专利名称：小球藻提取物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小球藻的提取物，特别是涉及培养于含碘化物或碘酸盐的培养基中的淡水小球藻及其生产方法和其应用。
小球藻属是细胞绿藻纲的一个属，因为它显示对太阳光和其他光能有极好利用效率，显示比其他常见植物有更快的增殖速率，并且含有蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素、矿物质等多种营养物质，因此是人和其他动物食物的极好来源之一。此外，小球藻中所含有的生物学活性物质表现有加速细菌、动物和植物生长的作用。小球藻还具有一定的药理学活性，即可作为医药的有效成分用以治疗消化器管肿瘤、高胆固醇血症、癌症等。已经研究了小球藻的这些生物学活性与其细胞增殖因子的关联。
小球藻可分成作为天然产品的海生藻及作为培养产品的淡水藻，因为前一种类型小球藻的生产能力低，所以后者占据了绝大部分市场。
本发明人从海生与淡水小球藻不同的观点出发进行了研究，发现一般市售的淡水小球藻基本不含碘化合物，而海生小球藻则含有大量被认为是取自海水的碘化合物。因此，进一步研究了在添加含碘化合物的培养基中培养淡水小球藻以得到其中含碘成分的小球藻，并研究了它们作为抗肿瘤药物的应用[日本专利59-192083(A)号(日本专利申请号65213/1983)和日本专利62-123128(由日本专利申请号65213/1983分出的日本专利申请号162144/1986)]。
据估计，由其中含有碘成分的淡水小球藻制得的提取物可表现具有生物学活性，以及不同于那些来自基本上不含碘成分的淡水小球藻之常规细胞增殖产品的其他效能。
本发明的基本目的在于由其中含有碘成分的淡水小球藻制得提取物以阐明其物理-化学性质及药学活性。
本发明的具体目的之一是提供含有高水平碘成分及其他成分的提取物。
本发明的另一个具体目的是提供制备该提取物的方法。
本发明的再一个目的是提供含有该提取物的医药组合物。
根据本发明，可通过制得至少含有100ppm碘，至少含有10%(重量)的糖、至少10%(重量)蛋白和至少含4.5mg/ml核酸的提取物来实现第一个具体目的。
制备提取物的方法包括在至少含有100ppm碘的培养基中、于光照下培养淡水小球藻、由培养基中分离小球藻、向分离的小球藻内加水于100℃下至少加热几分钟、分离出不溶性物质，以得到作为滤出液的提取物。含水提取物可以冻干保存。
用于本发明的淡水小球藻包括chlorella pyrenoidosa、chlorella burgaris、chlorella eribrdes、chlorella cenedesumus、chlorella cramidomonas、chlorella cerenastorum等，但其中优选的是chlorella pyrenoidosa、chlorella burgaris和chlorella eribrdes。小球藻可在包括第一或预培养阶段及第二或主培养阶段的2阶段培养系统中进行培养。可在培养基中接种小球藻，同时通入含2%CO2的空气进行搅拌，于25℃及白光束(几千lux，如5，000 lux)下照射几天(如5天)完成预培养。可使用含有乙酸盐作为主要营养源并至少含有100ppm(如300ppm)碘离子的另一种培养基进行主培养，其中将预培养的小球藻接种在培养基中以使其压紧的细胞体积达到2～4μl/ml。培养须于25～30℃、在白光束(几千lux，如3500lux)照射下进行4至7天，同时以每分钟3升的流速通入空气进行搅拌。可将人工光照改为太阳光的自然光照。通过加入乙酸盐补充培养基将培养基的pH控制在6.0到8.0范围内。
本发明的小球藻提取物可用作医药的有效成分或作为食品添加剂。在制备医药时，对其药物制品的存在形式没有限制，因此可制成口服或非口服制剂，如使用常规医药载体或赋形剂制成粉末剂、颗粒剂、片剂、糖衣片剂、胶囊剂等固体制剂，或溶液剂、悬浮剂、乳剂等液体制剂。必要时还可包含辅助剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等添加剂。
图1显示本发明提取物的洗脱图形，其为使用SephadexG-25柱进行凝胶过滤;
图2显示使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法，在有各种分子量标志物存在情况下，对图1所示A部分中的蛋白质进行分子量测定的结果;
图3显示试验开始后3周时，各组被试大鼠血清内的T4浓度;
图4与图3相似，不同的是所示结果为试验开始后6周时记录的;
图5显示试验开始后6周时，对各组被试大鼠进行甲状腺大小测定的结果;
图6显示试验开始后6周时，对各组被试大鼠的甲状腺进行重量测定的结果。
以下结合制备本发明提取物的实施例和药学试样实施例进一步解释本发明。
实施例(1)淡水小球藻的培养(a)无菌培养将1接种环的淡水小球藻(chlorella pyrenoidosa W)接种于含下列表1所示之组合物并通过于120℃下加热处理15分钟预灭菌的培养基中，然后进行预培养。于25℃下、同时用含2%CO2的空气搅拌并在白光(5000lux)照射下预培养5天。
表1(用于预培养的培养基)组分含量KNO35.0gMg SO4·7H2O 2.5gKH2PO41.25gFe SO4·7H2O 5.0mgEDTA7.0mgARNONA5(＊)1.0ml蒸馏水1000mlpH0.5表中(＊)经加入2.86g H3BO3、1.81g Mn Cl2·4H2O、0.22g Zn SO4·7H2O、0.08g Cu SO4·5H2O、0.021g Na2Mo O4、1000ml纯净水和1滴浓硫酸并混合而成。
预培养完成后，在小型发酵罐(体积为7升)内加入4升含下列表2所示组合物的基本培养基和碘酸钾(KIO3)，以使其中碘离子浓度达到300ppm。在该发酵罐内加入预培养过的小球藻，以使其压实的细胞体积为2～4(μl/ml)。该主培养过程中经自动加入含下列表3所示组合物的乙酸盐添加培养基，以保持其pH在6.2至6.5范围内。
光照强度3500lux;
空气给进速率3升/分;
旋转速度300rpm。
表2(用于主培养的基本培养基)组分含量尿素300mgKH2PO4150mgMg SO4·7H2O 150mgFe SO4·7H2O 10mgARNONA5(＊)1ml蒸馏水1000mlpH6.7(＊)见表1
表3(乙酸盐添加培养基)组分含量乙酸400gEDTA-2Na1.4gFe SO4·7H2O 1.0gMg SO4·7H2O 12g尿素50gKH2PO424gARNONA5(＊)2ml蒸馏水1000ml(＊)见表1将培养的小球藻离心并将所得湿沉淀冷冻干燥。用铬酸和硫酸的混合溶液使所得粉末小球藻湿分解，并使所形成的碘与亚磷酸反应，从而通过蒸馏使其加入吸附到氢氧化钠溶液中的碘酸内。硫氰酸(Ⅲ)与碘的接触反应是使用碘酸吸附的溶液进行的，通过7天时间的培养发现淡水小球藻摄入碘的量(作为碘离子)为32ppm。
(b)室外培养在带有搅拌器、且直径为19米的循环培养池内加入如上面(a)之表2中所示的基本培养基，添加量应使培养基的深度达到15cm。在培养基内接种与上述(a)中同种的淡水小球藻，使其细胞填充体积为3μl/ml，在池内加入碘酸钾，使其中碘离子浓度为100ppm，然后持续加入(a)部分表3中所示的乙酸盐添加培养基以使整个池中培养基的pH维持在6.5至8.5范围内。以后池中培养基的浓度每隔一天增加5cm，培养7天深度达30cm。在增加培养基深度时，加入碘酸钾使碘离子浓度一直保持在100ppm。培养期的最后一天时小球藻的细胞填充体积为12μl/ml，且小球藻摄取的碘浓度(作为碘离子的量)为57.7ppm。
(2)提取操作在经过上面1-a中所述的7天培养后，离心处理培养基与培养的小球藻的混合物，得到小球藻的湿沉淀饼。将640ml蒸馏水加到320g湿沉淀饼内并于100℃加热10分钟。冷却至室温后，离心处理混合物(5000rpm，10分钟)，除去小球藻残留物得到含水提取物。冻干含水提取物得到粉末状的提取物(下文记作A-CGF)(产率24g)。
将11g粉末A-CGF溶解于水中，使用SephadexG-25柱(4×100cm)对所得溶液进行凝胶过滤并以每管约70ml收集洗脱液。
图1中显示了结果。由该图可明显看出，各部分洗脱液可分为两组，即有效高分子量的A组(以下简称A-FA)和有效低分子量的B组(以下简称A-FB)对A-FA部分进行SDS聚丙烯酰胺电泳分析，显示其含有7种蛋白质(分子量46100，40000，34000，30000，18000，10500和7000)，其中大部分是分子量为34000、30000、18000和7000的蛋白质(见图2)。但根据SDS聚丙烯酰胺电泳分析，Lowry分析法显示阳性的A-FB部分不含有分子量高于7000的蛋白质。
此外，测定了得自淡水小球藻粉末提取物之A-CGF、A-FA和A-FB以及对照样品的碘含量(依照上面1-a中所述的方法)、糖含量(依照苯酚-硫酸法)、蛋白含量(依照Lowry法)和核酸含量(依照吸收光谱法，即检测0.01%溶液的260nm吸光率)。结果可见对照组淡水小球藻相似于A-CGF，但不含碘(该对照小球藻下文简称C-CGF)，较高分子量组相似于A-FA(该部分以下简称C-FA)，较低分子量组相似于A-FB(该部分以下简称C-FB)，但两者均如C-CGF一样不含碘。结果在下列表4中给出。
药学试验实施例1(抗肿瘤活性)将A-CGF和C-CGF分别溶解于蒸馏水中并加热(100℃，5分钟)灭菌。将所得溶液注射到ddy小鼠(雄性，5周龄)腹腔内，以每天10、100和1000mg/kg的剂量注射5天。末次注射后第二天将1×104或1×105个肉瘤180细胞(作为腹水癌细胞)移植到各小鼠的腹腔内，移植后40天观察动物的存活或死亡率。结果示于下列表5中。由该表可以看出，在移植1×104个瘤细胞的情况下，给药剂量为10mg/kg时显示A-CGF有显著的抗肿瘤作用;在移植1×105个瘤细胞的情况下，给药剂量为10mg/kg和100mg/kg时作用稍弱;但发现给予C-CGF组未具有抗肿瘤作用。
药学试验实施例2(因甲状腺功能降低导致的防止高胆固醇血症作用)比较了A-CGF和C-CGF对因摄入丙基硫尿嘧啶(简称PTU)所引起的甲状腺机能减退所致高胆固醇血症的作用。
将SD大鼠(雄性，7周龄)分为下列几组，并给予下示食物。
(1)正常食物(2)低碘食物(3)低碘食物+PTU(62.5μg)(4)低碘食物+PTU(62.5μg)+A-CGF(12μg)(5)低碘食物+PTU(62.5μg)+A-CGF(60μg)(6)低碘食物+PTU(62.5μg)+C-CGF(12μg)(7)低碘食物+PTU(62.5μg)+C-CGF(60μg)(8)低碘食物+PTU(62.5μg)+KIO3(60μg)注括号中的数值代表剂量/鼠/天。
各组动物均饲养6周。在饲养期间，分别检测了第3和第6周时血中T4浓度，第6周时甲状腺的大小和重量，所得结果示于图3至6中。
图中显示在下示危险率情况下，基于对照组(第(3)组)，记号＊、＊＊＊＊＊表示具有显著性差异。
＊P<0.05＊＊P<0.01＊＊＊P<0.001由图中看出，A-CGF有明显的防止高胆固醇血症的作用，但C-CGF则没有这种保护作用。
权利要求
1.一种摄取了碘的淡水小球藻提取物，其基本上由至少100ppm碘、至少10%(重量)糖、至少10%(重量)蛋白质和至少4.5mg/ml核酸组成。
2.由淡水小球藻中制得提取物的方法，其包括在至少含有100ppm碘离子的培养基中及光照下培养淡水小球藻、由培养基内分离小球藻、向分离的小球藻内加水并100℃至少加热几分钟及分离不溶性物质诸步骤，以得到作为滤出液的提取物。
3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括冷冻干燥步骤，以将含水提取物制成粉末状提取物。
4.一种用于人类医药或兽药的医药组合物，其包含有效量的权利要求1的提取物及医药载体或赋形剂。
全文摘要
公开了一种培养在含碘离子之培养基中的淡水小球藻的提取物。该提取物含有100ppm以上的碘、10％(重量)或更多的糖、10％(重量)或更多的蛋白质及核酸，是经在可摄取其中碘的培养基中培养淡水小球藻、自培养基中分离小球藻、在水中加热小球藻并过滤出不溶性物质而作为滤出液得到的提取物。可将含水提取物冷冻干燥保存。该提取物可用作医药组合物的成分，以预防或治疗因碘缺乏引起的疾病。
文档编号A61K36/02GK1034860SQ8910009
公开日1989年8月23日 申请日期1989年1月4日 优先权日1988年1月5日
发明者泽井喜一, 原一惠, 城森孝仁, 三谷隆彦, 黑野昌庸, 内田启一, 田中博已 申请人:株式会社三和化学研究所