双链rna纠正循环免疫复合物及单核细胞功能异常的制作方法

专利名称：双链rna纠正循环免疫复合物及单核细胞功能异常的制作方法
人类的各种主要炎性疾病都是以形成循环免疫复合物(CIC)为特征的，其基本上是于血清中存在抗原-抗体复合物。病原学上，持续存在CIC与包括系统性红瘢狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、各种恶性肿瘤以及由HIV和其他病毒、细菌和寄生虫引起的传染性疾病有关。在上述疾病及其他相关紊乱中，清除CIC，即除去单核细胞/巨噬细胞然后将它们输送到肝脏的正常过程也被扰乱了。因此在这些病人群中常常观察到外周血单核细胞功能及吞噬能力的相关紊乱;一般说来，这些缺陷常常可导致各种身体组织的大量炎性破坏，并降低必然要接触到细菌、病毒和真菌等病原体者对这些病原体的抵抗能力。
本文介绍了一种能够控制上述大部分功能缺陷同时又能改善临床状况的新方法。特别是描述了一种利用双链RNA的降低异常CIC免疫产物沉积同时改善单核细胞功能、消除所有对人体的不利影响的方法。另外还描述了保护胸腺和骨髓衍生的细胞免受病毒感染及阻止病毒在接受了有效量配对或失配dsRNA的病人体内扩散，该dsRNA可赋予病人以抗病毒抗性但没有有害的细胞毒性。
通常作为良性过程开始的正常功能性免疫系统、免疫复合物形成可能造成对各种器官和组织的损伤。由CIC激活补体(一种正常血液产物)可导致一系列破坏性变化，包括细胞溶解及CIC在各种血管壁、细胞膜上沉积等。在特殊的临床实践中，发动这种致病性免疫反应的抗原常常是未知的，但它们可以是微生物、肿瘤甚或机体本身的组织。某些传染性疾病如乙型肝炎亦可伴有免疫复合物疾病。迄今已了解了CIC在诊断和检测各种临床状态之治疗效果上的作用，进而近十年来已建立了40多种检测和定量分析病理体液中这类免疫复合物的方法。由生产部门推出的产品小册子，如标有4/87的Maryland医学实验室的小册子和1977年推出的RocheBiomedical实验室的小册子都指出了与CIC有关的疾病范围并证明仅次于增加了人体内CIC产生问题之化学问题的重要性。
实际上CIC可以包含有病毒颗粒，如在爱滋病病人的CIC中即有HIV本身的病毒包含物(Morrow等，Clin.ImmunologyandImmunoPathology.Vol.40，P。515，1986)。CIC，特别是如果以高浓度存在时，可引起免疫抑制作用，甚至能造成对机体极为重要的网状内皮系统的阻障(参见Morrow等的文章)。可见，循环免疫复合物(IC)可能是许多人和动物疾病中导致单核细胞-巨噬细胞功能异常的原因之一。因此可以认为，虽然形成“小”量IC可能是对疾病的正常病理生理反应的一部分，但IC的不适当合成将会引起和/或加剧各种疾病。
特别是在估计风湿性疾病，如类风湿性关节炎和红斑狼疮中，免疫复合物形成是一个有用的参数。许多病人在若干时间内体内免疫复合物水平提高，可认为与病情活动有关。
用于估计人体内CIC的方法包括检测CR1受体，〔一种与补体系统的某些片段(特别是C3G和C4G)结合的糖蛋白〕。红血细胞(RBC)在其表面上携带体循环中的大部分CR1受体。CR1似乎是通过RBC将CIC输送到肝脏然后被局部的单核细胞/巨噬细胞除掉而赋予RBC以消除CIC的能力(见Tausk等，J.Clin.Investigation，Vol.78，p.977，1986及本文提到的文章)。有自身抗体和CIC形成的各种疾病，如关节炎、红斑狼疮和爱滋病，均与红细胞CR1的水平低有关。
本发明使用了dsRNA，特别是失配dsRNA治疗炎症性疾病。炎症性疾病的一个根本原因是可利用的CR1受体缺乏及循环C3增加，对此将在下面详细述及。用dsRNA治疗可使这些指标回复正常。
我检查了一组已有HIV感染之证据的病人，以确定CIC水平、CR1水平与疾病严重性(临床状态)之间的关系。此外我还通过其他试验(直接Coombs试验)以检测是否免疫复合物能结合到受试者的RBC上，以及如根据单核细胞功能和数目所探查的他们的网状内皮系统的功能状态，而这要在完成这些基础测定后才有意义。我发现我确实能够在给予某些dsRNA分子后使免疫学紊乱及恶化的临床状况以一种协调方式逆转。
我首先选择了有以前接触HIV史的个体即有原型免疫学功能紊乱者，因为(a)他们已出现了明显的高水平免疫复合物(见Mc-Dougal等，J.Clin.Immun.，Vol.5，p130，1985及本文所列参考文献)，(b)病原微生物是已知的，(3)该疾病在危害公众健康的慢性病中有着空前的重要性。最后，先前所使用了各种治疗方法，包括使用药物和生物制品(干扰素、白细胞介素、胸腺提取物、isoprinosine、胸腺衍生的多肽等)，但均没有证明它们可改变严重的免疫紊乱或日益恶化的临床过程。再者，有许多令人信服的理由表明一种新的治疗方法，即抑制免疫复合物的形成或增加其清除率的方法，在许多其他人体疾病的治疗中将会产生深远的影响。确实已有新的证据表明逐渐丢失CR1活性(由于进行性CIC形成)与还原病毒/炎性疾病从无症状“带病毒”状态到最后濒死期的整个进程有关(见Inada等，AIDSResearch，Vol，2，p235，1986及本文所列文献)。
“匹配的dsRNA”是指其中对应链之间的氢键键合(碱基堆积)为相对完整的dsRNA，即每29个连续的碱基残基中平均不到1个碱基对被断开。据此，术语“失配dsRNA”的意义也应是明确的。
dsRNA可以是一种多聚次黄苷酸和多聚胞苷酸的复合物，且多聚胞苷酸中所含尿嘧啶碱基或鸟嘌呤碱基的比例，可由每5个有1个至每30个中有1个(poly I.poly(C4-29X＞U或G)。
dsRNA可具有结构通式rIn·r(C12，U)n。下面讨论dsRNA的其他适当例子。
用于本发明的优选的失配dsRNA是以选自poly(Cn，U)和poly(Cn，G)(其中n是4到29的正整数)的共聚核苷酸为基础的，其为通过修饰rIn·rCn以沿着多聚胞核苷酸(rCn)链掺入未配对碱基(尿嘧啶或鸟嘌呤)所形成的多聚次黄核苷酸和多聚胞核苷酸之复合物的失配类似物。此外，dsRNA可以是经修饰多聚次黄核苷酸(rIn)的核糖基骨架，如掺入2′-邻位-甲基核糖基残基而由poly(I)·poly(C)dsRNA衍生的dsRNA类似物。失配复合物可与某种RNA稳定的聚合物如赖氨酸或纤维素相复合。这些rIn·rCn的失配类似物中，优选的是如Carter和Ts′o在美国专利4130641和4024222号(均列为本文参考文献)中所述的结构通式为rIn·r(C11-14，U)n或rIn·1r(C29，G)n者。本文所述的dsRNA一般均可适用于本发明。
可用于本发明的其他失配dsRNA包括poly(I)·poly(C4，U)poly(I)·poly(C7，U)poly(I)·poly(C13，U)poly(I)·poly(C22，U)poly(I)·poly(C20，G)poly(I)·poly(C29，G)和poly(I)·poly(Cp，)23G＞P用于本申请中的淋巴激活素包括干扰素特别是α-干扰素、白细胞介素特别是向细胞介素-2(IL-2)和重组的白细胞介素-2(rIL-2)，以及肿瘤坏死因子(TNF)。另外还包括在动物对所接触的淋巴激活素的反应中所形成之淋巴激活素激活的杀伤细胞(LAK)。
所用淋巴激活素为干扰素(α)时，其使用量为每毫升病人体液0.01到100，000IRU。所用淋巴激活素为IL-2(最好是rIL-2)时，给药量的范围为每公斤病人体重约102IL-2单位至上限达到病人体内不可接受的毒性水平，即高达106IL-2单位。但最有效的、易于控制毒性反应的给药剂量为每公斤体重约103到104IL-2单位。
dsRNA的常用给药量为每毫升病人体液约0.1到1，000微克dsRNA。所说的体液是指血清、盐、维生素等的溶液，其在机体内循环并浸透组织。如给予上述的两种制剂时，可作为混合物给予两种活性制剂，亦可分别但同时给药或相继给药。
dsRNA和淋巴激活素“联合”给药的方式包括将两种制剂作为治疗混合物一起给药;两种制剂分别但同时给药，如通过分开的静脉内输入管注入同一病人体内。“联合”给药还包括将两种药物分开给，其中先给一种并在短时间内给予第二种。
用dsRNA恢复已改变了的免疫复合物形成

图1显示了对一60Kg体重病人给予一种dsRNA即rIn·Ir(C11-14，U)n(50-200mg，每周两次)之前、给药期间和给药后所作临床检验的结果。作免疫复合物试验(Inada，1986，上述文献)旨在寻找能参与整个补体激活过程的免疫复合物。简单地说，首先加热失活病人血清并结合豚鼠补体，然后还原(使用dTT，即硫苏糖醇)，最后加入正常RBC作为带有已知的、预定含量之游离CR1受体的指示细胞。如果病人血清中有免疫复合物，指示细胞将会凝集，即产生免疫粘附凝集作用(IAHA)。我们用“游离”CR1受体试验测定了病人RBC上的“游离”CR1受体活性，并将我的表1中的结果与Inada对各种未处理之病人所作检测的结果(见他的图1所示，AIDS Research，Vol.2，No.3，p238，1986)进行比较。我首先使用Inada所描述的及本领域内已知的技术使免疫复合物、补体及病人RBC“影细胞”(空胞)混合。如果病人的RBC上有可利用的CR1受体，即结合CIC，这样当加入指示RBC(得自正常人)时，溶液中便没有CIC且指示RBC不会凝集。如果达到凝集的程度，即表明病人的RBC空胞因没有可利用的CR1受体而不能结合CIC。在这种情况下，没有CR1受体可能是由于存在高(异常)水平的循环免疫复合物而使这些受体被饱和之故。“游离”CR1受体的水平低是一个预后不良的征象，并常常与CIC水平高有关。
表1CIC水平、“游离”CP1受体含量之间的关系直接Coomb′s试验以及给予dsRNA对纠正这些些异常(致病性)免疫学参数的效果血细胞免疫复合物 “游离”CR1直接Coombs′病人比容(μg/ml)受体试验1.Rejo，予处理 40 32 - IgG、IgM、C32周 40 16 + IgG、IgM、C34周 36 4 ++ IgG、IgM、C38周400+++IgG，IgM16周400+++痕量IgG2.Clin，予处理 45 40 - IgM，C32周4620+04周450++08周450++016周450+++03.Tuja，予处理 36 36 + IgG，IgM，C34周 34 28 + IgG， C38周 35 16 +++ IgG、痕量C320周354+++040周350++++0
4.Poca，予处理 34 32 - IgG、IgM、C38周364+IgG20周 36 4 ++ 痕量IgM、痕量C340周360+++0检查正常被检者(10)免疫复合物阴性，CR1++++，Coombs′试验阴性。
人们可以很容易地看出，我通过给予dsRNA能够使患炎性疾病病人的这些参数恢复到基本正常。将表1所示数据与Inada等人的图1和表1中所示数据作比较，可以很清楚地看出，我对有关病人使用dsRNA治疗后所测的结果，就同样广泛的实验室参数来说，与Inada等人报导的37个健康人的正常值十分接近。
我在上面已就用于本发明之检测“游离”CR1受体的方法作了概述。我还利用Inada等人的技术检测了在给予dsRNA之前、给药期间及给药后结合到病人RBC上的免疫分子的实际类型(直接Coombs′试验)。特别是当IgG和IgM这两类免疫球蛋白结合到RBC上时，即表明存在一种活性异常免疫过程。例如，Inada发现正常受检者都没有出现直接Coombs′试验阳性，而携带活性还原病毒感染的病人中64-84%很容易检出阳性结果，而且阳性的程度与临床状态有关。我还检验了是否由补体系统之特异成分C3包被RBC也是异常免疫或炎性反应的一个附加的可靠标志。特别是，RBC上存在C3即表明补体系统或其中C1、C4、C2及最后的C3相继结合到RBC上的级联反应被激活。再者，我还证明了这样一个完全未曾预略到的发现，即dsRNA能够纠正附着于病人循环RBC上之炎性系统成分(如IgG、IgM和C3分子)的异常浓度。
特别重要的是，在我的恢复免疫反应之不同方面的动力学的工作中，还表明dsRNA与基本疾病过程的可见根源有一定关联。例如，与临床状态迅速改善相关联的免疫复合物水平很快下降(表1)，而直接Coombs′试验则改善较慢。我的观察结果支持这样的论点(a)Coombs′试验的异常很难于转为正常，常常需要2-3个月才能去除;而(b)CIC水平下降更为迅速，因为正如用直接Coombs′试验所检测的，它们通常只在RBC被异常免疫复合物饱和之后才开始出现。将我的表1(最后一栏，直接Coombs′试验数据)与Inada的图2和3相比较，有力地证明了我确实能够使我的被检病人的严重免疫功能紊乱按照Inada等人独立检测一组完全健康和正常人群而建立的免疫学标准恢复到基本正常状态(例如Inada检测的一组健康被检者中，其RBC上均没有可检出水平的免疫球蛋白决定子(determinants)或补体C3片段)。
恢复已改变了的血液单核细胞功能虽然单核细胞-巨噬细胞在(1)发起和调节免疫反应以及(2)抗微生物的防御机制中起着关键性作用，但对这些细胞研究的课题却很少(见Roux-Lombard等，EuropeanJ。ofClin.Investigation，Vol.16，p262，1986和本文列出的文献)。例如，单核细胞/巨噬细胞能吞噬各种微生物并产生具有高度杀菌能力的活性氧中间体。它们还能分泌已知可改变T细胞功能的前列腺素。因此，考虑到我在表1所示的其他参数，相对于它们在免疫调节中的互补性和关键性作用，我进一步研究了在对同一组病人给予dsRNA之前、给药期间和给药之后的单核细胞吞噬和杀菌能力(一种重要功能)及外周血单核细胞数。
我用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法由肝素化血中分离出单核细胞。用锥虫兰染料排斥试验确定其存活率大于95%。然后用MO2(用于单核细胞)、OKT3、OKT4、OKT8等标准单克隆抗体检测单核细胞及T淋巴细胞亚群，继后又使用了得自Ortho Diagnostics公司(Raritan，New Jersey，U.S。A.)的萤光素结合的羊抗小鼠免疫球蛋白，以便于进行细胞计数。
表2给带有免疫复合物的病人使用dsRNA以恢复其降低了的血单核细胞功能/数目病人%单核细胞单核细胞数%杀伤细胞(MO2标志) (每毫升) (正常范围＝10-62%)1，Rajo，预处理15502周633044周12660108周189901816周179352，Clin，预处理212632周8504104周13819358周159454016周19119740
3，Tuja，预处理29804周1153948周104901520周125882040周18882354，Poca，预处理14028周93151620周124202440周2070040我还以标准技术在自体或合并的AB型血清存在下使用金黄色酿脓葡萄球菌检测了杀菌能力(Cruchard等，DiagnosticImmunol.，Vol.2，P203，1984;该部分内容列入本文参考文献)。表2中我给出了以保温1小时后被杀死之细菌的百分数表示的实验结果。
从表2可以看出，在免疫协合者接受定期给予的失配dsRNA(rIn·r(C11-14，U)n，亦称Ampligen ，此为HEM Research有限公司(Rockville，Maryland，USA)注册的商品名)后，其单核细胞数目和功能得以迅速而出乎预略的恢复。遗憾的是，以前一些研究者使用其他淋巴激活素来恢复这种功能的尝试均告失败。比较表1和2可以明显看出，就同时恢复多种免疫学功能来说，我已获得了多方面的成果，而且获得了具有有利的反应动力学并显然没有宿主毒性的效果。
表3所示数据表明dsRNA的保护性作用可扩展到免疫系统之各种T细胞成分以外。这些数据显示了dsRNA在保护骨髓细胞系例如但不仅限于单核细胞/巨噬细胞中的效果。考虑到T细胞属于胸腺衍生的细胞系，所以我还证明了某些剂量的dsRNA特异性保护骨髓及胸腺来源之人类细胞的其他能力;即能够使细胞免受动物病毒感染，而对包括其复制周期在内的正常细胞功能则没有可测出的有害影响。其中使用了HIV(病毒)作为原型，因为该病毒在急性溶胞能力、亚急性溶胞能力甚或基因檎夏芰Γㄇ痹诤 或激发癌症的能力)等方面均可模拟其他病毒。
表3所示结果进一步证实了对各种病毒分离物(如HTLV-ⅢB和HTLV-ⅢRF)及各种靶细胞(如U937或H9细胞)的抗病毒作用。
阻止和/或控制骨髓衍生之细胞的感染而又没有毒性，这在治疗上是很有意义的，因为事实上许多动物病毒都以这类细胞作为初级或二级病毒储库。例如，HIV用巨噬细胞、巨核细胞及各种能对集落刺激因子起反应的细胞作为宿主，而这些集落刺激因子恰在其致病机理及使之得以逃避宿主免疫监视能力等方面起到重要作用。
权利要求
1.一种治疗以病人血液中循环免疫复合物增加为特征之炎性疾病的方法，该方法包括对患有这种炎性疾病者给予有效量的双链RNA，直至循环免疫复合物恢复到正常水平以表明该炎性疾病被去除为止。
2.一种诊断和治疗由病人血液中循环免疫复合物诱导之炎性疾病的方法，其包括(1)通过(a)检测病人血液样品之红血细胞上可利用的CR1受体水平，(b)作直接Coombs′试验以检测已结合到病人红血细胞上之免疫分子的类型，或(c)作为病人补体系统被激活的一种指征估计被C3包被之病人红血细胞的水平，以估计病人血液血清样品中的循环免疫复合物，以及必要时(2)给病人使用有效量的双链RNA。
3.根据权利要求2的方法，其中炎性疾病是由微生物如病毒、细菌或原虫引起的，为一自身免疫过程、类风湿性关节炎、肝炎或系统性红斑狼疮。
4.根据权利要求3的方法，其中炎性疾病是按照A型、B型或非A/B型肝炎病毒病原因子分类的。
5.一种诊断和恢复病人免疫功能的方法，其包括(1)通过(a)自病人体内分离单核细胞，检测单核细胞和T淋巴细胞亚群、将检测的结果与已知的、标准化的无症状人群的检测结果相比较;(b)检测病人血液样品的杀伤细胞的能力并与对已知的、标准化的无症状正常人群所作检测的结果相比较;或(c)进行(a)或(b)两种检测以估计病人的免疫功能，而且如果一项或两项检测所得的数据与标准值有明显差异，则(2)对病人给予足以恢复其免疫功能量的dsRNA。
6.根据权利要求5的方法，其中失配dsRNA是与poly C复合的poly I，又最好其中与poly C复合的poly I是另外还与一种RNA稳定化的聚合物如赖氨酸或纤维素相复合的。
7.根据权利要求2或5的方法，其中dsRNA是与多聚尿苷酸复合的多聚腺苷酸，且最好是失配的(mismatched)。
8.根据权利要求2或5的方法，其中dsRNA是失配的并且是一种多聚次黄苷酸和多聚胞苷酸的复合物，多聚胞苷酸的5个至30个碱基中含有1个尿嘧啶或尿嘌呤碱基，且该失配dsRNA最好是rIn′r(C11-14，U)n。
9.根据权利要求2或5的方法，其中在用dsRNA治疗前或治疗同时给用一种淋巴激活素如干扰素或白细胞介素。
10.一种使胸腺或骨髓分化的细胞免受病毒感染或阻止病毒扩散的方法，其包括对被试者投予一种能使之产生抗病毒抗性而又无不良之细胞毒性的有效量的配对或失配的dsRNA。
11.根据权利要求10的方法，其中失配dsRNA是与poly C复合的poly I。
12.根据权利要求11的方法，其中与poly C复合的poly I还另外与一种RNA稳定化的聚合物相复合。
13.根据权利要求12的方法，其中稳定化的聚合物是赖氨酸或纤维素。
14.根据权利要求10的方法，其中dsRNA是与多聚尿苷酸复合的多聚腺苷酸。
15.根据权利要求11的方法，其中给予了一种失配dsRNA。
16.根据权利要求15的方法，其中失配dsRNA是多聚次黄苷酸和多聚胞苷酸的复合物，且包聚胞苷酸的每1至30个碱基中有1个尿嘧啶或鸟嘌呤碱基。
17.根据权利要求16的方法，其中失配dsRNA是rIn·r(C11-14，U)n。
18.根据权利要求10的方法，其中dsRNA包含键断裂区且dsRNA表现有rIn·r(C11-14，U)的有利的治疗比例特性。
19.根据权利要求15的方法，其中所给予的失配dsRNA的量可达到每毫升病人体液1至1，000微克的水平。
全文摘要
给予匹配的或失匹配的dsRNA可使见于患有炎性疾病，病毒感染或单纯免疫功能失调之病人血清中的，循环免疫复合物异常恢复到正常水平或赋予病人以抗病毒免疫力。
文档编号A61K31/70GK1035050SQ8810637
公开日1989年8月30日 申请日期1988年7月16日 优先权日1987年7月17日
发明者威廉A·卡特 申请人:Hem研究公司