专利名称:头孢烯化合物的生产方法
本发明的涉及头孢烯化合物及其生产。
发明人从土壤及植物中分离出一系列微生物，发现某些微生物可以产生新的头孢烯抗菌素，发明人将这些抗菌素命名为TAN-547，TAN-592和TAN-591。TAN-547至少有6个组分，即TAN-547A，B，C，D，E和F，TAN-592至少有6个组分TAN-592A，B，C，E，和F，TAN-591至少有3个组分TAN-591A，B和C。另外发明人发现将TAN-547A，B或C，TAN-592A，B或C或TAN-591A，B或C水解时，得7-甲酰氨基头孢烯化合物，而将TAN-547D，E，F或TAD-592D，E或F水解则得去乙酰头孢菌素C，进一步通过酶反应7-甲酰胺基-头孢烯化合物转化为7-甲酰胺基-7-氨基头孢烯。
发明人在上述发现的基础上进行了进一步研究，完成了本发明。本发明指的是(1)下式化合物及其盐
其中R1是HOOC-
，HOOC-(CH2)3-CO-或者为氢原子
(2)下式化合物Ⅱ及其盐的制备方法
该方法是把式Ⅲ化合物或其盐
与一种微生物的培养液或培养过程中的物质相接触，这种微生物属于假单胞菌属(pseudomonas)并且能将起始物7位的HOOC-(CH2)3-CO-NH-基转换成NH2-基。
(3)化合物Ⅲ及其盐的制备方法，其中包括下式化合物Ⅳ及其盐
与一种微生物的培养液或培养过程中的物质相接触，这种微生物属于三角酵母菌属(Trigonopsis)并且能将起始物7位的
转换到HOOC-CH-(CH2)3-CO-NH，以及(4)化合物(Ⅳ)，去乙酰头孢菌C以及它们的盐的生产方法，该方法是将式Ⅴ化合物或其水解
其中R4是甲酰胺基或氢原子，R2是氨基酸的一个残基或肽的两个残基来自丝氨酸及丙氨酸，或氢原子，R3是-NH-C(＝NH)-NH2或-CH2NH2，X是丙氨酸或丝氨酸残基;假如X是丙氨酸残基则R3是一个氨基酸残基或丙氨酸肽的二个残基或是氢原子，R3是-NH-C(＝NH)-NH2。
在上式中，丙氨酸残基代表
或
丝氨酸残基代表
或
，甲酰胺基代表
。在专利申请中，式(Ⅴ)所示的化合物命名如下
抗菌素TAN-547或TAN-547有时用来指单个的抗菌素TAN-547A，B，C，D，E或F或者指二个以上上述单个抗菌素的混合物。抗菌素TAN-592或TAN-592有时用来指单个的TAN-592A，B，C，D，E或F或者指至少两个以上上述单个抗菌素的混合物。抗菌素TAN-591或TAN-591有时用以指单个的TAN-591A，B，或C或者指至少两个以上上述单个抗菌素的混合物。
在本申请中，7-甲酰胺基-去乙酰基头孢菌素C即化合物Ⅳ和去乙酰基头孢菌素C在某些场合相应地简称“7-FA-DCPC”和DCPC。
上述化合物的盐类，用作药物如细菌感染的治疗剂，包括药物适宜的盐类如锂盐，钠盐，钡盐，钙盐和镁盐，用作合成中间体时则包括上述提及的盐以及诸如铵盐，甲胺盐，二乙基胺盐，三甲基胺盐，四丁基铵盐以及吡啶盐。
为了得到在培养液内产生和积聚的上述抗菌素，抗菌素TAN-547，592，和591的起始物质可以通过在培养基中培养微生物的方法来产生[这种微生物属于溶化菌属(Lysobacter)或黄瘤菌属(Xanthomonas)]，该起始物能制成并收获相应的TAN-547，592和591。
生产TAN-547，592或591的微生物实例是溶化菌内酰胺属(Lysobacter lacyamgeuus)YK-90，黄瘤菌内酰胺属(xanthomonas lactamgena)YK-280以及黄瘤菌内酰胺属(xan Thomonas lactamgena)YK-278。这些微生物已经贮存在日本发酵研究所(IFO)以及日本对外贸易工业部工业科技局发酵研究所(FRI)，保存物已转换成佩斯条约承认的保存物并贮存在FRI中。
下面是微生物的贮存日期和注册号。
IFO FRI微生物 注册号 注册号 布达佩斯条贮存日期 贮存日期 约的注册号溶化菌内酰胺尿Lysobacter IFO 14288 FERM P-7247 FERMlactamgena September September BP-575YK-280 14，1983 19，1983黄瘤菌内酰胺尿Xanthomonas IFO 14330 FERM P-7602 FERMlactamgena March April BP-635YK-280 20，1984 28，1984黄瘤菌内酰胺尿Xanthomonas IFO 14351 FERM P-7681 FERMlactamgena June June BP-636YK-278 18，1984 25，1984从化合物Ⅴ制备化合物Ⅳ或DCPC的生产过程是在碱性条件下将起始化合物处理，碱性条件包括将起始化合物加入其中进行处理的水溶液，其PH值已调整到7至11，最好是9至9.7。
所述水溶液包括通常用于化学反应的缓冲液，上述缓冲液可作为例子指出的还有调节到上述PH值范围的磷酸盐，硼酸盐，柠檬酸盐，碳酸盐，盐酸盐，醋酸盐，氢氧化钠，甘氨酸，二乙基巴比土酸，硼砂，铵盐，氨甲基丙二醇的水溶液以及此等类似物。
本发明水解反应是在0℃至80℃的温度范围内进行的，最好是20℃至40℃间，持续1至72小时，最好约4小时至40小时内。
在从化合物Ⅳ制备化合物Ⅲ的方法中任何一个能把化合物Ⅳ转换成化合物Ⅲ的三角酵母菌(Trigoropsis)属微生物均可被运用。
作为微生物被提及的是三角酵母菌(Trigonopsis Valiabilis)属的微生物。所用的微生物以三角酵母菌(Trigonopsis Valiabilis)IFO 0671以及IFO 0755作为特例列举。
以IFO号码为特征的微生物已经存放在日本IFO中并且列入IFO 1984年第七版培养物清单中，下面是微生物在IFO的贮存日期。
微生物 贮存日期IFO 0671 1954年10月29日IFO 0755 1955年10月15日三角酵母菌属(Trigonopsis riabilis)微生物的形态学特征与“分类学研究”一书中“酵母”章节中描述的那些相一致，[该书为1970年的第二版本，1353-1937页，编辑杰，莱德(J.Ladder)，此荷兰出版公司出版(North Holland pub.corporation)]从化合物Ⅲ生产化合物Ⅱ的方法中，任一假单胞菌属(pseudomonas)并能把化合物Ⅲ转化为化合物Ⅱ的微生物均可运用。值得提到的被运用的微生物是假单胞菌属sp.uk-2221，该微生物是日本富库切耶玛(Fukuchiyama)城肖哥(Hyogo)专区收集的土壤样品中分离出来的。
菌株UK-2221微生物的特征描述于下a)形态学在营养琼脂斜面培养基上24℃培养5天后，观察发现，细胞呈棒状，直径为0.5至1.0微米(μm)长度为0.8至2.0微米(μm)，该微生物可观察到鞭毛，不形成孢子，并且为革兰氏阴性，不抗酸。
b)在各种培养基中生长特点1到14天24℃下培养后所作的观察
1)营养琼脂平板培养物无色园形菌落具有凸状园的表面和完整的边界，不产生扩散性色素。
2)营养琼脂斜面培养物中度生度，无色菌落，无扩散性色素产生。
3)营养液培养物不良的污浊生长，形成沉积，无膜状生长。
4)明胶营养的戳刺培养物轻度生长，无液化活性。
5)石蕊乳液无还原能力，无蛋白胨活性。
C)生理性质1)硝酸盐的还原(-)2)反硝化反应(-)3)MR(甲基红)试验(-)4)VP[伏其斯-泼拉斯考依尔(Voges-proskauer)试验(-)5)吲哚的产生(-)6)硫化氢的产生(醋酸铅试验)(-)7)淀粉水解(-)8)柠檬酸的利用[科泽(koser′s)克里斯蒂森(Christensen′s)和西蒙斯(Simmon′s)培养基](+)[西蒙斯(Simmon′s)基-]9)氮源利用Ⅰ)硝酸甲(-)Ⅱ)硫酸钾(+)10)色素的产生(King A和B以及甘露醇酵母膏琼脂培养基)不产生扩散性色素。
king A培养基10克丙三醇(甘油)，20克蛋白胨，1.4克氯化镁，10克硫酸铵，15克琼脂，1000毫升蒸溜水，PH为7.2。
king B培养基10克甘油，20克蛋白胨，1.5克磷酸氢二钾，1.5克硫酸镁，15克琼脂，PH为7.2。
11)脲酶(+)
12)氧化酶(+)(弱)13)过氧化氢酶(+)14)生长范围Ⅰ)PH微生物生长的PH值为4.3到7.0，最佳PH值为5.0到6.0。
Ⅱ)温度微生物生长的温度为14到32℃，最佳温度为18到26℃。
15)氧的需求严格需氧。
16)O-F(氧化-发酵)试验，[休·利夫森(Hugh·Leifson)法]不反应。
17)从糖产生酸和气体酸 气 利用蛋白胨-水 蛋白胨-水 (戴维斯培养物)L-阿拉伯酮糖 - - -D-木糖 - - +D-葡萄糖 - - +D-甘露糖 - - +D-果糖 - - +D-半乳糖 - - +麦芽糖 - - -蔗糖 - - -乳糖 - - -海藻糖 - - -D-山梨醇 - - +D-甘露醇 - - +肌醇 - - +丙三醇 - - +淀粉 - - -
+阳性，±假阳性，-阴性18)在DNA中含有的GC(鸟嘌呤+胞嘧啶)68.3±1.5%当菌株UK2221与卑尔根(Bergey′s)氏细菌测定学操作法第八版描述的种属，国际系统细菌学杂志30，225-420(1980)，32，146-149(1982)以及文献有效清单上描述的种属比较，UK-2221菌株属于假单胞菌属是有根据的，因为UK-2221菌株为革兰氏阴性杆菌，是活动的有单个极性鞭毛，严格需氧，对过氧化氢酶呈阳性的菌株在O-F试验中不反应，DNA的GC含量为68.3±1.5%(鸟嘌呤+胞嘧啶)，本发明人将UK-2221菌株命名为假单胞菌属(Pseudomonas)sp.UK-2221。
上述假单胞菌属(pseudomonas)sp.UK-2221已于1984年8月31日贮存在日本发酵研究所(IFO)，在该所(IFO)的注册号为14366，此微生物曾于1984年9月7日贮存在日本对外贸易工业部工业科技局发酵研究所(FRI)，注册号为FERMP-7836，贮存品已经转换为布达佩斯条约承认的贮存品并贮存在FRI中，注册号为FERM BP-637。
用于本发明的三角酵母菌(Trigonopsis)和假单胞菌属(pseudomonas)属微生物一般倾向于改变其性状，而且很易用人工致突变方法便其发生突变，例如用紫外光，X-射线，化学试剂(如亚硝基胍，乙基甲烷磺酸等)无论那一种上述变株均可用于本发明中，因为至今它们仍具有本发明中所述转换能力。本发明的“培养液”是指在本发明中使用的微生物培养产物。用于本发明的培养基可以是液体的也可是固体的，以前者更为合适。培养方法可以是表面培养亦可振荡培养，沉没通氧的培养对大规模生产是有利的。
在培养基中加入微生物所能利用的碳源，氮源，无机物质，营养物质等等。作为碳源的有葡萄糖，麦芽糖，废糖浆，脂肪和油(例如，豆油，橄榄油等)以及有机酸(例如柠檬酸，琥珀酸，葡萄糖酸等)。有机氮化物及无机氮化合物诸如大豆饼粉，棉籽饼粉，玉米浆，干酵母，酵母膏，肉渍膏，胨，尿素，硫酸铵，硫酸铵硝酸铵，氯化铵，磷酸铵均可作为氮源利用。
培养微生物时无机盐通常是需要的，诸如氯化钠，氯化钾，碳酸钙，碳酸镁，磷酸二氢钾以及磷酸氢二钠，常单独地或恰当的组合起来作为无机盐使用。
用作培养三角酵母菌(Trigonopsis)属微生物的培养基可以含D-氨基酸(例如D-丙氨酸，D-蛋氨酸)或D-α-氨基己二酸。
在液体培养的情况下，任何一种静止培养沉没培养，振荡培养，通氧培养都可被采用，但沉没通氧培养对大规模生产特别可取。
三角酵母菌(Trigonopsis)属微生物的培养条件随培养基的状态，培养基的配方，培养方法而变化。优先选择的条件如下温度约20至45℃，最好约24到37℃。
培基的PH值约6到9，最好约6到8。
培养时间约24到144小时，最好约24到120小时。
假单胞菌属微生物的培养条件随培基状态，培基配方，培养方法而变化。优先选择的条件如下温度约20到45℃，最好约24到37℃培基的PH值约6到9，最好约6到8。
培养时间约24到144小时，最好约24到120小时。
用于本发明的术语“培养过程中的物质”是指细胞或碎裂细胞含有参与本发明过程的酶，该酶可通过对上述培养物进行任何一种下述过程来获得诸如过滤，离心，超声碎裂法兰西-压榨处理，渗透压处理，冷冻融化处理，氧化铝研磨，溶菌酶处理，洗涤剂处理，有机溶剂处理等。
化合物Ⅳ与三角酵母菌(Trigonopsis)属微生物的培养液或其培养过程中的物质接触的反应中化合物Ⅳ的浓度约为0.5到20毫克/毫升。最好约5到10毫克/毫升，细胞的数量约0.1到1克/毫升。最好约0.1到0.3克/毫升以湿细胞计。培养过程中物质的数量从湿细胞数计算。反应体系的PH值调节到约6到10，最好约7.5到8.5。反应混合液约15到40℃，最好15到37℃，反应时间约4到48小时，最好8到16小时。反应可以用静止的、振荡的、通氧的或搅动的方法。最好用振荡、通氧或搅动的方法。
为了以好的收率获得目的化合物Ⅲ可以在反应体系中加入过氧化氢酶抑制剂。过氧化氢酶抑制剂的例子比如是无机叠氮化物(如叠氮化钠)，抗坏血酸，3-氨基-1，2，3，三唑。可以通过对大肠杆菌的抗微生物活性消失的测定，或用薄层色谱法，高压液相色谱法以证实反应在进行或终止。反应完全后，将反应混合液进行离心分离以除去细胞，目的化合物Ⅲ从上清液中分出并提纯。
本过程可以伴随三角酵母菌(Trigonopsis)微生物的培养一起进行，当这种情况时在培养前将化合物Ⅳ加到培养基中，其量约为1到20毫克/毫升，最好约2到10毫克/毫升。培养温度，培基PH值和培养时间与微生物的培养条件相同。
本反应过程中，
基首先转换成HOOC-CO(CH2)3-CO-NH-基，此基团又立即转换成HOOC-(CH2)3-CO-NH-，即得化合物Ⅲ。
化合物Ⅲ与假单胞菌属(pseudomonas)属微生物的培养液或其培养过程物质相接触的反应中化合物Ⅲ的浓度约为2到20毫克/毫升，最好约4到10毫克/毫升。细胞数量约0.1到1克/毫升，最好0.1到0.3克/毫升以湿细胞计。培养过程物质的数量是以湿细胞数量计算的。反应体系的PH值调节到6到10，最好6.5到7.5。反应混合液的温度约15到40℃，最好15到37℃，反应时间约4小时到66小时，最好16到54小时。反应可以用静止的、振荡的、通氧的或搅动的方式。尤其是振荡、通氧或搅动的方式较好。
本过程可以伴随假单胞菌属(pseudomonas)属微生物的培养一起进行，在这种情况下在化合物Ⅲ在培养前加入培养介质中，其数量约为2到20毫克/毫升，最好约4到10毫克/毫升。培养温度，培基PH值和培养时间与微生物的培养条件相同。
为了从反应液中分离出化合物Ⅳ，Ⅲ，Ⅱ或DCPC，可以把通常用于分离水溶性酸性物质的方法适当的综合起来加以利用。这样，各种吸附剂载体的吸附色谱法，离子交换树脂的离子交换色谱法，凝胶过滤，反相液体色谱法，或者诸如减压浓缩，冷冻干燥等方法都可以任意次序综合起来单独或反复地利用。作为吸附剂载体的有活性碳、吸附树脂、阴离子交换树脂、纤维素粉等或具有分子筛作用的载体以及此等都可利用。常用的随载体种类的不同而不同的洗脱剂有水溶性有机溶剂，含水丙酮溶液，甲醇，丙醇，丁醇，异丙醇，异丁醇等或各种酸，碱，缓冲液或无机或有机盐的水溶液。
更详细的情况参见它们的实例，反应结束后反应液的PH值调节到6至7附近，因为讨论中的反应物是个酸性物质，反应液通过Cl-或ACO-型载体以及吸附抗菌素。作为载体有如阴离子交换树脂(如琥石离子交换树脂IRA-68，402，410(美国罗默-哈斯公司Rohm & Hass Co.，U.S.A)，道维克斯-1(Dowex-1)离子交换树脂(美国道化学公司Dow Chemical Co.，U.S.A)，二价阴离子交换树脂SA-21 C.(日本三菱化学工业有限公司Mitsubishi Chemical Industries，Ltd.，Japan)等]。用氯化钠水溶液或缓冲液作为讨论中被吸附物质的洗脱剂以洗脱活性物质，为了使洗脱物脱盐，将洗脱物中和至弱酸性并用活性碳(日本武田药品工业株式会社Takeda Chemical Industries，Ltd.，Japan)色谱法分离，随即用含醇的水洗脱，如此等等。
然后将含有活性物质的洗脱物在低温下减压浓缩，浓缩物通过DEAE或QAE Sephadax(瑞典Pharmacia公司Pharmacia Co.，Sweden)氯离子(Cl-)型树脂以及吸附抗菌素。被吸附的抗菌素用稀氯化钠溶液分级洗脱，用高压液相色谱法鉴别有效部分，合并有效洗脱液用活性碳色谱法进行处理，随后脱盐。洗脱液浓缩，浓缩液冷冻干燥，将丙酮加入冷冻干燥粉中，过滤并收集形成的沉淀。
用已知方法可以将所得化合物的盐转化为其它盐类。例如将所得的盐溶于水中在冷却下用稀盐酸调节溶液的PH值约2至3，用诸如含有氢氧化钠，氢氧化钙，甲胺，四丁基氢氧化铵等的稀碱溶液立即调节上述水溶液的PH值约至7到8以产生所需的盐，上述水溶液用活性炭色谱法进行分离，用水洗去无机或有机盐后，目的化合物的盐即被洗脱下来。
在下面要描述的实例1中所得到的7-FA-DCPC(化合物Ⅳ)钠盐呈以下物化性质(1)外观白色粉末。
(2)旋光率(α)(α)25D+146.5°±30°(C＝0.51，水)(3)分子量438(根据次级离子质谱分析法(SIMS)提供的数据)(4)元素分析(%)，C15H19N4O8SNaH2O试验值 计算值C 39.65±2.0 39.48H 4，640±0.5 4.64N 12.20±1.0 12.28O 31.55S 7.281±1.0 7.02Na 5.2±1.0 5.04(5)紫外吸收(UV)谱
258+±2nm(209±50) (参见图1)(6)红外吸收(IR)谱(KBr片)
主波数(cm-1)3430，3240，3020，1770，1680，1610，1520，1410，1375，1300，1220，1145，1070，1040，1000，800，710，540cm-1(参见图2)(7)13C核磁共振(NMR)谱(100兆周(MH2)，氘中)δ179，65(S)，177，22(S)，171，43(S)，166，30(d)，162.01(S)132.76(S)，122.50(S)，79.47(S)，66.03(d)，63.75(t)，57.33(d)，37.28(t)，32.70(t)，28.22(t)，23.40(t)ppm(S代表单峰;d代表双峰，t代表三峰)(8)高压液相色谱(HPLC)[沃尔特联社，美国(Waters Associates，U.S.A)]柱YMC-Pak A-312(日本，山村化学试验室(Yamamura ChemicalLaboratories，Japan)]流动相2%甲醇-0.01克分子磷酸盐溶液(PH3.0)流速2毫升/分，Rt＝2.3分(9)颜色反应阳性茚三酮反应阴性埃尔利希(Ehrlich)重氮化反应，格瑞克利贝克Graig-Leaback)反应，口(Sakaguchi)反应。
(10)溶解度易溶于水溶于甲醇微溶于乙醚和乙酸乙酯在上述物化性质的基础上可以认为将TAN-547 A，B或C进行水解所得化合物是用上述式Ⅳ表示的7-FA-DCPC，
在下面要描述的实例9中所得到的7-FA-DCPC(化合物Ⅳ)钠盐呈以下物化性质(1)外观白色粉末。
(2)旋光率(α)25D+150°±30°(C＝0.55，水)(3)分子量438(根据次级离子质谱分析(SIMS)法提供的数据)(4)元素分析(%)，C15H19N4O8SNa H2O试验值 计算值C 39.8±2.0 39.48H 4，9±0.5 4.64N 12.3±1.0 12.28O 31.55S 6.9±1.0 7.02Na 5.4±1.0 5.04(5)紫外吸收(UV)谱
)258±2nm(200±50) 参见图4(6)红外吸收(IR)谱(KBr片)主波数(cm-1)3430，3240，3020，1770，1680，1610，1520，1410，1375，1300，1220，1145，1070，1040，1000，800，710，540cm-1参见图5(7)13C核磁共振(NMR)谱(100兆周(MH2)，氘中)δ179，65(S)，177，2(S)，171，4(S)，166，3(d)，162.)(S)，132.7(S)，122.5(S)，79.5(S)，66.0(d)，63.8(t)，57.3(d)，37.3(t)，32.7(t)，28.2(t)，23.4(t)ppm
(S)代表单峰;d代表双峰，t代表三峰)(8)高压液相色谱(HPLC)[美国，沃尔特联社，(Waters Associates，U.S.A)]柱YMC-Pak A-312(日本，山村化学试验室(Yamamura ChemicalLaboratories，Japan)]流动相2%甲醇-0.01克分子磷酸盐溶液(PH3.0)流速2毫升/分，Rt＝2.3分(9)颜色反应阳性茚三酮反应阴性埃尔利希(Ehrlich)重氮化反应，格瑞克利贝克Graig-Leaback)反应，口(Sakaguchi)反应。
(10)溶解度易溶于水溶于甲醇微溶于乙醚和乙酸乙酯在上述物化性质的基础上可以认为将TAN-592 A，B或C或TAN-591 A，B或C进行水解所得化合物是用上述式Ⅳ表示的7-FA-D-CPC，在下面描述之实例5和17中所得到之DCPC钠盐经红外(IR)(图3和6)，紫外(UV)，13C核磁共振(NMR)，质谱，元素分析，高压液相色谱(HPLC)Rt(保留时间)值以及抗菌谱证实与DCPC的真实样品相一致。
DCPC为一已知化合物并且是生产头孢烯类抗菌素的有用中间体。
下面提及的实例21中所得的化合物Ⅲ的双钠盐的物化性质如下(1)外观
白色粉末。
(2)分子量分子离子峰M/Z 432(M+H)+次级离子质谱分析法S IMS)(3)元素分析(%)(40℃，真空干燥8小时)试验值 计算值C 38.06 38.19H 3.81 3.66N 9.97 9.54O 30.88S 7.68 7.28Na 10.44(4)分子式C14H15N3O8SNa2O5H2O(5)紫外(UV)吸收谱(水)
259nm(E1%1cm＝224) (参见图4)(6)红外(IR)吸收谱(KBr)主要吸收峰值(cm-1)3430，3230，3010，1775，1700，1690，1610，1580，1410，1305，1240，1150，1065，1045，1000，850，800，710，515参见图7(7)1H核磁共振(NMR)谱100兆周(MH2)，氘中，δppm J(H2)1.75-2.15 2H，m2.15-2.55 4H，m3.38 1H，d，J＝183.70 1H，d，J＝184.27 2H，s，5.39 1H，s，8.21 1H，s，
(8)高压液相色谱(HPLC)[美国，沃尔特联社，(Waters Assoc，U.S.A)]，型号6000 A/660/440柱YMC-Pack A-312，流动相0.01克分子磷酸盐缓冲液(PH6.3)2毫升/分检测254nmRt＝3.1分下面要提及的实例22中所得的化合物Ⅱ的物化性质如下(1)外观白色粉末。
(2)分子量分子离子峰M/Z 296(M+Na)+用次级离子质谱分析法SIMS法(3)分子式C9H11N3O5S(273)(4)紫外(UV)吸收谱
259nm(E1%1cm＝365)(5)圆二色性(CD)谱
(6)红外(IR)吸收谱主要吸收峰(cm-1)3400，2980，1760，1680，1600，1510，1410，1380，1290，1240，1180，1140，1070，1040，1000，860，790，700，500参见图8(7)1H核磁共振(NMR)谱400兆周(MH2)，氘中，δppm J(H2)3.43 1H，d，J＝17.63.65 1H，d，J＝17.64.21 1H，d，J＝12.94.25 1H，d，J＝12.95.19 1H，s，
8.17 1H，s，(8)高压液相色谱(HPLC)型号638-50(日本，日立公司Hitachi co.，Japan)柱YMC-Pack A-312，流动相0.01克分子磷酸盐缓冲液(PH6.3)2毫升/分检测254nmRt＝3.0分下面要对7-FA-DCPC的生物学性质提供一些参考。7-FA-DCPC钠盐显示了如表Ⅰ所示的抗菌谱，从此表显而易见，抗菌素7-FA-DCPC具有抗革兰氏阳性和阴性的抗菌活性。
表Ⅰ抗菌素7-FA-DCPC钠盐的抗菌谱受试生物 最小抑菌浓度 微克(μg)/毫升大肠杆菌NIHJ JC-2 50(Escherichiacoli)鼠伤寒沙门氏菌IFO 12529 25(Salmonella typhimurium)肺炎球菌IFO 3317 50(Klebsiella pneumoniae)普通变形菌 IFO 3988 25(proteus vulgaris)奇异变形菌 ATCC 21100 12.5(proteus mirabilis)粘质沙雷氏菌 IFO 12648 25(serratia marcescens)粪产碱菌 IFO 13111 12.5(Alcaligenes faecalis)氯脓杆菌 IFO3080 100
(pseudomonas aeruginosa)金黄色葡萄球菌FDA209p 100(Staphylococcus aureus)枯草芽孢杆菌NIHJ PC I219 100(Bacillus subtilis)巨大芽孢杆菌 IFO 12108 100(Bacillus megaterium)注培养基营养琼脂(PH7.0)接种微生物的浓度106CFU(菌落形成单位)/毫升。
另外，7-FA-DCPC钠盐对各种β-内酰胺酶是稳定的。7-FA-DCPC以及DCPC对β-内酰胺酶的稳定性出示在表Ⅱ中。
表2对β-内酰胺酶的稳定性抑菌圈的直径(用平皿法)7-FA-DCPC DCPC CMC (注1)未加一对照组 23 30 30青酶素(注2)(penicillinase) 23 30 30头孢菌素酶(注3)(Cephalorporinase) 23 8 ＜8注所用化合物的浓度;100微克/毫升(μg/ml)
所用的菌株大肠杆菌PG8培养基营养琼脂培养基(PH7.0)含有二氨基庚二酸(20毫克/升)注1CMC 头菌素C(cephamyeinc)注2从蜡样芽孢杆菌属(Bacillus cereus)提取的青酶素酶(由美国卡尔比化学公司(Calbio Chemical，U.S.A生产)0.048单位/毫升注3从阴沟肠杆菌(Entero bacter cloacae)提取的头孢菌素酶0.025单位/毫升。
另外7-FA-DCPC钠盐对小鼠细菌感染性疾病的治疗作用列入表3中表3感染菌给药途径 ED50(毫克/公斤)大肠杆菌 皮下 约1000-111＊ 皮下 59.5＊腹膜内感染。
当7-FA-DCPC钠盐以1克/公斤剂量小鼠皮下给药后，未观察到死亡现象;因此，7-FA-DCPC被认为是低毒性的。这些数据证实，化合物Ⅳ具有抗革兰氏阳性和阴性细菌的抗菌活性并且是一个对哺乳动物毒性低的抗菌素。化合物Ⅳ，其中R是甲酰胺基，对产生β-内酰胺酶的菌株是稳定的，因而可用于治疗哺乳动物(诸如小鼠，大鼠，兔子，狗，人类等等)由细菌感染而引起的疾病，将化合物Ⅳ例如用作抗细菌感染性疾病的治疗剂时采用不同于口服的注射给药途径，对上述哺乳动物采用皮下注射或肌肉注射，剂量约为2到100毫克/公斤/天，最好约10到50毫克/公斤/天。将化合物Ⅳ制成胶丸，作为口服药的剂型，给药剂量约为10到200毫克/公斤/天(以化合物Ⅳ计)，最好约20到100毫克/公斤/天。
此外，化合物(Ⅳ)可用作杀菌剂，化合物(Ⅳ)例如制成液体制剂，该制剂中溶于蒸馏水中的化合物Ⅳ的浓度约为0.02至0.2重量/体积%，制成软膏则含有0.5至50毫克，最好每克制剂含有化合物(Ⅳ)2至20毫克，上述制剂可外涂用于上述哺乳动物的手、脚、眼、耳等灭菌和消毒。
化合物Ⅳ作为一个合成新药的中间体也具有很高的价值。
本发明的水解包括其结果在于提高目的化合物Ⅳ收率的3位上酯键的选择性解离本发明的方法在工业生产上是有优越性。
由于本发明过程中的起始化合物Ⅴ可以通过细菌培养在短期内大规模生产，另外，在上述发酵方法后运用本发明能使目的化合物(Ⅳ)大量生产，提高收率，缩短工时，因而就提供了一个有利于将化合物Ⅳ进行工业生产的方法。
化合物Ⅲ作为生产头孢烯抗菌素的中间体是有用的。例如生产本发明化合物Ⅱ。
化合物Ⅱ的生物学性质参见于后，化合物Ⅱ钠盐的抗菌谱如表4所示。从该表可见化合物Ⅱ具有抗革兰氏阴性抗菌活性。
表4化合物Ⅱ钠盐的抗菌谱。
受试生物 抑菌圈直径(毫米) (参见注解)大肠杆菌CP 13 11(Escherichia coli)绿脓杆菌C 141 19(Pseudomonas aeruginosa)金黄色葡萄球菌FDA209p(Staphylococcus aureus) ＜8注培养基营养琼脂培养基(PH7.0)含有二氨基庚二酸化合物Ⅱ的浓度1000微克(μg)/毫升另外，化合物(Ⅱ)的钠盐对各种β-内酰胺酶是稳定的。化合物Ⅱ和DCPC对各种β-内酰胺酶的稳定性列入表5中表5对β-内酰胺酶的稳定性酶 抑菌圈的直径(毫米) (平皿法)化合物(Ⅱ) DCPC(注1) CMC(注2)未加-对照组 19 30 27.5青霉素酶(注2) 19 30 27.5头孢菌素酶(注3) 19 ＜8 ＜8注化合物Ⅱ的浓度1000微克/毫升另一个化合物的浓度100微克/毫升所用的菌株假单胞菌属绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)C141培养基营养琼脂培养基(PH7.0)含有二氨基庚二酸(20毫克/立升)注1DCPC去乙酰头孢菌素C注2CMC头霉素C注3从蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)中提取的青霉素酶(美国卡尔比化学公司(Calbio Chemical，U.S.A)0.048单位/毫升注4从阴沟肠杆菌(Entero bacter cloacae)中提取的酶0.025单位/毫升。
化合物(Ⅱ)的钠盐以1克/公斤的剂量大鼠皮下给药未发现死亡，因而，化合物(Ⅱ)被认为是低毒性的。这些数据证实，化合物(Ⅱ)具有抗革兰氏阴性杆菌的抗菌活性，并且是一个低毒性的抗菌素。
因此化合物Ⅱ可用于治疗哺乳动物由细菌引起的感染性疾病(例如鼠，小牛，马，狗，人类等)或家禽(例如鹅，鸭)将化合物(Ⅱ)例如用作抗细菌性感染疾病的治疗剂，则化合物(Ⅱ)可例如采用不同于口服的注射给药途径，对上述哺乳动物则采用皮下注射，或肌肉注射，其剂量约为5至200毫克/公斤/天，最好为20至200毫克/公斤/天。将化合物Ⅱ制成胶丸作为口服药的剂型其给药剂量为约20至400毫克/公斤/天(以化合物Ⅱ计)，最好约40-200毫克/公斤/天。
另外，化合物(Ⅱ)可用作杀菌剂。化合物(Ⅱ)例如制成液体制剂，该制剂中含有溶于蒸馏水中的化合物Ⅱ的浓度约为0.05至0.4重量/体积%，制成软膏则含有约1至100毫克。最好每克制剂含有约4至50毫克化合物(Ⅱ)该制剂可外涂用于上述哺乳动物的手、脚、眼、耳等处的灭菌和消毒以作抗感染用。
化合物(Ⅱ)也是一个合成头孢烯化合物的有高度价值的中间体。
从头孢菌素C和去乙酰头孢C的比较中得知，3-位乙酰化的头孢菌素衍生物是不稳定的，然而在3-位上有-CH2OH基的本化合物(Ⅱ)在水溶液中比乙酰化的头孢烯化合物(该化合物在3-位有-CH2OCOCH3基)要出乎意料的稳定。这一事实表明本化合物Ⅱ很容易在生产头孢烯化合物的反应中用作中间体。
图1和图4表示例1和9所得的化合物Ⅳ的紫外吸收谱。图2，3，5，6，7和8表示例1所得化合物Ⅳ的，例9所得化合物Ⅳ的，例5所得DCPC，例17所得DCPC，例21所得化合物Ⅲ，例22所得化合物Ⅱ的红外吸收谱。
下面用参考实例更详细介绍本发明。
在培养基中的%表示重量/体积除非有另外的注明。
参考实施例1(1)生长在营养琼脂斜面培养基上的溶化菌内酰胺属(Lysobacter Lactamgenus)Yk-90(IFO 14288，FERM BP-575)接种3个200毫升爱伦美氏(Erlenmeyer)瓶，每个瓶中含有由2%葡萄糖，3%可溶淀粉，1%生的大豆面，1%玉米浆，0.5%聚胨[日本太和营养化学有限公司(Daigo Nutr itive Chemicals，Ltd.)生产]和0.3%氯化钠，0.5%沉淀碳酸钙掺和组成的水溶液培养基(PH7)40毫升，在旋转摇床上于24℃进行48小时振荡培养以获得种子培养物。
然后将由3%糊精，1.5%生大豆面，1.5%玉米粉，0.2%聚胨，0.1%硫代硫酸钠，0.5%沉淀碳酸钙掺和组成的水溶液(PH6.5)培养基4000毫升以每份40毫升量分配到200毫升爱伦美氏瓶中，然后该瓶在120℃灭菌20分钟。将1毫升种子培养物分别转入每个200毫升含有上述培养基的爱伦美氏瓶中，在旋转摇床上以200转/分的转动速度24℃培养72小时。
用7%草酸调节上述程序获得的培养液的PH值至3.5，与哈佛罗-高级-胶(hyflo-Super-Gel)[美国约翰迈佛兰(Johns Manville)产品]相混合，过滤，得滤液(16立升)，滤液调节PH值至6.8，通过一装有活性碳的柱子(1立升)。用水洗柱子(3立升)，用8%异丁醇-N/200盐酸(8立升)将抗菌素TAN-547洗脱下来。洗脱液浓缩至1.8立升，浓缩液通过安伯来特(Amberlite)CG-50(H+型，1.4立升)[美国罗默，哈斯公司(Rohm & Haas co.，U.S.A.)生产]柱。用水(4.5立升)洗柱，然后用N/100盐酸进行(9立升)分级洗脱，收集活性部分，浓缩，调节浓缩液的PH值至7.3并将其通过一装有双阴离子交换树脂HP-20(50至100目，0.5立升)柱(日本三菱化学工业有限公司(Mitsubishi Chemical Industries，Ltd.，Japan)生产)的柱子。用0.01克分子浓度的磷酸缓冲液(PH3.5，5立升)冲洗柱子后，用0.01克分子的磷酸缓冲液进行分级洗脱。收集有效部分，洗脱液调节PH值至7.2，将其通过一装有活性碳(100毫升)的柱子，柱子用水洗(300毫升)，用8%异丁醇-N/200盐酸(600毫升)进行洗脱。洗脱液浓缩，浓缩液通过一装有CM-葡聚糖凝胶C25(Na+型，200毫升)[瑞典Pharmacia精细化学公司(pharmacia Fine Chemicals co.，sweden生产]的柱子，随后用0.02克分子氯化钠水溶液(6立升)进行洗脱。各个组分分别用高压液相色谱进行分析，相应含有TAN-A，B和C的组分作为主要成分收集起来。
将含有TAN-547 A组分作为主要成分调节其PH值至7.2，将其通过一装有活性碳(10毫升)的柱子，用水(30毫升)洗柱后，用8%异丁醇-N/200盐酸(70毫升)进行洗脱。洗脱液浓缩，浓缩液冷冻干燥得粉末状粗品TAN-547A双盐酸盐(61毫克)。
将含有TAN-547B和C的组分作为主要成分用同样方法进行处理，相应地得到粉末状粗品TAN-547B双盐酸盐(144毫克)，粉末状粗品TAN-547 C双盐酸盐(226毫克)。
粉末状粗品(61毫克)TAN-547A的双盐酸盐用制备性高压液相色谱法进行分离，该分离柱以YMC-凝胶ODS I-15(日本山村化学试验窒(Yamamura Chemical Laboratories，Japan)]为载体，并用0.02克分子磷酸缓冲液(PH3.0)进行分级洗脱，各个部分分别用高压液相色谱法(HPLC)进行分析，收集只显示单峰的部分，用1克当量浓度氢氧化钠溶液调节活性部分的PH值至7.5，再用1克当量浓度盐酸溶液重新将其调至PH3.0，将其通过活性炭柱(5毫升)，用水(25毫升)洗柱后，用8%异丁醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩，冷冻干燥得白色粉末TAN-547A的双盐酸盐(40毫克)。TAN-547B和C的双盐酸盐同法进行制备性高压液相色谱法分离得白色粉末TAN-547B的双盐酸盐(96毫克)以及白色粉末TAN-547C的双盐酸盐(112毫克)。
(2)将于营养琼脂斜面培养基上生长的溶化菌内酰胺属(Lysobacter lactamgenus)YK-90(IFO 14288，FERM BP-575)接种在2个2升的口(Sakaguchi)烧瓶内，每个烧瓶装有500毫升培养基水溶液(PH7.0)其组成为葡萄糖2%，可溶淀粉3%，生黄豆粉1%，玉米浆1%，聚胨0.5%和氯化钠0.3%，并掺入0.5%的沉淀碳酸钙。然后置于往复式摇瓶机上，于24℃下培养48小时，将所得的全部培养液转移到一个200升的罐内，内装掺入0.5%除沫剂Actcol(日本武田药品工业株式会社生产)的上述培养基(120升)，在吹气(速率为120升/分)和搅拌(150转/分)条件下于24℃培养48小时。所得的全部培养液再转移到一个6000升的罐内，内装4000升培养基水溶液，其组成为糊精3%，生黄豆粉1.5%，玉米麦质1.5%，聚胨0.2%和硫代硫酸钠0.1%，并掺入0.5%的沉淀碳酸钙和0.05%的Actcol，在吹气(速率为4000升/分)和搅拌(120转/分)条件下于24℃培养66小时。
上述过程所得的培养液(3900升)用2N盐酸调节PH至6.1，加入Hyflo-Super Gel，过滤水洗，得滤液4370升。将滤液的PH调节至7.0，然后通过装有120升50-100目的Dowex 50W Na型离子交换树脂的柱，柱经水(360升)洗后，再用2M氯化钠水溶液(1800升)洗脱。洗脱液通过活性炭柱(60升炭)。柱经180升水洗后，再用420升8%异丁醇-N/200盐酸洗脱。洗脱液浓缩至40升，调节其PH至7.3，再通过装有40升Diaion HP-20的柱，柱经80升PH7.3的0.01M磷酸缓冲液洗涤后，用400升PH3.5的0.01M磷酸缓冲液洗脱。
洗脱液通过活性炭柱(内装10升炭)，用30升水将柱洗涤后，再用70升8%异丁醇-N/200盐酸洗脱。洗脱液浓缩至2升，调节PH至7.3，然后通过装有4升50-100目Diaion HP-20的柱，柱经12升PH7.3的0.01M磷酸缓冲液洗涤后，再用40升PH3.5的0.01M磷酸缓冲液洗脱分离。各个洗脱部分均用HPLC分析，并将其分成两组，一组含主要组分TAN-547A，B，和C，另一组含TAN-547D，E和F。合并含主要组分TAN-547D，E和F的部分，并通过活性炭(300毫升)柱，用水将柱洗涤后，再用2100毫升8%异丁醇-N/200盐酸洗脱。洗脱液通过装有300毫升Na型的交联葡聚糖CM-Sephadex C25的柱，然后用12升0.02M氯化钠水溶液洗脱分离。各个洗脱部分用HPLC分析，分别收集含主要组分TAN-547D，E和F的部分。
合并含主要组分TAN-547F的部分，并通过活性炭(50毫升)柱，用150毫升水将柱洗涤后，再用350毫升8%异丁醇-N/200盐酸洗脱，洗脱液浓缩，浓缩物经冷冻干燥得1.0克TAN-547F粗品粉末。按同样程序分别处理含主要组分TAN-547D和E的部分，得0.3克TAN-547D粗品粉末的0.6和TAN-547E粗品粉末。
将1.0克TAN-547F粗品用制备HPLC分离纯化，载体为YMC-GEL ODS 30/60(日本山村化学研究所生产)，用2%甲醇-0.02M磷酸缓冲液(PH3.0)洗脱分离，各个洗脱部分用HPLC分析，收集含主要组分TAN-547F的部分，调节其PH至7.1，并通过活性炭(20毫升)柱，用60毫升水将柱洗涤后，再用140毫升8%异丁醇-N/200盐酸洗脱。洗脱液浓缩，浓缩物用制备HPLC分离，载体为TSK-GEL，LS-410(日本东洋曹达制造有限公司生产)用1%甲醇/0.01M磷酸缓冲液(PH3.0)洗脱分离，各个洗脱部分用HPLC分析，收集只有一个峰的部分，合并并用1N氢氧化钠调节PH至7.0，再用1N盐酸再调节PH至3.0，并通过活性炭(10毫升)柱，柱经60毫升水洗后，用140毫升8%异丁醇-N/200盐酸洗脱，洗脱液浓缩，浓缩物均经冷冻干燥，得69毫克TAN-547F.2HCl白色粉末。TAN-547D和E粗品粉末也按同样方法用HPLC分离纯化。得30毫克TAN-547D.HCl白色粉末和63毫克TAN-547E.2HCl白色粉末。
上面所得得抗生素TAN-547.2HCl其物理化学性质如下(1)TAN-547A.2HCl1)外观白色粉末2)比旋度[α]25D+71.8°±20°(C＝0.50，水)3)分子量SIMS法，(M+H)+6884)分子式C26H41N9O11S.2HCl.(3H2O)5)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C，38.29±2.0 C，38.33H，6.48±1.0 H，6.06N，15.11±1.5 N，15.47
O，27.49S，4.12±1.0 S，3.94Cl，8.71±1.5 Cl，8.70＊1，样品于减压下室温干燥(干燥剂P2O5)15小时，＊2，此为含3克分子水的样品的计算值6)紫外吸收光谱(UV)
±2nm(E1%1cm＝117±20)7)园二色光谱(CD)
-30900±5000和
+29500±5000(-负值(-)考顿效应(cotton effect);+正值(+)考顿效应)8)红外吸收光谱(IR)主波数(KBr片)3420，3250，3080，3000，1775，1730，1670，1510，1450，1440 1260，1165，1060，980，860，510，9)核磁共振谱(13C-NMR)D2O，100MH2的信号如下所示(δppm)179.84(s)，177.42(s)，176.05(s)，173.75(s)，171.12(s)，166.40(d)，162.16(s)，159.62(s)，134.86(s)，117.40(s)，79.64(s)，72.66(d)，67.16(t)，65.94(d)，57.34(d)，56.31(d)52.03(d)，43.59(t)，41.23(t)，37.36(t)，32.80(t)，29.98(t)28.60(t)，27.50(t)，23.50(t)，19.75(q)(S单峰，d二重峰，t三重峰，q四重峰)10)氨基酸分析样品用5.5N盐酸于110℃下水解15小时丙氨酸0.86克分子α-氨基己二酸0.94克分子11)薄层层析(TLC)点样用膜纤维素(日本东京化学工业公司生产)
溶媒系统，乙腈3%硫酸铵(1∶1)，Rf＝0.5212)高性能液体色谱(HPLC)柱，YMC pack A312(日本山村化学试验室制造)，移动相，2%甲醇/0.01M磷酸缓冲液(PH3.0)，2毫升/分。Rt＝5.8(分)组分A，B和C(2HCl)的下述性质是共同的。
13)溶解度易溶于水、丙酮水溶液、醇水溶液微溶于二甲基亚砜、甲醇、丙酮醋酸乙酯14)显色反应阳性(水合)茚三酮，格瑞克-利贝克(Greig-Leaback)，口反应(Sakaguchi)阴性埃尔利希(Ehrlich)拜尔登(Barton)反应高锰酸钾15)稳定性在酸性和碱性水溶液中不稳定，在中性水溶液中稍微不稳定16)这些物质的特性为两性物质(二盐酸盐为中性)(ⅱ)TAN-547B.2HCl1)外观白色粉末2)比旋度[α]25D+54.8°±15°(C＝0.56，H2O)3)分子量SIMS法，(M+H)+7594)分子式C29H46N10O12S.2HCl(3H2O)5)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C，39.02±20 C，39.32H，6.51±1.0 H，6.14N，15.46±1.5 N，15.81O，27.09
S，3.50±1.0 S，3.62Cl，8.27±1.5 Cl，8.01＊1，＊2，条件和A的相同6)UV光谱图3
±2nm(E1%1cm)＝113±20)7)CD光谱
-33600±5000和
+30700±50008)IR光谱主波数(cm-1)为3370，3260，3220，3080，3000，1780，1735，1675，1535，1460，1410，1260，1170，1070，880，800，530，9)(13C-NMR)谱D2O，100MH2的信号如下所示(δppm)如下所示179.78(s)，177.92(s)，176.88(s)，176.15(s)，173.49(s)，170.77(s)，166.41(d)，162.25(s)，159.59(s)，134.39(s)，118.69(s)，79.66(s)，72.91(d)，67.11(t)，66.04(d)，56.95(d)，56.03(d)，53.14(d)，51.72(d)，43.61(t)，41.52(t)37.32(t)，32.62(t)，29.23(t)，28.66(t)，27.50(t)，23.47(t)19.55(q)，19.51(q)10)氨基酸分析(条件与A的相同)丙氨酸2.1克分子α-氨基己二酸1.1克分子11)TLC(条件与A的相同)Rf＝0.5512)HPLC(条件与A的相同)Rt＝6.8(分)(ⅲ)TAN-547C 2HCL
1)外观白色粉末2)比旋度[α]25D+25.1°±15°(C＝0.49，H2O)3)分子量SIMS法，(M+H)+8304)分子式C32H51N11O13S2HCL(3H2O)5)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C，39.61±20 C，40.17H，6.54±1.0 H，6.22N，15.92±1.5 N，16.10O，26.75S，3.41±1.0 S，3.55Cl，6.41±1.5 Cl，7.41＊1，＊2，条件和A的相同。
6)UV光谱
260±2nm(E1%1cm)＝106±20)7)CD光谱
-34700 5±5000和
+28400 5±50008)IR光谱主波数(cm-1)(KBr片)为3350，3250，3070，3000，2950，1780，1735，1665，1530，1450 1400，1300，1250，1160，1060，790，5209)13C-NMR谱D2O，100MH2的信号如下所示(δppm)如下所示179.79(s)，178.04(s)，177.47(s)，177.38(s)，176.12(s)，173.47(s)，171.08(s)，166.32(d)，162.07(s)，159.52(s)，135.00(s)，117.27(s)，79.57(s)，72.86(d)，67.10(t)，65.88(d)，57.28(d)，55.87(d)，53.07(d)，52.35(d)，51.62(d)
43.52(t)，41.52(t)，37.27(t)，32.73(t)，29.25(t)，28.48(t)27.36(t)，23.41(t)，19.45(q)，19.42(q)，19.25(q)10)氨基酸分析(条件与A的相同)丙氨酸3.1克分子α-氨基己二酸1.1克分子11)TLC(条件与A的相同)Rf＝0.6012)HPLC(条件与A的相同)Rt＝11.7(分)
+21000±5000(-负值(-)考顿效应;+正值(+)考顿效应)8)核磁共振谱(13C-NMR)D2O，100MH2的信号如下所示(δppm)179.52(s)，177.43(s)，176.05(s)，173.72(s)，171.61(s)，167.89(s)，159.57(s)，134.40(s)，118.99(s)，72.64(d)67.23(t)，61.99(d)，60.13(d)，57.32(d)，56.28(d)，51.97(d)43.53(t)，41.18(t)，37.58(t)，32.75(t)，28.94(t)，28.43(t)27.46(t)，23.85(t)，19.70(g)，(S单峰，d二重蜂，t三重蜂，q四重峰)9)红外吸收光谱(IR)主波数(KBr片)3420，3250，3075，2950，1765，1735，1665，1540，1450，1400 1350，1270，1160，1115，1065，1030，980，750，54010)氨基酸分析样品用5.5N盐酸于110℃下水解15小时丙氨酸约1克分子α-氨基己二酸约1克分子(ⅳ)TAN-547D 2HCL1)外观白色粉末
2)比旋度[α]25D+53.5°±10°(C＝0.51，HO)3)分子量SIMS法，(M+H)+6454)分子式C25H40N8O10S HCl(3H2O)5)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C，40.30±2.0 C，40.84H，6.44±1.0 H，6.44N，15.34±1.5 N，15.24O，28.29S，4.39±1.0 S，4.36Cl，4.66±1.5 Cl，4.82＊1，样品于减压下室温干燥(干燥剂P2O5)15小时＊2，此为含3克分子水的样品的计算值6)紫外吸收光谱(UV)
±2nm(E1%1cm＝122±20)7)园二色光谱(CD)
-33000±5000和11)薄层层析(TLC)点样薄膜、纤维素(日本东京化学工业公司生产溶媒系统，乙腈3%硫酸铵(1∶1)，Rf＝0.5012)高性能液体色谱(HPLC)柱，YMC pack A312，移动相，5%甲醇/0.01 M磷酸缓冲液(PH3.0)，2毫升/分。Rt＝4.2(分)组分D，E和F(为HCLL盐)的下述性质是共通的13)溶解度易溶于水、丙酮水溶液、醇水溶液微溶于二甲基亚砜、甲醇、丙酮醋酸乙酯14)显色反应阳性(水合)茚三酮，格瑞克-利贝克(Greig-Lieback)，口反应(Sakaguchi)阴性埃尔利希(Elrlich)拜尔登(Barton)反应，高锰酸钾15)稳定性在酸性和中性水溶液稍微不稳定，在碱性溶液中不稳定16)这些物质的特性为两性物质(2HCL为中性)(ⅴ)TAN-547E 2HCL1)外观白色粉末2)比旋度[α]25D+31.1°±10°(C＝0.51，H2O)3)分子量SIMS法，(M+H)+7164)分子式C28H45N9O11S2HCL(3H2O)5)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C，39.86±2.0 C，39.90H，6.28±1.0 H，6.34N，14.64±1.5 N，14.96O，26.58S，3.79±1.0 S，3.80Cl，7.83±1.5 Cl，8.41＊1，＊2，条件和D的相同6)UV光谱
260±2nm(E1%1cm＝114±20)7)CD光谱
-31000±5000和
+21000±50008)IR光谱主波数(cm-1)如下3375，3260，3220，3075，2950，1770，1735，1660，1540，1455 1400，1345，1250，1160，1115，1065，1035，980，880，815，5409)13C-NMR谱D2O，100MH2的信号如下所示(δppm)179.48(s)，177.82(s)，177.36(s)，176.12(s)，173.46(s)，171.49(s)，167.83(s)，159.54(d)，134.37(s)，118.99(s)，72.84(d)，67.19(t)，61.95(d)，60.10(d)，57.31(d)，55.96(d)53.04(d)，51.63(d)，43.53(t)，41.47(t)，37.53(t)，32.72(t)29.14(t)，28.38(t)，27.43(t)，23.81(t)，19.44(q)，10)氨基酸分析(条件与D的相同)丙氨酸约2克分子α-氨基己二酸约1克分子11)TLC(条件与D的相同)Rf＝0.5412)HPLC(条件与D的相同)Rt＝4.9(分)(Ⅵ)TAN-547F 2HCL1)外观白色粉末2)比旋度[α]25D+5.8°±3°(C＝0.49，H2O)3)分子量SIMS法，(M+H)+7874)假定分子式C31H50N10O12S2HCl(3H2O)5)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C，40.27±2.0 C，40.74H，6.52±1.0 H，6.40
N，14.52±1.5 N，15.33O，26.26S，2.92±1.0 S，3.51Cl，7.12±1.5 Cl，7.76＊1，＊2，条件和D的相同。
6)UV光谱
7)CD光谱
8)IR光谱主波数(cm-1)(KBr片)如下3360，3250，3070，3000，2950，1770，1750，1660，1535，1455，1395，1345，1240，1160，1115，1065，1030，980，960，870，5109)13C-NMR谱D2O，100MH2的信号如下所示(δppm)179.39(s)，177.87(s)，177.26(s)，176.47(s)，176.15(s)，173.45(s)，170.68(s)，168.00(s)，159.65(s)，133.51(s)，121.03(s)，72.90(d)，67.15(t)，62.04(d)，52.44(d)，51.77(d)，43.64(t)，41.54(t)，37.47(t)，32.54(t)，29.30(t)，28.56(t)，27.41(t)，23.77(t)，19.55(q)，19.44(q)，19.37(q)10)氨基酸分析(条件与D的相同)丙氨酸约3克分子α-氨基己二酸约1克分子11)TLC(条件与D的相同)Rf＝0.5812)HPLC(条件和D的相同)Rt＝6.5(分)
经HPLC法测定，丙氨酸和α-氨基己二酸的绝对构型分别为L-和R-型。
参考例2(1)将从日本三重(Mie)府阿山(Ayama)地区Tsuge采集的植物标本中分离的黄瘤菌内酰胺属(Xanthomonas lactamgena)YK-280(IFO 14330，FERM BP-635)于琼脂营养斜面培养基上培养，然后接种到一个2升的口(Sakaguchi)烧瓶内，内装有500毫升培养基水溶液(PH7.0)，其组成为葡萄糖2%，可溶淀粉3%，生黄豆粉1%，玉米浆0.3%，聚胨0.5%和氯化钠0.3%，并掺入0.5%的沉淀碳酸钙。将烧瓶置于往复式摇瓶机上，于24℃下培养48小时，将所得的全部培养液转移到一个200升的罐内，内装120升上述培养基，并掺入0.05%的除沫剂Actcol，在通气(120升/分)和搅拌(120转/分)条件下，于24℃培养48小时。全部培养液再转移到一个2000升的罐内，内装1200升培养基水溶液，(不调节PH)其组成为糊精3%，生黄豆粉3%，聚胨0.2%并掺入0.05%的除沫剂Actcol和0.5%的沉淀碳酸钙，在通气(1200升/分)和搅拌(100转/分)下，于24℃培养66小时。
经上述过程得到的培养液(1140升)用2NHCl调节PH至6.0，然后加入Hyf10-Super Gel，过滤、水洗，得滤液1370升。将滤液的PH调节至6.3，并通过装有120升Dowex 50W(25升，50-100目，Na+型)离子交换树脂的柱。柱经水(75升)洗后，用2M氯化钠水溶液洗脱。洗脱液通过装有15升活性炭的柱，经水洗后(45升水)，用8%异丁醇-N/100盐酸(105升)洗脱，将洗脱液的PH调节至6.2，然后浓缩至12升，再将浓缩液的PH调节至7.3，并通过装有10升Diaion HP-20的柱。用20升PH7.3的0.01M磷酸缓冲液洗涤，再用100升PH2.5的0.01M磷酸缓冲液洗脱。
洗脱液通过装有2.5升活性炭的柱，用6升水洗涤后，再用18升8%异丁醇-N/200盐酸洗脱。洗脱液浓缩至1.6升，调节其PH至7.3，然后通过装有2升50-100目Diaion HP-20的柱，用4升PH7.3的0.01M磷酸缓冲液洗涤后，再用20升PH3.0的0.01M磷酸缓冲液洗脱分离。各个洗脱部分用液体层析分析，并将所得的部分分为两组，一组含主要组分TAN-592A，B，和C，另一组含主要成分TAN-592D，E和F。
将含主要组分TAN-592A、B和C的部分合并并通过装有500毫升活性炭的柱，经水(1.5升)洗后，用3升8%异丁醇-N/200盐酸洗脱。将洗脱液浓缩，浓缩液通过装有0.8升Na+型的CM-Sephadex C25的柱，用40升0.02M氯化钠水溶液洗脱分离，各个部分用液相层析分析，将显示TAN-59A和B单峰的部分收集，并收集含主要组分TAN-592C的部分。
合并只含TAN-592A的部分，并通过装有0.3升活性炭的柱，经水(0.9升洗后，用2.1升8%异丁醇-N/200盐酸洗脱，洗脱液浓缩，经冷冻干燥后得1.5克TAN-592A.2 HCl白色粉末。按上述程序从只含TAN-592B的部分得2.0克TAN-592B HCl白色粉末和从含主要组分TAN-592C的部分得到1.9克TAN-592C粗品粉末。
将TAN-592C粗品粉末(0.7克)装入内有100毫升Na+型CM-Sephadex C-25的柱内，用3升0.02M氯化钠水溶液洗脱分离，各洗脱部分用液体层析分析，收集含主要组分TAN-592C的部分，并通过装有30毫升活性炭的柱，经水(100毫升)洗后，用210毫升8%异丁醇-N/200HCl洗脱，洗脱液浓缩。浓缩液HPLC[用山村(yamamura)化学公司生产的φ20毫米X250毫米的YMC-Pack SH-343柱)分离，用PH3.00的0.01M磷酸缓冲液洗脱分离，各个洗脱部分用液相色谱分析，收集只显示单峰的部分。将这些有效部分的PH用1N NaOH调节至7.3，再用1N HCL回调至PH3.0，并通过装有20毫升活性炭柱，水(80毫升)洗后，用200毫升8%异丁醇-水洗脱。洗脱液经浓缩和冷冻干燥后，得到110毫克TAN-592C 2HCl-白色粉末。
合并从上述过程得到的含主要组分TAN-592D、E和F的部分，并通过装有200毫升活性炭的柱，经水(600毫升)洗后，用1.4升8%异丁醇-N/200 HCl洗脱，洗脱液经浓缩后，通过装有300毫升Na+型CM-Sephadex c-25的柱，然后用15升0.02M氯化钠水溶液洗脱分离，各洗脱部分用液相层析分析，分别收集含主要组分TAN-592D、E和F的部分。
合并含主要组分TAN-592D的部分，并通过装有80毫升活性炭的柱，用250毫升水洗涤后，再用560毫升8%异丁醇-N/200 HCl洗脱，洗脱液经浓缩和冷冻干燥，得1236毫克TAN-592D粗品粉末。按同样程序，从含主要组分TAN-592E和F的部分分别得到1560毫克TAN-592E和656毫克TAN-592F粗品粉末。
将TAN-592D(1236毫克)用高性能液体色谱分离(柱子为YMC-Pack SH-343)，用1%甲醇-0.01M磷酸缓冲液(PH3.0)洗脱分离，各个部分用液相层析分析，收集只显示单峰的部分，然后用1NNaOH调节其PH至7.3，并通过装有50毫升活性炭的柱，经200毫升水洗涤后，用400毫升8%异丁醇水溶液洗脱，洗脱液经浓缩和冷冻干燥后，得到232毫克TAN-592D 2HCl白色粉末。
按如上述同样的程序，将TAN-592E和F的粗品粉末用高性能液体色谱分离，分别得到501毫克TAN-592E.2HCl和46毫克TAN-592F.2HCl，均为白色粉末。
上述所得的TAN-592.HCl的物化性质如下。
(ⅰ)TAN-592A.2HCl1)外观白色粉末2)分子量SIMS法，(M+H)+7043)分子式C26H41N9O12S2HCL(2H2O)4)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2
C，38.49±2.0 C，38.43H，6.03±1.0 H，5.83N，15.63±1.5 N，15.51O，27.56S，4.22±1.0 S，3.95Cl，7.95±1.5 Cl，8.73＊1，样品于减压下60℃干燥(P2O5)8小时。
＊2，此为含2克分子水的样品的计算值5)紫外光谱(UV)
±2nm(E1%1cm＝124±20)6)园二色光谱(CD)
-32000±5000和
+28000±50007)红外吸收光谱(IR)(KBr片)主泼数(cm-1)为3420，3080，2960，1780，1730，1670，1510，1400，1260，1170 1060，980，860，510，8)核磁共振谱(13C-NMR)D2O，100MH2的信号如下所示(δppm)179.79(s)，177.00(s)，176.11(s)，170.93(s)，170.77(s)，166.42(d)，162.24(s)，159.63(s)，134.46(s)，118.40(s)，79.67(s)，72.70(d)，67.67(t)，66.01(d)，63.26(t)，57.58(d)57.03(d)，56.52(t)，43.61(t)，41.18(t)，37.35(t)，32.68(t)28.98(t)，28.65(t)，27.52(t)，23.50(t)(S单峰，d二重蜂，t三重蜂，q四重峰)9)氨基酸分析样品用5.5N盐酸于110℃下水解15小时。鉴定出丝氨酸和α-氨基己二酸10)薄层层析(TLC)点样膜、纤维素(东京化学工业公司生产)
溶媒系统，乙腈3%硫酸铵(1∶1)，Rf＝0.5811)高性能液体色谱(HPLC)柱，YMC pack A312，移动相，2%甲醇/0.01M磷酸缓冲液(PH3.0)，2毫升/分。Rt＝3.7(分)A、B、C、D、E和F的下述性质是共通的。
12)溶解度易溶于水、丙酮水溶液、醇水溶液微溶于二甲基亚砜、甲醇、丙酮醋酸乙酯13)显色反应阳性(水合)茚三酮，格瑞克-利贝克(Greig-Leaback)，口反应(Sakaguchi)阴性Barton反应，高锰酸钾(ⅱ)TAN-592B HCl1)外观白色粉末2)分子量SIMS法，(M+H)+7913)分子式C29H46N10O14S HCl(2H2O)4)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C，40.002±2.0 C，40.35H，5.83±1.0 H，5.95N，15.64±1.5 N，16.23O，29.65S，4.30±1.0 S，3.71Cl，4.50±1.5 Cl，4.11＊1，＊2，条件和A的相同
6)UV光谱
260±2nm(E1%1cm＝108±20)7)CD光谱
-31000±5000和
+29000±50008)IR光谱3400，3080，2950，1780，1730，1660，1520，1390，1250，1170 1060，980，860，5209)13C-NMR谱179.85(s)，177.20(s)，176.24(s)，174.41(s)，171.13(s)，166.42(d)，162.23(s)，159.61(s)，134.55(s)，117.97(s)，79.67(s)，72.86(d)，67.10(d)，66.00(d)，63.89(t)，63.19(t)59.10(d)，57.40(d)，57.18(d)，56.30(d)，43.58(t)，41.46(t)37.36(t)，32.74(t)，29.33(t)，28.66(t)，27.41(t)，23.52(t)9)氨基酸分析(条件与A的相同)丝氨酸(约2克分子)还检出α-氨基己二酸10)TLC(条件与A的相同)Rf＝0.6111)HPLC(条件与A的相同)Rt＝4.2(分)(ⅲ)TAN-592C 2HCl1)外观白色粉末2)分子量SIMS法，(M+H)+8623)分子式C32H51N11O15S.2HCl.(4H2O)4)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C，38.04±2.0 C，38.17
H，6.30±1.0 H，6.11N，14.30±1.5 N，15.30O，30.19S，3.18±1.0 S，3.18Cl，7.76±1.5 Cl，7.04＊1，条件与A的相同。
＊此样品含4克分子水。
5)UV光谱
260±2nm(E1%1cm＝97+±20)6)CD光谱
-28000±5000和
+26000±50007)IR光谱3420，3070，3000，2950，1780，1735，1660，1520，1450，1390 1250，1165，1060，860，5208)13C-NMR)谱179.52(s)，178.64(s)，176.16(s)，175.71(s)，174.49(s)，173.94(s)，169.48(s)，166.45(d)，162.54(s)，159.67(s)，132.57(s)，123.59(s)，79.79(s)，72.33(d)，66.82(t)，66.47(d)，64.06(t)，63.87(t)，58.97(d)，58.28(d)，56.26(d)56.21(d)，51.93(d)，43.62(t)，41.46(t)，37.25(t)，32.33(t)29.33(t)，28.91(t)，27.35(t)，23.41(t)，19.47(q)，9)氨基酸分析(条件与A的相同)丝氨酸(约2克分子)并检出α-氨基己二酸10)TLC(条件与A的相同)Rf＝0.6811)HPLC(条件与A的相同)
Rt＝4.6(分)(ⅳ)TAN-592D 2HCl1)外观白色粉末2)分子量SIMS法，(M+H)+6613)分子式C25H40N8O11S2HCl(3H2O)4)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C，37.51±2.0 C，38.12H，6.28±1.0 H，6.14N，14.10±1.5 N，14.23O，28.44S，4.00±1.0 S，4.07Cl，9.94±1.5 Cl，9.00＊1条件与A的相同。
＊2此样品含3克分子结晶水。
5)UV光谱
260±2nm(E1%1cm＝110±20)6)CD光谱
-25000±5000和
+22000±50007)IR光谱3420，3075，2950，1770，1735，1670，1550，1460，1400，1260 1170，1110，1065，870，540，8)13C-NMR谱179.36(s)，176.10(s)，175.86(s)，170.69(s)，170.18(s)，168.18(d)，159.69(s)，132.59(s)，122.91(s)，72.69(d)，67.04(t)，63.21(t)，62.08(d)，60.24(d)，57.58(d)，56.57(d)
56.39(d)，43.64(t)，41.19(t)，37.41(t)，32.36(t)，28.97(t)28.71(t)，27.51(t)，23.71(t)，9)氨基酸分析(条件与A的相同)检定出丝氨酸和α-氨基己二酸10)TLC(条件与A的相同)Rf＝0.6211)HPLC(条件与A的相同)Rt＝7.9(分)(ⅴ)TAN-592E 2HCl1)外观白色粉末2)分子量SIMS法，(M+H)+7483)分子式C28H45N9O13S 2HCl(H2O)4)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C，39.71±2.0 C，40.10H，5.87±1.0 H，5.89N，14.85±1.5 N，15.03O，26.71S，3.90±1.0 S，3.82Cl，7.46±1.5 Cl，8.45＊1条件与A的相同＊2此样品含1克分子结晶水。
5)UV光谱
260±2nm(E1%1cm＝91+±20)6)CD光谱
-24000±5000和
+17000±5000
7)IR光谱3400，3060，2950，1760，1730，1660，1540，1460，1439，1240 1170，1110，1065，1020，870，810，5008)13C-NMR谱179.41(s)，176.44(s)，176.20(s)，174.23(s)，171.02(s)，168.01(s)，159.66(s)，133.50(s)，121.05(s)，72.83(d)，67.11(t)，63.92(t)，63.12(t)，62.06(d)，60.21(d)，58.99(d)57.38(d)，56.82(d)，56.27(d)，43.62(t)，41.40(t)，37.49(t)32.54(t)，29.23(t)，28.59(t)，27.40(t)，23.78(t)9)氨基酸分析(条件与A的相同)丝氨酸(约2克分子)并检出α-氨基己二酸10)TLC(条件与A的相同)Rf＝0.6411)HPLC(条件与A的相同)Rt＝9.6(分)(Ⅵ)TAN-592F 2HCl1)外观白色粉末2)分子量SIMS法(M+H)+8193)分子式C31H50N10O14S 2HCl(4H2O)4)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C 38.00±2.0 C 38.63H 6.87±1.0 H 6.27N 14.35±1.5 N 14.53O 29.88S 3.10±1.0 S 3.33C17.78±1.5 C17.36
＊1条件与A的相同。
＊2此样品含4克分子水。
5)UV光谱
260±2nm(E1%1cm＝90±20)6)CD光谱
-32000±5000和
+20000±50007)IR光谱3420，3070，2950，1770，1735，1660，1540，1460，1395，1340 1250，1160，1110，1065，5308)氨基酸分析(条件与A的相同)丝氨酸(约2克分子)并检出丙氨酸和α-氨基己二酸。
9)TLC(条件与A的相同)，Rf＝0.6710)HPLC(条件与A的相同)，Rt＝10.1(分)上述丝氨酸，丙氨酸和α-氨基己二酸的绝对构型，经HPLC测定分别为L-，L-和D-型。
(2)将在营养琼脂斜面培养基上生长的黄瘤菌内酰胺属(Xanthomonas，lactamagena)YK-278(IFO 14351，FERM BP-636)培养物接种在15个200毫升的锥瓶内，每个锥瓶内装有40毫升培养基水溶液(PH7.0)，其组成为葡萄糖2%，可溶淀粉3%，生黄豆粉1%，玉米浆，聚胨0.5%和氯化钠0.3%，并搀入0.5%的沉淀碳酸钙。锥瓶置于旋转式摇瓶机上于(24℃)下培养24小时，所得的培养液作为种子培养液。
将含3%的糊精、1.5%的玉米浆，0.2%的聚胨，0.1%的硫代硫酸钠和0.5%的沉淀碳酸钙的16升培养基(PH7.0)分装入200毫升的锥瓶内，每个装40毫升。然后于120℃下灭菌20分钟。将1毫升种子培养液接种入这些装有经灭菌的培养基的锥瓶内，置于旋转式摇瓶机上(转速230转/分)于17℃下培养90小时。
将从上述过程得到的16升培养液用2N HCL调节至PH6.5，并加入16升水，经离心分离得32升滤液。
滤液通过装有0.5升50-100目Na+型Dowex-50W的离子交换树脂柱，经1.5升水洗涤后，用10升2M氯化钠水溶液洗脱，洗脱液通过装有0.3升活性炭的柱，柱子用1升水洗涤，然后用2.2升8%异丁醇-N/200HCl洗脱。调节洗脱液的PH至6.2，并浓缩至0.5升。将浓缩液的PH调节至7.3，并通过装有0.6升Diaion HP-20的柱，柱子经1.6升PH7.3的0.01M磷酸缓冲液洗涤后，再用6升PH3.0的0.01M磷酸缓冲液洗脱。
三部分的洗脱液分别通过装有80毫升活性炭的柱，柱子用300毫升水洗后，用600 8%异丁醇-N/200HCL洗脱，洗脱液经冷冻干燥，分别得到402毫克粗品Ⅰ、760毫克粗品Ⅱ和448毫克粗品Ⅲ。
经HPLC分析，表明粗品Ⅱ含TAN-592A、B和C，粗品Ⅲ含TAN-592D、E和F。
按如(1)所述的方法将粗品纯化，得18毫克TAN-592A(HCL)，39毫克B，35毫克C，12毫克D，15毫克E和24毫克F。
将粗品Ⅰ(400毫克)溶于100毫升水，溶液通过装有50毫升Na+型CM-Sephadex C-25的柱，然后用1.5升0.02M的氯化钠水溶液洗脱分离。各个洗脱部分用液相层析分析，分别收集含主要组分TAN-591A、B和C的部分。
将含主要组分TAN-591A、B和C的部分分别通过装有活性炭的柱(每根柱装10毫升)，每根柱用30毫升水洗后，分别用70毫升8%异丁醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩并用高性能液体色谱分离(柱YMC Pack SH-343，φ20毫米X250毫米)用PH4.5的0.01M磷酸缓冲液洗脱分离。各个洗脱部分用液相层析分析，收集显示单峰的部分，用1N NaOH将这些部分的PH调节至7.3，再用1N HCL回调至PH3.0，并分别通过装有5毫升活性炭的柱。柱子经20毫升水洗后，用50毫升8%异丁醇水溶液洗脱，洗脱液经浓缩和冷冻干燥后，分别得到3毫克TAN-591A、18毫克B和22毫克C盐酸盐，均为白色粉末。
上述所得的抗生素TAN-591HCL的物化性质如下(ⅰ)TAN-591A 2HCl1)外观白色粉末2)分子量SIMS法(M+H)+6763)分子式C26H41N7O12S 2HCl(2H2O)4)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C 40.38±2.0 C 39.79H 6.53±1.0 H 6.04N 12.81±1.5 N 12.50O 28.54S 4.07±1.0 S 4.09C18.40±1.0 C19.04＊1，样品在减压下于60℃干燥(P2O5)8小时。
＊2，此为含2克分子水的样品的计算值。
5)紫外(UV)光谱
260±2nm(E1%1cm＝118±20)6)园二色光谱(CD)
-34000±5000和
+27000±50007)红外光谱(IR)(KBr片)主泼数(cm-1)为3420，3250，3080，2950，1780，1735，1675，1515，1410，1360 1280，1160，1060，980，860，5208)核磁共振谱(13C-NMR)D2O，100MH2的信号如下所示(δppm)179.74(s)，177.19(s)，176.16(s)，170.90(s)，170.66(s)，166.42(d)，162.12(s)，134.89(s)，117.77(s)，79.70(s)，72.71(d)，67.12(t)，66.02(d)，63.22(t)，57.58(d)，57.35(d)56.67(d)，42.22(t)，41.21(t)，37.36(t)，32.77(t)，31.28(t)29.30(t)，28.62(t)，25.08(t)，23.50(t)(S单峰，d二重峰，t三重峰，g四重峰)9)氨基酸分析样品用5.5N HCL于110℃下水解15小时。
检出丝氨酸和α-氨基己二酸。
10)薄层层析(TLC)点样膜，纤维素(东京化学工业公司生产)溶媒系统，乙腈3%;3%硫酸铵(1∶1)，Rf＝0.4511)高性能液体色谱(HPLC)柱，YMC pack A312，移动相，5%甲醇/0.01M磷酸缓冲液(PH3.0)，2毫升/分Rt＝2.4(分)A、B和C的组分的下述性质是共通的12)溶解度易溶于水、丙酮水溶液、醇水溶液微溶于二甲基亚砜、甲醇、丙酮，醋酸乙酯13)显色反应阳性(水合)茚三酮，Greig-Leaback反应阴性Barton反应，高锰酸钾 口(Sakaguchi)反应(ⅱ)TAN-591 B 2HCl1)外观白色粉末2)分子量SIMS法(M+H)+7633)分子式C29H46N8O14S 2HCl(2H2O)4)元素分析(%)
分析值＊1计算值＊2C 39.34±2.0 C 39.95H 6.02±1.0 H 6.01N 12.52±1.5 N 12.85O 29.38S 4.40±1.0 S 3.68C17.57±1.5 C18.13＊1，＊2，条件与A的相同。
5)UV光谱
260±2nm(E1%1cm＝124±20)6)CD光谱
-39000±5000和
+29000±50007)IR光谱3400，3270，3080，2970，1780，1735，1670，1530，1410，1260 1160，1060，980，875，5208)13C-NMR谱179.69(s)，177.19(s)，176.21(s)，174.14(s)，171.04(s)，170.89(d)，166.38(d)，162.07(s)，134.95(s)，117.55(s)79.68(s)，72.84(d)，67.09(t)，66.00(d)，63.90(t)，63.10(t)59.00(d)，57.41(d)，57.36(d)，56.37(d)，45.25(t)，41.41(t)37.35(t)，32.77(t)，31.47(t)，29.20(t)，28.60(t)，24.94(t)23.49(t)，9)氨基酸分析(条件与A的相同)丝氨酸(约2克分子)并检出α-氨基己二酸。
10)TLC(条件与A的相同)Rf＝0.47
11)HPLC(条件与A的相同)Rt＝2.8(分)(ⅲ)TAN-591C.3HCl1)外观白色粉末2)分子量SIMS法(M+H)+8343)分子式C32H51N9O15S 3HCl(4H2O)4)元素分析(%)分析值＊1计算值＊2C 36.74±2.0 C 37.85H 6.31±1.0 H 6.16N 11.74±1.5 N 12.42O 29.94S 3.48±1.0 S 3.16CL11.86±1.5 CL10.48＊1条件与A的相同。
＊2此样品含4克分子水。
5)UV光谱
260±2nm(E1%1cm＝110±20)6)CD光谱
-57000±5000和
+39000±50007)IR光谱3440，3270，3080，2950，1780，1740，1675，1530，1410，1250，1150，1060，960，800，5408)氨基酸分析(条件与A的相同)丝氨酸(约2克分子)，并检出丙氨酸和α-氨基己二酸。
9)TLC(条件与A的相同)
Rf＝0.5110)HPLC(条件与A的相同)Rt＝3.3(分)上述丝氨酸，丙氨酸和α-氨基己二酸的绝对构型，经HPLC分析确定分别为L-，L-和D-型。
实施例1将TAN-547A(1.0克)溶于200毫升0.02M磷酸氢二钠水溶液中，溶液用2N氢氧化钠水溶液调节PH至9.4，然后于室温下搅拌33小时。此期间每隔5小时加入2N氢氧化钠，以使溶液的PH保持在9.0-9.4之间。反应毕加入100毫升水，再调节其PH至7.0，然后通过装有100毫升CL-型QAE-Sephadex A-25(瑞典Pharmacia精细化工厂生产)的柱，随后用PH7.0的0.02M磷酸缓冲液洗脱分离。各部分用HPLC分析，收集显示单峰的部分，并调节其PH至7.0。将这些部分的溶液合并，并通过装有50毫升活性炭的柱。柱子经水(150毫升)洗后，用300毫升8%异丁醇水溶液洗脱，洗脱液经浓缩和冷冻干燥，得253毫克7-FA-DCPC钠盐白色粉末。
实施例2将8.5毫克TAN-547B溶于8.5毫升0.02M磷酸氢二钠溶液中，并用1N氢氧化钠调节PH至9.4。溶液于室温下搅拌24小时，其间加入0.1的氢氧化钠以使其PH保持在9.0-9.4之间。反应液用HPLC分析。由此可得到1.3毫克7-FA-DCPC钠盐。其物化性质表明它与例1所得的化合物完全相同。
实施例3将7.0毫克TAN-547C溶于7毫升0.02M磷酸氢二钠溶液中，溶液用0.1N氢氧化钠调节PH至9.4。并于室温下搅拌24小时，其间加入0.1的氢氧化钠使PH保持在9.0-9.4之间。反应液用HPLC分析。由此可得到1.0毫克7-FA-DCPC钠盐。其物化性质表明，它和例1所得到的化合物完全相同。
实施例4于2升TAN-547A(9克)、B(8克)和C(1.5克)混合物的水溶液中加入7.2克磷酸氢二钠，溶液用2N氢氧化钠调节PH至9.4，并于室温下搅拌24小时。反应毕加入4升水，调节其PH至7.0，然后通过装有20升CL-型QAE-Sephadex A-25的柱，柱子用3升水洗后，再用8升PH7.0的0.02M磷酸缓冲液洗脱。合并水洗液和缓冲液，并通过装有1升炭粉的柱，柱用4升水洗涤后，再用3升8%异丁醇洗脱。洗脱液浓缩，浓缩液通过装有0.5升50-100目的Cl-型Dowex/x2的离子交换树脂柱。柱用1升水洗后，再用2.5升0.1M氯化钠水溶液洗脱。此洗脱液和上述从QAE-Sephadex A-25得到的洗脱液(8升)合并，并通过装有0.7升炭粉的柱。柱经2升水洗后，用2.8升8%异丁醇溶液洗脱。洗脱液经浓缩和冷冻干燥后，得3.0克7-FA-DCPC钠盐粉末。其物化性质表明，它与例1得到的化合物完全相同。
实施例5将90毫克TAN-547D溶于20毫升0.01M磷酸氢二钠水溶液中，溶液用1N氢氧化钠水溶液调节PH至9.4，并于室温下搅拌33小时。此期间每隔5小时加入0.1N氢氧化钠，以使其PH保持在9.0-9.4之间。反应毕加入20毫升水，调节溶液的PH至7.0，并通过装有15毫升CL-型QAE-Sephadex A-25的柱，随后用PH7.0的0.02M磷酸缓冲液洗脱分离。各个洗脱部分用HPLC分析，收集显示单峰的洗脱部分，并调节其PH至7.0，并通过装有10毫升活性炭的柱。柱经40毫升水洗后，再用70毫升8%异丁醇洗脱。洗脱液经浓缩和冷冻干燥，得到18毫克DCPC钠盐，为白色粉末。
实施例6将7.0毫克TAN-547E溶于3.8毫升0.02M磷酸氢二钠溶液中，溶液用0.2N氢氧化钠调节PH至9.4。并于室温下搅拌24小时，其间加入0.1的氢氧化钠以保持其PH在9.0-9.4之间。反应液用液相层析分析，由此可得到1.4毫克的DCPC钠盐。其物化性质表明，它与例5所得到的化合物完全相同。
实施例7将3.5毫克TAN-547F溶于3.8毫升磷酸氢二钠溶液中，溶液用0.2N氢氧化钠调节PH至9.4，并于室温下搅拌32小时，其间加入0.1的氢氧化钠以使其PH保持在9.0-9.5之间。反应液用液相层析分析，由此可得到0.64毫克的DCPC钠盐。其物化性质表明，它与例5所得到的化合物完全相同。
实施例8将4.3毫克TAN-547D，3.6毫克TAN-547E和2.7毫克TAN-547F溶于10毫升0.2M磷酸氢二钠溶液中，溶液用0.1N氢氧化钠调节PH至9.4，并于室温下搅拌25小时，此期间加入0.1N的氢氧化钠以使其PH保持在9.0-9.5之间。反应液用HPLC分析，由此可得到1.7毫克DCPC钠盐。其物化性质表明，它与例5所得到的化合物完全相同。
实施例9将0.5克TAN-592A溶于100毫升0.02M磷酸氢二钠水溶液中，溶液用2N氢氧化钠水溶液调节PH至9.5，并于室温下搅拌30小时，其间保持反应液的PH在9.4-9.6之间反应毕加入50毫升水，调节其PH至7.0，并通过装有50毫升CL-型QAE-Sephadex A-25的柱，随后用PH7.0的0.02M磷酸缓冲液洗脱分离。各个洗脱部分用HPLC分析，收集显示单峰的部分，并调节其PH至7.0，然后通过装有25毫升活性炭的柱，柱经75毫升水洗后，用150毫升8%异丁醇洗脱。洗脱液经浓缩和冷冻干燥，得到112毫克7-FA-DCPC钠盐，为白色粉末。
实施例10将0.5克TAN-592B溶于100毫升0.02M磷酸氢二钠水溶液中，溶液用2N氢氧化钠水溶液调节PH至9.4，并于室温下搅拌32小时，其间保持其PH在9.2-9.6之间。反应毕加入50毫升水，调节PH至7.0，并通过装有50毫升CL-型QAE-Sephadex A-25的柱，随后用PH7.0的0.02M磷酸缓冲液洗脱分离。各个洗脱部分用HPLC分析，收集显示单峰的部分，合并并调节其PH至7.0，然后通过装有25毫升活性炭的柱，柱经75毫升水洗后，用150毫升8%异丁醇洗脱。洗脱液经浓缩和冷冻干燥后，得到56毫克7-FA-DCPC钠盐，为白色粉末。
实施例11将8.0毫克TAN-592C溶于8.0毫升0.02M磷酸氢二钠溶液中，溶液用0.1N氢氧化钠调节PH至9.4，并于室温下搅拌20小时，其间加入0.1N的氢氧化钠以使其PH保持在9.2-9.7之间。反应液用HPLC分析，由此可得到1.1毫克7-FA-DCPC。其物化性质表明，它与例9所得到的化合物完全相同。
实施例12于TAN-592A(10.2克)、B(8.2克)和C(1.6克)混合物的水溶液(2升)中，加入7.2克磷酸氢二钠，溶液用2N氢氧化钠调节PH至9.4，至于室温下搅拌31小时，其间用2N氢氧化钠保持其PH在9.0～9.4之间。反应毕加入4升水调节其PH至6.7，并通过装有1升Na+型Dowex 50 WX2的柱，柱经1升水洗后，洗液与洗脱液合并，并通过装有1.5升炭粉的柱，柱经4升水洗后，用7.5升8%异丁醇洗脱。洗脱液浓缩，浓缩液通过装有1升Cl-型QAE-Sephadex A-25的柱，随后用0.02M氯化钠水溶液洗脱分离。含抗生素的部分(4升)通过装有1.5升炭粉的柱，柱经4.5升水洗后，用4.5升8%异丁醇洗脱。洗脱液经浓缩和冷冻干燥，得到4.1克的7-FA-DCPC钠盐粉末。其物化性质表明，它与例9得到的混合物完全相同。
实施例13将10克TAN-591A溶于200毫升0.02M磷酸氢二钠水溶液中，溶液用2N氢氧化钠水溶液调节PH至9.4，并于室温下搅拌33小时，其间保持其PH在9.0～9.4之间。反应毕加入100毫升水并调节其PH至7.0溶液通过装有100毫升Cl-型QAE Sephadex A-25的柱，随后用PH7.0的0.02M磷酸缓冲液洗脱分离。各个洗脱部分用高速液体层析分析，收集显示单峰的部分，合并并调节其PH至7.0。并通过装有50毫升活性炭的柱，柱经150毫升水洗后，用300毫升8%异丁醇洗脱。洗脱液经浓缩和冷冻干燥，得到122毫克7-FA-DCPC钠盐，为白色粉末。
实施例14将9.2毫克TAN-591B溶于9.2毫升磷酸氢二钠溶液中，溶液用0.1N氢氧化钠调节PH至9.4，至于室温下搅拌20小时，其间用0.1N氢氧化钠保持其PH在9.2～9.7之间。反应溶液用高速液体层析分析，由此可得1.5毫克7-FA-DCPC其物化性质表明，它与例9得到的化合物完全相同。
实施例15将7.8毫克TAN-591C溶于7.8毫升0.02M再用120毫升8%异丁醇洗脱。洗脱液浓缩，浓缩物经冷冻干燥，得到140毫克7-DCPC钠盐粉末。其物化性质表明，它与例9得到的化合物完全相同。
实施例16于50毫升TAN-591A(400毫克)、B(112毫克)和C(53毫克)混合物的水溶液中，加入180毫克磷酸氢二钠，溶液用2N氢氧化钠调节PH至9.4，其间用2N氢氧化钠保持其PH在9.0～9.4之间。反应毕加入100毫升水，调节PH至7.0，并通过装有25毫升Na+型Dowex 50 WX2的柱，随后用25毫升水洗涤。水洗液和洗脱液合并，并通过装有25毫升炭粉的柱，柱经100毫升水洗后，再用75毫升8%异丁醇洗脱。洗脱液浓缩，浓缩液通过装有25毫升Cl-型QAE-Sephadex A-25的柱，随后用350毫升0.02M氯化钠水溶液洗脱分离。将含抗生素的部分(100毫升)通过装有40毫升炭粉的柱，柱经120毫升水洗后，化性质表明，它与例17得到的化合物完全相同。
实施例17将100毫克TAN-592D溶于20毫升0.01M磷酸氢二钠溶液中，溶液用1N氢氧化钠调节PH至9.4，并于室温下搅拌30小时，其间保持其PH在9.0～9.4之间。反应毕加入20毫升水，调节其PH至7.0，并通过装有25毫升Cl-型QAE-Sephadex A-25的柱，随后用PH7.0的0.02M磷酸缓冲液洗脱分离。各洗脱部分用HPLC分析，收集显示单峰的部分，合并并调节PH至7.0。并通过装有10毫升活性炭的柱，柱经40毫升水洗后，用70毫升8%异丁醇洗脱。洗脱液经浓缩和冷冻干燥，得到21毫克DCPC钠盐，为白色粉末。
实施例18将9.2毫克TAN-592E溶于9.2毫升0.02M磷酸氢二钠溶液中，溶液用0.2N氢氧化钠调节至PH9.4，并于室温下搅拌20小时，其间加入0.1N氢氧化钠以保持PH在9.2～9.7之间。反应液用液相层析分析，由此可得2.4毫克DCPC钠盐。其物化性质表明，它和例17得到的化合物完全相同。
实施例19将8.0毫克TAN-592F溶于16毫升0.02M磷酸氢二钠溶液中，溶液用0.2N氢氧化钠调节PH至9.4，并于室温下搅拌20小时，其间加入0.1N氢氧化钠以保持其PH在9.2～9.7之间。反应液用液相层析分析，由此可得2.0毫克DCPC钠盐。其物化性质表明，它与例17得到的化合物完全相同。
实施例20将3毫克TAN-592D，3毫克TAN-592E和3毫克TAN592C溶于10毫升0.02M磷酸氢二钠溶液中，溶液用0.1N氢氧化钠调节PH至9.4，并于室温下搅拌25小时，其间加入0.1N氢氧化钠以保持其PH在9.0～9.5之间。反应液用高速液体色谱分析，由此可得1.5毫克DCPC钠盐。其物磷酸氢二钠溶液中，溶液用0.1N氢氧化钠调节PH至9.4，并于室温下搅拌20小时，其间用0.1N氢氧化钠保持其PH在9.2～9.7之间。反应液用高速液体层析分析，由此可得到0.82毫克7-FA-DCPC钠盐。其物化性质表明，它与例9得到的化合物完全相同。
实施例21将三角酵母菌(Trigonopsis variabilis)IFO 0755接种在装有40毫升种子培养基的200毫升烧瓶内。每升种子培养基(PH6.0)含20克葡萄糖，4克KH2PO41克MgSO4·7H2O，0.5克CaCl2，0.1克H3PO4，40毫克(NH4)6Mo7O24·4H2O，40毫克MnSO4·4H2O，40毫克ZnSO4·7H2O，45毫克CuSO4·5H2O，25毫克FeSO4·7H2O，4毫克盐酸硫胺，20微克生物素，4克DL-α-丙氨酸。培养液于28℃下振摇2天。
将1毫升培养液转移到主培养基内(除DL-α-丙氨酸用DL-蛋氨酸代替外，其它组份相同)，将细胞用高速离心机分离，经蒸馏水洗涤后，分散于40毫升内含10毫克分子叠氮化钠的1M焦磷酸缓冲液(PH8.0)中。于混悬液中加入4毫升440毫克化合物(Ⅳ)的水溶液。混合物倾入200毫升烧瓶内，于28℃下反应16小时。用高速离心将细胞滤去，得91毫升上清液。
上清液加入500毫升水，调节PH至7.0，然后通过200毫升Cl-型QAE Sephadex A-25的柱，用0.05M磷酸缓冲液(PH7.0)洗脱，合并有效部分，并通过装有200毫升活性炭的柱，柱经水洗后，先用1000毫升8%异丁醇水溶液，再用400毫升8%异丁醇水溶液-N/100氨水洗脱。洗脱液浓缩，浓缩液通过装有200毫升Cl-型QAE Sephadex A-25的柱，柱子用PH7.0的0.03M磷酸缓冲液洗脱。各个洗脱部分用HPLC分析，收集显示单峰的部分，并通过装有300毫升活性炭的柱。柱子经900毫升水洗后，先用900毫升8%异丁醇水溶液，随后再用500毫升8%异丁醇-N/100氨水洗脱。合并洗脱，浓缩和冷冻干燥，得360毫克化合物(Ⅲ)的双钠盐。
实施例22将-铂环量的假单胞菌属(Pseudomonas)SP.UK-2221(IFO 14366，FERM BP-637)接种于装在1升锥瓶内的200毫升培养基中。培养基含1%的胨，0.5%的肉浸膏，0.1%酵母浸膏，0.05%的戊二酸和0.5%的氯化钠，其PH为10.0。培养物于30℃下振摇7天。
离心分离出细胞，并将之分散在0.1M磷酸钾缓冲液中(PH7.0)，配成浓度为500毫克/毫升。此混悬液(20毫升)与60毫升浓度为15毫克/毫升的化合物(Ⅲ)(从例21得到)的0.1M磷酸钾缓冲液混合，于37℃下放置48小时。反应混合物经离心过滤除去细胞，将所得上清液的PH调节至7.2，然后通过装有5毫升活性炭的柱，柱子经10毫升水洗后，先用10毫升水，再用40毫升8%异丁醇洗脱。洗脱液于减压下浓缩，浓缩液(1毫升)通过装有5毫升Cl-型QAE-Sephadex A-25的柱，柱子先用25毫升水，后用25毫升0.02M氯化钠水溶液洗涤后，再用0.05M氯化钠水溶液洗脱，每5毫升收集一份。各个洗脱部分用HPLC分析，收集显示所需化合物单峰的部分，得20毫升有效部分。将其PH调节至6.9，并通过活性炭柱(5毫升)柱层析。柱子经25毫升水洗后，先用25毫升8%异丁醇，后用25毫升8%异丁醇-N/100氨水洗脱。洗脱液于减压下浓缩，冷冻干燥，得8.5毫克游离的化合物(Ⅱ)，为白色粉末。
图1吸收度VS波数图2透光度VS波数图3透光度VS波数图4吸收度VS波数图5～图8透光度VS波数
权利要求
1.生产结构物式如下的化合物或其盐的方法即将结构式如下的化合物
或其盐与一种微生物的培养液或培养液的加工产物一起培养。这种微生物属假单胞菌属，能
将起始化合物7-位上的HOOC-(CH2)3-CONH基团转变为-NH2-基。
2.根据权利要求
1所述的方法，其中微生物为假单胞菌属Pseudomonas sp.UK-2221(IFO 14366)。
3.生产结构式如下的化合物或其盐的方法即将结构式如下的化合物
或其盐与一种微生物的培养液或培养液的加工产物一起培养，这种微生物属Trigonopsis，能将起始化合物7-位上的
基团转变为HOOC-(CH2)3-CO-NH-基。
4.根据权利要求
3所述的方法，其中微生物为三角酵母菌属(Trigonopsis variabilis IFO0755)。
专利摘要
结构式如下的化合物(其中R′为
文档编号C12P35/00GK85104867SQ85104867
公开日1987年1月14日 申请日期1985年6月25日
发明者原田节夫, 坪谷重利, 小野英南 申请人:武田药品工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan