一种双标记定量降解和释放的软骨支架及其制备和检测方法

本发明属于生物医学工程领域，尤其涉及一种双标记定量降解和释放的软骨支架及其制备和检测方法。

背景技术：

1、关节软骨的修复和再生是再生医学领域研究的难点和热点。由于软骨内缺乏血管和接近无细胞的特性，软骨组织的自我修复能力有限。功能型软骨支架将可降解的生物高分子材料与组织干细胞等结合，提供了结构与功能的双重修复效果，在修复关节软骨方面受到广泛的关注。间充质干细胞(mscs)具有软骨细胞的分化潜能，来源广泛易提取，在体外条件下可实现稳定扩增等优势，是最常用于制备软骨修复支架的干细胞类型。

2、理想的软骨支架需具有与组织再生相匹配的降解速率，同时具备可控的干细胞释放速率。一方面，植入支架过早降解将失去对再生细胞的黏附、迁移等支持作用，而过晚降解容易导致空间占位效应阻碍了组织再生；另一方面，在修复过程中负载的mscs需要在损伤区域保持一定浓度才能有效促进软骨细胞的再生修复。现有的成像技术，如磁共振和计算机断层扫描等，只能对植入材料进行解剖学定位，而无法进一步提供材料的功能信息。因而难以实现支架降解和干细胞释放的同步监测，限制了功能型软骨支架的临床转化。

3、因此，有迫切地需求开发一种双标记的软骨支架及其监测方法，该方法能在体同步定量监测支架的降解和mscs的释放。现有的功能型支架通过磁化水凝胶的结构，可以实现在磁共振设备上定位植入支架，但是无法定量支架的降解，更难以实现同步定量干细胞的在体释放。磁粒子成像(magnetic particle imaging，mpi)是新兴的分子影像技术，其利用超顺磁粒子在高梯度磁场内无磁场区域的非线性响应再磁化的原理，进而高灵敏地定量磁粒子的在体浓度。在同一激励场下不同性状磁粒子产生的磁化响应不同，前沿的磁粒子频谱技术通过对不同磁化曲线的多谱段重建，可同时精准定量不同磁粒子的实时浓度。因而，研发一种基于磁粒子频谱技术的功能型软骨支架具有广阔的临床应用前景。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种双标记定量降解和释放的软骨支架及基于磁粒子频谱技术的监测方法，该支架在高强度可降解的双网水凝胶中均匀负载功能化修饰的fe4o3和吞噬了fe4o3的间充质干细胞；在支架降解的过程可以同步释放间充质干细胞和负载的fe4o3，通过磁粒子频谱技术获取游离磁粒子和细胞内磁粒子的磁化曲线，对两种粒子进行多谱段重建以精准定量不同磁粒子在体的浓度变化，从而实现同步监测支架的降解和干细胞的释放。基于磁粒子技术具备纳摩尔级的检测灵敏度，本发明提出的新型定量支架和监测方法有助于解决现有的软骨支架难以达到可控监测的技术难点。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案在于：

3、一种双标记定量降解和释放的软骨支架：所述支架以聚乙二醇双丙烯酸酯和i型胶原蛋白形成双网络水凝胶为主要架构，水凝胶网络内均匀分散磁性fe4o3；和负载含磁性fe4o3的mscs。

4、优选地，所述fe4o3的粒径为20nm；所述fe4o3的浓度为0.1m，所述mscs的数量为1*106个/ml，i型胶原蛋白占水凝胶重量的比例的10％。

5、本发明还提供所述的软骨支架的制备方法，包括如下步骤：所述的mscs与fe4o3溶液共孵育获得负载有含磁性的fe4o3的mscs。

6、优选地，所述的软骨支架的制备方法包括：

7、步骤一：将羧基化葡聚糖修饰fe4o3与带nh2的高分子聚乙二醇在edc/nhs的催化作用下共价反应形成pegda@fe4o3；

8、步骤二：水凝胶的制备涉及两步交联反应，先将pegda水溶液加入光引发剂i29596后避光保存；第一步交联反应是i型胶原蛋白/醋酸溶液与pegda母液和pegda@fe4o3混合均匀，搅拌后，将溶液置于模具中，在紫外灯照射后，形成水凝胶i级网络；将反应后溶液加入edac/nhs溶液中室温静置交联形成ii级网络；

9、步骤三：当水凝胶完全交联后，更换干净的去离子水，用超声仪清洗15min，重复清洗3次，去除未反应的化学物质；

10、步骤四：提取小鼠骨髓来源的间充质干细胞，对采集的干细胞进行初步处理，去除异物和红细胞后，进行体外扩增，待细胞达到指数级增殖后，与fe4o3溶液共孵育12小时后，用平衡盐溶液清洗3次后消化细胞，用带血清培养基重悬制备干细胞悬液；

11、步骤五：将干细胞悬液加入适当体积的培养基，轻柔晃动使其均匀分布于培养基中，加入成型水凝胶混合孵育，并在37℃，5％co2，95％饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天换液一次，培养一周后，通过免疫荧光实验可评估干细胞在水凝胶网络内的存活与增殖情况。

12、优选地，步骤一中，所述的高分子聚乙二醇的分子量为2000；所述共价反应的条件为室温，反应溶剂用ph＝5～6的pbs缓冲液，反应时长4小时；反应结束通过超滤管去除未反应物质。

13、优选地，步骤二具体为：先将100mg/ml的pegda水溶液加入6wt％的光引发剂i29596后避光保存；第一步交联反应是i型胶原蛋白/醋酸溶液与pegda母液和pegda@fe4o3混合均匀，搅拌速度300r/min，搅拌15分钟后将溶液置于模具中，在365nm紫外灯照射25min，形成水凝胶i级网络；将反应后溶液加入edac/nhs溶液中室温静置交联24小时形成ii级网络；i型胶原蛋白在水凝胶的重量比例为10％。

14、优选地，步骤四中所述fe4o3孵育浓度为250ug/ml，血清培养基的血清比例为20％；干细胞浓度为1x106个/ml；

15、步骤五中所述水凝胶直径约6-7mm，高为5mm；培养基的体积保证高于水凝胶表面3-5mm。

16、本发明还提供一种软骨支架的检测方法，包括如下步骤：

17、步骤a：将梯度浓度的游离fe4o3溶液和梯度体积的吞噬了fe4o3的间充质干细胞悬液分别注入ep管中，将ep管分别置于定制mpi扫描仓内，采用无惯性快速扫描技术获取信号；

18、步骤b：将步骤a采集的信号进行频谱特征分析，分别构建fe4o3在间充质干细胞内和游离态的频谱特征模型；基于上述特征，构建混合磁粒子分离模型，用于分离游离态和在间充质干细胞内的fe4o3信号；

19、步骤c：将所述的软骨支架浸泡在含200u/ml的i型胶原酶的tris-cacl2缓冲液中，置于在37℃，5％co2，95％饱和湿度的培养箱中进行体外降解实验，每天更换新鲜降解液；分别在12h，24h，48h，72h以及96h检测降解过程中水凝胶网络内的游离磁粒子和胞内磁粒子的信号值，通过步骤b获取的线性方程式，计算在间充质干细胞内fe4o3和游离态fe4o3粒子随着时间延长水凝胶逐步降解过程中的浓度变化。

20、优选地，步骤a中游离fe4o3溶液的梯度浓度为：5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml。

21、优选地，步骤a中吞噬了fe4o3的间充质干细胞悬液的梯度体积为25μl、50μl、100μl、200μl、400μl；步骤a中吞噬fe4o3的间充质干细胞悬液的浓度1x106个/ml。

22、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

23、1.本发明提供的制备方法，为一种双标记定量降解和释放的小动物软骨支架制备方法，以pegda和i型胶原蛋白形成的双网水凝胶为基本架构，通过水凝胶体系中羧基和羟基发生的离子配位作用，提高磁性纳米颗粒在水凝胶网络的分散性；通过共孵育的方法在水凝胶网络中均匀负载含磁性纳米颗粒的间充质干细胞，因而适用于mpi实时监测。该支架利用可体内降解的天然蛋白(i型胶原蛋白)具备良好的生物相容性，降解的速率可以根据需求调控i型胶原和pegda的比例获得，释放干细胞的速率可以根据需求调控负载干细胞的浓度获得。

24、2.本发明提供的一种基于新型磁粒子频谱技术同步定量的监测方法，该方法基于纳米磁学理论和磁纳米粒子频谱的非线性特征，建立不同弛豫磁纳米粒子信号与其浓度的数学模型，通过同步反演重构算法，可以精准定量在不同介质下磁纳米粒子的实时浓度，因而实现可控降解和释放的目的。