皮质抑素14在制备银屑病治疗药物中的应用

皮质抑素14在制备银屑病治疗药物中的应用
1.本技术是2020年3月30日提交的申请号为2020102340200，发明名称为：皮质抑素14在制备自身免疫炎性疾病治疗药物中的应用的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及医学领域，具体涉及皮质抑素14在制备自身免疫炎性疾病治疗药物中的应用。


背景技术：

3.目前，银屑病等自身免疫炎性疾病在临床上多见，患者一般需要长期药物治疗，其中tnf-α拮抗药物是目前最为常用且治疗效果确切的一类药物[1]，在全世界范围内广泛应用。临床使用的tnf-α拮抗药物来自生物工程制药，相关药物种类少，患者选择余地小，而且相关药物合成费用较高，给需要长期应用的患者造成经济负担。同时，目前使用的tnf-α拮抗药物有其自身潜在副作用，且有不同程度增加感染等风险的可能性，而tnf-α细胞表面抗体tnfr，也作为主要结合位点之一进行深入研究和探索，比如目前临床常用的依那西普就是直接结合tnfr从而抑制炎性疾病进程[2]。目前使用的此类药物多为生物制剂[3]，造价较高，且存在感染等潜在风险，在一定程度上影响使用。
[0004]
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[0005]
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[0006]
3.moulis,g.,pugnet,g.,costedoat-chalumeau,n.,mathian,a.,leroux,g.,boutemy,j.,espitia,o.,bouillet,l.,berthier,s.,gaultier,j.b.,jeandel,p.y.,konate,a.,mekinian,a.,solau-gervais,e.,terrier,b.,wendling,d.,andry,f.,garnier,c.,cathebras,p.,arnaud,l.,palmaro,a.,cacoub,p.,amoura,z.,piette,j.c.,arlet,p.,lapeyre-mestre,m.&sailler,l.(2018)efficacy and safety of biologics in relapsing polychondritis:a french national multicentre study,annals of the rheumatic diseases.77,1172-1178.


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供一种肿瘤坏死因子拮抗剂皮质抑素14在制备自身免疫炎性疾病治疗药物中的应用，皮质抑素14作为一种tnf-α拮抗药物，具有减轻炎性反应，改善银屑病等炎性疾病病情的作用，体外实验未显示皮质抑素14有增加肿瘤等风险，而且药物长期使用是安全的。
[0008]
本发明的技术方案是：
[0009]
皮质抑素14(cortistatin14，简写为cst-14)，cas:186901-48-4。其分子量21kd。
[0010]
cst-14的氨基酸序列为：
[0011]
pro-cys-lys-asn-phe-phe-trp-lys-thr-phe-ser-ser-cys-lys(disulfide bridge:cys2-cys13)，制备简单，这也是其相较于其他肿瘤坏死因子拮抗药物的优势所在。同时，目前对于其合成纯度，已经达到99.5％以上，纯度符合药物制备要求。
[0012]
本发明提供肿瘤坏死因子拮抗剂皮质抑素14在制备自身免疫炎性疾病治疗药物中的应用，尤其的，其作为肿瘤坏死因子拮抗剂，拮抗tnf-α功能实现。
[0013]
具体的，尤其是在制备银屑病治疗药物中的应用。
[0014]
还包括制备类风湿性关节炎及骨关节炎药物中的应用。
[0015]
以及可预测的，在治疗红斑狼疮上的应用。
[0016]
本发明所述药物还包括药学上可接受的载体、助剂或稀释剂。
[0017]
所述药物的形式选自如下之一：喷雾、气溶胶、溶液、洗液、凝胶、软膏、糊剂、乳剂和悬浮液。
[0018]
优选的，所述药物的形式选自如下之一：乳膏、油膏。
[0019]
对于软膏，所述软膏包含选自下述的试剂：硬脂酸、硬脂醇、鲸蜡醇、甘油、水、及其混合物，并且，所述药物具有生理学上可接受的ph。
[0020]
对于乳膏，所述乳膏包含选自下述的试剂：硬脂酸、硬脂醇、鲸蜡醇、甘油、水、及其混合物，并且，所述药物具有生理学上可接受的ph。
[0021]
所述药物优选注射剂型，给药模式优选纳米颗粒介导局部给药。
[0022]
另外，皮质抑素-17属于皮质抑素在动物和人体内的另一种存在形式，有研究显示皮质抑素-14与皮质抑素-17在功能上有相似处，因此皮质抑素-17未来在自身免疫性疾病中也有开发应用的可能。
[0023]
通过体外结合实验及体内动物模型实验，分子间相互作用实验结果表明，皮质抑素14(cst-14)可以直接结合肿瘤坏死因子tnf-α细胞表面受体，拮抗tnf-α功能，并在银屑病等自身免疫炎性疾病中发挥保护性作用。cst-14属于新型tnf-α拮抗药物,可通过现有技术直接合成，从而降低成本。另外，动物模型中，cst-14的长期应用未见明显毒副作用，可用于银屑病，红斑狼疮、类风湿性关节炎及骨关节炎等领域。
附图说明
[0024]
图1是皮质抑素14在小鼠皮炎中的直观治疗效果图
[0025]
图2是皮质抑素14对小鼠皮炎治疗效果的银屑病评分
[0026]
图3是co-ip测定的皮质抑素14与肿瘤坏死因子结合能力
[0027]
图4是固相结合实验测定皮质抑素14与肿瘤坏死因子受体tnfr1及tnfr2的结合能力
[0028]
图5是皮质抑素14对动物模型中巨噬细胞极化过程的影响图
[0029]
图6是组织学实验检测皮质抑素14减轻小鼠皮炎模型表皮增殖和炎性细胞浸润的作用。
[0030]
图7系统性红斑狼疮动物实验mrl/lpr基因敲除小鼠模型直观对比
[0031]
图8系统性红斑狼疮动物实验mrl/lpr基因敲除小鼠模型脾脏体积对比
[0032]
图9系统性红斑狼疮动物实验mrl/lpr基因敲除小鼠模型体重对比
[0033]
图10骨肉瘤hos细胞细胞划痕实验
[0034]
图11骨肉瘤hos细胞细胞划痕实验统计学分析
[0035]
图12edu实验
具体实施方式
[0036]
以下实施例中涉及的实验动物、试剂、培养基和缓冲液的来源：
[0037]
皮质抑素14(纯度98.4％，cas:186901-48-4,其氨基酸序列为pro-cys-lys-asn-phe-phe-trp-lys-thr-phe-ser-ser-cys-lys(disulfide bridge:cys2-cys13))(吉尔生化有限公司)
[0038]
bl6/c57雄性小鼠，(山东大学动物中心)
[0039]
pbs缓冲液，(碧云天生物试剂公司)
[0040]
f4/80抗体，cd86抗体，cd206抗体(thermo fisher，pierce)
[0041]
ripa细胞蛋白质提取裂解液(thermo fisher，pierce)
[0042]
蛋白酶抑制剂(北京索莱宝科技有限公司)
[0043]
bca蛋白定量试剂盒(上海炎熙生物科技有限公司)
[0044]
complete edta-free(罗氏生物医药)
[0045]
二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)
[0046]
中性树胶(上海泰坦科技股份有限公司)
[0047]
浓盐酸(国药集团化学试剂有限公司)
[0048]
伊红(上海泰坦科技股份有限公司)
[0049]
苏木素(上海泰坦科技股份有限公司)
[0050]
甲醇(国药集团化学试剂有限公司)
[0051]
柠檬酸盐缓冲液(0.01m，ph＝6.0)(生工生物工程上海股份有限公司)
[0052]
10％ngs(生工生物工程上海股份有限公司)
[0053]
过氧化氢(h2o2)(国药集团化学试剂有限公司)
[0054]
bsa(生工生物工程上海股份有限公司)
[0055]
无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)
[0056]
细胞计数仪购自美国thermo fisher公司
[0057]
显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司
[0058]
离心机购自济南欧莱博医疗器械有限公司
[0059]
电子天平购自济南欧莱博医疗器械有限公司
[0060]
酶联免疫检测仪(酶标仪)购自北京美华仪科技有限公司
[0061]
流式细胞仪购自bd公司
[0062]
制冰机购自济南欧莱博医疗器械有限公司
[0063]
超纯水系统购自济南欧莱博医疗器械有限公司
[0064]
涡旋混合器购自济南欧莱博医疗器械有限公司
[0065]
biocare 3000购自ge health care
[0066]
1.皮肤炎症小鼠模型构建
[0067]
在10周龄野生型bl6/c57雄性小鼠中建立咪喹莫特(imiquimod)诱导的皮肤炎症小鼠模型(共42只)。首先，用剃刀和脱毛膏剃掉所有小鼠的背部皮肤。空白组的野生型小鼠(14只)每天在剃毛的背部皮肤上涂上凡士林乳膏，并腹膜内注射无菌pbs缓冲液。然后实验治疗组的野生型小鼠(14只)每天在剃毛的背部皮肤上涂上62.5mg5％咪喹莫特乳膏，并腹膜内注射外源性皮质抑素14(1μg/200μl)1周。皮肤炎症组的野生型小鼠(14只)每天在剃毛的背部皮肤上涂上62.5mg5％咪喹莫特乳膏，并腹膜内注射等量无菌pbs缓冲液。基于银屑病样皮肤区域严重性指数，使用如先前报道的临床评分进行区分皮肤炎症严重性的评估。简而言之，红斑，鳞屑和增厚的评分为0至4(0：无；1：轻微；2：中度；3：显着；4：严重)。显示这三个参数的累积分数(比例：0-12)以评估皮肤炎症的严重程度。两名实验员采用双盲法互不影响，单独进行评分。1周后，将所有组的小鼠用过量的10％水合氯醛(中国山东大学齐鲁医院)安乐死，收集背部皮肤标本用于后续试验。
[0068]
图1及图2为本实验的结果图，通过直观照片及银屑病评分显示小鼠的银屑病皮炎在皮质抑素14治疗下有明显的缓解。
[0069]
2.流式细胞仪分析巨噬细胞
[0070]
为了测定巨噬细胞亚群，将来自咪喹莫特诱导的皮肤炎症小鼠模型中的小鼠皮肤样品研磨成单细胞悬液，用200目筛网过滤后用于流式细胞技术染色。简而言之，将荧光缀合的抗体(抗f4/80，抗cd86，抗cd206)加入到单细胞悬浮液(100μl)中。在温和混合后，将样品在4℃下孵育20分钟，然后使用流式细胞仪分析。通过分析阳性细胞的百分比和阳性信号的强度来确定巨噬细胞亚群分析。流式细胞仪参数设置：fitc通过fitc通道(fl-1)检测，激发波长488nm，发射波长530nm；pi通过fl-2通道检测，激发波长488nm,发射波长630nm。
[0071]
图5即通过流式细胞技术显示，皮质抑素14通过调控巨噬细胞向具有抗炎功能的m2亚型极化，从而在皮炎中具有良好的治疗作用。
[0072]
3.组织切片制备
[0073]
将来自所有组的小鼠皮肤固定在10％福尔马林中，至少在室温下固定72小时。50％乙醇(60分钟)、70％乙醇(60分钟)、85％乙醇(60分钟)、95％乙醇(60分钟)、100％乙醇(30分钟)、100％乙醇(30分钟)依次进行组织脱水；经过乙醇和二甲苯(60分钟)、二甲苯(60分钟)依次处理；然后用二甲苯和石蜡(60分钟)，石蜡(80分钟)透明；将组织放入盒中，用石蜡填充，然后将其放在石蜡包埋机的冷台上。将嵌入的组织石蜡块置于切片机上并切片，组织厚度约4μm；将含有组织的石蜡片轻轻涂抹在42℃的水中。完全展平后，用干净的玻璃片轻轻拨起切片；将切片放在载玻片上，编号，并在68℃的烤箱中烘烤至少6小时。
[0074]
4.苏木精/伊红染色
[0075]
切片常规脂溶性溶剂脱蜡至水(二甲苯两次，15分钟/每次；100％酒精5分钟；95％酒精5分钟；75％酒精5分钟；50％酒精5分钟)，然后使用苏木精染色液染色5分钟，用清水冲洗干净后，继续使用伊红染色液染色5分钟，清水冲洗干净后脱水(50％酒精5分钟；75％酒精5分钟；95％酒精5分钟；100％酒精5分钟；二甲苯两次，15分钟/每次)，后等切片晾干后使用中性树胶封片，放在光学显微镜下观察和分析。
[0076]
5.免疫组织化学染色
[0077]
组织切片脱蜡并水合。即连续二甲苯8分钟、二甲苯8分钟、二甲苯8分钟、无水乙醇8分钟、无水乙醇8分钟、95％乙醇8分钟、80％乙醇8分钟和75％乙醇8分钟。在70％乙醇8分
钟后，将切片用水冲洗4次，每次5分钟；接下来，将脱蜡和水合的切片置于3％过氧化氢溶液中并在37℃下反应20分钟以阻断内源性过氧化物酶。每次用双蒸水洗涤4次，每次5分钟，修复抗原。将柠檬酸盐缓冲液置于金属加热器中并煮沸。煮沸15分钟，关闭电源并保持15分钟。自然冷却至室温；然后每次洗涤pbs 5次，每次5分钟，擦拭周围组织，加入5％山羊血清，阻断非特异性抗原，在室温下反应1小时，然后将cd68抗体逐滴添加至组织切片，并在4℃下在湿盒中孵育过夜；第二天，取出切片，在37℃培养箱中孵育1小时，用pbs冲洗5次，每15分钟，加入增强的辣根过氧化物酶偶联二抗，室温孵育2小时。用pbs清洗多余的二抗(5次，每次5分钟)；滴加新鲜制备的dab着色溶液，在光学显微镜下观察，并呈现棕黄色，并用pbs洗涤以停止显色；接下来，进行苏木精复染。将有色切片置修饰的苏木精染色中并染色5分钟。在光学显微镜下观察染色。然后用0.2％盐酸分离切片，并用流水冲洗切片。最后，切片通过70％酒精10分钟、75％酒精8分钟、80％酒精8分钟、90％酒精8分钟、无水乙醇8分钟、无水乙醇8分钟、二甲苯8分钟和二甲苯8分钟依次浸洗。脱水2分钟后，擦拭组织周围的组织并擦拭，滴加中性凝胶，将盖玻片置于光学显微镜下观察。
[0078]
图6为上述4和5实验的结果图，图a显示he染色结果，显示皮质抑素14治疗对于巨噬细胞等炎性细胞在皮肤的浸润具有极好的缓解作用。
[0079]
图b为免疫组织化学染色，使用cd68免疫组化是巨噬细胞的标记分子，明确皮质抑素-14改善银屑病模型炎性细胞浸润的功能。
[0080]
6.co-ip及蛋白质印记检测
[0081]
取出180μl ripa裂解液，加入10ul蛋白酶抑制剂和10ul磷酸酶抑制剂，制备为200ul组织裂解液。然后将从-80℃冰箱中取出的冷冻软骨细胞样品置于ep管中，加入制备的组织裂解液，将ep管置于已用液氮预冷却的均化器中进行匀浆；设置均质化时间和数量。在细胞完全均质化后，取出ep管，以12000rpm离心，在15℃下离心15分钟，并将上清液转移到新的1.5ml ep管中。留取20ul左右细胞裂解的上清液加2xloading buffer煮5min，作为input组。提前将琼脂糖凝珠(s beads)均分至新的ep管内，要使用剪去了尖头的枪头吸取beads，且保证每管里的beads量一致，小心吸去上清液，加入a蛋白的抗体和细胞裂解后的上清液。1mg蛋白裂解液加入25ul悬浮液包括1:1的s beads与2ug a蛋白抗体。4℃摇床孵化2-4h，binding结束，1400r x 1min,4℃离心。真空泵或移液枪吸去上清，注意不要吸到沉淀，加入800ul netn，上下颠倒混匀，保证底部的沉淀悬浮起来，离心，洗beads三次最后一次弃去上清，用点样枪头将残液吸净，加15ul 2xloading buffer煮5min，作为co-ip组点样，剩下的沉淀再次加入10ul 2x loading buffer煮一次，作为ip组点样。
[0082]
将电泳槽放在电泳装置上并打开电源，正极和负极都装好。将电压调节至约150v以保持恒定电压。当溴酚蓝标签移动到凝胶底部时，关闭电源并将跑胶缓冲液倒回瓶中。准备1000ml转膜缓冲液并在4℃下预冷；将2片厚滤纸(约8
×
10cm大小)和硝酸纤维素膜在电泳前30分钟浸泡，将海绵夹浸入转移缓冲液中；将玻璃板浸入转移液中，用塑料铲小心地取出玻璃板，从玻璃上取下凝胶，除去所有的浓缩胶和不必要的分离胶；按海绵-滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序组装转膜夹层；将转移夹放入转移槽中以确保转移夹的凝胶侧朝向阴极，同时膜的侧面朝向阳极，向转移槽添加适量的缓冲液至确保转移夹完全浸入水中，放入冰盒中；将黑色电极引线插入转膜装置的阴极插座，红色电极引线插入阳极插座，将阳极和阴极引线连接到相应的电源输出；将转膜装置置于冰上，打开电源，将仪器转
移条件设定为恒流240ma，薄膜转移时间为90min；转膜完成后，将其从转膜装置中取出转移至盒子里，压板小心地打开用镊子转移pvdf膜层，取出硝酸纤维素pvdf膜，在膜附近的右上方切一个角作为标记。封闭和抗体孵育：取出转移的硝酸纤维素膜，用tbst冲洗1分钟，洗去膜上残留的转移溶液，然后将其面朝上放入5％脱脂奶粉封闭液中。在摇床上室温下，封闭1小时，将膜切成一定大小，准备一抗孵育。一抗孵育：将一抗进行稀释，将膜浸泡在适量稀释的一抗中，并在4℃下放入冰箱中过夜(8～12h)。洗涤一抗：取出膜并用tbst在振荡器上洗涤，5分钟
×
3次。二抗孵育：山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗用浓度为1：10000的二抗稀释液制备。将膜浸入适量稀释的二抗中并在室温下温育1小时。洗涤二抗：取出膜后，在摇床上用tbst洗涤5分钟
×
3次。显影：取相同量的超敏ecl化学发光试剂盒，与液体a和液体b充分混合，避开光线，然后将硝酸纤维素膜置于黑色薄膜上，正面朝上，室温下用移液管取适量的显色混合液施加到薄膜上以便在凝胶成像系统中显影和成像。
[0083]
图3表明，软骨细胞中，皮质抑素-14可与细胞表面肿瘤坏死因子受体tnfr1及tnfr2组成复合体，因此，皮质抑素-14与tnfr1及tnfr2存在结合。
[0084]
图3、图4是皮质抑素14与肿瘤坏死因子受体tnfr1及tnfr2直接结合的结果图。图3通过co-ip测定的皮质抑素14与肿瘤坏死因子受体通过抗体检测结合，图4中a-b是通过固相结合实验测定，皮质抑素14与肿瘤坏死因子受体具有直接结合能力。
[0085]
通过上述实验，证实cst-14能够直接结合tnf-α的细胞表面受体tnfr，并且对于imiquimod诱导的银屑病动物模型有确切疗效，并有效促使巨噬细胞向m2抗炎亚型转化。同时，皮质抑素-14是一种多肽分子，其分子量21kd,明显小于前期类似制剂(依那西普，英夫利昔单抗，阿达木单抗等)，相比而言可减少单次使用剂量。
[0086]
7.动物实验
[0087]
动物实验显示，该分子长期使用(小鼠实验超过3个月)并未见明显脏器损害及小鼠行为变化。
[0088]
另外，对于另一种常见的自身免疫炎性疾病—红斑狼疮也进行了小鼠实验。图7、8、9系统性红斑狼疮动物实验mrl/lpr基因敲除小鼠模型显示，cst治疗对于小鼠狼疮发生有缓解作用，且皮质抑素-14治疗3个月后小鼠体重无明显变化。
[0089]
图7中，显示系统性红斑狼疮面部斑片状脱毛及皮损明显减轻，图8中显示无治疗组脾大，皮质抑素-14治疗组明显减小。图9显示两组体重无明显差异。
[0090]
同时，前期体外细胞数据显示皮质抑素-14刺激肿瘤细胞未产生明显迁移增殖迹象。图10中，骨肉瘤hos细胞细胞划痕实验；图11，划痕的统计学分析，皮质抑素-14未明显促进迁移；图12.edu实验，相较于对照组，皮质抑素-14刺激未明显刺激hos细胞增殖。
[0091]
上述两项试验均为本领域常用公知试验操作，在此不再赘述。
[0092]
所有数据均以至少三次独立实验的平均数士标准差表示。对于两组数据的统计学分析采用配对t检验多于两组数据的统计学分析采用单因素方差分析。
[0093]
更为重要的是，cst-14制备简单，制备方法纯熟，可直接合成，而前期同类药物均为生物制剂，因此cst-14较其他同类别tnf-α抑制剂可明显降低成本，从而降低患者经济负担。
[0094]
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进
等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。