应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法

专利名称:应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及到兽用生物制品技术领域：
，具体涉及到一种应用生物反应器工业化生 产猪乙型脑炎疫苗的方法。
背景技术：
乙型脑炎Opanese Enc印halitis，JE)，简称乙脑，是一种人蓄共患的蚊媒传播 病毒性疾病，对猪引起猪的繁殖障碍。由于JEV通常在蚊-猪-蚊等动物间循环，猪被认为 是JEV最重要的自然宿主，在给养猪业带来损失的同时，也是人类公共卫生潜在的威胁。目 前使用疫苗预防接种仍然是预防该病的有效手段。
当前大规模应用的猪乙脑疫苗有鼠脑灭活疫苗，来自中山株或北京株病毒；细胞 培养灭活疫苗，来自北京P-3株病毒；细胞培养减毒活疫苗，来自SA14-14-2株病毒。生产 方法虽然相对简单，成熟，但生产劳动强度大，效率低，疫苗批间差异大，已经越来越不适应 当前疫苗大规模生产的要求。
针对乙脑疫苗的生产方法，已有相关文献的报道。专利公开号为CN101732708A 的专利申请，公开了 一种利用地鼠肾原代细胞培养乙脑病毒的方法；专利公开号为 CN1966075A的专利申请，公开了一种应用二倍体细胞株KMB17培养乙脑病毒的方法，专利 公开号为CN1248471A的专利申请，公开一种利用Vero细胞制备乙脑疫苗的方法，其生产方 法为转瓶或生物反应器培养，生物反应器培养微载体用量为2 7g/L，并且是采用批式培 养。
以上文献均涉及到人用乙脑疫苗的制备方法，但生产过程手工操作密集，生产效 率低，产品质量不稳定，而且猪乙脑疫苗的生产方法方面的文献却不见报道。
发明内容
本发明的目的为了克服猪乙脑疫苗现有生产方法的缺陷，提供一种应用生物反应 器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法，其优点是设备占地面积小、生产规模大；自动化控制 程度高，生产效率好；培养设备密闭，不易污染；副产物少，疫苗的副反应小；生产的病毒液 滴度高，疫苗质量稳定。
本发明的技术方案为
应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)将微载体和生物反应器灭菌后，接种制苗用细胞，进行培养，待微载体上的细胞形成致 密的单层，接种乙型脑炎病毒，并继续培养，使病毒繁殖；所述的制苗用细胞为对猪乙型脑 炎病毒毒株敏感的细胞，且为Vero细胞和BHK-21细胞；⑵、待细胞病变达到80%以上时， 停止培养，收获病毒液；C3)对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；(4)通过柱层析方 法纯化灭活的病毒制成疫苗。
所述的病毒的接种量为0. 0001 0. IMOI。
所述的生物反应器设定参数为pH 6. 5 7. 8、温度33 37°C、溶氧30 80%、搅拌速度30 lOOrpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH 6. 8 7. 2、细胞培养阶段 温度设定37°C，病毒培养阶段温度设定35°C、溶氧50%、搅拌速度30 lOOrpm。
所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2 25g/L。
所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。
所述的生物反应器容积为14 150L ；制苗用细胞可采用14L 40L或14L 40L 150L逐级放大的培养模式，即通过胰酶将14L生物反应器培养的细胞消化下来，作为 种子细胞接种到40L生物反应器，再将40L反应器内培养的细胞消化下来作为种子细胞接 种到150L生物反应器，如此形成生物反应器之间的逐级放大培养过程，从而避免了单纯的 用转瓶培养种子细胞而容易造成污染和增加劳动强度的缺陷；于40L或150L生物反应器培 养狂犬病毒；或，直接用14L、40L或150L的生物反应器培养病毒。
所述生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞 的密度以每天0. 5 4个工作体积。
本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产猪乙型脑炎 疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低 成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应


图1为本发明的工艺流程图。
图加为细胞接种后4天的微载体细胞图片。
图2b为接毒后细胞状态的微载体细胞图片。
图3为细胞生长曲线。
具体实施方式
以下是本发明一个具体的实施方案，以进一步的阐述本发明，但不能解释为限制 本发明的范围。
实施例1
生物反应器美国NBS公司14L和40L生物反应器；
微载体=Cytodex-I (通用电气医疗集团生命科学部)；
猪乙脑病毒冊1株；
细胞生长液含体积浓度为8%小牛血清的M199(北京清大天一生物技术有限公 司)；
病毒维持液含体积浓度为小牛血清的M199(北京清大天一生物技术有限公 司)；
细胞培养分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodexl，水化后， 用pH7. 2的磷酸盐缓冲液PBS淘洗2遍，灭菌，加入细胞生长液平衡，接种Vero细胞，进行培 养；培养的方法参数为pH7. 2、温度37°C、溶氧50%、搅拌速度30 IOOrpm;每天定时取样 观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1. 5XlOVml时， 开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度的递增、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4个工作体积，4以维持细胞的生长，培养4天，细胞的密度达到7 X 106/ml。
微载体培养的放大待14L生物反应器细胞的密度达到7X 106/ml，将长满细胞的 微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度为0. 02% EDTA的PBS缓冲液清洗细胞两次， 加入37°C预热的含质量浓度为0. 02% EDTA、质量浓度为0. 25%胰酶的胰酶消化液，消化 8min,排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充 分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培 养方法进行培养。
病毒繁殖当40L生物反应器细胞的密度达到8X106/ml，更换病毒维持液，按照 0. 01M0I接种猪乙脑病毒；接毒后他开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，同 时收获病毒液，待细胞病变达到80%以上时，结束培养，测定病毒含量8. OlogTCID50) /ml, 将收获的病毒液置于2 8°C中，并保存在-20°C。
病毒浓缩、灭活、纯化、配苗将上述收获的病毒液用30万截留分子量的超滤膜包 浓缩10倍，按灭活剂与病毒浓缩液的体积比为1 2000加入质量浓度为37%甲醛溶液灭 活剂进行灭活后，再经过凝胶层析柱kphar0Se4FF柱层析得到纯化疫苗。
实施例2
生物反应器美国NBS公司14L和40L生物反应器；
微载体=Cytodex-I (通用电气医疗集团生命科学部)；
猪乙脑病毒冊1株；
细胞生长液含体积浓度为8%小牛血清的M199(北京清大天一生物技术有限公 司)；
病毒维持液含体积浓度为小牛血清的M199(北京清大天一生物技术有限公 司)；
细胞培养分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodexl，水化后， 用pH7. 2的磷酸盐缓冲液PBS淘洗2遍，灭菌，加入细胞生长液平衡，接种BHK-21细胞，进 行培养；培养的方法参数为pH7. 2、温度37°C、融氧50%、搅拌速度30 IOOrpm ；每天定时 取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1. 5 X IO6/ ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4个工作体积，以 维持细胞的生长，培养4天，细胞的密度达到7 X 106/ml。
微载体培养的放大待14L生物反应器细胞的密度达到7X 106/ml，将长满细胞的 微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度为0. 02% EDTA的PBS缓冲液清洗细胞两次， 加入37°C预热的含质量浓度为0. 02% EDTA、质量浓度为0. 25%胰酶的胰酶消化液，消化 lOmin，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充 分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培 养方法进行培养。
病毒繁殖当40L生物反应器细胞的密度达到8X106/ml，更换病毒维持液，按照 0. OlMOI接种猪乙脑病毒；接毒后他开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，待 细胞病变达到80%以上时，同时收获病毒液，测定病毒含量8. 21ogTCID5(1)/ml，将收获的病 毒液置于2 8°C中，并保存在_20°C。
病毒浓缩、灭活、纯化、配苗将上述收获的病毒液用30万截留分子量的超滤膜包浓缩50倍，按灭活剂与病毒浓缩液的体积比为1 2000加入质量浓度为37%甲醛溶液灭 活剂进行灭活后，再经过凝胶层析柱kphar0Se4FF柱层析得到纯化疫苗；按抗原和油佐剂 1 1比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗，油佐剂的配制为94% (V/V)白油、6% (V/V) ^Span-80,2% (g/V)硬脂酸铝。
权利要求
1.应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)将微载体和生物反应器灭菌后，接种制苗用细胞，进行培养，待微载体上的细胞形成致 密的单层，接种乙型脑炎病毒，并继续培养，使病毒繁殖；所述的制苗用细胞为对猪乙型脑 炎病毒毒株敏感的细胞，且为Vero细胞和BHK-21细胞；⑵、待细胞病变达到80%以上时， 停止培养，收获病毒液；C3)对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；(4)通过柱层析方 法纯化灭活的病毒制成疫苗。
2.根据权利要求
1所述的应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法，其特征 在于所述的生物反应器设定参数为pH 6. 5 7. 8、温度33 37°C、溶氧30 80%、搅拌 速度30 IOOrpm0
3.根据权利要求
1所述的应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法，其特征 在于病毒的接种量为0. 0001 0. IMOI。
4.根据权利要求
1 3之一所述的应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方 法，其特征在于所述的生物反应器容积为14 150L。或，制苗用细胞经过14L 40L或 14L 40L 150L逐级放大培养后，于40L或150L生物反应器培养狂犬病毒；或，直接用 14L、40L或150L的生物反应器培养病毒。
5.根据权利要求
1 4之一所述的应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方 法，其特征在于所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2 25g/L。
6.根据权利要求
1 4之一所述应的用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方 法，其特征在于所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。
7.根据权利要求
1 4之一所述的应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方 法，其特征在于所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率 根据细胞的密度为每天0. 5 4个工作体积。
专利摘要
本发明提供一种应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法，包括如下步骤(1)将微载体和生物反应器灭菌后，接种制苗用细胞，进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种乙型脑炎病毒，并继续培养，使病毒繁殖；(2)待细胞病变达到80％以上时，停止培养，收获病毒液；(3)对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；(4)通过柱层析方法纯化灭活的病毒制成疫苗。本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产猪乙型脑炎疫苗，与传统的转瓶生产方法相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。
文档编号A61P31/14GKCN102038943SQ201010284021
公开日2011年5月4日 申请日期2010年9月15日
发明者刘汉平, 张萍, 朱薇, 李伟, 温文生, 漆世华, 秦红刚, 靖志强 申请人:武汉中博生物股份有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan