蛋白磷酸激酶PP2A催化亚基与微囊藻毒素MC-LR结合位点的应用

本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及蛋白磷酸激酶pp2a催化亚基与微囊藻毒素mc-lr结合位点的应用，尤其涉及微囊藻毒素与蛋白磷酸激酶pp2a催化亚基结合的关键氨基酸位点，为开发筛选微囊藻毒素中毒的解毒药物奠定基础。

背景技术：

1、蓝藻(蓝细菌，cyanobacteria)是地球上最早出现的光合自养生物，广泛分布于淡水、咸淡水、海水和陆生环境。近年来，随着人类社会生产力的大幅提高及人口压力的不断增大，日益增多的工业废水、生活污水和农业灌溉废水排入河流、湖泊，自然水体外源性营养负荷增加，全球范围的淡水水体富营养化以及蓝藻水华频繁发生的现象日趋严重(newcombe et al 2012；paerl and paul 2012)。蓝藻的暴发性繁殖导致水体透明度下降，溶氧量降低，生态多样性被破坏；另一方面，蓝藻能产生一系列毒性很强的天然毒素(蓝藻毒素，cyanotoxin)，如环肽(cyclic peptides)、生物碱(alkaloid)和脂多糖内毒素(lipopolysaccharide，lps)等，对动物乃至人类的健康构成严重的威胁(cheung et al2013；huisman et al 2013)。其中，具有神经毒性的环肽毒素——微囊藻毒素(microcystins，mcs)是出现频率最高、分布最广、危害最大的一类，水体中mcs的普遍存在已经成为一种全球性的生态灾难(谢平2009)。微囊藻毒素是一类具有生物活性的单环七肽化合物，主要产自微囊藻(microcystis)、鱼腥藻(anabaena)、颤藻(oscillatoria)、念珠藻(nostoc)等蓝绿藻类，在蓝藻种群活跃生长或蓝藻水华分解时期随着藻细胞的死亡而释放到水体中(carmichael 2001；van apeldoorn et al 2007)。在我国发生蓝藻水华的水体中，微囊藻占总藻类的90％，而其中产毒微囊藻所占比例高达96.6％，主要为铜绿微囊藻，因此，蓝藻水华常被称为微囊藻水华(李大命等2011；黄君等2015)。水体中只要有产毒蓝藻存在，就会有mcs，当mcs很微量时，不会对人类和其他动物产生明显的毒害作用。世界卫生组织(world health organization，who)规定人类饮用水中mcs的安全浓度不超过1μg/l(who 2010)，我国于2006年将mc-lr列为饮用水检测指标(gb5749-2006)。2007年6月太湖的蓝藻水华污染及饮用水危机事件向人们敲响了警钟，蓝藻水华暴发，就会有大量产毒蓝藻向水体中不断释放mcs，使得水体中mcs的量远远高于安全值，通过饮用水和食物链的累积与逐级放大作用，人类面临着巨大的mcs的毒害风险(newcombe et al 2012)。mcs是一类分子质量约为1000da的单环七肽化合物(van apeldoorn et al 2007)，主要由7个氨基酸构成，一般化学结构是：环(d-丙氨酸-l-x-赤-β-甲基-d-异天冬氨酸-l-y-adda-d-异谷氨酸-n-甲基脱氢丙氨酸)，其中adda为3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸，是一个特殊的20个碳原子的氨基酸，是mcs表达生物活性所必须的，去除adda基团后，mcs毒性降低(mcelhiney and lawton2005)，x、y为两种可变的l-氨基酸，导致mcs有200多种同分异构体(puddick et al 2014)。在众多变体中，mc-lr是分布最广、毒性最强的一种(abdel-rahman et al 1993；pearson et al 2010)。

2、mc-lr具有全身性的毒性作用，特别的是可以引起急性肝衰竭。而越来越多的报道显示mc-lr还有生殖毒性，神经毒性，肾毒性等，不仅如此，它还能将毒性传递至子代15–17。

3、mcs强烈抑制pp1和pp2a的活性。生物体内许多生化过程都依赖于蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化和去磷酸化作用，而早在上世纪90年代，mcs就被证实会强烈地抑制蛋白磷酸酶的活性。磷酸化丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶(phosphoserineand phosphothreonine residuesphos phatase，ppp)是生物体内蛋白磷酸酶家族中重要的成员之一，真核生物的ppp家族分为4类：pp-1、pp-2a、pp-2b、pp-2c。mcs可以通过与pp-1和pp2a的共价结合，强烈地抑制了该酶的活性18。pp2a是由支持亚基a、调节亚基b和催化亚基c组成，而mc-lr能够和催化亚基c特异性结合，从而抑制pp2a的活性19。mc-lr对pp2a的抑制破坏了相关蛋白的去磷酸机制，同时增加了蛋白激酶的活性，导致细胞内多种蛋白高度磷酸化，使得细胞内多种生化过程无法完成，造成如细胞骨架分解，信号通路受阻，细胞代谢和周期紊乱等20。因此寻找mc-lr的解毒剂就迫在眉睫。

4、目前还未报道mc-lr与pp2a结合的关键氨基酸位点，也未制造出有效的解毒剂。而本发明找到了mc-lr与pp2a催化亚基c亚基结合的关键氨基酸位点，为设计和筛选针对mc-lr中毒的解毒药物提供了基础。

技术实现思路

1、本发明提供了微囊藻毒素mc-lr与蛋白磷酸激酶pp2a催化亚基结合的关键氨基酸位点，即第243位亮氨酸和/或第269位半胱氨酸，为开发筛选微囊藻毒素中毒的解毒药物奠定基础。由此解决现有技术中缺乏微囊藻毒素解毒剂的技术问题。

2、根据本发明第一方面，提供了一种蛋白磷酸激酶pp2a催化亚基第243位亮氨酸和/或第269位半胱氨酸作为微囊藻毒素mc-lr结合位点的应用，所述微囊藻毒素mc-lr的结构为环状(d-丙氨酸-l-亮氨酸-赤-β-甲基-d-异天冬氨酸-l-精氨酸-adda-d-谷氨酸-n-甲基脱羟基丙氨酸)，其中adda为3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸。

3、根据本发明另一方面，提供了蛋白磷酸激酶pp2a催化亚基第243位亮氨酸和/或第269位半胱氨酸作为筛选微囊藻毒素mc-lr中毒的解毒药物的靶点的应用，所述微囊藻毒素mc-lr的结构为环状(d-丙氨酸-l-亮氨酸-赤-β-甲基-d-异天冬氨酸-l-精氨酸-adda-d-谷氨酸-n-甲基脱羟基丙氨酸)，其中adda为3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸。

4、优选地，所述解毒药物的靶点用于筛选阻断微囊藻毒素mc-lr与蛋白磷酸激酶pp2a催化亚基结合的药物。

5、优选地，所述第269位的半胱氨酸与微囊藻毒素mc-lr形成共价键，所述第243位的亮氨酸与微囊藻毒素mc-lr形成范德华力。

6、总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

7、(1)微囊藻毒素mc-lr具有重大的生态安全威胁，进一步的极大的威胁人类的健康。以往的研究表明，mc-lr进入生物体内通过结合pp2a催化亚基c亚基，降低pp2a活性来发挥毒性效应。而本发明发现mc-lr与pp2a催化亚基c亚基结合的两个重要的氨基酸位点，只影响结合不影响催化功能，即第243位亮氨酸和/或第269位半胱氨酸，对通过这两个位点设计解毒药物提供了理论支持。

8、(2)本发明关注于mc-lr与pp2a催化亚基c亚基的氨基酸位点，首次提出pp2a催化亚基c亚基第243位亮氨酸和第269位半胱氨酸是与pp2a催化亚基c亚基结合的关键位点。能够将上述位点作为药物靶标，设计筛选阻断mc-lr与pp2a催化亚基c亚基结合的药物，从而对mc-lr中毒进行解毒。