专利名称：利用原生骨组织制作骨成型术材料的方法及其所制作的材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及供给骨形成术使用的一种材料及利用人及动物原生骨组织制造该材料的方法，本发明的主要目的是为外科医生提供一种骨的代用物质，该物质具有生理相容、非抗原、骨相容及使骨整合等性能。
本发明的目的在于制造一种骨移植片，它能被修削成亏缺骨的形状，供外科医生使用，这样的移植片既可用来取代自体移植，从而避免第二个手术位，又可用来作为取代它种非自体移植，从而避免这种移植手术的缺点与危险。
这种材料与先有技术的材料相比有所改进，其优点在于这种材料的制作方法特别适用于修复外科、创伤外科、矫形外科、面颚科或颌科等外科，以及牙科或兽医科制作移植片，一般说来，这种材料适用制作任何骨位上需要的移植片。
采用替代即取代骨组织并非新的技术，有关这方面的首次科技出版物可追溯到1800年代，后来这方面的文章越来越多，它们所涉及的是非自体移植术及异物移植术，其所用的取代骨组织中的矿物质的相对含量及蛋白质的相对含量根据这些方法可按各种比例变化。在采用人及动物的原生骨的替代物方面，在当时及后来已开发使用了以下下天然矿物质作的移植片珊瑚类、羟基磷灰石、陶瓷或天然合成物，例如可被生物降解的聚合物材料。
现今，在这个领域中的研究机构正在致力于采用更接近于骨的材料，特别是在其结构及成分上更接近于人骨的材料，以便适于骨移植片形成整体，该骨移植片被植入新结构的机体所接受并且其移入符合俗称“顺从替代物”的机理。
骨是一种在永恒变化中生长的组织，它同时也经历着骨质的破坏及再生过程。在正常过程中也和被植入了异物材料时一样由于破骨细胞吸收旧组织而留出了腔隙，在该腔隙中由成骨细胞制造新组织，在被吸收的骨量与新生成的骨量之间总是保持着平衡。
显然，当被植入的结构越接近于正常骨结构时，上述现象越容易出现。
正因为如此，人们现在喜欢用原生骨组织来制作骨的替代材料。在该原生骨组织中动物的原生骨组织被优先采用，其理由是出于伦理与现实的考虑。
一般地说，局部地去除无机盐能促使骨移植的整合，因此要进行各种补充的步骤，以便或是力求达到完全去除骨中的蛋白，或是力求影响在骨质中保持相交连的蛋白的性质，或是依然增加这些蛋白的含量。
在以下引证的先有技术中，尤其要提及的是美国专利U.S.4394370，其中考虑通过一种具有交连作用的戊二醛粘合剂，一种由去除无机盐的粉末状人骨形成的混合物和重新组成的胶原粉剂融合成一种海绵状物质。
美国专利U.S.4743259中是把用盐酸去除无机盐同借助于被胍从其第二部分萃取出蛋白质使在去无机盐骨的第一部分中富集蛋白质相结合起来。
此外，在公开号为2582517及2582518的法国专利申请中提出利用局部去除无机盐及借助于戊二醛的鞣化处理从动物身上，尤其是从牛身上取出骨片。供外科医生移植的骨片是把牛骨切出的适合形状的骨片，为此要予先进行一次处理，该处理步骤包括利用有机溶剂如乙醇去除油脂即脂肪，利用钙萃取剂如盐酸去除无机盐和在戊二醛中的鞣化处理以及多次的冲洗。
由上述法国专利申请说明书可以看出，这种鞣化处理已使处理后的骨的特性变好。其原因是它有助于大分子链的交连，然而现在对此先有技术的这些建议持有异议，虽然利用戊二醛处理不会引起免疫性能的明显降低，然而被移植骨的再生并未象所期望的那样能促进骨移植片的整合，此外化合物如戊二醛，还具有对生物有毒的缺点。
人们可以看到本发明的出发点在于为了使骨移植片良好地整合，用在原生骨中以特有形式保持骨质中的胶原，主要是对于Ⅰ型胶原在能够保存骨的极其微小的细节的同时，并允许其本身的空间结构保持为一个外部蜂窝状的植入物的载体。人们也可以看到这些先有技术的处理对骨的胶原与对其它蛋白质的作用看上去差不多，即，为了解除它们的抗原性需要将它们去除或改性。
因此本发明提出一种对利用人或动物的骨组织的处理方法，该方法制作出一种骨的替代材料，它的特征在于以未变性的但去除了抗原蛋白的Ⅰ型胶原作为整体地保持原生骨的结构，它归结为一个惊人的发现可以在天然骨组织中施行一个有选择地萃取抗原性蛋白的操作步骤，而仍保持结构中的胶原。
更确切地说，本发明方法的特征在于它包括至少一个有选择性地萃取和/或变性非胶原性结构的蛋白质的步骤，这是借助于以尿素为基的有选择性的萃取剂来实现的。在本发明的范围内采用尿素的水溶液是有利的，其浓度一般取在2至10M之间，最好在5至8M之间。
在对根据本发明的包含使用尿素或类似萃取剂实施的方法进行系统分析后表明，它引起了这样的反应，其目的在于经过了与传统方式相同的去脂及局部去除无机盐后，在原生骨组织中继续存在的不希望有的蛋白的大分子链被拆开了，而同时还使骨结构中的胶原基本上未受到破坏。
在经过传统的外部清洗处理后，相对于未变性的结构中胶原而言有选择地消除了骨质中的这种蛋白，在根据本发明的实施例中，这种冲洗可在温度为30℃至60℃之间进行，最好在45℃至55℃温度中进行。它是以对骨外科移植材料最后的特性有利的这样一种方式实现的即在对蛋白质合乎要求的去除及对未鞣化形式的胶原的保持之间取得一种折衷。
根据本发明的第二个特征，该方法可以包括重复使用尿素有选择萃取的重要步骤，其中最好将尿素与另一种能分开二硫化物桥的试剂，如乙基硫醇相结合起来使用，每次完成该步骤后均跟随一次合适的冲洗步骤。
此外，整个方法中可以包括另外各种与传统方式相同的步骤，并在它们中间尤其包括一种用离子溶剂萃取的步骤，该离子溶剂尤其是被用作一种盐的水溶液，例如氯化钠的水溶液。
应该指出，在本发明的实际实施中所使用的萃取剂可以很容易地从对于机体没有任何毒性的化合物中选取，而不会出现例如在先有技术中所采用的戊二醛的现象。
在优选的各实施方式中，根据本发明的方法制作出一种骨材，其中用通用的分析技术可以观察到结构中胶原的成分，其有利的比例在20%至40%之间，最好是在25%至35%之间。
显然，在处理结束后所获得的材料中没有含有全部的原始胶原，从中可以发现，只保存有去过油脂干燥骨的有机物的90%左右，其中Ⅰ型胶原占95%左右、Ⅲ型胶原占5%左右，其中的Ⅰ型胶原的特征为由包含二个Ⅰ型阿尔法-1链和一个Ⅰ型阿尔法-2链的螺旋状排列的三个多蛋白酶链构成的，Ⅲ型胶原包括三个相同的阿尔法-1链。然而在传统的去脂和去除无机盐的操作时，只有被易于萃取的胶原与其它蛋白质同时被去除。而当用尿素对先前未被去除的其它蛋白进行改性时，这种结构胶原被大部分保存下来，并未受到侵蚀，这些未被去除的蛋白主要是由抗原性的蛋白多糖或糖蛋白构成的。
然而根据本发明获取的材料的性质，尤其是其骨整合能力，以及机械性能与容易成形的性能，看来这些性能确实与存在原始胶原的这些成分有关。这些原始胶原结合在微孔结构中，并主要是由Ⅰ型胶原构成的。还应指出的是，本发明一般说来能产生以相当富集的Ⅰ型胶原形式存在的胶原，其含量例如可高达含97%，而Ⅲ型胶原的含量则为3%。
利用公知的对胶原类型定性分析的技术对所得到的材料进行检验，例如或通过与Ⅰ型抗原性抗体起反应后由免疫荧光法检验胶原，或是使其与溴化氰起反应以获得能显示的多种肽混合物，并根据它们的分子量将该混合物进行分离，然后用电泳法进行分析。
根据本发明的材料通常所含有的成分在以下范围内水 2-10或小于10脂类 1-15或小于15灰状物(Cendres) 40-65
钙 10-25磷 5-20钙/磷(Ca/P) 1-2.2蛋白 30-45胶原 20-40下面结合具体例子来详细描述本发明的方法及其制作的材料在临床上的应用。当然，这些例子决不是对发明的限定。
例Ⅰ骨块材料的制备使用例如从屠宰场取得的刚屠宰过的牛的骨骺或骨干中予先切下的骨块材料。根据具体的应用，优选海绵状骨(骨骺)或皮下层骨(骨干)。在本例中，由于希望有很好的抗压能力，最好是对骨骺横向地，并与杆状网垂直地进行切割。
首先将该骨块按照传统的骨组织去脂步骤利用氯仿/甲醇或乙醇/二氯甲烷的混合物进行处理，该去脂混合物的加入量按取下的每单位重量新鲜牛骨部分约为10单位体积(10l/kg)加入。该步骤能够提取与骨的网状结构交连的自由脂肪、脂肪酸、脂蛋白。在这里是以下列方式完成的400克牛骨块利用4升氯仿-甲醇混合物(2/3-1/3)进行处理，在处理温度为4℃下处理24小时，并不断搅拌。
在以后的操作中除非另有说明，都将采用按每单位重量的牛骨部分加10单位体积混合物的比例来进行。
然后，使这些骨块经去除无机盐的处理，即将其与0.6M的盐酸在4℃温度下保持接触6小时。该步骤与传统方式相同，但可依据如在法国专利2582517中所述的方式采用变更的条件，即利用每升摩尔浓度在0.1M及1M之间的盐酸溶液，或是其它矿物酸溶液，例如羧酸及/或一种能复合骨中钙的有机剂，例如四醋酸乙二胺进行处理。
作为变型，可以延长与HCl接触的时间，例如为36小时。根据这个处理时间，可以使材料的硬度提高一些，以适合在将来应用中对硬度的要求。
在这个去除无机盐过程中，还可以去除一部分由与骨胶原的网状结构相交连的羟磷灰石形成的离子，以使得所保留的骨胶原对即将进行的萃取处理更有效地进行。
随后的步骤是借助与氯化钠的水溶液的接触进行萃取将该骨块放在4升1M的氯化钠溶液中在温度为4℃下搅拌36小时。
这个萃取步骤使得骨材去除了最易溶解的或最新合成的大分子成分。在萃取时可发现在先前处理后仍然存留的脂类、蛋白多糖及胶原。该步骤不能使骨胶原网状结构变性，但是在随后的一些萃取步骤中，最坚固的材料组分被破坏之前，几种组分会被部分地萃取出来。
接着就进行本发明的重要步骤，根据这个重要步骤，将骨块与4升8M的尿素在室温(20℃)下保持接触6个小时。
该步骤可以萃取这样的分子蛋白多糖及糖蛋白，其中包含的结构糖蛋白是在骨中具有极强抗原性的分子，可是没有使太多的可与胶原交连的网状结构产生同样的变性。
对此萃取还附加了一次新的具有相似目的的萃取，它是利用4升含有0.2%的乙基硫醇的8M尿素溶液，在室温下处理24小时。
在这两次有选择性的萃取步骤全部结束时可以发现已经萃取出糖蛋白，非胶原成分或至少使它们有效地变了性，并阻止了受渗入到骨的网状组织的大分子成分中的糖蛋白的自然抗原性排斥的移植物质。
然后将上述操作过程中使用的各种溶液及反应物利用4升55℃的蒸馏水冲洗24小时。
接着，利用pH＝7.4的0.4M磷酸钙缓冲剂进行处理，该处理在35℃下伴随搅动地进行48小时，该次操作后随即用2升乙醇在室温下进行冲洗24小时。
用纯净水的冲洗可以去除，或是说继续地萃取出脂类、蛋白多糖、胶原及糖蛋白。所采用的处理温度应能抑制在组织中有毒酶的活性，也即降低来自于内生的，或外生的如源于细菌的蛋白酶，以及其它溶性酶的活性。
当用磷酸钙缓冲剂提取时，会继续地去除基体的成分和/或仍然可能存在于骨的网状结构中的脂类。以及可能再平衡骨中的盐类。
最后，在一个酒精槽中进行清洗，可使仍然与胶原网状组织有弱交连的化合物，尤其是使剩余的脂类的萃取更干净，但尤其是方便了以后的分离操作。
事实上，根据本发明，为了获取骨形成术材料接受处理的骨片最后经过滴除水份，用乙醇冲洗及在通风的烘箱中干燥，它们同样还可以经受冷冻及/或冷干，以便贮存直至使用它们为止。供单个使用的骨片能容易地加工成适合使用的形状。也即此种骨材可取各种不同的尺寸的平行六面体的块状、截锥状、层状，中心骨髓的杆状及园盘状等。这些确定的形状即可适于保存条件又便于电离辐射杀菌。
例Ⅱ 分析研究最后获取的材料经过了显微、生物化学及化学检验。
a)光学显微、光照及偏振光照检验
该检验表明骨组织的结构得到保持;尤其发现海绵状组织的柱状网的特征结构;还特别证实了胶原仍处于原来的排列，这点非常清楚地使根据本发明的材料区别于现有技术可能制作出的产物，后者是在某种载体上带来外生的胶原。
b)荧光显微检验该检验能够显示出具体的层结构的特征，它们是非常近似自然骨的层结构的。Ⅰ型胶原的特征显示是利用专一的Ⅰ型抗胶原抗体来完成的。
c)生物化学检验利用溴化氰作的试验证实了其胶原正是Ⅰ型的，提高肽阿尔法1CB7和肽阿尔法1CB8蛋白的存在量。肽阿尔法1CB6蛋白的存在证明了链的交连，因而也就证实了部分地保持了其空间结构。同样地也观察到阿尔法CB3的存在。
这些与标准物质比较的结果表明了存在Ⅰ型胶原所具有的特性。
d)化学检验用根据例Ⅰ的方法完成的4份产物进行分析的平均数值得到以下结果剂料 平均值% 端点值脱出的水 6.8 6.3-7.3脂类 10.8 7.4-14.0灰状物(Cendres) 48.4 44.6-53钙 16.8 15.5-18.0磷 11.5 8.8-13.4Ca/P 1.49 1.22-1.86蛋白 36.8 35.4-38.5胶原 30.2 29.5-30.7例ⅢA制备粉末材料从牛骨中取出的骨块，除去需要考虑截面的定向情况外，总是按照在例Ⅰ中所述方式处理。然后将所处理的骨块磨成粉末，该粉末可按下述方法使用。
例ⅢB制备用模子制成的材料作为变型，将不同粒度的粉末借助于粘合剂用模子制成所需形状的骨块，该粘合剂最好是源于生物的，但也可根据应用的情况采用能被生物降解的合成聚合物。
在本例的具体情况中，使用了一种作为溶剂并按照血管再形成术进行成形的材料，它是这样的材料对1份骨粉加1至10份的能被生物降解多乳族(Lasérie des Polylactique)的合成聚合物。也可采用对100份骨粉加1或2份的血纤维蛋白，粉末的粒度等级在1000至250μ之间变化。
最后的生成物应由辐射杀菌并且以适于以无菌包装方式存放。
例Ⅳ方法的变型如例1中那样处理牛骨块，只是在用酒精作最后的清洗前，在用蒸馏水清洗前或后，增加一个新的去脂步骤，即用一种氯仿及甲醇的混合物或是由乙醇及二氯甲烷的混合物进行处理。
这个步骤能使交连的骨网状结构的去脂更为完善，并清除了仍与骨网状结构保持交连的脂类物质，脂肪酸或脂蛋白。增加这一次去脂例如可以在更好的条件下获得按照例Ⅲ制作的粉末，以便使其中剩余脂类的成分最好小于5%。
同样地，还可以适当地增加两个附加的去脂步骤，这样就能获得一种产物，其剩余的脂类完全可以略去不计，也就是为1%或低于1%的数量级。
当然，在该种条件下，其它成分的相对百分比也发生了变化。
另一方面可改变各个处理步骤中的条件，尤其是浓度，接触时间及温度方面的条件，对于要处理的三维尺寸可在8至30厘米之间变化的整块骨来说，这些条件的范围限定如下利用离子溶剂的提取，它是借助一种0.5至2M的NaCl溶液在温度为2°至5℃下，处理12小时至36小时而完成。
尿素水溶液，其浓度在5至10M之间;
尿素中的乙基硫醇水溶剂，其中包含0.1%至0.5%体积的乙基硫醇;
在这个溶剂中可选择萃取时间范围是在室温下为12至36小时之间。
这样就制取了令人满意的骨形成术材料，其分析结果处在以下范围中灰状物(Cendres) 50%至62%脂类 0.5%至5%干化损失 7%至10%蛋白(Kjeldahl) 33%至45%钙 15%至22%磷 10%至17%Ca/P比例 1%至2.2%胶原 33%至38%(该胶原的剂量测定是根据羟脯氨酸测定的)在本发明的变型中可获得同样的产物，它们是用例Ⅲ中所述的那种粉末构成的。
例Ⅴ对一岁被腌割的雄猫的临床观察该猫是因在一次事故中(被汽车引起创伤性休克)造成了右股骨(在靠近粗隆及干骺端部位)的粉碎性骨折。利用本发明的骨成形术材料，在自创伤后的第8天用下述技术施行了手术按照传统的骨折病灶手术方式将一个按照例Ⅰ制取的骨块嵌入到重新构成的股骨干的粗隆块中，然后借助于小尺寸的Pérot外部固定件(直径为2mm的带螺纹的贯穿术用的固定骨折的钉子)使股骨骨干重新复位使其愈合。
该动物完全重新恢复了行走，跑及跳的功能，在第60及90天时进行的X射线检查表明了骨的恢复是令人满意的，移植片也参与了整合。该手术避免了骨折引起的并发症，这种并发症可能在肢体非愈合的情况下截肢的化脓感染引起的。
例Ⅵ德国牧羊大该动物因在一次交通事故中而造成了具有碎骨片的粉碎性股骨干骨折。很快地对它施行了手术并装入了一个异体移植片，该移植片是用如在例Ⅰ中处理的牛骨块制备的，在该骨块中这样地修削移植片，以便获得一个适于股骨干连接端榫槽的镶嵌移植片。骨合成镶嵌的固化是利用放置一个Pérot笔直的板及借助于在股骨骨干中的直径为3.5mm的固定螺丝来实现的。
该动物在一些天以后恢复了站立。在第30天及60天由X射线的检查表明镶嵌的稳固性及移植片的整固。
例Ⅶ利用本发明的粉末状材料用于一位女患者左上侧门牙末端的切牙手术根据传统的技术施行手术，切开连同切除囊肿的半月形牙切口及利用CO2激光器对该部位进行消毒。再置入根据本发明例Ⅲ制作的粉末状材料，将该材料与消过毒的生物血清混合，并将其压入带血的牙骨晶洞内部，然后将牙龈的皮瓣置到原位并缝合，再拍摄一张X射线检查照片。
在第8天的观察已可以看出愈合极好。在第8天拍摄的X射线照片表明其愈合比使用它种传统方式中使用的填牙材料有更好的质量根据本发明的材料对X射线的不透明程度可知其接近于人的牙龈骨。
在第15天及1月时的X射线检查证实了该结论。其愈合已经完善，并未显出任何异体排斥现象。
X射线的照相检查证实了骨粉的“整合”，也即根据施行该手术医生的经验，相对于利用其它公知的市场上的补牙材料作过的结果来说，这完全是一种异乎寻常的成功。
例Ⅷ利用本发明的材料对一位50岁女患者的牙周组织的两个囊包施行摘除手术在切开从左上中心门牙延伸到左上第二臼牙上的皮瓣后，通过完全刮除牙垢和切除神经根部并进行表面处置的操作来对牙骨部分和囊包进行消毒。
借助于CO2激光器除掉在皮瓣上及在囊包内部的牙龈部位的肉芽组织，然后对骨膜及囊包利用生物血清冲洗。
再使用根据例Ⅰ中的两片骨块材料，对这些无菌骨块在严格无菌条件下修削到所需尺寸，将这两片骨块一起置入，以保证紧密的接触及作为骨折的固定措施。这个操作完成后，再将皮瓣置位并进行缝合。
在去掉外科包敷物和拆掉缝合线，以及清洗净手术位后的第8天可观察到，有一些缝合针脚(2个)松开了，这两个骨块的搭接是不完善的，因为它们仍隐约可以分辨出。尽管如此，该手术的愈合仍是令人满意的，是非常少见的事例，原来在骨膜部位上是裸露的地方，一个新的牙龈如同正常发育的一样正在骨的上面发育。因此根据本发明的材料得到新牙龈的“认可”。这些是由X射线照象的检查结果证实的。
在第15天时，根据本发明的材料制备的这两片骨块已被迁移的皮瓣及在剥离部位上的牙龈完全地复盖了。
这就通过人齿龈骨的“中性化”或它的囊包结构证实了根据本发明的材料的完全整合以及宛如由骨膜上重新长出一个新的牙龈。
在一个月后的最后X射线检查可以证实这两片骨块已在其部位上完全地整合。没有显示出任何异体排斥现象。此外，牙齿不再松动，牙龈的外观恢复正常，这对手术后出现缝合问题来说，真是一个例外。
权利要求
1.利用对人或动物的骨组织的处理制作一种骨形成术材料的方法，其特征在于该方法包括至少一个非胶原结构蛋白的选择萃取和/或变性的步骤，它是借助于以尿素为基的有选择性的萃取剂来实现的。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于该尿素是水溶液状态的，其浓度在2至10M之间，并最好在5至8M之间。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于在所述有选择萃取步骤前，对所述骨材料用与公知方式相同的去脂及去除无机盐的处理。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于去脂处理是利用与一种氯仿/甲醇或乙醇/二氯甲烷的混合物来实现的，该混合物按1份重量的骨块约为10份体积比例(10l/kg)加入。
5.根据权利要求3或4的方法，其特征在于其去除无机盐处理是借助于一种盐酸溶液来实现的，它的摩尔浓度为0.1M至1M之间。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求的方法，其特征在于在所述有选择性萃取步骤之后接着一个附加的有选择性提取步骤，该步骤借助于添加了乙基硫醇的尿素水溶液，该乙基硫醇的浓度最好在0.1%至0.5%体积之间。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求的方法，其特征在于在所述有选择性提取步骤之前经过一个在一种离子溶液例如氯化钠溶液中可溶成分的萃取步骤。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求的方法，其特征在于在所述有选择性萃取之后，至少包括一个去除变性结构的糖蛋白的冲洗操作。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述冲洗操作在低于60℃温度下进行。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述冲洗操作是借助于温度在30℃至60℃之间最好为45°至55℃之间，用蒸馏水来完成的。
11.一种骨形成术的材料，其特征在于与未变性Ⅰ型胶原整体地保持原自然骨结构。
12.根据权利要求11的材料，其特征在于它包括结构胶原，其比例在20%至40%之间，最好为25%至35%的范围内。
13.根据权利要求11及12的材料，其特征在于该材料包括脂类的比例小于15%，蛋白的比例在30%至45%之间，钙的比例为10%至25%，磷的比例为5%至20%，水的成份低于10%、Ca/P的比例最好在1至2.2之间。
14.根据权利要求11至13中一个权利要求的材料，其特征在于该材料是以下列几何形状存在的平行六面体、截锥、层状、中心骨髓的杆状块及园盘状块;或者是粉末;或者是用一种溶剂的粉末混合物，该溶剂最好是源于生物的例如血纤维蛋白，或源于合成物的如能被生物降解的一种合成聚合物。
15.根据权利要求11至14中任一权利要求的材料，其特征在于它是由根据权利要求1至10中任一方法制作的。
全文摘要
本方法涉及一种利用对人或动物的骨组织处理制作骨成型术中所使用的材料的方法，其特征在于，其中至少包括一个对非胶原性蛋白有选择性提取及/或变性的步骤，该步骤是借助以尿素为基的有选择性的提取剂来实现的。
文档编号A61F2/28GK1052430SQ90109859
公开日1991年6月26日 申请日期1990年11月20日 优先权日1989年11月22日
发明者罗伯特·彼尼法克, 米歇尔·佛利, 帕伯劳·戈尔蒂史密特, 檐恩-比尔·劳恩特拉德, 檐克威斯·卢克斯 申请人:特朗费多公司