd16a的非天然存在的修饰的fc区和不结合野生型抗体fc区的非天然存在的突变的cd16a的组合。由于使用针对不同抗原的多种抗体获得了相似的结果，还确定了这些特征不依赖于抗原(实施例5-8)。本发明人还建立了表达野生型cd16a或非天然存在的突变的cd16a的自然杀伤(nk)细胞系，并确认了抗体依赖性细胞毒性(adcc)反映了结合活性，如实施例6(实施例10、11)所证。此外，本发明人证实了存在过量igg1抗体的情况下实施例6中的结合活性特征(实施例9)。

3、本发明提供了预期在医学和工业中使用的作为组合物和方法的以下方面。

4、一方面，本发明提供了包含修饰的igg的fc区的多肽，其中所述修饰的fc区是非天然存在的，与野生型或天然存在的igg的fc区相比包含至少一个氨基酸突变；该多肽基本上不具有对野生型或天然存在的fcγ受体的结合活性，能够结合至与野生型或天然存在的fcγ受体相比包含至少一个氨基酸突变的非天然存在的fcγ受体。

5、在一些实施方式中，野生型或天然存在的fcγ受体是野生型或天然存在的cd16a，所述包含至少一个氨基酸突变的非天然存在的fcγ受体是包含至少一种氨基酸突变的非天然存在的cd16a。

6、在一些实施方式中，野生型或天然存在的cd16a包括seq id no:78所示的氨基酸序列。

7、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包含选自下组的至少一个突变：(i)对应于seq id no:78中第131位的位置处赖氨酸突变为天冬氨酸(k131d突变)，(ii)对应于seq id no:78中第128位的位置处赖氨酸突变为谷氨酸(k128e突变)，和(iii)对应于seq id no:78中第131位的位置处赖氨酸突变为谷氨酸(k131e突变)。

8、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包含k131d突变和k128e突变之一或两者都有。在其他实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包含k131e突变和k128e突变之一或两者都有。在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包含k131d突变，还包括选自下组的至少一个突变：(iv)对应于seq id no:78中第38位的位置处天冬酰胺突变为谷氨酰胺(n38q突变)和(v)对应于seq id no:78中第74位的位置处天冬酰胺突变为谷氨酰胺(n74q突变)。在其他实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包括seq id no:80、seq id no:82、seq id no:84、seq id no:86或seq id no:88所示的氨基酸序列。

9、在一些实施方式中，多肽包括人igγ1的修饰的fc区，所述修饰的fc区包括(i)对应于根据eu索引标号第269位的位置处谷氨酸突变为精氨酸(e269r突变)和(ii)选自下组的至少一个突变：(a)对应于根据eu索引标号第294位的位置处谷氨酸突变为精氨酸(e294r突变)和(b)对应于根据eu索引标号第294位的位置处谷氨酸突变为赖氨酸(e294k突变)。

10、在一些实施方式中，多肽是抗体。在其他实施方式中，多肽是结合至癌症抗原的抗体。

11、在另一方面，本发明提供了使用免疫治疗以治疗或预防患者的疾病或病症的方法。该方法包括给予患者如本文所述的多肽和细胞，其中所述细胞表达非天然存在的fcγ受体，所述非天然存在的fcγ受体与野生型或天然存在的fcγ受体相比包含至少一个氨基酸突变，其中所述多肽能够结合至所述的包含至少一个氨基酸突变的非天然存在的fcγ受体。

12、在一些实施方式中，细胞是人免疫细胞。在其他实施方式中，人免疫细胞是选自下组的细胞：t细胞、巨噬细胞、树突细胞、nkt-细胞、nk细胞、小胶质细胞、破骨细胞、粒细胞、单核细胞和先天免疫细胞。在一些实施方式中，细胞来源于干细胞。在其他实施方式中，干细胞选自多潜能干细胞、造血干细胞、成人干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、产后干细胞、多能干细胞和胚胎生殖细胞。在一些实施方式中，干细胞是多潜能干细胞。在其他实施方式中，多潜能干细胞是诱导多潜能干细胞(ips细胞)或胚胎干细胞(es细胞)。

13、在一些实施方式中，细胞包括β-2微球蛋白(b2m)基因中遗传工程改造的破坏。

14、在一些实施方式中，所述细胞还包含能够编码单链融合人白细胞抗原(hla)i类蛋白的多核苷酸，所述单链融合人白细胞抗原(hla)i类蛋白包含直接或通过接头序列共价连接hla-1α链至少一部分的b2m蛋白的至少一部分。在一些实施方式中，所述hla-1α链选自hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。

15、在一些实施方式中，细胞包括人白细胞抗原(hla)ii类相关基因中遗传工程改造的破坏。在一些实施方式中，hla ii类相关基因选自：含调节因子x-相关锚蛋白的蛋白(rfxank)、调节因子5(rfx5)、调节因子x相关蛋白(rfxap)、ii类反式激活子(ciita)、hla-dpa(α链)、hla-dpb(β链)、hla-dqa、hla-dqb、hla-dra、hla-drb、hla-dma、hla-dmb、hla-doa和hla-dob。

16、在一些实施方式中，细胞包含一种或多种编码单链融合hla ii类蛋白的多核苷酸或hla ii类蛋白。

17、在一些实施方式中，该方法是用于治疗或预防癌症的方法。

18、在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文所述的多肽和药学上可接受的赋形剂。

19、在一些实施方式中，药物组合物与细胞用于免疫疗法的组合用途，其中所述细胞表达非天然存在的fcγ受体，所述非天然存在的fcγ受体与野生型或天然存在的fcγ受体相比包含至少一个氨基酸突变，其中所述多肽能够结合至包含至少一个氨基酸突变的非天然存在的fcγ受体。

20、在一些实施方式中，细胞是人免疫细胞。在一些实施方式中，人免疫细胞是选自下组的细胞：t细胞、巨噬细胞、树突细胞、nkt-细胞、nk细胞、小胶质细胞、破骨细胞、粒细胞、单核细胞和先天免疫细胞。在一些实施方式中，细胞来源于干细胞。在一些实施方式中，干细胞选自多潜能干细胞、造血干细胞、成人干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、产后干细胞、多能干细胞和胚胎生殖细胞。在一些实施方式中，干细胞是多潜能干细胞。在一些实施方式中，多潜能干细胞是诱导多潜能干细胞(ips细胞)或胚胎干细胞(es细胞)。

21、在一些实施方式中，细胞包括β-2微球蛋白(b2m)基因中遗传工程改造的破坏。

22、在一些实施方式中，所述细胞还包含能够编码单链融合人白细胞抗原(hla)i类蛋白的多核苷酸，所述单链融合人白细胞抗原(hla)i类蛋白包含直接或通过接头序列共价连接hla-1α链至少一部分的b2m蛋白的至少一部分。在一些实施方式中，所述hla-1α链选自hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。

23、在一些实施方式中，细胞包括人白细胞抗原(hla)ii类相关基因中遗传工程改造的破坏。在一些实施方式中，hla ii类相关基因选自：含调节因子x-相关锚蛋白的蛋白(rfxank)、调节因子5(rfx5)、调节因子x相关蛋白(rfxap)、ii类反式激活子(ciita)、hla-dpa(α链)、hla-dpb(β链)、hla-dqa、hla-dqb、hla-dra、hla-drb、hla-dma、hla-dmb、hla-doa和hla-dob。

24、在一些实施方式中，细胞包含一种或多种编码单链融合hla ii类蛋白的多核苷酸或hla ii类蛋白。

25、在另一方面，本发明提供了用于采用免疫治疗来治疗或预防患者的疾病或病症的试剂盒。该试剂盒包括(i)如本文所述的多肽和(ii)细胞，其中所述细胞表达非天然存在的fcγ受体，所述非天然存在的fcγ受体与野生型或天然存在的fcγ受体相比包含至少一个氨基酸突变，其中所述多肽能够结合至所述的包含至少一个氨基酸突变的非天然存在的fcγ受体。

26、在一些实施方式中，细胞是人免疫细胞。在一些实施方式中，人免疫细胞是选自下组的细胞：t细胞、巨噬细胞、树突细胞、nkt-细胞、nk细胞、小胶质细胞、破骨细胞、粒细胞、单核细胞和先天免疫细胞。在一些实施方式中，细胞来源于干细胞。在一些实施方式中，干细胞选自多潜能干细胞、造血干细胞、成人干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、产后干细胞、多能干细胞和胚胎生殖细胞。在一些实施方式中，干细胞是多潜能干细胞。在一些实施方式中，多潜能干细胞是诱导多潜能干细胞(ips细胞)或胚胎干细胞(es细胞)。

27、在一些实施方式中，细胞包括β-2微球蛋白(b2m)基因中遗传工程改造的破坏。

28、在一些实施方式中，所述细胞还包含能够编码单链融合人白细胞抗原(hla)i类蛋白的多核苷酸，所述单链融合人白细胞抗原(hla)i类蛋白包含直接或通过接头序列共价连接hla-1α链至少一部分的b2m蛋白的至少一部分。在一些实施方式中，所述hla-1α链选自hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。

29、在一些实施方式中，细胞包括人白细胞抗原(hla)ii类相关基因中遗传工程改造的破坏。在一些实施方式中，hla ii类相关基因选自：含调节因子x-相关锚蛋白的蛋白(rfxank)、调节因子5(rfx5)、调节因子x相关蛋白(rfxap)、ii类反式激活子(ciita)、hla-dpa(α链)、hla-dpb(β链)、hla-dqa、hla-dqb、hla-dra、hla-drb、hla-dma、hla-dmb、hla-doa和hla-dob。

30、在一些实施方式中，细胞包含一种或多种编码单链融合hla ii类蛋白的多核苷酸或hla ii类蛋白。

31、一方面，本发明提供一种表达非天然存在的cd16a的细胞，所述非天然存在cd16a与野生型或天然存在的cd16a相比包含至少一个氨基酸突变，其中所述至少一个氨基酸突变选自：(i)对应于seq id no:78中第131位的位置处赖氨酸突变为天冬氨酸(k131d突变)，(ii)对应于seq id no:78中第128位的位置处赖氨酸突变为谷氨酸(k128e突变)，和(iii)对应于seq id no:78中第131位的位置处赖氨酸突变为谷氨酸(k131e突变)，其中所述非天然存在cd16a包括与seq id no:78具有90％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

32、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包含k131d突变和k128e突变之一或两者都有。

33、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包含k131e突变和k128e突变之一或两者都有。

34、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包含k131d突变，还包括选自下组的至少一个突变：(iv)对应于seq id no:78中第38位的位置处天冬酰胺突变为谷氨酰胺(n38q突变)和(v)对应于seq id no:78中第74位的位置处天冬酰胺突变为谷氨酰胺(n74q突变)。

35、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包括seq id no:80、seq idno:82、seq id no:84、seq id no:86或seq id no:88所示的氨基酸序列。

36、在一些实施方式中，细胞是人免疫细胞。在一些实施方式中，人免疫细胞是选自下组的细胞：t细胞、巨噬细胞、树突细胞、nkt-细胞、nk细胞、小胶质细胞、破骨细胞、粒细胞、单核细胞和先天免疫细胞。在一些实施方式中，细胞来源于干细胞。在一些实施方式中，干细胞选自多潜能干细胞、造血干细胞、成人干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、产后干细胞、多能干细胞和胚胎生殖细胞。在一些实施方式中，干细胞是多潜能干细胞。在一些实施方式中，多潜能干细胞是诱导多潜能干细胞(ips细胞)或胚胎干细胞(es细胞)。

37、在一些实施方式中，细胞包括β-2微球蛋白(b2m)基因中遗传工程改造的破坏。

38、在一些实施方式中，所述细胞还包含能够编码单链融合人白细胞抗原(hla)i类蛋白的多核苷酸，所述单链融合人白细胞抗原(hla)i类蛋白包含直接或通过接头序列共价连接hla-1α链至少一部分的b2m蛋白的至少一部分。在一些实施方式中，所述hla-1α链选自hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。

39、在一些实施方式中，细胞包括人白细胞抗原(hla)ii类相关基因中遗传工程改造的破坏。在一些实施方式中，hla ii类相关基因选自：含调节因子x-相关锚蛋白的蛋白(rfxank)、调节因子5(rfx5)、调节因子x相关蛋白(rfxap)、ii类反式激活子(ciita)、hla-dpa(α链)、hla-dpb(β链)、hla-dqa、hla-dqb、hla-dra、hla-drb、hla-dma、hla-dmb、hla-doa和hla-dob。

40、在一些实施方式中，细胞包含一种或多种编码单链融合hla ii类蛋白的多核苷酸或hla ii类蛋白。

41、在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的细胞和药学上可接受的赋形剂。

42、在一些实施方式中，药物组合物是用于与包含修饰的igg的fc区的多肽用于免疫疗法的组合用途，其中所述修饰的fc区是非天然存在的，与野生型或天然存在的igg的fc区相比包含至少一个氨基酸突变，所述多肽基本上不具有与野生型或天然存在的cd16a的结合活性，而能够与所述细胞表达的包含至少一个氨基酸突变的非天然存在的cd16a结合。

43、在一些实施方式中，多肽包括人igγ1的修饰的fc区，所述修饰的fc区包括(i)对应于根据eu索引标号第269位的位置处谷氨酸突变为精氨酸(e269r突变)和(ii)选自下组的至少一个突变：(a)对应于根据eu索引标号第294位的位置处谷氨酸突变为精氨酸(e294r突变)和(b)对应于根据eu索引标号第294位的位置处谷氨酸突变为赖氨酸(e294k突变)。

44、在一些实施方式中，多肽是抗体。在一些实施方式中，多肽是结合至癌症抗原的抗体。

45、在一些实施方式中，药物组合物用于治疗癌症。

46、在一方面，本发明提供了用于制备包含修饰的igg的fc区的多肽的方法。该方法包括以下步骤：1)提供包含修饰的igg的fc区的多肽，其中所述修饰的fc区是非天然存在的，与野生型或天然存在的igg相比包含至少一个氨基酸突变；2)测量1)中获得的所述多肽对野生型或天然存在的fcγ受体的结合活性；3)测量1)中获得的所述多肽对非天然存在的fcγ受体的结合活性，所述非天然存在的fcγ受体与野生型或天然存在的fcγ受体相比包含至少一个氨基酸突变；和4)从1)中获得的所述多肽中选择一种多肽，所述多肽基本上不具有对野生型或天然存在的fcγ受体的结合活性，而是结合至包含至少一个氨基酸突变的非天然存在的fcγ受体。

47、在一些实施方式中，其中所述野生型或天然存在的fcγ受体是野生型或天然存在的cd16a，所述包含至少一个氨基酸突变的非天然存在的fcγ受体是包含至少一种氨基酸突变的非天然存在的cd16a。

48、在一些实施方式中，野生型或天然存在的cd16a包括seq id no:78所示的氨基酸序列。

49、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的非天然存在的cd16a包含选自下组的至少一个突变：(i)对应于seq id no:78中第131位的位置处赖氨酸突变为天冬氨酸(k131d突变)，(ii)对应于seq id no:78中第128位的位置处赖氨酸突变为谷氨酸(k128e突变)，和(iii)对应于seq id no:78中第131位的位置处赖氨酸突变为谷氨酸(k131e突变)。

50、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包含k131d突变和k128e突变之一或两者都有。

51、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包含k131e突变和k128e突变之一或两者都有。

52、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的cd16a包含k131d突变，还包括选自下组的至少一个突变：(iv)对应于seq id no:78中第38位的位置处天冬酰胺突变为谷氨酰胺(n38q突变)和(v)对应于seq id no:78中第74位的位置处天冬酰胺突变为谷氨酰胺(n74q突变)。

53、在一些实施方式中，包含修饰的igg的fc区的非天然存在的多肽是抗体。在一些实施方式中，抗体是结合至癌症抗原的抗体。

54、在一些实施方式中，包含修饰的igg的fc区的多肽是抗体，所述方法还包括使所述抗体与免疫细胞和细胞接触的步骤，所述免疫细胞表达含有至少一个氨基酸突变的非天然存在的fcγ受体，所述细胞表达所述抗体所结合的抗原，以及测量抗体依赖性细胞毒性(adcc)活性的步骤。

55、在另一方面，本发明提供一种制备非天然存在的fcγ受体的方法。该方法包括以下步骤：1)提供非天然存在的fcγ受体，所述非天然存在的fcγ受体与野生型或天然存在的fcγ受体相比包含至少一个氨基酸突变；2)提供包含野生型或天然存在的igg的fc区的多肽，和包含与野生型或天然存在的igg相比含有至少一个氨基酸突变的igg的fc区的多肽；3)测量1)中获得的非天然存在的fcγ受体对包含野生型或天然存在的igg的fc区的多肽的结合活性；4)测量1)中获得的非天然存在的fcγ受体对包含含有至少一个氨基酸突变的igg的fc区的多肽的结合活性；和5)从1)中获得的非天然存在的fcγ受体中选择一种非天然存在的fcγ受体，这种非天然存在的fcγ受体对包含野生型或天然存在的igg的fc区的多肽基本上不具有结合活性，而是结合含有至少一个氨基酸突变的igg的fc区的多肽。

56、在一些实施方式中，fcγ受体是cd16a。

57、在一些实施方式中，野生型或天然存在的fcγ受体是包含seq id no:78所示的氨基酸序列的cd16a。

58、在一些实施方式中，包含至少一个氨基酸突变的igg的fc区是与野生型或天然存在的igγ1相比包含至少一个氨基酸突变的人igγ1的fc区，其包括(a)对应于根据eu索引标号第269位的位置处谷氨酸突变为精氨酸(e269r突变)和(b)选自下组的至少一个突变：(i)对应于根据eu索引标号第294位的位置处谷氨酸突变为精氨酸(e294r突变)和(ii)对应于根据eu索引标号第294位的位置处谷氨酸突变为赖氨酸(e294k突变)。

59、在一些实施方式中，包含含有至少一个氨基酸突变的igg的fc区的多肽是抗体。在一些实施方式中，抗体是结合至癌症抗原的抗体。

60、在一些实施方式中，包含含有至少一个氨基酸突变的igg的fc区的多肽是抗体，所述方法还包括使所述抗体与免疫细胞和细胞接触的步骤，所述抗体包含2)中获得的含有至少一个氨基酸突变的igg的fc区，所述免疫细胞表达1)中获得的含有至少一个氨基酸突变的fcγ受体，所述细胞表达所述抗体所结合的抗原，以及测量抗体依赖性细胞毒性(adcc)活性的步骤。

61、另一方面，本发明提供了一种制备结合对的方法，所述结合对包括(a)包含修饰的igg的fc区的多肽和(b)非天然存在的修饰的fcγ受体。该方法包括以下步骤：1)提供包含野生型或天然存在的igg的fc区的多肽，和包含修饰的igg的fc区的多肽，其中所述修饰的fc区是非天然存在的，与野生型或天然存在的igg的fc区相比含有至少一个氨基酸突变；2)提供野生型或天然存在的fcγ受体和非天然存在的修饰的fcγ受体，与野生型或天然存在的fcγ受体相比，其中所述修饰的fcγ受体包含至少一个氨基酸突变；3)测量2)中获取的各fcγ受体对1)中获取的各多肽的结合活性；和4)选择(a)含有修饰的fc区的多肽，所述多肽结合至修饰的fcγ受体，并且对野生型或天然存在的fcγ受体基本不具有结合活性，和(b)修饰的fcγ受体，其结合至含有修饰的fc区的多肽，而不结合至野生型或天然存在的igg的fc区。

62、在一些实施方式中，fcγ受体是cd16a。

63、在一些实施方式中，野生型或天然存在的cd16a包含seq id no:78所示的氨基酸序列。

64、在一些实施方式中，包含修饰的igg的fc的多肽是抗体。在一些实施方式中，抗体是结合至癌症抗原的抗体。

65、在一些实施方式中，4)中选择的包含修饰的igg的fc区的多肽是抗体，所述方法还包括使所述抗体与免疫细胞和细胞接触的步骤，所述免疫细胞表达4)中选择的修饰的fcγ受体，所述细胞表达所述抗体所结合的抗原，以及测量抗体依赖性细胞毒性(adcc)活性的步骤。

66、预计本发明能够提供表现出特异性结合模式的诱变的fcγ受体和诱变的fc区的组合，以及使用这些组合的内源性分子不会降低其药效的免疫治疗。