一种评估抗体与多肽芯片结合特征的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种评估抗体与多肽芯片结合特征的方法。

背景技术：

1、抗体分子是通过与抗原相结合来发挥生物学功能的。通常认为抗体与特定抗原的结合是高度特异性的。然而存在以下机制导致抗体的结合具有广谱性或特异性降低：1)抗原蛋白发生突变产生相似序列。例如抗体s309能结合到相似的病毒sars-cov-1和sars-cov-2的spike蛋白(pinto,d.,et al.,cross-neutralization of sars-cov-2by a humanmonoclonal sars-cov antibody.nature,2020.583(7815):p.290-295.)，且能结合到sars-cov-2的多种突变株上(vanblargan,l.a.,et al.,an infectious sars-cov-2b.1.1.529omicron virus escapes neutralization by therapeutic monoclonalantibodies.nature medicine,2022.28(3):p.490-495.)。这种能够包容更多突变的广谱性结合是抗体药筛选的重要考量(min,l.and q.sun,antibodies and vaccines targetrbd of sars-cov-2.frontiers in molecular biosciences,2021.8.)。2)分子模拟(molecular mimicry)。即另一种蛋白上的局部序列(线性或空间)能够模拟抗体特定抗原上的表位区域序列，从而造成抗体能够与该蛋白相结合。这种现象被认为与多种自身免疫性疾病的发生发展有关(cusick,m.f.,j.e.libbey and r.s.fujinami,molecularmimicry as a mechanism of autoimmune disease.clinical reviews in allergy&immunology,2012.42(1):p.102-111.)，也应该是抗体药筛选和使用所极力回避的对象。因此确定一个抗体结合最少需要多少个氨基酸，抗体能结合到什么样的氨基酸组合，对于筛选广谱中和抗体和研究抗体的脱靶效应具有重要价值。

2、在现有技术中，能够精细地研究抗体结合特性，鉴定抗体表位的技术有展示系统和短肽芯片。展示系统中，展示载体可以是细菌载体，如staphylococcal display vector(pscem1)或噬菌体如phorf等。ph.d-12噬菌体展示系统将编码12个氨基酸随机肽的dna序列整合到m13噬菌体的衣壳蛋白上，该文库理论上有约109个转化序列。virscan则将编码56个氨基酸的dna序列整合到t7细菌噬菌体展示系统，这两种思路均被用于尝试鉴定线性和空间表位。在cd20抗体rituximab的噬菌体展示研究发现7条序列，能展示这些序列的噬菌体能够与该抗体结合。这7条序列中的5条具有类似的序列构成，均包含有wp.wle(li,m.,etal.,mimotope vaccination for epitope-specific induction of anti-cd20antibodies.cellular immunology,2006.239(2):p.136-143.)。但更多噬菌体展示研究获得少许12mer短肽并没有类似的特征或肽数量更少，且考虑到实际库容与理论库容的差异未知(qi,h.,et al.,antibody binding epitope mapping(abmap)of hundredantibodies in a single run.mol cell proteomics,2021.20:p.100059.)，该技术并不适合用来评估抗体的结合特性。短肽芯片与抗体的结合体现出强而稳定的序列一致性(richer,j.,s.a.johnston and p.stafford,epitope identification from fixed-complexity random-sequence peptide microarrays.molecular&cellular proteomics,2015.14(1):p.136-147.)。从线性表位抗体的研究来看，具有最强信号的短肽多富含与表位一致的氨基酸。为了体现这种一致性，常采用的方式是生成motif，作为对强信号短肽的序列一致性展示。该motif代表所有可能与抗体结合的序列所应该具备的特征。但仍然有多个问题尚未解决：1)空间表位的抗体能否与短肽芯片结合，并获得其结合特征？2)最少需要多少氨基酸就可以发生结合？3)motif中各个位置的各种氨基酸可以随机组合即可与抗体相结合吗？

3、多肽芯片是研究抗体结合特性的合适方式，为了解决上述问题，本公开用包含3百万条短肽的芯片与17个商业抗体结合，这些抗体已知具有线性和/或空间表位，且有已发表的抗原-抗体复合物的解析结构。首先尝试评估抗体与多肽芯片的结合效果，考虑到芯片上多肽数量的限制和多肽长度的限制，需要先行评估多肽芯片是否能够与抗体有效结合；然后从能与抗体结合的多肽的氨基酸构成来推测主要参与结合的氨基酸子序列，包括子序列的长度、氨基酸构成和相对的结合强度。用氨基酸子序列构成的抗体结合谱来替代以motif来表述的抗体结合特征。这些信息将有助于线性和空间表位的鉴定和分类，也会有助于分析抗体结合的广谱性和抗体脱靶结合的风险评估，同时可能应用于指导空间表位线性模拟肽的设计、筛选和修饰。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺陷，本公开提供了基于多肽芯片生成关键氨基酸标识序列从而评估抗体与多肽芯片结合特征的方法，旨在用于评估抗原-抗体的结合特性，为进一步研究线性和空间表位的鉴定和分类、分析抗体结合的广谱性和抗体脱靶结合的风险评估，以及应用于指导空间表位线性模拟肽的设计、筛选和修饰提供可能性。

2、一方面，本公开提供了一种评估抗体与多肽芯片结合特征的方法，包括：

3、确定多肽芯片中与待测抗体结合产生信号的关键氨基酸标识序列集合；

4、基于关键氨基酸标识序列集合，确定描述抗体与多肽芯片结合特征的指标；

5、基于指标对抗体与多肽芯片的结合特征进行评估。

6、其中，确定多肽芯片中与待测抗体结合产生信号的关键氨基酸标识序列集合，包括：

7、获取多肽芯片中与待测抗体结合产生信号的氨基酸标识序列集合；

8、基于氨基酸标识序列集合生成关键氨基酸标识序列集合。

9、其中，基于氨基酸标识序列集合生成关键氨基酸标识序列集合，包括：

10、根据氨基酸标识序列集合生成氨基酸标识子序列集合；

11、筛选氨基酸标识子序列集合并获得结合氨基酸标识序列集合；以及

12、筛选结合氨基酸标识序列集合并获得关键氨基酸标识序列集合。

13、其中，确定描述抗体与多肽芯片结合特征的指标，包括：

14、统计所有与多肽芯片结合产生信号的信号短肽的数量，该数量为抗体结合度指标；

15、统计所有与多肽芯片结合产生强信号的强信号短肽的数量，该数量为抗体结合强度指标；

16、计算多肽芯片的表位可鉴定度指标，包括：

17、遍历多肽芯片中的各信号短肽，筛选出对应有关键氨基酸标识序列集合的信号短肽，并筛选出第一信号强度值最大的信号短肽，获取信号短肽对应的第一信号强度值；

18、遍历关键氨基酸标识序列集合中包含预设氨基酸标识个数的各关键氨基酸标识序列，筛选出第二信号强度值最大的关键氨基酸标识序列，获取关键氨基酸标识序列对应的第二信号强度值；

19、计算关键氨基酸标识序列对应的第二信号强度值除以信号短肽对应的第一信号强度值的比值，该比值为表位可鉴定度指标；

20、计算多肽芯片与待测抗体结合后的线性区数量指标，包括：

21、确定关键氨基酸标识序列集合中各关键氨基酸标识序列在待测抗体对应的靶向抗原的线性序列中的位置；

22、基于各关键氨基酸标识序列的位置，确定线性区，线性区对应的各氨基酸标识序列所生成的各氨基酸标识子序列集合中均包含关键氨基酸标识序列，其中，关键氨基酸标识序列包含的氨基酸标识个数在预设范围内；

23、统计线性区的数量，该数量为线性区数量指标；

24、计算多肽芯片与待测抗体结合后的线性结合度指标，包括：

25、筛选出关键氨基酸标识序列集合中的包含预设氨基酸标识个数的关键氨基酸标识序列中，各关键氨基酸标识序列具有的最大的第二信号强度值；

26、将关键氨基酸标识序列集合中的包含预设氨基酸标识个数的各关键氨基酸标识序列与线性区对应的氨基酸标识序列进行比对，生成比对上线性区的关键氨基酸标识序列集合；

27、筛选出比对上线性区的关键氨基酸标识序列集合中的包含预设氨基酸标识个数的各关键氨基酸标识序列中，各比对上线性区的关键氨基酸标识序列具有的最大的第二信号强度值；

28、计算比对上线性区的关键氨基酸标识序列具有的最大的第二信号强度值除以关键氨基酸标识序列具有的最大的第二信号强度值的比值，该比值为线性结合度指标；

29、计算抗原-抗体结合的线性度指标，包括：

30、合并氨基酸标识构成相同的关键氨基酸标识序列，生成合并子序列集合，关键氨基酸标识序列包含预设氨基酸标识个数，氨基酸标识构成相同的关键氨基酸标识序列为原始子序列；

31、确定合并子序列集合中各合并子序列对应的原始子序列中，第二信号强度值最高的原始子序列是否可比对上线性区对应的氨基酸标识序列；

32、若是，合并子序列为可比对上线性区的合并子序列；

33、计算合并子序列集合中可比对上线性区的合并子序列的数量除以所有合并子序列的数量的比值，该比值为抗原-抗体结合的线性度指标；

34、统计关键氨基酸标识序列集合中，包含预设氨基酸标识个数的关键氨基酸标识序列的数量，该数量为关键结合序列数量指标。

35、其中，基于指标对抗体与多肽芯片的结合特征进行评估，包括：

36、确定待测抗体与多肽芯片结合后对应的指标是否符合以下条件组中的全部条件：

37、(1)待测抗体与多肽芯片结合后对应的抗体结合度指标大于等于预设值；

38、(2)待测抗体与多肽芯片结合后对应的抗体结合强度指标大于等于预设值；

39、(3)待测抗体与多肽芯片结合后对应的关键结合序列数量指标大于预设值；

40、若是，待测抗体与多肽芯片的结合好；

41、若否，待测抗体与多肽芯片的结合差。

42、响应于待测抗体与多肽芯片的结合好，确定待测抗体与多肽芯片结合后对应的线性结合度指标是否小于预设值；

43、若是，则生成用于指示待测抗体结合的靶向抗原上的表位主要为空间抗原表位区的指示信息。

44、响应于待测抗体与多肽芯片结合后对应的线性结合度指标小于预设值，确定待测抗体与多肽芯片结合后对应的线性区数量指标是否大于预设值；

45、若是，则生成用于指示待测抗体结合的靶向抗原上的表位同时包含空间抗原表位区和线性抗原表位区的指示信息。

46、响应于待测抗体与多肽芯片的结合好，确定待测抗体与多肽芯片结合后对应的线性结合度指标是否等于预设值；

47、若是，则生成用于指示待测抗体结合的靶向抗原上的表位主要为线性抗原表位区的指示信息。

48、确定待测抗体与多肽芯片结合后对应的抗原-抗体结合的线性度指标是否等于预设值；

49、若是，生成用于指示氨基酸线性顺序对线性抗原表位区约束性强的指示信息。