负载至少两个不同核酸的细胞外囊泡的制作方法

背景技术：

1、核酸疗法代表了能够在基因水平上进行治疗干预的新模式。其包括但不限于短rna(如反义寡核苷酸(asos)、短干扰rna(sirna)和微小rna(mirna))，长rna(如信使rna(mrna))，或甚至双链dna(dsdna)。这些模式通常被认为是疾病修饰的，因为它们抑制或促进疾病相关蛋白的产生。随着crispr-cas9、锌指核酸酶(zfn)和转录激活因子样效应物核酸酶(talens)等基因组编辑工具的发现，现在可以在基因组水平上根本性地纠正疾病。然而，核酸作为下一代药物的临床开发受到了阻碍，主要是由于其不能穿透细胞膜、具有免疫原性以及易受到循环中核酸酶影响，导致其在递送方面受到限制。

2、目前，大多数核酸治疗都涉及单一靶点，例如已批准的药物，如帕蒂西兰(patisiran)(针对遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性的sirna)、奈-沃瑞替近(voretigene neparvovec)(针对leber先天性黑蒙症的aav基因疗法)、或辉瑞-biontechcovid19 mrna疫苗。然而，有几种治疗应用受益于两种或多种基因产物的递送。一个此类例子是载体化抗体或抗体基因治疗的概念，其中，在涉及递送编码抗体的重链和轻链的两个转基因的基因治疗之后，抗体从患者的器官(如肝脏)内源性产生。另一个例子是基因组编辑，其需要有效的载体来共同递送其多种成分。具体而言，crispr-cas9系统介导的基因插入需要cas9的转录物和向导rna，以及同源性定向修复的dna模板。引物编辑涉及共同递送编码与工程化逆转录酶融合的spcas9核酸内切酶的转录物以及引物编辑向导rna(pegrna)。

3、两种最先进且被广泛探索的递送载体是腺相关病毒(aav)和脂质纳米颗粒(lnp)。aav是一种小型(20nm)复制缺陷病毒，能够感染分裂细胞和静止细胞。这些病毒被积极用于基因治疗用途，因为与相同剂量的其他病毒相比，它们不会引起疾病，引发的免疫反应也相对温和。然而，其受限于较小的转基因容量(4.5kb)，并且由于再给药时产生适应性免疫反应而无法再给药。lnp是下一类递送载体，其向肝细胞和树突状细胞递送rna的能力已得到临床验证。然而，lnp在循环中相对不稳定，向肝细胞以外的组织进行全身性核酸递送仍然具有高度挑战性。

4、细胞外囊泡(ev)是介导细胞间生物分子的转移的细胞来源的脂质膜结合囊泡。ev具有生物相容性，并具有独特的天然嗜性，并且，由于其来源于细胞细胞，它们几乎没有毒性或免疫原性的威胁。我们之前已经证明，红细胞ev(rbcev)可以用外源性地负载多种有效载荷，包括aso、mrna和dna(例如，参见pct/sg2021/050020，其内容完全并入本文)。

5、鉴于以上考虑而设计了本发明。

技术实现思路

0、概述

1、本文提供了负载有负荷物的细胞外囊泡，其中所述负荷物包括至少两个不同的核酸分子。在一些情况下，所述负荷物包括至少三个不同的核酸分子。

2、所述核酸分子可以选自下组：dna质粒、rna质粒、环状dna、线性双链dna、dna微环、哑铃形dna最小载体、rna微环、小干扰rna(sirna)、信使rna(mrna)、向导rna(grna)、引物编辑向导rna(peg rna)、crispr rna(crrna)，反式激活crispr rna(tracrrna)、环状rna、微小rna(mirna)、初级mirna(pri-mirna)、前体mirna(pre-mirna)、piwi相互作用rna(pirna)、转移rna(trna)、长非编码rna(lncrna)、反义寡核苷酸(aso)、短发夹rna(shrna)、小激活rna(sarna)、小核rna(snorna)、缺口聚物(gapmer)、锁核酸(lna)、肽核酸(pna)和表达载体。

3、所述至少两个不同的核酸分子或至少三个不同的核酸分子可以具有不相同的序列。同时或替代地，所述至少两个不同的核酸分子或至少三个不同的氨基酸可以是不同类型的核酸分子。例如，所述负荷物可以包括至少两个不同的分子，其中所述至少两个不同的分子中每一个均独立地选自下组：小干扰rna(sirna)、信使rna(mrna)、向导rna(grna)、引物编辑向导rna(peg rna)、crispr rna(crrna)，反式激活crispr rna(tracrrna)、环状rna、微小rna(mirna)、初级mirna(pri-mirna)、前体mirna(pre-mirna)、piwi相互作用rna(pirna)、转移rna(trna)、长非编码rna(lncrna)、反义寡核苷酸(aso)、短发夹rna(shrna)、小激活rna(sarna)、小核rna(snorna)、缺口聚物(gapmer)、锁核酸(lna)、肽核酸(pna)、表达载体、dna质粒、环状dna、线性双链dna、rna质粒、dna微环、哑铃形dna最小载体和rna微环。优选地，所述至少两个不同的核酸分子或至少三个不同的核酸分子包含编码cas酶和grna的mrna或dna质粒。grna优选为pegrna或sgrna。在一些情况下，所述负荷物可以包括dna和rna、至少两个不相同的分子、至少两个不同的mrna、质粒和grna、或者mrna和grna。在一些情况下，所述至少两个不同的核酸分子包括质粒(例如dna质粒)和反义寡核苷酸。在一些情况下，所述至少两个不同的核酸分子包括质粒(例如dna质粒)和sirna。

4、在某些方面，所述细胞外囊泡包括crispr/cas基因编辑系统的一组分。在一些方面，所述细胞外囊泡包含crispr/cas基因编辑系统的至少两个或至少三个组分。例如，所述细胞外囊泡可包含grna(例如sgrna)和编码核酸酶的核酸分子。所述核酸酶可以是cas9或cas12核酸酶。细胞外囊泡可以包括dna修复模板。因此，所述细胞外囊泡可包含选自下组的一种、两种或三种组分：grna、编码核酸酶的核酸和dna修复模板。

5、在另一个方面，所述细胞外囊泡包含编码抗原结合分子或抗原结合分子的片段的核酸。所述抗原结合分子或其片段可以是抗体、scfv、fab、f(ab)2、微抗体或双抗体。细胞外囊泡可包含编码抗原结合分子或其片段的第一多肽的第一核酸和编码抗原结合分子或其片段的另一多肽的第二核酸。

6、在优选的方面中，所述细胞外囊泡是来自红细胞的细胞外囊泡。

7、本文还描述了包含本文公开的细胞外囊泡的组合物。在这些组合物中，至少一个细胞外囊泡包含负荷物，其中所述负荷物包含至少两个不同的核酸。在一些情况下，所述组合物包含多个细胞外囊泡。在这样的组合物中，组合物中的一个、几个或基本上所有的细胞外囊泡可以包含负荷物，其中所述负荷物包含至少两个不同的核酸分子或至少三个不同的核酸分子。

8、本文还描述了制备包含负荷物的细胞外囊泡的方法，其中所述负荷物包含至少两个不同的核酸分子。在一些情况下，所述方法包括a)提供混合物，所述混合物包括要负载到细胞外囊泡中的核酸分子；和b)在足以使细胞外囊泡负载所述核酸分子的条件下将所述混合物与所述细胞外囊泡接触，其中所述核酸分子的混合物包含至少两个不同的核酸分子。在一些方面中，所述混合物进一步包含转染试剂。在其他情况下，该方法还包括在混合物与细胞外囊泡接触后进行电穿孔的步骤。在一些方法中，所述混合物以约1:1的比例包含至少两个不同的负荷物分子。优选地，要负载的细胞外囊泡是来自红细胞的细胞外囊泡(rbcev)。

9、本文所述的一些方法涉及制备包含待负载到细胞外囊泡中的核酸分子的混合物的步骤。该步骤可涉及制备核酸分子的混合物，其中至少一个核酸分子不同于混合物中的其他核酸分子，其中将转染试剂加入该混合物中。或者，该步骤可以涉及制备两个或多个亚混合物，每个亚混合物包含要负载到细胞外囊泡中的核酸和转染试剂。然后将亚混合物合并以形成混合物。

10、所述至少两个不同的负荷物分子各自是核酸分子。所述至少两个不同的负荷物分子可以都是质粒。所述至少两个不同的负荷物分子可以都是rna分子。所述至少两个不同的核酸分子可以具有不相同的序列和/或所述至少二个不同的核酸分子可以是不同类型的核酸分子(例如，至少一个dna和至少一个rna、至少一个质粒和至少一个寡核苷酸、至少一个质粒和至少一个rna、至少一个环状核酸和至少一个非环状核酸等，这是阅读本公开的本领域技术人员将清楚的)。

11、混合物的核酸可以选自下组：小干扰rna(sirna)、信使rna(mrna)、向导rna(grna)、引物编辑向导rna(peg rna)、crispr rna(crrna)，反式激活crispr rna(tracrrna)、环状rna、微小rna(mirna)、初级mirna(pri-mirna)、前体mirna(pre-mirna)、piwi相互作用rna(pirna)、转移rna(trna)、长非编码rna(lncrna)、反义寡核苷酸(aso)、短发夹rna(shrna)、小激活rna(sarna)、小核rna(snorna)、缺口聚物(gapmer)、锁核酸(lna)、肽核酸(pna)、表达载体、dna质粒、rna质粒、dna微环、哑铃形dna最小载体和rna微环。负荷物可以包括dna和rna、至少两个不相同的分子、至少两个不同的mrna、质粒和grna、或者mrna和grna。

12、考虑本文所提供的公开内容后不难理解，共包封的核酸可以具有大致相同的大小，或者可以具有不同的大小。事实上，在一些实施方式中，共包封的核酸可以具有大体上共同的结构特征(例如，是质粒，包括表达控制元件，其在某些实施方式中可以是相同的，并且包括不同的表达[又称“载荷”]序列)，或者甚至可以基本上相同的，但是具有特定的序列和/或其他结构变化。或者，如本文所教导的(并通过例证证实)，共负载的核酸可以具有差异很大的大小(例如，一个或多个质粒和一个或更多个寡核苷酸)。

13、某些方法涉及核酸分子的负载，其中核酸分子包含或编码crispr/cas基因编辑系统的组分。在这样的方法中，混合物可以包含或编码crispr/cas基因编辑系统的组分。该混合物可以包含grna分子和编码核酸酶的核酸分子。所述核酸酶可以是cas9核酸酶或cas12核酸酶。

14、某些方法涉及负荷物分子的负载，其中负荷物分子包括编码抗原结合分子的两个或多个核酸分子。在这样的方法中，混合物可以包含编码抗原结合分子的第一多肽的第一核酸和编码抗原结合分子的第二多肽的第二核酸。

15、在另一个方面，本文描述了一种将两个或多个核酸分子递送到细胞的方法，其中所述方法包括使细胞与本发明的细胞外囊泡接触。

16、本文还描述了用于治疗方法的细胞外囊泡、治疗方法以及细胞外囊泡在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。这些方面可涉及将本发明的细胞外囊泡施用于受试者，所述受试者患有遗传性病症、炎症性疾病、癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病或胃肠道疾病。所述受试者可能患有癌症，所述癌症任选地选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、鼻咽癌、肾癌或胶质瘤。这些方面可以涉及通过表达所述核酸编码的蛋白质或肽来治疗患者的疾病。它们可能涉及通过基因编辑或基因治疗来治疗疾病。

17、本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许的或者明确避免的情况。