MSX1在抗乙型肝炎病毒中的应用

本发明属于基因工程和生物医药领，涉及肌节同源盒基因1(musclesegment homeobox gene 1，msx1)的新用途，具体为msx1在抗乙型肝炎病毒中的应用。

背景技术：

1、慢性乙型肝炎病毒(hbv)感染(chb)仍然是世界范围内严重的公共卫生问题，是肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌(hcc)发展的危险因素，每年导致约90万例hbv相关死亡。

2、hbv是一种包膜病毒，含有部分双链松弛环状dna(rcdna)。进入肝细胞后，病毒rcdna转运到细胞核并转化为共价闭合环状dna(cccdna)。cccdna是所有病毒mrna的唯一转录模板，病毒转录由四个病毒启动子驱动，即增强子ii/核心蛋白(hbc)启动子(enii/cp)、表面蛋白启动子1和2(sp1和sp2)以及增强子i/x蛋白(hbx)启动子(eni/xp)，分别产生3.5、2.4、2.1和0.7kb的rna。3.5kb的前基因组(pg)rna作为聚合酶(pol)和hbc的翻译模板，也可以与pol结合，在hbc形成的衣壳内启动病毒复制，而3.5kb的prec rna作为分泌e抗原(hbeag)的翻译模板。2.4/2.1和0.7kb rna分别编码大/中/小表面抗原(l/m/shbsag)和hbx。cccdna作为病毒转录的模板，在hbv的持续存在中起着关键作用，转录因子和顺式元件之间的相互作用可以影响启动子的活性，从而影响病毒rna的产生水平。因此，转录因子的鉴定不仅为研究转录起始的分子机制提供了新视角，而且有助于发现新的抗病毒靶点。

3、根据不同的病毒和宿主免疫状态，乙型肝炎病毒感染的自然病程可分为四个时间阶段：免疫耐受期(it)、免疫活动期(ia)、非活动性懈怠期(ic)和hbeag阴性肝炎期(enh)。it期的特点是存在hbeag，非常高水平的hbv dna(＞107iu/ml)，通过正常-低的谷丙转氨酶(alt)水平反映轻微肝脏坏死炎症或无肝脏坏死炎症。ia期的特征是存在hbeag，高水平的hbv dna(104～107iu/ml)，肝脏中度或重度炎症反应(肝炎)伴随alt水平升高。数年it期的患者可进入ia期，成年期感染的患者更频繁和/或更迅速进入ia期。ia期肝脏免疫微环境已被证明在控制hbv传播和复制中发挥重要作用，例如通过细胞毒性t淋巴细胞(ctl)反应清除hbv感染的肝细胞。然而，肝细胞内环境是否参与hbv的调节尚未得到充分说明。

4、肌节同源盒基因1(muscle segment homeobox gene 1，msx1)是msx转录家族的成员，通过与核心转录复合体组分相互作用抑制宿主基因表达，在分化和发育中起关键作用。虽然同源盒(ho)结构域为msx1识别和结合启动子的特定dna序列，但也观察到msx1介导的转录抑制可独立于ho结构域；了解msx1以不同模式抑制基因表达的机制是十分有意义的。此外，msx1已被证明在调节针对rna病毒的先天免疫反应中是必不可少的，例如仙台病毒(sev)和水疱性口炎病毒(vsv)，但其对于其他rna病毒和dna病毒的作用机制还鲜有研究。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本发明创新性地发现肝内msx1为hbv的一个新的宿主限制因子，且观察到免疫活动期患者的肝内msx1表达水平远高于免疫耐受期患者，这可能解释了msx1在乙肝自然病程的不同阶段调节hbv活性的重要性；本发明在两种hbv持久性小鼠模型中，基于基因疗法，msx1的过表达证实了msx1在体内对hbv基因表达和基因组复制的重要作用，并且确定了msx1可作为治疗chb的治疗靶点。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一个方面是提供一种抗乙型肝炎病毒感染的基因或由其编码的蛋白，所述基因为肝内msx1基因，所述蛋白为所述肝内msx1基因编码的msx1蛋白。

4、本发明的第二个方面是提供msx1的应用，其选自以下应用中的至少一种：作为乙型肝炎病毒宿主限制因子的应用、作为治疗乙型肝炎病毒感染的药物靶点的应用、在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的应用、在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的应用。上述乙型肝炎病毒感染可具体为慢性乙肝病毒感染。

5、进一步地，所述药物选自下述中的一种：将msx1蛋白、或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料作为活性成分的药物；用于过表达肝内msx1或提高肝内msx1表达水平的药物。

6、进一步地，所述生物材料包括含有msx1基因的重组载体、重组细胞系。

7、进一步地，所述重组载体包括但不限于：表达msx1的重组pcmc质粒、表达msx1的重组pcdh质粒、表达msx1的重组血清8型腺相关病毒、表达msx1的慢病毒。

8、进一步地，所述msx1为人msx1，其gene id号为4487，其也可为其他哺乳动物的msx1。其中，其他哺乳动物的msx1与人msx1的开放阅读框(orf)序列相似性在85％以上，例如88％、90％、94％等，其他哺乳动物包括鼠、兔等。

9、进一步地，构建至上述生物材料中的人msx1的基因序列(seq id no.1)如下所示：aggccccggctgctgacatgacttctttgccactcggtgtcaaagtggaggactccgccttcggcaagccggcggggggaggcgcgggccaggcccccagcgccgccgcggccacggcagccgccatgggcgcggacgaggagggggccaagcccaaagtgtccccttcgctcctgcccttcagcgtggaggcgctcatggccgaccacaggaagccgggggccaaggagagcgccctggcgccctccgagggcgtgcaggcggcgggtggctcggcgcagccactgggcgtcccgccggggtcgctgggagccccggacgcgccctcttcgccgcggccgctcggccatttctcggtggggggactcctcaagctgccagaagatgcgctcgtcaaagccgagagccccgagaagcccgagaggaccccgtggatgcagagcccccgcttctccccgccgccggccaggcggctgagccccccagcctgcaccctccgcaaacacaagacgaaccgtaagccgcggacgcccttcaccaccgcgcagctgctggcgctggagcgcaagttccgccagaagcagtacctgtccatcgccgagcgcgcggagttctccagctcgctcagcctcactgagacgcaggtgaagatatggttccagaaccgccgcgccaaggcaaagagactacaagaggcagagctggagaagctgaagatggccgccaagcccatgctgccaccggctgccttcggcctctccttccctctcggcggccccgcagctgtagcggccgcggcgggtgcctcgctctacggtgcctctggccccttccagcgcgccgcgctgcctgtggcgcccgtgggactctacacggcccatgtgggctacagcatgtaccacctgaca。

10、进一步地，将人msx1的开放阅读框分别克隆到pcmc质粒或pcdh质粒，以获得表达msx1的重组pcmc质粒或重组pcdh质粒。

11、进一步地，所述重组细胞系含有表达msx1的重组pcdh质粒，其制备步骤包括：将重组pcdh质粒与辅助质粒pspax2和pmd2以4：3：1的比例使用聚乙烯亚胺(pei)共转染入hek293t细胞。也可采用本领域其他合适的细胞系。

12、可理解的是，通过基因工程方法可将msx1基因克隆至上述所列质粒以外的其他质粒中、上述所列载体病毒以外的其他载体病毒中；上述msx1表达质粒或msx1表达腺相关病毒(或msx1表达慢病毒)或在细胞系中过表达后制备纯化的msx1蛋白，可用于感染肝细胞(hepg2、phh、huh7、hepa1-6、aml12、hepad38等)或通过适当的方法施用于(例如采用尾静脉高压水动力方法注射)hbv动物模型(bps小鼠模型、rcccdna小鼠模型等)，作为抗hbv干预方式。

13、进一步地，在上述应用中，所述药物为抑制乙型肝炎病毒基因表达和基因组复制的药物。

14、进一步地，所述药物为抑制enii/cp活性和病毒cccdna转录的药物。

15、进一步地，在所述药物中，msx1通过下述机制发挥作用：msx1与肝细胞核因子4α(hnf4α)竞争结合msx1顺式响应元件(mre)，其通过ho结构域与mre结合导致mre上的hnf4α富集减少，从而抑制增强子ii/核心蛋白(hbc)启动子(enii/cp)活性和病毒cccdna转录。具体地，msx1通过ho结构域中的aa 218至260的氨基酸片段与mre结合。

16、进一步地，所述乙型肝炎病毒感染的个体为哺乳动物，包括但不限于：人、鼠等。

17、进一步地，所述乙型肝炎病毒为b基因型和c基因型。

18、在一具体实施方式中，将2×1011基因组当量的表达msx1的重组血清8型腺相关病毒(aav-msx1-flag)以200μl pbs经尾静脉注射给hbv动物模型。msx1降低了cp活性，注射aav-msx1-flag能更快地降低血清hbsag和hbeag，msx1诱导的hbsag清除与hbsab的出现无关，降低hbv复制(核心相关dna)、rcccdna和病毒衣壳等标记物的水平，且部分注射aav-msx1-flag的小鼠清除了hbsag，清除了肝内rcccdna/bpsdna，可实现hbv的治愈。

19、本发明的第三个方面是提供一种乙型肝炎病毒的药物抑制剂，其活性成分包含msx1蛋白、或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料。

20、进一步地，所述生物材料为如本发明的第二个方面中任一所述的生物材料。

21、进一步地，所述药物抑制剂还包括药学上可接受的载体。

22、进一步地，所述药物抑制剂的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服剂、缓蚀剂、注射剂中的任意一种。

23、可理解的是，基于药物抑制剂的剂型及给药方式的不同，其所选择的载体的种类和用量也进行适应性调整选择。“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，其适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的药物抑制剂以及它们之间相互掺和，而不明显降低药物抑制剂的药效。

24、与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

25、本发明首次发现肝内肌节同源盒基因1(msx1)是hbv基因表达和复制的一种新的宿主限制因子。本发明首次揭露了msx1抑制乙肝病毒基因的转录，并揭示了另一种不依赖于表达水平的肝细胞核因子4α(hnf4α)介导的cccdna转录调控机制。

26、在hbv转染和未感染的系统中，msx1有效地抑制乙肝病毒基因表达和基因组复制。通过作用机制研究发现：msx1通过直接结合msx1顺式响应元件(mre)从而下调增强子ii/核心蛋白启动子(enii/cp)的活性，具体地：msx1介导的cp活性抑制是由于msx1与hnf4α竞争结合mre导致mre上的hnf4α富集减少，从而抑制enii/cp活性和病毒cccdna转录。临床资料显示(肝脏活检标本分析)，与免疫耐受期(it)相比，免疫活动期(ia)chb患者肝内msx1表达水平较高，但血清和肝内hbv标志物水平相对较低，msx1表达与患者hbv基因表达和复制呈负相关。最后，本发明在两种hbv持久性小鼠模型中评估了msx1介导的抗病毒作用，证明msx1是chb治疗的一个有希望的治疗靶点。