专利名称:融合微脂粒及供微脂粒融合所用之酸诱导性法的制作方法
本发明系指融合微脂粒，被PH控制之微脂粒融合作用，及这些微脂粒作为制药或类似制剂之载体时的用途。当微脂粒介质之PH被制成酸性时，含有(例如)磷脂酰乙醇胺及棕榈酰高半胱胺酸之微脂粒快速地发生融合。
微脂粒系为含有一个或多个微脂粒双层之囊胞，此微脂粒双层是完全围绕内部的水性空间。它们通常系由磷脂或其他脂族分子以单纯形式或以与其他分子诸如脂醇，长链酸或碱，或膜蛋白质等结合之形式制成。微脂粒之结构可为多层大囊胞(0.5至5微米)至单层小囊胞(250-750埃)形式。习惯上是根据大小来分类微脂粒，并使用三个字的字头语来命名所论及的微脂粒型。多层囊胞一般命名为(MLV)。单层小囊胞一般命名为(SUV)。而单层大囊胞则命名为(LUV)。下列之每一事例中的化学组合物一般是以字头语称之。参见D·Papahadjopoulos，Ann，N·Y·Acad，Sci308 1(1978)and Ann·Rpts·Med·Chem，14 250(1979)，其说明已
入本文中以供参考。
微脂粒制剂可由多种技术制得，其中包括乙醇注射法，(Batzri et al，Biochim，Biophys，Acta，298 1015(1973));醚浸渍法，(Deamer et al，Biochim，Biophys，Acta，443 629(1976))及Schiern et al，Biochim，Biophys·ACta，542 137(1978))，去垢剂移去法，(Razin，Biochim，Biophys·Acta，265 241(1972))，溶剂蒸发法，(Matsumato et al，J·Colloid Interface Sci，62 149(1977))，油(REV)乳浊液中之水之蒸发法(SZoka Jr·et al.，Proc·Natl·Acad·Sci·USA，75 4194(1978))，及MLV及LUV经由核孔聚碳酸盐膜之挤压法(Olson et al.，Biochim，Biophys，Acta，557 9(1979)。
微脂粒可用于影响试管试验及活体试验中的细胞活动。Wagee及Miller(Nature，235 399(1972)的报告中首先指出，带有抗病毒抗体之微脂粒可保护细胞避免受到病毒感染。Greoriadis及Buckland(Nature，244 170(1973))同样地观察到微脂粒对细胞之保护作用，其观点认为含有蔗糖酶之微脂粒可导致小鼠之腹膜巨噬细胞中之贮藏蔗糖空泡消失。Papa hadjopoulos及Coworkers(Biochim·Biophys·Acta，323 23(1973)中指出，微脂粒可诱导细胞融合而不发生细胞毒性反应。
微脂粒已用以影响细胞对暂时性分子(即寻常不能吸收的分子)之吸收能力。此效用致使微脂粒可作为外来物质(诸如药等)的载体。例如，在试管试验中，环状AMP对STS细胞生长之抑制作用可借助使用微脂粒作为载体而增强1000倍(Papahadjopoulos et al.，Nature，252 163(1974)及Papahadjopoulos et al.，Biochim Biophys·Acta，363 404(1974))。类似之增强效应也在Papahadjopoulos et al.，Cancer Res.，36 4406(1976)中述及，指出微脂粒中之放射菌D对抗抗药之田鼠细胞系的效力。
在适度酸性情况下之膜融合作用是感染多数封皮病毒，包括圣利基森林(Semliki Forest)病毒(Marsh，et al.，Cold Spring Harbor Symp·Ouant·Biol 46 835(1982)及White et al.，J·Cell Biol·89 674(1981)，水泡性口炎病毒及流行性感昌病毒(White et al.，如上)等的原因。酸诱导性膜粘合作用之正确机理尚未得知。有关微脂粒之研究的显示为，由azolectin所制得之微脂粒可在PH6.5下与粒线体之内膜融合(Schneider et al.，Natl Acad.Sci.USA，77 442-446(1980))，血清白蛋白(Schenkman et al.，Chem.Phys，Lipids，649 633(1981)及Schenkman et al.，Chem.Phys.Lipids，28 165(1981)及其蛋白分解片段(Chaimovich et al.，Biophys.J.，41 28a(1983))可在低于PH4以下的情况下诱导微脂粒发生融合。Blumenthal et al.，指出，Clathrin于PH6.5以下可诱导中性微脂粒发生融合(Blumenthal et al.，Biol.Chem.，258 3409(1983)。所有事例中，微脂粒之融合均需要某种蛋白质或其它大分子的存在。
Allens等人(J.Cell Biol.97 10)(a)，Abstr，No.419(1983))在报告中指出，含有磷脂酰乙醇胺及胆脂醇半琥珀酸酯之微脂粒，于浆质体之PH范围内对PH是灵敏的。这些微脂粒在浆质体进行酸化作用时，与浆质体之膜融合，因而将其内容物传递到细胞质。
Straubinger及Coworkers(J.Cell.Biol.97 109(a)，Abstr No.420(1983))的报告中指出在微酸性PH下会成为不稳定的微脂粒之制法。这些含有油酸，磷脂酰乙醇胺及胆脂醇(3∶7∶3的摩尔比率)之微脂粒在PH7.0以下，对阴离子萤光染料(Cacein)具有渗透性。这些微脂粒促使内藏之Calcein传递到CV-1细胞之细胞质中。
本发明系指(1)融合微脂粒，(2)使微脂粒融合之方法(3)这些微脂粒供细胞之显微镜下注射法(即传递制药或其他制剂)使用时之用途。当微脂粒之介质被处理成PH酸性时，则微脂粒(制成对PH灵敏)发生融合。当这些微脂粒大于含有一个或更多个弱酸官能基团(如羧基团)的两性分子，其摩尔百分比约为20时，微脂粒变得对PH灵敏。此种之化合物包括棕榈酰高半胱胺酸之长链，(即C12至C30，最好为C16至C24)脂肪酸诸如棕榈酸及油酸等。存在具有形成六方相或转化性微胞趋势之两性分子诸如磷脂酰乙醇胺等，可大大地增强融合的过程。以下的一个示范实例中，磷脂酰乙醇胺对棕榈酰高半胱胺酸之理想比率为8∶2。
附图的简单说明
图1描述微脂粒，在酸处理前(a)及酸处理后(b)以Biogel A 50M胶过滤法测得的图形。设标示及未标示的微脂粒在脂质浓度为200×10-6M及n＝3的情况下混合。测量各部分在缺乏(1)及存在(2)0.2%Triton X-100的情况下的N-NBD-PE萤光(λex＝468nm，λem＝530nm)。我们也得出在Triton的存在或缺乏下的萤光比率(3)。
图2描述PH值影响微脂粒融合的图表PE-PHC(8∶2)微脂粒系在脂质浓度为200×10-6M且n＝3的情况下发生融合。融合百分比则以方程式(1)计算出;且
图3描述微脂粒之融合百分比，可以得知PH对经过磷脂酰乙醇胺-油酸(8∶2)处理之微脂粒(4)及对经过磷脂酰乙醇胺-棕榈酸(8∶2)处理的微脂粒(5)的作用。
本文使用以下简称
PHC-棕榈酰高半胱胺酸
PE-磷脂酰乙醇胺
N-NBD-PE-N-(硝基-2，-1，3-苯并噁重氮-4-基)-PE
N-RH-PE＝N-(丽丝胺若丹明B-磺酰基)-PE
PC-磷脂酰胆碱
PA-棕榈酸
PS-磷脂酰丝胺酸
OA-油酸
Chol-胆脂醇
PBS-磷酸盐缓冲性盐水
本发明首先乃是证明一种不以蛋白质或其它大分子作为介质之酸诱导性微脂粒融合作用。论到蛋白质促成性微脂粒融合作用方面，如血清白蛋白(Schenkman et al.，Biochim。Biophy S.ACta，如上及Chaimovich，如上)，Clathrin(Blumenthal，如上)及病毒性糖朊(White，如上，White et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA.77 3272(1980));及Marsh et al，J.Cell Biol.，96 455(1983))等，明显可知蛋白质结构之改变乃是融合作用之主要推动力。本发明之方法中，推动力则来自脂质本身。高半胱胺酸在酸性PH下形成硫代内酯环(Baernstein J.Biol.Chem.，106 451(1934))。此机理过去被认为是导致含有双饱和PC及PHC之微脂粒中的PH-灵敏度漏失的原因。(YatVin et al.，Science 210 1253(1980))。然而，最近的证明则驳斥了此说法;PH之效应可被解释为“酸/碱”平衡之改变，亦即带电荷及未带电荷的N-酰基胺基酸之比例，因为它们在脂质的头基团间产生静电交互作用而发生改变。另外，质子化PHC之双层溶解度可能低的以致于在酸性PH下形成PHC之磁畴。这种双层脂质之侧相分离可构成融合之主要原因(Cestaro et.，J.Biochem.，133 229(1983);Yatvin et al.，in Liposome Technology，Gregoriadis，G.ed.)(CRC Press Boca Raton 1984);及Sundler et al.，Biochim Biophys.Acta，649 751(1981))。后者机理具有特别吸引力，这一点正是我们发现PE的存在可大大地增强酸诱导性之微脂粒融合作用。任何具有形成六方相或形成转化性微胞趋势之两性分子，诸如未饱和的纯PE，尤其是本发明所使用的二油酰PE等，均为适当。PE易形成六方相及转化性微胞(Cullis et al.，Nature(Lond)，271 672(1978)，Cullis et al.，Biochim Biophys Acta 559 399(1979)，(Cullis et al.，Nature(Lond)如上及Lucy Nature(Lond)，277 815(1970))。甚至，其他含有羧基团之长链亲两性物诸如脂肪酸等(见图3)也可用于诱导性微脂粒之融合。
已广泛地研究了微脂粒与动物细胞之交互反应。虽然最初认为微脂粒-细胞之融合作用是主要机理但最近在(Huang et al.，J.Biol.Chem.，258 14034(1983))及其他实验室(Heath et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，80 1377(1983);Leserman et al.，Nature(Lond.)，293226(1981);及Machy et al.，J Immunol.，129 2098(1982))中之研究指出，微脂粒之细胞吸液作用乃是微脂粒被吸收的主要原因。甚至Straubinger等人(Cell32 1069(1983))指出，经过细胞吸液化之微脂粒一旦处在酸性环境下，则会进入浆质体内。浆质体之PH被测定为5左右(Tycko et al.，Cell，28 643(1980))。所以，对浆质体范围中之PH(约为5)灵敏的微脂粒将融合到浆质体的膜上，并将其内容物释到细胞质中。
当介质PH降至7以下时，则含有PE及PHC的音波化微脂粒发生融合。降低微脂粒介质PH之方法，任何熟练的技术人员均可做到，最普通的方法是加入酸。此处所用之微脂粒介质通常为PH7.6的磷酸盐缓冲性盐水溶液。欲降低此PH，则需加入无机盐，如盐酸等。此酸的浓度可随要求的最终PH及被处理介质的量而改变。例如，如上所述，当将5微升1N Hcl加至2ml微脂粒悬浮液(在PH7.6之磷酸盐缓冲性盐水)中时，则PH降至4.8，因而微脂粒发生融合。此融合作用可藉助负性染色电子显微技术，观察微脂粒大小是否增加。原始，未经处理之音波化微脂粒之直径为4.9±2.3×102埃。以酸处理后(至PH4.8)，约1/3之微脂粒未改变其大小，亦即直径在300-700埃之范围中。其余微脂粒则变得较大，即直径为2.9±1.1×103埃。融合性微脂粒并未予以集结。既然微脂粒直径增加约6倍左右，故必需发生数环之融合。
微脂粒大小之增加也可借助胶过滤法测得(见图1)。在此测量法中，将标示之微脂粒(含1摩尔%N-NBD-PE及1莫耳%N-Rh-PE)及3倍以上之未标示微脂粒混合。取出一部分，令其置于Biogel A50M柱上(在PH7.4下)接受色层分离。异质之微脂粒群导致洗提立面图中具有宽阔之高峰。其它部分则以酸处理(至PH4.8)，再使PH回复至PH7.4(使用NaoH)后，置于相同柱上予以色层分离。在530nm下测量N-NBD-PE之放射量来检定洗提之微脂粒。亦即在0.2%Triton X-100(彻底溶解微脂粒)之存在下测量每一部分之萤光。如同所见，音波化微脂粒(最初于柱中之内容积部分中洗提)以酸处理后，已转移至空隙容积部分(第9部分)，此乃指微脂粒大小增加。而这些微脂粒中之N-NBD-PE萤光之比率于Triton X-100之存在或缺乏下是十分不同。融合前，比率通常大于5，此乃指示，由于有效的能量转移而导致N-NBD-PE萤光之高度淬火。以酸处理后，其比率显著地降至5以下，此乃指能量转移之效能较低。如果以酸处理可导致标示及未标示微脂粒间发生融合，则此结果是我们所期望的。这是由于萤光探针在融合膜中发生稀释之原故。
酸诱导性微脂粒融合作用可藉Struck等人(Biochem.，20 4093(1981)最初所论述的共振能转移法予以定量。此分析法中，融合之程度系藉埋于膜中之萤光探针之稀释度而测得。如图2所示，用方程式(1)计算之PE∶PHC(8∶2)微脂粒融合百分比系依介质之PH而定。当PH低于7.0时发生融合，在PH＝4.8-5.0时达到最大程度，PH＝6.2时，则达到中点。
微脂粒之脂质组成物强烈地决定酸诱导性融合作用之效能。表1显示各种由不同脂质组成物所制得之微脂粒于PH4.8下之融合百分比。由资料中所示，我们决定融合作用需要PHC之存在。PE及PHC(8∶2)之结合对融合作用极为有效;然而将PC加至此微脂粒中则减低融合作用。当25%的PE(PE∶PC∶PHC＝6∶2∶2)以PC取代时，则融合力由89降至36%。我们观察到，含有大量PE而无PC之微脂粒时具有最大融合力。融合百分比低于20%者视为不显著。
除了PE-PHC组成物之微脂粒外，我们也估测出其他脂质中，PH灵敏度对微脂粒融合作用之效力。例如，如图3所示，含有磷脂酰乙醇胺(PE)及棕榈酸(PA)(摩尔比率为8∶2)的微脂粒在PH约6.3及低于6.3下显示具有令人注目之融合速率及百分比。图2中显示含PE-PHC(8∶2)之微脂粒之融合百分比与PH函数系呈稳定且近直线增加。再将二者予以对照。
除了含PE/PA(8∶2)之微脂粒外，也研究了含PE及油酸(OA)(8∶2)之微脂粒(见图3)，这些微脂粒如同含PE/PA之微脂粒一样，其中PH6.3及6.3以下时具有快速的融合速率及百分比。
每一种对PH灵敏之微脂粒型(渐次融合或快速融合)作为供细胞之显微镜下注射法所用之输送剂方面，均有其优点及缺点。例如，渐次融合之微脂粒可在各种不同之细胞浆质存在的大范围PH中，输送其内容物。然而，由于融合作用限定在较高之PH值下，故注入量(于较高PH下)低。另一方面，含PE/PA(8∶2)及PE/OA(8∶2)之微脂粒(仅在某些PH下发生融合)于其阀点PH以上(即完全不具有某细胞之PH值)之情况下系完全无效。
表1
各种不同组成物所形成之微脂粒之酸诱导性融合作用＊
脂质组成物 融合力+%
PE∶PHC (8∶2) 89.0±2.14
PE∶PHC (6∶4) 53.0±1.58
PE∶PHC (3∶7) 62.0±1.87
PE∶PC∶PHC (6∶2∶2) 36.0±1.29
PE∶PC∶PHC (4∶4∶2) 21.0±2.01
PC∶PHC (8∶2) 8.0±1.00
PS∶PHC (8∶2) 16.0±1.29
PE∶PC (7∶3) 6.0±1.87
PE∶PS (7∶3) 13.0±1.29
PS∶PC (7∶3) 5.3±1.58
＊在脂质浓度为200×10-6M且n＝3的情况下的融合PH＝4.8
+根据方程式(1)计算得之，以平均值±标准偏差表示。
虽然PE∶PHC(8∶2)微脂粒可得最佳之融合作用，但以Calcein实验指出，此融合过程极易发生漏失。在高浓度之Calcein下，萤光是有效地自动淬火，然而当染料由微脂粒中漏失而使染料受到稀释时，则萤光显著地增强(Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta，597 418(1980))。表Ⅱ显示，融合期间，几乎所有PE∶PHC(8∶2)微脂粒中的内藏Calcein均快速释出。然而，如果这些微脂粒中含有40%之胆脂醇，则可观察到Calcein之漏失较少(55%之潜伏量)。如共振能转移分析法所示，含胆脂醇之微脂粒仍旧可有效地融合。
用本发明法所形成微脂粒可通过与浆质体之膜融合而提供有效的细胞质传递系统。含有胆脂醇之较不易漏失的微脂粒特别有用于将其内含物排至细胞质中。例如，可将外来物质诸如药，酵素，荷尔蒙，营养物，抗原，抗体(单株或惯用者)，RNA，DNA(天然或重组者)或以上之任何结合物及类似物质等装至本发明之PH灵敏性微脂粒中，最后再将它插入活细胞中。
以上所谓之“活细胞”系指活性物，植物或动物之细胞。例如，单细胞生物诸如酵母菌，藻，霉菌细菌等，多细胞生物或系统包括细胞培养(恶性或良性)等，及全体动物诸如哺乳类(包括人类)，爬虫类，鸟类等均是。
将物料装入微脂粒中之方法系已详知。例如，Szoka，Jr.等人于美国专利第4，394，448号中描述将DNA置入脂质囊胞中，以及使用这种微脂粒以将DNA插入活细胞中之方法。另一种的装入法系使用透析之技术(Philippot et al.，Biochim.Biophys.Acta，716 140(1982)).Szoka，Jr.等人及Philippot等人所教示之方法可成功地将DNA，RNA及其他大分子物诸如肽及荷尔蒙装至本发明之PH灵敏性微脂粒中。Szoka，Jr.及Philippot等人之说明已插入本文中以供参考。
制备内封物质的第一步骤乃是提供含有一种形成微脂粒之组成物(于有机溶剂中)及一种待内封物料之水性混合物的混合物。另外可令待内封之物料(依其溶解特性而定)溶于有机溶剂(如氯仿等)中。而后蒸发出有机溶剂，再使用水性缓冲剂(如磷酸盐缓冲性盐水)而由蒸发容器中移去薄脂质膜，由此可制得微脂粒。形成微脂粒之组成物及其制法通常已详知。参见Papahadjopoulos等人于美国专利第4，235，871号中所示，其说明已
入本文中以供参考。
如本文所示，PH灵敏性微脂粒系由磷脂酰乙醇胺(PE)及棕榈酰高半胺胺酸以各种摩尔比率制得，摩尔比率可于每九摩尔PHC中占一摩尔PE至每摩尔PHC中占九摩尔PE之比率间改变。理想之摩尔比率为1摩尔PHC中至少有3摩尔之PE。最理想之PE∶PHC摩尔比为4∶1。
物料及方法
物料
PHC系利用详知之方法予以合成及纯化(Yatvin et al.，Science，同上)。商用二油酰基PE，二油酰基PC及牛脑PS亦可使用。所有磷脂包括N-NBD-PE及N-Rh-PE等均由Avanti(Birmingham，AL)售出。胆脂醇及Calcein系由Sigma获得(St.Louis.No)。
微脂粒制剂
使无溶剂的脂质膜以10微摩耳/ml悬浮于PBS(PH7.4)中，并于室温下以浴音波计(实验室供应)音波化15分钟。各种不同之脂质组成物乃依指示使用。各含有一摩尔百分比N-NBD-PE及N-Rh-PE的萤光标示微脂粒系由与制备未标示微脂粒相同之法制得。
微脂粒融合作用
将10微升之标示微脂粒及各种不同量之未标示微脂粒加至2mlPBS中。测量相对萤光后，将5-20微升的水性1N Hcl加入使之成为各种不同之浓度，再将试样予以强烈搅动以达到期望之PH。于室温下约2min后，将适量之水性1N NaOH加入，使PH回复至7.4。继而再次测量试样之相对萤光。
萤光测量法
使用一种Perkin-ElmerLS5萤光一分光光度计并认定每一试样(于468nm下被激发)之放射光谱。激发及发射之缝宽分别为5nm及3nm。光放射量约为整个萤光记号之5-6%。N-NBD-PE于530nm下之放射量对N-Rh-PE于580nm下放射量之比率(R)系为N-NBD-PE及N-Rh-PE间共振能转移效能之灵敏测量法(Struck et al.，同上)。未融合微脂粒之R值为0.20，此乃是它具有高效能之能量转移之故。当标示微脂粒与未标示微脂粒融合时，萤光脂质发生稀释，因而导致能量转移效能之降低及R值之增加(Blumenthal et al.，同上及Struck et al.，同上)。因而R值之增加量系为微脂粒融合程度之定量测量，经完全融合而全部混合之脂质可得最大之R值(R值系测定融合物质中未标示对标示微脂粒之比率)。微脂粒之融合百分比乃以下列方程式算出
%融合＝ (Rf/Ri-1)/(n) ×100
其中Ri及Rf分别为融合反应前及反应后之R值。未标示微脂粒与标示微脂粒之浓度比率为n。欲检定方程式(1)之正确性，乃将标示及未标示微脂粒以不同比率混合，并测其Ri值。当Rf/Ri-1对n之点在n达3以前呈45°斜度之直线时，则表示方程式(1)系为有效。因为n＞3时，萤光加强性比理论上低，故大部分的实验均在n＝3时进行。R值之再生范围为±5%。
微脂粒之漏失
欲测定微脂粒于融合期间之漏失度，乃使用水溶性之自动淬火萤光染料(Calcein)作为内部之水性空间标记(Allen et al.，同上)。微脂粒系由缺乏萤光磷脂之脂混合物通过含140mM Calcein之PBS中音波化而制得。未内藏之Calcein系藉令微脂粒通过Sepharose-4B柱(于PBS中达到均衡状态)而移去。含Calcein之微脂粒则以上述酸及碱处理。分别于490nm之激发波长及518nm的放射波长下测量融合前及融合后，以及加入0.2%Triton X-100(用以微脂粒破裂)后的Calcein萤光。Calcein萤光之潜伏态以下列方程式算出
潜伏%＝(1- (F)/(Ft) )×100 (2)
其中F及Ft分别为Triton之存在或缺乏下之Calcein萤光强度。
电子显微技术
微脂粒以0.5%之醋酸双氧铀予以负性染色，再于Hitachi 600电子显微镜(于75KV下操作)下观察。摄取放大35，000X之照片，再更进一步将照片放大。欲测定微脂粒之大小分布，乃以由三种不同之微脂粒制剂中摄得之显微照片来测量200个以上之微脂粒，并绘出柱状图。
实例1
将脂肪酸所衍生的单株抗体(抗-H2Kk)以Shen等人于Biochim.Biophys，Acta，689 31(1982)中所述之方法置入含有本发明适当的PE-PHC(8∶2)融合微脂粒之逆相蒸发囊胞(REV)(Szoka Jr.et al.，同上)中。而后将这些免疫微脂粒以含有140mM Calcein(作为标记)的PBS处理。
将小鼠L929细胞(K单套型)与这些已标记化之免疫微脂粒共同保温，且根据萤光检查法得知扩散之萤光乃遍及细胞，此系指Calcein染料已释至细胞质中。
比照之下，与含有Calcein之对PH不灵敏之免疫微脂粒共同保温之小鼠细胞，仅显示小斑点之萤光。
对照实验中，小鼠A31细胞(d单套型)与本发明之免疫微脂粒共同保温之结果，并无萤光可检出。
实例2
使用实例1或Philippot等人之方法，将含有一种译成定氮酶密码之基因的重组DNA(如质体PBR322等)装入本发明之PH灵敏性微脂粒中。而后将马铃薯原浆(它能有效地使细胞吸附微脂粒)加至微脂粒中。已细胞吸附化之微脂粒与原浆之浆质体膜发生融合，并将其DNA释至细胞质中。此DNA进入宿主之基因体后，重整一段时间，即可表现定氮酶之效力。而后，令原浆于整个马铃薯植物中再生。因其可固定大气中之氮，因此可增加谷类之产量。
实例3
使用实例1或Philippot等人之方法，将含有生长荷尔蒙结构基因诸如牛生长激素(参见Miller et al.，European Patent Appln.No 47.600以26，08.80 US 181，348为基础或Praser et al.，European Patent Appln.No.68，646，以08.06.81US271，449为基础)或人类之原生长激素(参见Baxt-er et al.，Eurropean Patent Appln No.20，147以01.06.79 US44，647为基础)等之重组DNA(如质体PBR322等)装入本发明之PH灵敏性微脂粒(除含有PE及PHC(8∶2)外，亦含有乳糖酰脑糖苷(1至10摩尔百分比))中。将这些微脂粒由静脉内注入动体，如小牛体中，再由肝细胞予以选择地吸收。(Szoka，Jr.et al.，Biochim Biophys.Res.Comm.，110 140(1983)，
入本文中以供参考。重整之DNA于进入基团后一段时间，可产生过量之生长激素。动物之生长速率因而增加。
实例4
使用实例1或Philippot等人，同上之方法，将含有译成病毒抗炎或其部分密码之基因(如B型肝炎基因体等，参见Tiollais et al.，U.K.Patent Appln.No.2，034，323或Galibert et al.，U.S.Patent No.4，428，941的重组DNA(如质体PBR322等)装至本发明之PH灵敏性微脂粒中(除3PE及PHC(8∶2)外，尚有乳糖酰脑苷(1至10摩尔百分比)中，将这些微脂粒由静脉内注入年轻或成年之动物(包括哺乳类诸如人等)体中。肝细胞对病毒抗原或其部分之表达方式系引发体内之免疫反应(制造抗体以对抗抗原)。因此，动物可接种此疫苗以抗病毒之感染。
权利要求
1、一种融合微脂粒之方法，其中包括
(1)制造含有至少20摩尔百分比两性分子(含一个或多个弱酸官能基团)之微脂粒；
(2)将这些来自步骤(a)之微脂粒的PH降至低于PH7。
2、根据权利要求
1的方法其中上述两性分子的弱酸官能基团系为一个或多个羧基团。
3、根据权利要求
2的方法，其中上述之两性分子系为长链(C12至C30)脂肪酸。
4、根据权利要求
3的方法，其中上述长链脂肪酸系由棕榈酸及油酸所择定。
5、根据权利要求
2的方法，其中上述两性分子系为棕榈酰高半胱酸。
6、根据权利要求
1的方法，其中在步骤(b)内，PH值被降至6.0以下。
7、根据权利要求
1的方法，其中在步骤(b)内，PH值被降低至5.0以下。
8、根据权利要求
1的方法，其中，步骤(b)系使用水性无机酸进行。
9、根据权利要求
8的方法，其中，水性无机酸为盐酸。
10、根据权利要求
1的方法，其中此方法又包括形成步骤(a)内之微脂粒而该微脂粒含有可形成六方相趋势之两性分子。
11、根据权利要求
10的方法，其中上述六方相两性分子系为磷脂酰乙醇胺或其酸加成性长链(C16-C24)酯。
12、根据权利要求
11的方法，其中上述长链酯系为二油酰磷脂酰乙醇胺。
13、根据权利要求
12的方法，其中二油酰磷脂酰乙醇胺对上述含一个或多个弱酸官能基团之两性分子之摩尔比约为8∶2。
14、根据权利要求
13的方法，其中上述含一个或多个弱酸官能基团之两性分子系由棕榈酰高半胱胺酸，棕榈酸及油酸所择定。
15、将外来的物质插至活细胞中之方法，其中此方法包括
(a)将外来物料装至由两性分子(含一个多或多个弱酸官能基团)所制成之PH灵敏性微脂粒中;且
(b)令上述活细胞与上述已内封之PH灵敏性微脂粒接触，因而发生插入作用。
16、根据权利要求
15的方法，其中步骤(a)之PH灵敏性微脂粒更进一步地含有可形成六方相趋势之两性分子。
17、根据权利要求
16的方法，其中六方相两性分子系由棕榈酰高半胱胺酸，由酸及棕榈酸所择定。
18、根据权利要求
16的方法，其中步骤(a)之两性分子系为磷脂酰乙醇胺。
19、根据权利要求
18的方法，其中PH灵敏性微脂粒含有的摩尔比由9∶1至1∶9之磷脂酰乙醇胺(PE)和棕榈酰高半胱胺酸(PHC)。
20、根据权利要求
19的方法，其中，PE/PHC摩尔比率系由5∶1至1∶5。
21、根据权利要求
19之方法，其中，PE/PHC摩尔比率为8∶2。
22、根据权利要求
15之方法，其中，外来物质有药、酵素、荷尔蒙、营养物、抗原、抗体、RNA、DNA及其结合物。
23、根据权利要求
第15项之方法，其中，活细胞胞系由酵母菌，藻，霉菌，细菌，哺乳动物之细胞培养及全体动物之细胞中所择定。
24、含有两性分子(含一或多个酸性官能基团)之已融合而未聚结之微脂粒。
25、根据权利要求
第25项之融合微脂粒，其中两性分子系选自棕榈酰高半胱胺酸，棕榈酸及油酸中。
26、根据权利要求
第25项之融合微脂粒，此微脂粒更进一步含有具形成六方相趋势之两性分子。
27、根据权利要求
第26项之融合微脂粒，其中，六方相两性分子系为磷脂酰乙醇胺。
28、根据权利要求
第27项之已融合，未集结微脂粒，其含有摩尔比由1∶9至9∶1之磷脂酰乙醇胺(PE)及棕榈酰高半胱胺酸(PHC)。
29、根据权利要求
第28项之融合微脂粒，其中PE对PHC之摩尔比由5∶1至1∶5。
30、根据权利要求
第28项之融合微脂粒，其中PE对PHC之摩尔比为8∶2。
31、含有摩尔比为8∶2之磷脂酰乙醇胺及油酸的融合微脂粒。
32、含有摩尔比率为8∶2之磷脂酰乙醇胺及棕榈酸的融合微脂粒。
专利摘要
当介质的pH值降至7以下时，含有磷脂酰乙醇胺，棕榈酰高半胱胺酸或油酸或棕榈酸的微脂粒快速地发生融合。微脂粒的融合作用系借(a)如同共振能之转移所示，将诸微脂粒脂质混合，(b)胶过滤法及(c)电子显微术测知。含有磷脂酰乙醇胺和棕榈酰高半胱胺酸(8∶2)的微脂粒在融合期间，几乎所有包含的钙黄绿素都会释出。微脂粒中包含有胆脂醇(40％)时，则可真正地减少漏失而不损及融合作用。使那些对pH灵敏的微脂粒融合，可以将生物活性分子，诸如DNA等递送至活细胞中。
文档编号A61K9/50GK85101588SQ85101588
公开日1986年10月29日 申请日期1985年4月1日
发明者利夫·黄康纳 申请人:田纳西大学研究公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan