鱼生长激素多肽的制作方法

专利名称:鱼生长激素多肽的制作方法
本发明涉及编码鱼生长激素多肽的DNA。
掺入该DNA的重组DNA，含有该重组DNA的微生物和用该微生物生产鱼生长激素多肽的方法。予期鱼生长激素在鱼养殖工业中具有多方面用途。
哺乳动物生长激素是在脑垂体产生的。已经明了哺乳动物生长激素的生物活性和结构。如关于人类生长激素，有U.J.Lewis等人〔J.Am，Chem Soc，80，4429(1958)〕;A.S.Hartree〔Biochem，J.，100，754(1966)〕;及C.H.Li等人〔Arch.Biochem，Biophys·(Suppl.)，1，327(1962)〕的报导。
许多关于分离鱼生长激素的报导中，已发表的有-由罗非鱼(Tilapias)分离S.W.Famer等，Gen.Comp.Endocrin，30，91(1976)由鲟鱼(Sturgeons)分离S.W.Farmer等，Endocrinology，108，377(1981)由鲤鱼(Carps)分离A.F.Cook等，Gen.Comp.Endocrin，50，335(1983)。
另一方面，已知的有哺乳动物生长激素基因，大鼠生长激素基因〔P.H.Seebarg等，Nature，270，486(1977)〕、牛和猪生长激素基因〔P.H.Seeburg等，DNA，2，37(1983)〕和人类生长激素基团〔J，A.Nartial等，Science，205，602(1979)〕。但尚没有关于鱼生长激素基因和用该基因依重组DNA技术生产鱼生长激素多肽之方法的报导。
鱼生长激素具有刺激鱼生长的作用，且可作为诱饵成分用于养鱼业。由鱼的脑垂体回收的生长激素的量是很有限的，因此，一直期望建立一种以较低成本大量生产鱼生长激素的方法。
本发明人研究了利用重组DNA技术生产鱼生长激素的方法。结果，本发明人成功地回收了互补于鱼生长激素多肽的且可用于产生鱼生长激素的DNA，制得了含该DNA的重组DNA以及含该重组DNA的微生物。即由鲑鱼脑垂体中提取信使RNA(mRNA)并合成互补于该mRNA的DNA(cDNA)。然后合成相应于鲑鱼生长激素N末端附近氨基酸序列的DNA探针，选择与DNA探针杂交的cDNA以克隆鲑鱼生长激素基因。进而测定cDNA的碱基序列。
本发明人进一步研究并发现，在培养含有重组DNA(其中掺入了编码鲑鱼生长激素的cDNA)之微生物的培养基中，形成并集聚了大量的鲑鱼生长激素多肽。
图1之(1)和(2)分别为依Okayama-Berg方法合成cDNA和构建含cDNA之重组质粒的流程图。
图2为质粒PSGH1、PSGH3和PSGH14中cDNA的限制性酶切图。
图3为构建重组质粒PSGHIB2的流程。虽然在pSGH1和pSGH2中存在许多MboⅡ位点，但只有图3中所指的位点是构建该质粒所必须的。
图4为构建重组质粒pSGHⅡB9和pSGHⅡC2的流程。
本发明提供了鱼生长激素多肽，如具有表1或表2中所示肽序列的多肽，以及生产这种多肽的方法。该多肽可按下述重组DNA技术生产。
即由鱼脑垂体分离出鱼生长激素的mRNA，并以之作为模板制备互补于该mRNA的DNA(cDNA)，之后制备掺入了该cDNA的重组质粒。将该重组质粒引入缩主微生物。可将该DNA和重组质粒用于在大肠杆菌等细菌中表达鱼生长激素基团。经培养携带有该重组质粒的微生物以生产鱼生长激素。
因此，本发明还提供编码鱼生长激素多肽的DNA、掺入了该DNA的重组DNA，以及含该重组DNA的微生物。
本发明的DNA和重组质粒是按下述一般方法制备的。
由属于鲱形目的鲑鱼(例如大麻哈鱼类大马哈鱼Oncorhynchus Keta)的脑垂体制备总RNA，并通过一个Oligo(dT)纤维素柱分离带有聚腺苷酸的RNA〔Poly(A)DNA〕。以poly(A)DNA作模板，并用反向转录酶合成双股DNA。用体外重组DNA技术，将该合成的DNA插入一个载体DNA。如大肠杆菌质粒DNA中，得到重组DNA。
制取本发明之DNA和重组DNA的方法，详述如下切取鲑鱼脑垂体并立即在液氮中冷冻，向冷冻的脑垂体加入硫氰酸胍盐，破坏并溶解脑垂体。将溶解的脑垂体铺在CsCl溶液层上并进行超离心，得到总RNA的沉淀物。另外，可将LiCl加入含硫氰酸胍盐的溶解材料中，以回收较纯的RNA沉淀物。
将提取的RNA溶解于NaCl或KCl高张溶液(如0.5M)，并通过一个Oligo(dT)纤维素柱，使带有聚腺苷酸〔Poly(A)〕的mRNA吸附在柱上。用水或高张盐水，如lomM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，以分离带有Poly(A)的mRNA。
cDNA的合成和将cDNA插入载体是依下述的Okayama-Berg方法〔Okayama & Berg，Mol.Cell，Biol.2，161(1982)〕进行的。
首先，合成一个载体引物。在一种适当的溶液如含有Tris-HCl缓冲液(如PH7.5，10mM)、MgCl2(如6mM)和NaCl(如10mM)的溶液中，用KpnⅠ处理载体如PCDV1，以在KpnⅠ位点切断PCDVl。在含有Tris-HCl缓冲液(如PH6.8，30mM)、卡可基酸钠(如140mM)、CoCl2(如1mM)、二硫苏糖醇(如0.1mM)和dTTP(如0.25mM)的溶液中，在一适当温度下(如37℃)，使DNA与末端脱氧核苷酸基转移酶温育适当时间(如20分钟)，以在载体DNA的两3′末端加上大约60个胸苷酸残基。之后，在含有Tris-HCl缓冲液(如PH7.5，10mM)、MgCl2(如6mM)和NaCl(如100mM)的溶液中用EcoRI切断DNA。用低胶质化温度琼脂糖凝胶电脉法(以下称LGT法)〔Lars Wies-landerAnalytical Biochemistry，98，305(1979)〕分离该消化溶液，以回收约3.1Kb的DNA片段。然后将该DNA溶解在NaCl或KCl高张溶液(如0.5M)中，并通过一个Poly(bA)纤维素柱，以只允许带有Poly(T)的载体引物分子吸附在柱上。用水或高张盐溶液如10mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，以分离带有Poly(T)的载体引物分子。
之后，按下述方法合成连接子DNA。在适当的溶液如含Tris-HCl缓冲液(PH7.5，10mM)、MgCl2(如6mM)和NaCl(如50mM)的溶液中，用PstⅡ处理PLI DNA，以在PstⅠ位点切断之。以如合成载体引物的同样方法处理该DNA，所不同的只是以dGTP代替dTTP，同时加入约150ligo(dG)链。在适当的溶液如含Tris-HCl缓冲液(如PH7.5，10mM)、mgCl2(如6mM)和NaCl(如60mM)的溶液中以HindⅢ切断DNA。用琼脂糖凝胶电泳法分离出约0.5K
的DNA片段，并用DEAE滤纸回收之，从而得到连接子DNA。
按下述方法，以所得到的Poly(A)RNA，载体引物和连接子DNA合成cDNA。在含Tris-HCl缓冲液(如PH8.3，50mM)、MgCl2(如8mM)、KCl(如30mM)、二硫苏糖醇(如0.3mM)、以及dATP、dTTP、dCTP和dGTP(如各为2mM)的溶液中，于一适当温度下(如37℃)，用反向转录酶处理Poly(A)RNA和载体引物，至一适当的时间(如40分钟)。以加(dT)链至载体引物上所用的同样条件，在如此得到的RNA-DNA双股的3′末端加上约15bOligo(dc)链，所不同的只是以加dCTP代替dTTP。在含Tris-HCl缓冲液(如pH7.5，10mM)、MgCl2(如6mM)和NaCl(如60mM)的溶液中，用HindⅢ切断该DNA。该DNA与前已制备的连接子DNA混合，在含Tris-HCl缓冲液(如pH7.5、20mM)、MgCl2(如4mM)、(NH4)2SO4(如10mM)、KCl(如0.1M)和β-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)(如0.1mM)的溶液中，于适当温度下(如12℃)，将该混合物与大肠杆菌DNA连接酶温育一适当时间(如16小时)，以制备cDNA环和连接子DNA。向反应溶液中加各为40mM(终浓度)的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，并加入大肠杆菌DNA连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和大肠杆菌核糖核酸酶H，以用DNA置换RNA部分并得到含完整双股cDNA的重组质粒。
可用Scott等人的方法〔Katsuya ShigesadaSaibo Kogaku(Cell Engineering)、2，616(1983)〕，用如此得到的重组质粒转化大肠杆菌菌株，如大肠杆菌c600SF8。因为上述重组质粒中存在一个氨苄青霉素抗性基因，所以该大肠杆菌转化细胞是抗氨苄青霉素的。
依如下方法由氨苄青霉素抗性(APR)菌株中选出携带一个新的重组质粒DNA(具有一个互补于鱼生长激素之mRNA的基因)的微生物菌株。即，将由上得到的转化细胞固定在硝酸纤维素滤纸上，在其上与具有由已知鲑鱼生长激素多肽氨基酸序列推定之DNA序列的合成的DNA探针杂交，以选择表现强杂交的转化细胞〔Grunstein-Hogness的方法，Proc.Natl，Acad，Sci，USA.，72，3961〕。该探针DNA是用一般惯用的三酯法〔triester method)〔J.Am，Chem.Soc.，97，7327(1975)〕合成的。合成的DNA探针进行选择，是按Southern等人的方法〔J.Mol.Biol.，98，503(1975)〕更为确切地完成的，用如上所述的同样方法
定带有互补于鲑鱼生长激素mRNA之基因的重组质粒。
如此得到的重组质粒有PsGHl和PSGH14。此质粒可用以作为编码鲑鱼生长激素之DNA的来源。
通过在微生物体内表达编码鲑鱼生长激素的DNA，以生产鲑鱼生长激素多肽由携带该DNA的质粒切掉编码鲑鱼生长激素的DNA，并将其插入载体DNA。将所得到的重组DNA掺入微生物内，并培养如此得到的转化细胞，以在培养基中聚集鲑鱼生长激素多肽。然后，由培养物中回收鲑鱼生长激素。
上述的PSGH1和PSGH14便是含编码鲑鱼生长激素之DNA的较好质粒。
作为载体DNA，只要是将DNA掺入其中并能在微生物体内表达的任何载体均可使用。最好是使用能使外来DNA插入适当启动子如trP启动子、lac启动子或PL启动子之下游，且Shine-Dalgarno序列(下文称SD序列)和起始密码子(ATG)之间的长度校准到6-18碱基对的载体DNA。较好的载体DNA如质粒PGEL1。质粒PGEL1如图3和图4图解所示，含该质粒的微生物为大肠杆菌IGEL1，已于1984年9月6日以寄存号FERM BP-629寄存于工业科学和技术局的发酵研究所(以下称FRI)。编码这种多肽的DNA与载体DNA的重组可按常规的重组DNA技术完成，其中包括用限制性内切酶消化丙DNAS片段，并用T4DNA连接酶连接之。
如图3所图解说明的制备PSGH1和PGEL1中，编码鲑鱼生长激素的MboⅡ-SalⅠ消化片段和SalⅠ-BamHⅠ消化片段是分别由PSGH1制备的，并由PGEL1制备含色氨酸启动子的HindⅢ-BamHⅠ消化片段。另一方面，制备如下所示的合成的DNA连接子。
用T4DNA连接酶连接DNA片段和上述合成的DNA连接子，得到如图3中图解所示的重组质粒PSGH1B2。该质粒编码成熟的鲑鱼生长激素。
如图4所示的制备pSGH14和pGEL1中，进行两步骤构建。即分别由pSGH1制备编码鲑鱼生长激素成熟肽之N末端附近序列的MboⅡ-PVuⅡ消化片段和含残存的CDNA及载体部分的PVuⅡ-HindⅢ消化片段。另一方面，制备如下所示的合成的DNA连接子。
用T4DNA连接酶连接DNA片段和上述之合成的DNA连接子，得到如图4所示的重组质粒PSGHⅡB9。之后，由PSGHⅡB9得到编码鲑鱼生长激素成熟肽的HindⅢ-BamHⅠ消化片段，由pGEL1得到含色氨酸启动子的HindⅢ-BamHⅠ消化片段。用T4连接酶连接两DNA片段，得到如图4所示的重组质粒PSGHⅡC2。该质粒具有一个其编码成熟鲑鱼生长激素的区域与色氨酸启动子下游相连接的构建方式。
上述重组DNA技术所需的反应条件一般为如下所述。
用限制性内切酶消化DNA过程通常是在含2-200mM(最好10-40mM)Tris-HCl(PH6.0-9.5，最好7.0-8.0)、0-200mM NaCl和2-30mM(最好5-10mM)MgCl2的混合物中，以0.1-20μg DNA与每1μg 0.1-100单位、最好1-3单位的限制性内切酶，于20-70℃(最适温度依据所使用的限制性内切酶而定)反应15分钟至24小时。通常于55-75℃加热5-30分钟使反应停止，或者是用如苯酚和二乙基焦碳酸盐等试剂使限制性内切酶失活以终止反应。
用LGT方法式聚丙烯酰胺胶电泳法纯化经用限制性内切酶消化所产生的DNA片段。
DNA片段间的连接通常是在含2-200mM(最好10-40mM)Tris-HCl(PH6.1-9.5，最好7.0-8.0)、2-20mM(最好5-10mM)MgCl2、0.1-10mM(最好0.5-2.0mM)ATP和1-50mM(最好5-10mM)二硫苏糖醇的混合物中，用0.3-10单位T4DNA连接酶于1-37℃(最好3-20℃)处理15分钟至72小时，最好是2-20小时而完成的。
将连接反应产生的重组质粒DNA依Cohen等人的转化方法〔S.N.Cohen等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，69，2110(1972)〕引入大肠杆菌中。
依实施例1中所述的方法或Birnboim等人的方法〔H.C.Birnboim等Nucleic Acids Res.，I，1513(1979)〕，由携带该DNA的大肠杆菌中分离重组质粒DNA。
用1-10种限制性内切酶消化质粒DNA，并用琼脂糖凝胶电泳法或聚丙烯酰胺
胶电泳法检定各裂解位点。此外，如有必要，则用Maxam-Gilbert的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，74，560(1977)〕或Sanger的方法〔Sanger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977);Amersham公司M13 Cloning and Sequencing handbook〕测定DNA的碱基序列。
可依上述方法制得重组质粒DNA。
按下述方法生产本发明之鱼生长激素多肽。即用质粒PSGHIR2和PSGHⅡC2转化大肠杆菌K-12HB101，并由氨苄青霉素抗性菌落中选择携带PSGHIB2或PSGHⅡC2的大肠杆菌菌株。在一种培养基中培养携带PSGHIB2或PSGHⅡC2的大肠杆菌菌株，以在培养的细胞中产生鱼生长激素多肽。
作为培养基，不管是合成的培养基还是天然培养基，只要适合于大肠杆菌生长并产生鱼生长激素多肽，均可用。
可用葡萄糖、果糖、乳糖、甘油、甘露醇、山梨醇等作为碳源。
可用NH4Cl、(NH4)2SO4、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、多胨、肉类提取物、细菌用胰化胨、谷类浸泡液等作为氮源。
另外，可用的营养素如有K2NPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、维生素B1和MgCl2。
培养是在通气和搅动下，于pH5.5-8.5和温度为18-40℃时进行的。
培养5-90分钟后，在培养的细胞中即有鲑鱼生长激素多肽聚集。用溶菌酶处理收集的细胞，经反复冻融破坏之，并进行离心。依提取多肽的常用方法，提取如此得到的上清液，以回收这种多肽。
经在Laemmli的样品缓冲液〔Laemmli，Nature，227，680(1970)〕中直接加热溶解培养的细胞并进行SDS聚丙烯酰胺
胶电泳〔Laemmli的方法，参考文献同上〕和苦马氏亮兰染色，以检测此多肽。
通过下列有代表性的实施例阐述本发明的某些特殊之点。
实施例 1从鲑的脑垂体制备聚(A)RNA根据硫氰酸鈲-氯化铯方法〔edited ly Maniatis，et al.Molecular Cloning，P 196，pullished ly Cold Spring Harlor;Katsuya Shigesada，Sail.o Kogaku(Cell Engineering)，2，616(1983)〕由鲑的脑垂体制备具有聚(A)的一种RNA，该方法如下在这步骤中，2克冰冻的鲑的脑垂体(相当于约30个脑垂体)，在聚四氟乙烯匀浆器中，(每分钟5转)破碎并溶解在10毫升的溶液中，此溶液含有4M的硫氰酸鈲盐，0.5%的甲基甘氨酸，5mM的柠檬酸钠(PH7)和0.1M B-巯基乙醇的溶液中。将匀浆通过18G注射器以切断DNA，并放在超速离心管的1.2ml5.7 MCsCl和0.1MEDTA(PH8)的液层上。在Hitachi RPS40旋转器中(Hitachi Ltd的产品)，在每分钟35，000转的转速下离心15小时，以回收RNAs沉淀。将RNA沉淀溶解在含有1mM EDTA，10毫升Tris-HCl(PH8.0)溶液中，用酚-氯仿萃取后，RNA用乙醇沉淀而回收。这样得到的1毫克RNA溶解在含有10mM的Tris-HCl(PH8.0)和1mM EDTA的1毫升溶液中。该溶液在65℃培养5分钟，并加入0.1毫升的5mM NaCl，混合物在Oligo(dT)纤维素色谱柱(P-L生物化学公司的产品，柱体积为0.5毫升)进行色谱分析。具有聚(A)的mRNA被吸附在柱上，用含有10mM的Tris-HCl(PH7.5)和1mM EDTA溶液洗脱，并以每份0.2毫升收集，在第3到第5份中得到约10微克的具有聚(A)的mRNA。
实施例2CDNA的合成及CDNA插入载体中CDNA的合成及携带CDNA的重组质粒的构建是根据如下的Okayama-Berg的方法进行的〔Mol.Cell.Biol.，2，161(1982)〕过程示于图1中。
在这步骤中，将400微克的PCDV1〔Okayama和BergMol，Cell.Biol.，3，280(1983)〕加到含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，6mM MgCl2和10mM NaCl的300微升的溶液中，再加入500单位的KPnⅠ〔Takara Shuzo，公司的产品，限制酶在下文都用Takara Shuzo公司的产品，除非另外注明。〕反应在37℃进行6小时以使在KPnⅠ位点切开质粒。用酚-氯仿萃取后，DNA用乙醇沉淀，回收。将用KPnⅠ切下的约200微克的DNA加到200微升的溶液中，该溶液是将0.25mM浓度的dTTP加入一种缓冲液中(此后称为缓冲液)而配制成。缓冲液中含有40mM的二甲基胂酸钠，30mM Tris-HCl(PH6.8)，1mMCaCl2和0.1mM的二硫苏糖醇(此后称为DTT)，此外再入81单位的末端脱氧核苷酸转移酶(此后称为TdT)(P-L生物化学公司的产品)，反应在37℃进行11分钟，因此，约67聚(dT)链被加在用KPnⅠ切开的PCDV1的3′末端，用酚-氯仿萃取和乙醇沉淀，由溶液中回收约100微克的和聚(dT)链结合的PCDV1 DNA。将DNA加到150微升含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，6mM MgCl2和10mM NaCl的缓冲液中，此外，加入360单位的E CoRI，反应在37℃进行2小时。反应产物用LGT方法处理得到约60微克具有聚(dT)链的PCDV1约为3.1Kb的DNA片段。将这种DNA溶解到500微升含有10mMTris-HCl(PH8.0)和1mM EDTA的溶液中，这种溶液在65℃培养5分钟，并在以冰冷却的条件下加入50微升5M NaCl，混合物用Oligo(dA)纤维素色谱柱(Collalorative研究所的产品)进行色谱分析。具有足够的聚(dT)链的DNA在色谱柱上吸附，用含有10mM Tris-HCl(PH8.0)和1mM EDTA的溶液洗脱，得到27微克具有聚(dT)链的PCDVl(此后称作载体引物)。
然后，如下制备DNA连接子约14微克的PLI〔Okayama和BeryMog Cell.Biol.，3，280(1983)〕加到200微升含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，6mM MgCl2，和50mM NaCl的缓冲液中，再加入50单位的PStI，反应在37℃进行四小时，在PStⅠ位点切开PL1 DNA。这种反应产物用酚-氯仿萃取，并用乙醇沉淀，以回收约13微克在PStⅠ位点切开的PL1DNA。约13微克DNA加到50微升含有0.25mMd GPT(最终浓度)的TdT缓冲液中，然后再加入54单位的TdT(P-L生物化学公司的产品)，并在37℃培养13分钟，以在用PStⅠ切开的PL1的3′末端加上约14(dG)链。用酚-氯仿萃取，并用乙醇沉淀，回收DNA，将DNA加入100微升含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，6mMMgCl2和60mM NaCl的缓冲溶液中。再加入80单位的HindⅢ，并在37℃培养3小时以使在Hind Ⅲ位点切开PL1，反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，用DEAE纸方法〔Dretzen，等，anal.Biochem.，112，295(1981)〕回收约0.5KbDNA片段。这种DNA是具有Oligo(dG)链的DNA连接子(此后称为连接子-DNA)。
约2微克的聚(A)RNA和约1.4微克上述制备的载体引物溶解在22.3微升含有50mM Tris-HCl(PH8.3)，8mM MgCl2，30mMKCl，0.3mM的DTT，2mM的NTP(dATP，dTTP，dGTP和dCTP)和10单位的核糖核酸酶抑制剂(P-L生物化学公司的产品)的溶液中。加入10单位的逆向转录酶(Seikagaku Kogyo公司的产品)在37℃培养40分钟，以使DNA合成互补到mRNA上的DNA。反应产物用酚-氯仿萃取，并用乙醇沉淀以回收。连接RNA-DNA双链的载体引物DNA，该DNA溶解在20微升含有66μM dCTP和0.2微克的聚(A)的TdT缓冲溶液中。加入14单位的TdT(P-L生物化学公司的产品)，在37℃培养8分钟，在cDNA的3′末端加上12(Cd)链，反应产物用酚-氯仿萃取和用乙醇沉淀以回收连结有(dc)链的CDNA-载体引物DNA。这种DNA溶解在400微升含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，6mM MgCl2和60mM NaCl的溶液中。加入20单位的Hind Ⅲ，并在37℃培养2小时，以使在Hind Ⅲ位点切开这种DNA。反应产物用酚一氯仿萃取，并用乙醇沉淀，得到0.5Pmole(微微克分子浓度)的连接有(dc)链的cDNA一载体引物DNA。然后将0.08Pmole的这种DNA和0.16Pmole上述的连接子-DNA加到40微升含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，0.1mM的氯化钠和mM EDTA的溶液中，分别在65℃，42℃及0℃培养10分钟，25分钟及30分钟。将这反应溶液调节到400微升体积(总体积)其组分为20mM Tris-HCl(PH7.5)4mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，0.1M KCl和0.1mM的β-NAD。将10单位的大肠杆菌DNA连接醇(新英格兰Biolals的产品)加入反应溶液，并在11℃培养过夜，将这种反应溶液调节到含有40μM的dNTP和0.15mM的β-NAD。加入5单位的大肠杆菌DNA连接酶，7单位的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(P-L生物化学公司的产品)在12℃培养1小时，并继续在25℃培养1小时，用上述反应，含有CDNA的重组DNA是环形的RNA-DNA双链的RNA部分用DNA代替，并形成一种具有完全双链DNA的重组质粒。
实施例3含有鲑生长激素CDNA的重组DNA的选择根据SCott等〔Katsuya ShigesadaSailo Kogaku(Cell Engcneering)2，616(1983)〕的方法用例2中得到的重组质粒，将大肠杆菌C600SF8〔CameronProc.natl.acad.Sci.nSA，72，3416(1975)〕进行转化，在10，000个这样得到的菌落中4800菌落固定在硝基纤维素上。选择8菌种在40℃时用探针强烈杂化，其中合成的DNA相当于从鲑生长激素N一末端的第23到第28氨基酸序列，即1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 175′-A A A A T G T T T A A C G A C T T(G) (C) (T) (T)(这里第三个碱基是A或G，第九个是T或C，第十二个是C或T，第十五个是C或T，并和碱基的结合组成16种合成DNAs)用32P标记〔grunstein-Hogness方法Proc natl acad Sci，uSA.72，3961(1975)〕它用Southern方法证明了〔J.mol Biol，98，503(1975)〕用上述探针杂化的8个菌种和合成的DNA探针相当于C一末端附近的氨基酸的序列1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 145′-C A C A A A G T A G A G A C(T) (G) (T) (A)(G)(G)(这里第三个碱基为C或T，第六个是A或G，第九个是A，T，G或C，第十二个是G或A及碱基的结合形成32种合成的DNAs)。这种分别称为PSGH1，3，6，8，9，10，14，和17的质粒具有从已知的鲑生长激素的氨基酸所假设的DNA的序列，并认为含有生长激素CDNA。
实施例4质粒PSGH1和PSCH14的碱基序列8个由上面得到的质粒用不同的限制性内酶水解，并测定CDNA部分的割裂图。这种质粒从限止性核酸内切酶位点分成3组，即
PSGH1，6，9，10和17组，pSGH3组，PSGH8组每组的限止性核酸内切酶图示于图2。
与合成DNA探针朵化最强的质粒转译区的整个核苷酸的序列的进行如例3中所示，并认为几乎有完善的CDNA，特别是PSGH1按Sanger法用M13噬菌体进行测定〔Sanger，等，Proe natl acad Sci USA，74 5463(1977)amersham M13Cloning and Seauencing handlook〕，这种序列示于表1。在表1中，碱基数1-66编码用于单肽，67-630编码用于成熟的鲑生长激素多肽。
此外，在限止点不同于包括PSGH1组的PSGH8和PSGH14中，认为含有较长的CDNA，并有几乎完全长度的PSGH14，按Sanger方法用M13噬菌体处理。
表1一 基因的密码〔通用的〕10 20A T G G G A C A A G T G T T T C T G C TM e T G l y G l n V a l P h e L e u L e30 40G A T G C C A G T C T T A C T G G T C Au M e t P r O V a l L e u L e u V a l S50 60G T T G T T T C C T G A C T C A A G G Ge r C y S P h e L e u S e r G l n G l y70 80
G C A G C G A T A G A A A A C C A A C GA l a A l a I l e G l u A S n G l n A r90 100G C T C T T C A A C A T C G C G G T C Ag L e u P h e A S n I L e A l a V a l S110 120G T C G G G T G C A A C A T C T C C A Ce r A r g V a l G l n H i S L e u H i S130 140C T A T T G G C T C A G A A A A T G T TL e u L e u A l a G l n L y S M e t P h150 160C A A T G A C T T T G A C G G T A C C Ce A S n A S P P h e A S P G l y T h r L170 180T G T T G C C T G A T G A A C G C A G Ae u L e u P r O A S P G l u A r g A r g190 200C A G C T G A A C A A G A T A T T C C TG L n L e u A S n L y S I l e P h e L e210 220G C T G G A C T T C T G T A A C T C T Gu L e u A S P P h e C y S A S n S e r A230 240
A C T C C A T C G T G A G C C C A G T CS P S e r I l e V a l S e r P r O V a l250 260G A C A A G C A C G A G A C T C A G A AA S P L y S H i S G l u T h r G l n L y270 280G A G T T C A G T C C T G A A G C T G CS S e r S e r V a l L e u L y S L e u L290 300T C C A C A T T T C T T T C C G T C T Ge u H i S I l e S e V P h e A r g L e u310 320A A T G A A T C C T G G G A G T A C C CI l e G l u S e r T r P G l u T y r P r330 340T A G C C A G A C C C T G A T C A T C TO S e r G l n T h r L e u I l e I l e S350 360C C A A C A G C C T A A T G G T C A G Ae r A S n S e r L e u M e t V a l A r g370 380A A C G C C A A C C A G A T C T C T G AA S n A l a A S n G l n I l e S e r G l390 400
G A A G C T C A G C G A C C T C A A A Gu L y S L e u S e r A S P L e u L y S V410 420T G G G C A T C A A C C T G C T C A T Ca l G l y I l e A S n L e u L e u I l e430 440A C G G G G A G C C A G G A T G G C G TT h r G l y S e r G l n A S P G l y V a450 460A C T G A G C C T G G A T G A C A A T Gl L e u S e r L e u A S P A S P A S n A470 480A C T C T C A G C A G C T G C C C C C CS P S e r G l N G l N L e u P r O P r O490 500T A C G G G A A C T A C T A C C A G A AT y r G l y A S n T y r T y r G l n A S510 520C C T G G G G G G C G A C G G A A A C Gn L e u G l y G l y A S P G l y A S n V530 540T C A G G A G G A A C T A C G A G T T Ga l A r g A r g A S n T y r G l u L e u550 560
T T G G C A T G C T T C A A G A A G G AL e u A l a c y S P h e L y S L y S A S570 580C A T G C A C A A G G T C G A G A C C TP M e t H i S L y S V a l G l u T h r T590 600A C C T G A C C G T C G C C A A G T G Cy r L e u T h r V a l A l a L y S C y S610 620A G G A A G T C A C T G G A G G C C A AA r g L y S S e r L e u G l u A l a A S630C T G C A C T C T G T A Gn C y S T h r L e u ＊ ＊ ＊表2基因的密码〔通用的〕10A T G G G A C A A G T G T T T C T G C TM e t G l y G l n V a l P n e L e u L e30 40G A T G C C A G T C T T A C T G G T C Au M e t P r O V a l L e u L e u V a l S50 60
G T T G T T T C C T G A G T C A A G G Ge r C y S P h e L e u S e r G l n G l y70 80G C G G C G A T G G A A A A C C A A C GA l a A l a M e T G l u A S n G l n A r90 100G C T C T T C A A C A T C G T G G T C Ag L e u P h e A S n I l e V a l V a l A110 120A C C G G G T G C A A C A C C T C C A CS n A r g V a l G l n H i S L e u H i S130 140C T A T T G G C T C A G A A A A T G T TL e u L e u A l a G l n L y S M e t P h150 160C A A C G A C T T T G A A G G C A C C Ce A S n A S P P h e G l u G l y T h r L170 180T G T T G T C T G A T G A A C G C A G Ae u L e u S e r A S P G l u A r g A r g190 200C A G C T G A A C A A G A T A T T C C TG l n L e u A S n L y S I l e P h e L e210 220
G C T G G A C T T C T G T A A C T C T Gu L e u A S P P n e C y S A S n S e r A230 240A C T C C A T C G T G A G C C C C A T CS P S e r I l e V a l S e r P r O I l e250 260G A C A A G C A G G A G A C T C A G A AA S P L y S G l n G l u T h r G l n L y270 280G A G T T C A G T C C T G A A G C T G CS S e r S e r V a l L e u L y S L e u L290 300T C C A T A T C T C T T T C C G C C T Ge u H i S I l e S e r P h e A r g L e u310 320A T T G A A T C C T G G G A G T A C C CI l e G l u S e r T r P G l u T y r P r330 340T A G C C A G A C C C T G A C C A T C TO S e r G I n T h r L e u T h r I l e S350 360C C A A C A G C C T A A T G G T C A G Ae r A S n S e r L e u M e t V a l A r g370 380
A A C T C C A A C C A G A T C T C T G AA S n S e r A S n G l n I l e S e r G l390 400G A A G C T C A G C G A C C T C A A A Gu L y S L e u S e r A S P L e u L y S V410 420T G G G C A T C A A C C T G C T C A T Ca l G l y I l e A S n L e u L e u I l e430 440G A G G G G A G C C A G G A A G G G G TG l u G l y S e r G l n G l u G l y V a450 460A C T G A G C C T G G A T G A C A A T Gl L e u S e r L e u A S P A S P A S n A470 480A C T C T C A G C A T C T G C C C C C CS P S e r G l n H i s L e u P r O P r O490 500T A C G G G A A C T A C T A C C A G A AT y r G l y A S n T y r T y r G l n A S510 520C C T G G G G G G C G A C G G C A A C Gn L e u G l y G l y A S P G l y A S n V530 540
T C A G G A G G A A C T A C G A A C T Ga l A r g A r g A S n T y r G l u L e u550 560T T G G C C T G C T T C A A G A A G G AL e u A l a C y S P h e L y S L y S A S570 580C A T G C A T A A G G T T G A G A C C TP M e t H i S L y S V a l G l u T h s T590 600A C C T G A C C G T C G C T A A G T G Cy r L e u T h r V a l A l a L y S C y S610 620A G G A A G T C A C T G G A G G C C A AA r g L y S S e r L e u G l u A l a A S630C T G C A C T C T G T A An C y S T h r L e u ＊ ＊ ＊在图2中，碱基数1-66密码用于单肽，67-630密码用于成熟的蛙生长激素多肽。
在188氨基酸中的单肽的22个氨基酸中，由CDNA编码的多肽与由PSGHI编码的多肽完全相同，但在成熟的12个氨基酸中是不同的，如表2用划线于下表示。此外，只有鲑生长激素多肽所测定的N-末端40个氨基酸序列指出5个氨基酸是明显不同的。然而，鲑生长激素PSGH14含有的CDNA密码不同于PSGH1。含有PSGH1和PSCH14的大肠杆菌以大肠杆菌ESGH1(FERM BP-551)和ESGH14(FERMBP-611)已分别于1984年6月23和1984年9月20日寄存在FRI实施例5编码成熟的鲑生长激素多肽的重组质粒PSGHIB2在这例子中，5微克含有编码鲑生长激素多肽的DNA的质粒PSGHI溶在40微升含20mM的Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，10mMNaCl(此后称为“Y-10缓冲液”)溶液中，然后，加入10单位的限制酶molⅡ(新英格兰生化实验公司的产品)，水解反应在37℃进行3小时。将溶液中的NaCl浓度调节到175mM，加入10单位的SalⅠ，水解反应在37℃进行3小时，用LGT法从反应溶液中得到约0.2微克相当于N-末端区的163碱基对的DNA片段。
然后，5微克的PSGH1溶解在40微升的含有20mMTris-HCl(PH7.5)，mMMgCl2和100mMNaCl的溶液中(此后称为“Y-100缓冲液”)。加入10单位的BamHI，水解反应在37℃进行3小时。然后，将反应溶液中的NaCl调节到175mM，加入10单位的SalⅠ，水解反应在37℃进行3小时，用LGT法由反应溶液中得到约0.5μg含有C-末端区和3′-非转译区的约900碱基对的DNA片段。
分别将5微升的PGEL1溶解在40微升的Y-100缓冲液中，并加入BamHⅠ和HindⅢ各10个单位。水解反应在30℃进行3小时，从反应溶液中得到约1微克含有色氨酸启动基因2.7仟碱基的DNA片段。
为了加入一种对编码成熟的鲑生长激素多肽的DNA表达所必要的转译起始密码子ATG，并连接载体DNA和上述提到的DNA，如下合成DNA连接子。
用常规的triester方法〔R.Crea，etalProc，natl，acad，Sci.，75，5765(1978)〕。合成DNAs17-聚合物和12聚合物的两种单链，然后，将各12Pmole的17聚合物和12聚合物DNAs溶于20微升的含50mMTris-HCl(PH7.5)，10mMMgCl2，10mM的二硫苏糖醇和1mM ATP的溶液中，加入六个单位的4T聚核苷酸激酶(Takara Shugo公司的产品)硷酸化作用在37℃进行60分钟。
然后，将上面得到的Pmole PSGH1的MboⅡ-SalⅠ片段(163碱基对)，0.06Pmole PSGH1的SalⅠ-BandHI片段(约900碱基对)和0.02Pmole PGEL1的HindⅢ-Bam HI片段(约2.7仟碱基)溶解在30微升的含50mMTris-HCl(PH7.5)，10mM的二硫苏糖醇和1mM ATP溶液中。加入5微升的上述得到的合成DNA硷酸化反应溶液，并在混合物中加入6个单位的T4DNA连接酶(Takara Shuzo公司的产品)，连接反应在4℃进行18小时。
用反应溶液将大肠杆菌HBlol〔BoliVer，等，gene，2，75(1977)转化而得到一种APR菌落，图中说明的质粒DNAPSGHIB2从菌落中回收。PSGHIB2的结构是由分裂成ECORI，HindⅢ，ClaI，BgⅢ，SalⅠ和Bam HI，并用琼脂糖凝胶电泳而承认。根据Sanger方法〔Sanger，等;Proc natl acad Sei USA，74，5463(1977);amersham Co，M13 Cloning and Sequencing handbook〕用M13噬菌体测定3在PSGH1B2中编码鲑生长激素多肽的N-末端区的DNA序列，并说明如下
结果证明了PSGHIB2含有编码成熟的鲑生长激素多肽的DNA含有质粒PSGHIB2的大肠杆菌在1948年9月20日以大肠杆菌ESGHIB2，寄存号为FERMBP-612，寄存于FRI。
实施例6(1)由PSGH14构建编码成熟的鲑生长激素多肽的重组质粒PSGHⅡB9在这个例子中，将5微克含有编码鲑生长激素多肽的DNA的质粒PSGH14溶解在100微升的含20mMTris-HCl(PH7.5)，10mMNaCl，和10mMNaCl的溶液中，然后，加入10单位的限制酶MboⅡ(新英格兰Biolabs的产品)，水解反应在37℃进行3小时，在溶液中的NaCl的浓度调节到50mM，加入10个单位的PVuⅡ。水解反应在37℃进行3小时，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DEAE纸法从反应溶液中得到约0.05g的相当于N-末端区108碱基对的DNA片段。
然后，将5微克的PSGH14溶解在40微升含有20mMTris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，和50mMNaCl(以后称为“Y-50缓冲液”)的溶液中。加入PVuⅡ和HindⅢ各10个单位，(消化)水解反应在37℃进行3小时。用LGT法从反应溶液中得到约0.5微克的含有由PSGH14产生的生长激素C-末端区和3′非转译区的约3.3仟碱基的DNA片段和部分载体。
为了加入一个编码成熟的鲑生长激素多肽的DNA表达所必要的转译的起始密码子ATG，并连接载体DNA和上述的DNA，如下合成DNA连接子
用常规的triester方法〔R.Crea，等，Proc，natl，acad，Sci，uSA，75，5765(1978)〕合成14聚合物和9聚合物的二个单链DNAs。然后，将14-聚合物各39Pmole溶解在20微升含50mMTris-HCl(PH7.5)，10mMMgCl2，10mM二硫苏糖醇和1mM的ATP溶液中。加入6个单位的T4聚核苷酸激酶(Takara Shuzo公司的产品)，硷酸化反应在37℃中进行60分钟。
然后，上述得到的0.08Pmole的PSGH14 MboⅡ-PVuⅡ片段(108碱基对)和0.02Pmole的PSGH14的PVuⅡ-HindⅢ片段(约3.7仟碱基)溶解在30微升含50mMTris-HCl(PH7.5)，10mMMgCl2，10mM的二硫苏糖醇和1mM的ATP的溶液中。加入5微升的上面得到的硷酸化反应溶液合成的DNA。将6单位的4TDNA连接酶加到混合物中，连接反应在4℃下进行10个小时。
大肠杆菌HB 101〔BoliVar，等，gene，2，75(1977)〕用反应溶液转化得到一种APR菌落，如图4所示的质粒DNA PSGHIIB9，是从菌落中回收的。由分裂成HindⅢ，XbaⅠ，BglⅢ和Bam HI和琼脂糖凝胶电泳而承认PSGHⅡB9的结构。
(2)在PSGHⅡB9中将编码成熟的鲑生长激素多肽区域插入表达载体PGEL1在这步骤中，将5微克PSGHⅡB9溶于40微升的Y-50缓冲液中，加入Bam HI和HindⅢ各10单位，水解反应在37℃进行3小时，用LGT方法从反应溶液中得到0.1微克编码完全成熟的鲑生长激素多肽的约1200碱基对的DNA片段。
分别地将5微克的PGEL1溶解在40微升的Y-50缓冲液中，单加入Bam HI和Hind Ⅲ各10单位，水解反应在37℃进行3小时，用LGT法从反应溶液中得到约0.1微克含有色氨酸启动基因的约2.7仟碱基的DNA片段。
然后，0.01微克PSGHIIB9的HindⅢ-BamHⅠ片段(约1200碱基对)和0.015微克的PGELⅠ的Hind Ⅲ-Bam HI片段(约2.7仟碱基)溶解在30微升含50mM Tris-HCl(PH7.5)，10mMMgCl2，10mM的二硫苏糖醇和1mM ATP的溶液中，加入6单位的T4DNA连接酶，连接反应在4℃进行18个小时。
用反应溶液转化大肠杆菌101，而得到APR菌落，示于图4的质粒DNA PSGHlIC2，是从菌落中回收的。PSGHIIC2的结构由分裂成ECORI，HindⅢ，ClaI，BgⅢ和Bam HI和琼脂糖凝胶电泳而承认PSGHIIC2的构建。
含有质粒PSGHIIB9和PSGHIIC2大肠杆菌菌株已于1985年2月8日以大肠杆菌ESGHIIB9和ESGHIIC2，分别以FERMBP-707和708的寄存号，寄存在FRI。
实施例7由含有PSGHIB2或PSGHIIC2的大肠杆菌产生新的鲑生长激素多肽。
大肠杆菌W3110(FERMBP-723)与在例5或例6中用常规的方法得到重组质粒PSGHIB2或PSGHIIC2进行转化。将得到的APR菌落在8毫升含有0.6%Na2HPO4，0.3%KH2PO4，0.5%NaCl，0.1%NH4Cl，0.5%葡萄糖，0.5%色氨酸，1mMMgSO4和4微克/毫升维生素B1的MCG培养基中(PH7.2)培养，在30℃培养18小时，培养基用每分钟8，000转的转速离心10分钟，以回收细胞，该细胞悬浮在Laemmli的样品缓冲液中，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，和考马斯亮兰染色测定分子量约为25，000的部分的多肽带，这种带在用不含质粒的大肠杆菌的情况下是看不到的，结果证明，带有PSGHIB2或PSGHIIC2的大肠杆菌可产生大量的鲑的生长激素多肽。
权利要求
1.具有如表1或表2所示的肽的序列的鱼的生长激素多肽。
2.根据权利要求
1的多肽，其中鱼的生长激素是鲱形目的生长激素。
3.一种编码鱼生长激素多肽的DNA。
4.根据权利要求
3的DNA，其中鱼生长激素多肽是有如表1或表2所示的肽的序列。
5.一种重组DNA，其中连接一种编码鱼生长激素多肽的DNA。
6.根据权利要求
5的重组DNA，其中鱼生长激素多肽具有如表1或表2所示的肽的序列。
7.根据权利要求
5的重组DNA，该重组DNA称为质粒PSGHI或PSGH14。
8.含有重组DNA的微生物，其中连接了编码鱼生长激素多肽的DNA。
9.根据权利要求
8的微生物，其中鱼生长激素多肽具有如表1或表2所示的肽的序列。
10.根据权利要求
8的微生物，其中微生物是属于大肠杆菌。
11.一个生产鱼生长激素的方法，该方法包括在营养基中培养一种微生物，该微生物含有重组DNA，其中结合了编码鱼生长激素多肽的DNA，在培养基中积累鱼生长激素多肽，从而回收这种多肽。
专利摘要
根据本发明，结合编码鱼生长激素多肽的DNA的重组DNA，而且得到含有这种重组DNA的微生物，它们能用于大量生产鱼生长激素多肽。
文档编号C12N15/00GK85104988SQ85104988
公开日1986年4月10日 申请日期1985年7月1日
发明者关根进, 水上民夫, 佐藤盛幸, 伊藤菁莪, 齐藤晓子 申请人:协和发酵工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan