基于免疫细胞膜的靶向药物递送纳米微球及其制备方法与应用

本发明属于生物医学材料，具体地说，涉及一种基于免疫细胞膜的靶向药物递送纳米微球及其制备方法与应用。

背景技术：

1、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，简称as)是一种主要侵犯脊柱，并累及骶髂关节和外周关节(如中轴关节、四肢关节等)的慢性进行性炎性疾病，强直性脊柱炎的病因目前尚未完全明确，但近年来研究结果表明促炎与抑炎的失衡在as的发生、发展中起到重要作用，人体中辅助性t细胞17(thelper cell 17,th17)与调节性t细胞(regulatorycell，简称treg)可能来源于同一前体细胞，在分化方向的选择上存在互相竞争的关系，而两种细胞的功能及分泌的炎性因子也存在相互拮抗的作用，越来越多的研究显示，as患者体内的treg分化比例降低，且分化后的treg免疫调节功能也存在异常，导致了炎症的发展。目前，强直性脊柱炎多通过服用非甾体类抗炎药进行治疗，但是常见的药物存在靶向性和缓释性较差的缺点，导致治疗效果不佳。

2、新型的基于生物膜材料的载药纳米微球在药物的缓控释体系中得到了新的应用，其中应用较为广泛的有：以外泌体(exosome)为代表的基于细胞膜的天然胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)、利用细胞膜加工过后的载药纳米微球，近年来，上述两种基于生物膜材料的载药纳米微球在肿瘤治疗(t.kang,q.q.zhu,d.wei,j.x.feng,j.h.yao,t.z.jiang,q.x.song,x.b.wei,h.z.chen,x.l.gao,j.chen,nanoparticles coated withneutrophil membranes can effectively treat cancer metastasis,acs nano 11(2)(2017)1397-1411.)以及免疫治疗(g.dou,r.tian,x.m.liu,p.y.yuan,q.w.ye,j.liu,s.y.liu,j.zhou,z.h.deng,x.chen,s.y.liu,y.jin,chimeric apoptotic bodiesfunctionalized with natural membrane and modular delivery system forinflammation modulation,sci adv 6(30)(2020).)中均发挥了重要作用，已成为靶向药物递送领域的研究热点。

3、两种基于生物膜材料的载药纳米微球中细胞膜的来源一般为免疫细胞，而免疫细胞涵盖的种类繁多，如t细胞、中性粒细胞及巨噬细胞等，其中，在生物膜载药纳米微球材料中应用最为广泛的为嗜中性粒细胞(或中性粒细胞，neutrophil)，由该类细胞制备得到的纳米微球载药系统在新型的癌症及肿瘤治疗(f.oroojalian,m.beygi,b.baradaran,a.mokhtarzadeh,m.shahbazis.immune cell membrane-coated biomimeticnanoparticles for targeted cancer therapy,small 2006282.)、心血管疾病治疗(l.feng,c.dou,y.xia,b.li,m.zhao,p.yu,y.zheng,a.el-toni,n.atta,a.galal,y.cheng,x.cai,y.wang,f.zhang.neutrophil-like cell-membrane-coated nanozymetherapy for ischemic brain damage and long-term neurological functionalrecovery,acs nano 15(2021)2263-2280.)以及肝脏肿瘤疾病引起的炎症治疗(k.wang,y.lei,d.xia,p.xu,t.zhu,z.jiang,y.ma.neutrophil membranes coated,antibioticagent loaded nanoparticles targeting to the lung inflammation,colloids surf bbiointerfaces 188(2020)110755.)中均可发挥作用。另有研究表明，由中性粒细胞膜包被的纳米微球(聚乳酸-羟基乙酸共聚物，poly(lactic-co-glycolic acid)，简称plga)可有效保留免疫细胞膜表面的抗原决定簇(antigenic exterior)，从而可保持免疫细胞的免疫原性(q.zhang,d.dehaini,y.zhang,j.zhou,x.chen,l.zhang,r.h.fang,w.gao,l.zhang.neutrophil membrane-coated nanoparticles inhibit synovialinflammation and alleviate joint damage in inflammatory arthritis,naturenanotechnology 13(2018)1182-1190.)，进而可在骨关节炎治疗中发挥靶向递送功能。

4、但是目前尚未见利用此类纳米微球载药系统包埋具有治疗作用的生物活性分子及药物对关节炎症以及其它骨骼肌系统的炎症治疗的相关研究，缺乏具有靶向骨骼肌炎症疾病等的治疗作用的新的靶点。

5、有鉴于此，提供一种新的可实现对脊柱炎症部位进行精准治疗的载药系统成为当前亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、为此，本发明所要解决的技术问题在于传统用于治疗脊柱炎症尤其是强直性脊柱炎的药物靶向性和缓释性差，从而提出一种靶向性好、且具有缓释功能的基于免疫细胞膜的靶向药物递送纳米微球及其制备方法与应用。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

3、本发明第一方面提供一种基于免疫细胞膜的靶向药物递送纳米微球，其包括免疫细胞膜、plga纳米微球和药物分子，所述药物分子包埋于所述plga纳米微球内，所述免疫细胞膜通过超声法或挤出法包覆于所述plga纳米微球外部，其中，药物分子为大分子蛋白药物或疏水性小分子药物；所述免疫细胞膜、plga纳米微球的质量比为1:1～2:1，plga纳米微球与大分子蛋白药物的质量比为1800:1～9000:1，plga纳米微球与疏水性小分子药物质量比为60:1～200:1。

4、作为优选，所述免疫细胞膜由外周血液分离的人源免疫细胞提取得到，所述免疫细胞为t细胞或中性粒细胞；所述大分子蛋白药物为组蛋白琥珀酰化酶gcn5，所述疏水性小分子药物为小分子抑制剂cpypp或西维来司钠。

5、作为优选，所述plga纳米微球的平均粒径为200-400nm。

6、本发明第二方面提供一种制备所述的基于免疫细胞膜的靶向药物递送纳米微球的方法，其包括如下步骤：

7、s1、提取免疫细胞膜，所述免疫细胞膜由外周血液分离的人源免疫细胞提取得到，步骤为：

8、将人外周血淋巴细胞分离液与血液按照1:1的比例分层混合，在700g下离心30min；离心后得到由上至下依次是稀释血浆、单个核细胞、分离液、红细胞及粒细胞的分层溶液；

9、吸出所需细胞层加入pbs在650g下离心5min，并用pbs洗涤两次；

10、加入适量红细胞裂解液在600g下离心5min，去除红细胞，得到中性粒细胞或t细胞；

11、将细胞团浸泡于缓冲液中，使细胞核、细胞质渗透至细胞膜外，利用分层高速离心法将其除去，全程利用冰浴保持细胞膜的活性，之后破碎所述细胞膜以备用；

12、s2、制备包埋药物分子的plga纳米微球，采用单乳化法或双乳化法将药物分子包埋于所述plga纳米微球中；

13、s3、用所述免疫细胞膜包封包埋有药物分子的plga纳米微球。

14、作为优选，所述步骤s3中，用所述免疫细胞膜包封包埋有药物分子的plga纳米微球通过超声法或推膜法进行，其中，所述超声法包括：

15、将所述免疫细胞膜与包埋有药物分子的plga纳米微球混匀后，共同超声处理，所述超声处理的参数为振幅：27％，开5s关3s，2个循环，然后在4℃、150000g的条件下超离心处理45min，即得所述基于免疫细胞膜的靶向药物递送纳米微球。

16、作为优选，所述推膜法包括：将所述免疫细胞膜与包埋有药物分子的plga纳米微球混匀后，对得到的混合物用挤出器进行挤出处理，所述挤出处理过程采用聚碳酸酯膜作为过滤结构。

17、作为优选，所述大分子蛋白药物采用双乳化法包埋于所述plga纳米微球，所述疏水性小分子药物采用单乳化法包埋于所述plga纳米微球，其中，所述单乳化法包括：

18、将plga溶解于乙酸乙酯有机溶剂，得到预混物；

19、将药物分子溶解于二甲基亚砜并在搅拌的条件下添加到所述预混物中，得到有机相；

20、用含有聚乙烯醇的水相乳化所述有机相，得到乳液；

21、将所述乳液室温搅拌后冰浴超声，均质处理，之后通过旋蒸去除过量的乙酸乙酯，超速冷冻离心并洗涤后冻干得到包埋药物分子的plga纳米微球。

22、作为优选，所述双乳化法包括：

23、将含有药物分子的水溶液与含有plga的乙酸乙酯有机溶剂混合，冰浴超声处理，形成水-油乳液；

24、将所述水油乳液与含有聚乙烯醇的溶液混合均匀，得到水-油-水乳液；

25、将所述水-油-水乳液进行冰浴超声或均质处理后，通过旋蒸去除过量的乙酸乙酯，超速冷冻离心并洗涤后冻干得到包埋药物分子的plga纳米微球。

26、作为优选，在冻干处理前，还包括添加冻干保护剂的步骤，所述冻干保护剂为聚乙烯醇或甘露醇，所述冻干保护剂的质量浓度为0.5％-1％(w/v)。

27、本发明第三方面提供一种所述的基于免疫细胞膜的靶向药物递送纳米微球在负载治疗脊柱炎症药物中的应用。

28、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

29、本发明提供的基于免疫细胞膜的靶向药物递送纳米微球，包括免疫细胞膜、plga纳米微球和药物分子，药物分子包埋于plga纳米微球内，免疫细胞膜通过超声法或挤出法包覆于所述plga纳米微球外部，其中，药物分子为大分子蛋白药物(组蛋白琥珀酰化酶gcn5)、疏水性小分子药物(小分子抑制剂cpypp或西维来司钠/svt)；免疫细胞膜、plga纳米微球的质量比为1:1～2:1，plga纳米微球与组蛋白琥珀酰化酶gcn5的质量比为1800:1～9000:1，plga纳米微球与小分子抑制剂cpypp、西维来司钠的质量比为60:1～200:1。该基于免疫细胞膜的靶向药物递送纳米微球可靶向到体内各部位的t细胞或中性粒细胞，缓释的药物能够调节免疫细胞的功能，从而调控脊柱的炎症反应，实现脊柱炎症的精准治疗，且该靶向药物递送纳米微球制备方法简单，适用于负载治疗脊柱炎症的药物，特别是治疗强直性脊柱炎的药物。