调节细胞分裂素活性的组合物的制作方法

专利名称：调节细胞分裂素活性的组合物的制作方法
本申请是美国申请08/096，739(1993年7月23日)的部分继续申请，后者是美国申请07/974，750(1992年11月10日)的部分继续申请，美国申请07/974，750则又是美国申请07/878，188(1992年5月1日)的部分继续申请，这些申请的全文公开内容引入本文作为参考。
本发明涉及用于调节细胞分裂素活性例如，增强或抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)活性的物质、含这些物质的组合物及方法。更具体地说，本发明公开了物质和可药用组合物，当给宿主施用有效量的这些物质和组合物时，能抑制或增加由宿主细胞产生的活性TNF-α的分泌。通过本发明的方法可以调节由宿主免疫效应细胞(如，宿主被激活的巨噬细胞)产生的活性细胞分裂素，如TNF-α的分泌。
本发明还涉及预防和/或治疗病理过程的方法、或者相反地说，本发明涉及包括诱导细胞分裂素产生、分泌和/或其活性的、有益的、与免疫系统有关的反应的激发。本发明所选择的组合物含有有效低剂量的低分子量肝素(LMWH)，每隔5到8天给药一次。其它的组合物含有基本上纯净的羧酸化的和/或硫酸化的寡糖，该糖是从包括LMWH的层析分离和精制、酶降解的肝素和酶降解的胞外基质(DECM)的多种主要来源得到的。
这些物质，含有这些物质的组合物和特别是适于经非胃肠道、口服或局部用药的药物组合物均能在体外通过静止的T细胞和/或巨噬细胞应答免疫效应细胞激活因子的激活反应来抑制或增加TNF-α的分泌，免疫应答细胞激活因子包括(但不限于)T细胞特异抗原、T细胞分裂素、巨噬细胞激活因子、残余胞外基质(RECM)、纤维结合素、昆布氨酸(laminin)等。体内数据，显示出对实验性延迟型过敏性(DTH)的抑制，其进一步支持了体外结果。
2.1.肿瘤坏死因子αTNF-α，一种由单核细胞和T淋巴细胞产生的细胞分裂素，是产生炎性应答的一系列因素中的一个关键因素，并且作为病情的主要orchestrator它具有许多多效性作用(Beutler，B.和Cerami，A.，Ann.Rev.Immunol.(1989)7625-655)。
TNF-α的生理作用依赖于它的浓度和产生部位低浓度时，TNF-α会产生理想的平衡和防御功能;但高浓度时，在系统或某些组织中，TNF-α能与其它细胞分裂素，特别是白细胞介素-1(IL-1)产生协同作用而加剧许多炎性应答。
可以看到由TNF-α(与IL-1一起)诱导的下列活动发热、慢波睡眠、循环动力休克、时相蛋白产生增加、白蛋白产生减少、血管内皮细胞激活、主要的组织相容性复合(MHC)分子表达减少、脂蛋白脂酶减少、细胞色素P450降低、血浆锌和铁降低、成纤维细胞增生、滑液细胞胶原酶增加、环加氧酶活性提高、激活T细胞和B细胞、并且诱导细胞分裂素、TNF-α自身、IL-1、IL-6和IL-8的分泌。的确，研究表明这些细胞分裂素的生理作用是相互关联的(Philip，R.和Epstein，L.B.，Nature(1986)323(6083)86-89;Wallach，D.etal.，J.Immunol.(1988)140(9)2994-2999)。
现在还不知道具体TNF-α是如何发挥它的作用的，但人们认为它的许多作用与TNF-α激活细胞由细胞膜花生四烯酸产生前列腺素和白细胞三烯的能力有关。
TNF-α，作为多效性作用的结果，与身体许多不同器官的多种病情有关。在血管中，TNF-α激发出血性休克，抑制内皮细胞血栓调节素(thrombomodulin)并增强前凝血剂活性。它致使白血球和可能的血小板粘附于血管壁，因此可以激发动脉粥样硬化，还有脉管炎。
TNF-α激活血细胞并引起嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、单核细胞/巨噬细胞及T和B细胞的粘着。通过诱导IL-6和IL-8，TNF-α增强了炎性细胞的趋化性及其进入组织的渗透性。因此，TNF-α在自身免疫性疾病、变态反应和移植排斥的组织损伤中具有一定的作用。
TNF-α也称为恶病质素，因为它调控脂肪细胞的代谢活性并对伴随于肿瘤、慢性感染、慢性心脏病和慢性炎症的消瘦与恶病质起作用。TNF-α在增加脂肪组织消耗的同时，也可以通过抑制食欲对食欲缺乏性神经质起作用。
TNF-α对骨胳和心肌细胞有代谢作用。它对肝脏也具有明显的作用它抑制白蛋白和细胞色素P450的代谢并增加纤维蛋白原、1-酸糖蛋白和其它时相蛋白的产生。它也能引起肠坏死。
在中枢神经系统，TNF-α穿过血脑屏障并诱发发热，增加睡眠和食欲缺乏。增高的TNF-α浓度与多种硬化症有关。它还引起肾出血并影响甾体激素的产生，增进皮肤中的胶原酶和PGE-2，还通过激活破骨细胞引起骨和软骨的破裂。
总之，TNF-α涉及自身免疫性疾病、移植排斥、脉管炎和动脉粥样硬化中许多令人不快的炎性症状的发病机理。它在心脏病和癌症的应答中也起着作用。由于这些原因，人们探索调节活性形式的TNF-α的产生、分泌或有效性的途径，以此作为控制各种疾病的手段。
免疫系统的主要作用是抵抗外来入侵物如微生物引起的感染，保护机体。然而，它也可能会进攻机体的自身组织导致称为自身免疫性疾病的病症。一个机体的免疫系统对源于其它机体的组织的主动反应是被移植器官排斥后的有害原因。该系统对外来物质的高反应性引起了有症状的变态反应，象哮喘，鼻炎和湿疹。
控制这些反应的细胞是淋巴细胞，主要是被激活的T淋巴细胞，并且这些细胞主导的病理炎症应答直接依赖于它们转运通过血管壁到达其靶组织和从靶组织转运通过细胞壁的能力。因此，降低淋巴细胞粘附和通透血管壁的能力可以防止自身免疫性进攻，移植排斥和变态反应。这将代表一种新的、可能会产生与目前所用治疗方法相比疗效较好、付作用小的治疗原则。
动脉粥样硬化和脉管炎是血管发炎的慢性和急性病例。动脉粥样硬化包括动脉内膜增厚和发硬，导致冠心病、心肌梗塞、脑梗塞和外周血管疾病，并代表了西方发病率和死亡率的主要原因。从病理学上看，动脉粥样硬化是逐渐和缓慢发展成的一种由脂肪和钙质沉淀引起的得体损害。纤维性组织的增多最终导致产生血管腔突然闭塞的急性症状。
人们已经看到，TNF-α便于和促进人类免疫缺陷性病毒(HIV)在体外的复制(Matsuyama，T.etal.，J.Virol.(1989)63(6)2504-2509;Michihiko，S.etal.，Lancet(1989)1(8648)1206-1207)并能激发HIV-1基因表达，因此，它可能激发感染了HIV-1后的机体潜在的临床AIDS发展(okamoto，T.etal.，AIDSRes.Hum.Retroviruses(1989)5(2)131-138)。
因此，TNF-α，象其中部分是TNF-α的炎性应答一样，是一种好坏兼有的事。或许在明白了它的生理功能之后，人们可以更好地理解炎症作为一个整体的目的并洞悉在“TNF-α不足”和“TNF-α过量”下的情况。于是，如何最佳地设计一种合理而具体的涉及这种激素产生的疾病治疗方案便唾手可得了。
2.2.肝素肝素是一种葡萄糖胺聚糖、一种多聚阴离子型硫酸化多糖，在临床上作为一种抗血栓剂预防血凝。在动物模型中，肝素表现出降低自自免疫性T细胞到达其靶位的能力(Lider，O.etal.，Eur.J.Immunol.(1990)20493-499)。肝素以每天注射一次(小鼠5μg，大鼠20μg)的低剂量使用时，还显示出抑制大鼠的实验性自身免疫性疾病并在皮肤移植小鼠模型中延长同种移植鼠的存活(Lider，O.etal.，J.Clin，Invest.(1989)83752-756)。
在观察了其作用后，认为其机理涉及到通过T淋巴细胞抑制对穿透血管壁所必需的酶，主要是乙酰肝素酶的释放，所说的乙酰肝素酶能特异地进攻排列于血管的内皮下胞外基质(ECM)的葡萄糖胺聚糖部分(Naparstek，Y.etal.，Nature(1984)310241-243)。乙酰肝素酶的表达与自身免疫T淋巴细胞穿透血管壁的能力和在实验性自身免疫性脑脊髓炎的疾病模型(EAE)中攻击大脑的能力有关。
欧洲专利申请EP0114589(Folkman等)记述了一种抑制哺乳动物血管生成的组合物，该组合物中的活性药剂基本上由(1)肝素或六聚糖(hexasaccharide)或更大的肝素碎片和(2)可的松或氢化可的松或氢化可的松的11-α异构体组成。根据该公开文本，肝素自身和氢化可的松自身是不起作用的;只有当二者结合时才给出所需的效果。虽然在该文献中没有证据表明血管生成与自身免疫性疾病之间存在联系，但第5页描述了血管生成与牛皮癣和关节炎是相关的，并指导使用每天25，000单位到47，000单位高剂量的肝素(即约160到310mg/每天)。
Horvath，J.E.等人(Aust.N.Z.J.Med.(1975)5(6)537-539)描述了亚抗凝血剂量的皮下肝素对早期肾的同种移植功能的效果。每日剂量较高(5000u或约33mg)，该研究的结果是亚抗凝血剂量的肝素对早期移植功能或移植存活没有效果，然而它可能与增加的出血性并发症有关。
Toivanen，M.L.等人(Meth.andFind.Exp.Clin.Pharmacol.(1982)4(6)359-363)测定了高剂量(1000u/鼠或约7mg/鼠)肝素对抑制大鼠的佐剂关节炎的效果，发现肝素加剧大鼠的佐剂关节炎。
申请号PCT/AU88/00017、公开号为WO88/05301(Parish等人)的PCT专利申请描述了阻断或抑制内糖基酶活性，如乙酰肝素酶活性的硫酸化多糖类，该类糖用作抗(肿瘤)转移和抗炎剂。肝素和肝素衍生物如过碘酸氧化的肝素和还原型肝素的使用剂量在每只大鼠每天1.6～6.6mg范围，连续输注给药(对应于成年患者每人每天75～308mg)时具有微不足道的抗凝血活性，却显示出抗肿瘤转移和抗炎活性。
肝素和乙酰肝素硫酸酯是密切相关的葡萄糖胺聚糖大分子物质。这些多聚高分子的降解产物，被称作低分子量肝素(LMWH)，它们在血液凝固系统中有着与其母体大分子物质相同或更大的药理作用。进一步说，因为它的范围之广尽管多聚物的基本双糖亚单元、葡萄糖醛酸和N-乙酰基葡萄糖胺的不完全后合成方法，LMWH无论在大小上还是化学组成上它都将是一种异质混合物(见Goodman和Gilman的ThePharmacologicalBasisofTherapeutics，8thEd.，(PergamonPress，NewYork，1990)pp.1313-1315)。本领域描述了由肝素获得低分子产物的方法，该产物用作抗凝血剂。这些方法的探索使人们对这类产物在体内的存留或其出血性付作用的程度操乐观态度(见，如，Alpino，R.R.，等的美国专利5，010，063;Choay，J.，等的美国专利4，990，502;Lopez，L.L.等的美国专利4，981，955)。其它的文献指出使用亲和层析方法来获得低分子量产物(见，如Rosenberg，R.D.等的美国专利4，539，398和Jordan，R.E.等的美国专利4，446，314)。
Psuja，P.(FolioHaematol.(Leipz)，(1987)114429-436)研究了异质肝素与细胞表面之间相互作用的影响。Psuja报道发现培养的内皮细胞上有中等亲和性LMWH(Dδ＝5.6μm)受体，但他断定与受体结合的LMWH部分的上限量小于LMWH总量的1%。
其它的研究者证明了LMWH对各种类型的培养细胞的代谢的影响。Asselot-Chapel，C.等(Biochem.Pharmacol.(1989)38895-899和Biochem.Biophys，Acta，(1989)993240-244)报道LMWH引起培养的平滑肌细胞降低Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原之比率并减少纤维结合素的合成。Rappaport，R.等在美国专利4，889，808中教导LMWH能导致人的二倍体肺纤维细胞在没有血清培养时通过促进组织血浆酶原激活因子和相关蛋白的分泌与LMWH作用。
已有报道LMWH对复合多细胞系统有影响。Folkman等和Lider等人在EPO申请0114589和J.clin.Invest.(1989)83752-756中对此进行了说明。另外，在公开的国际申请WO90/03791中Diferrante，N.教导了LMWH在变形的人淋巴细胞C8166(ALL)的培养物中抑制HIV再生的用途。然而，在本领域以前所作的LMWH对细胞代谢的作用的实验研究中还没有实验认为异质LMWH会产生拮抗作用。进一步地说，没有研究表明或提出由于基本纯的寡糖物质的作用对细胞分裂素活性有调节作用。
本发明中公开了能够调节哺乳动物的细胞分裂素活性的物质，该物质为大体上纯的羧酸化的和/或硫酸化的寡糖，特别是，该物质显示出一致值(a)约为200，000%×(μg/gm)-1或更高的抑制性“R”值，该值是通过测定小鼠的实验性DTH反应的相对抑制性的体内生物分析法测得的，所说的小鼠是用从约0到2μg/mg小鼠的不同剂量的上述物质处理过的;或(b)约为0.03%×(pg/ml)-1或更高的增加“R”值，该值是通过测定TNF-α相对活性的体外生物分析法测得的，TNF-α在有0至约1×107pg/ml不同浓度的上述物质存在下由活性人体CD4+T细胞分泌的。优选的物质显示的体外抑制性“R”值选自300，000、400，000、500，000、600，000%×(μg/gm)-1或更高。
进一步讲，对活性TNF-α的分泌具有抑制作用的本发明的物质另外可以显示出至少约0.4%×(pg/ml)-1的抑制性R值，该值是通过测定TNF-α相对活性的体外生物分析法测得的，TNF-α是在有0到约1×107pg/ml不同浓度的上述物质的存在下由活性人体CD4-T细胞分泌的。
在本发明的一种实施方式中，羧酸酯或寡糖的分子量不大于3000道尔顿，优选范围在约400到约2000道尔顿，最优选的在约400到约1100道尔顿之间。通常抑制TNF-α活性(通过生物分析法测定，下文有更全面的描述)的本发明的物质含有活性基本单元与双糖有关的不同糖单元分子。然而，高达约10个糖单元(含有活性的基本双糖单元)的较大的寡糖链也能抑制TNF-α的活性。另一方面，本发明的物质，当它们起增加TNF-α观测活性作用时，通常有两种类型(ⅰ)分子量较高的低分子量分子凝集物，这些低分子量分子在非凝集状态时显示出抑制活性;和(ⅱ)失去了硫酸基团的双糖或单糖亚单元(即至少发生了某些脱硫酸作用)。
当纯化时，这些物质或含有这些物质的组合物基本上不含有产生相反或拮抗作用的其它物质。因此，大体上纯的显示出抑制活性(“向下”调节)的物质不仅基本上不含其它物质，而且通常也不含那些使能“向下”调节剂增高或延迟抑制活性的其它物质。这种情况，当然与有增加力的物质(即“上”调节剂)的情况相反，在后一种情况中则基本上不含其它的物质，特别是那些“向下”调节或与增加相拮抗的物质。
短语“调节作用”包括对影响细胞分裂素的体内或体外有效性或导致的活性的向上调节或向下调节两方面作用，细胞分裂素通常包括IL-1、IL-6、IL-8和特别是TNF-α。因此，本发明的组合物能对宿主的TNF-α的产生、分泌、TNF-α的胞外有效性、或宿主中TNF-α的活性形式发挥调节作用。例如，但不希望受到理论的限制，本发明可用于诱导一种物质、如蛋白质的分泌，这种物质可与TNF-α结合，改变它的构象并随之影响其生物活性。在透过被激活的T细胞或巨噬细胞时，本发明的组合物可与特异的低聚核苷酸序列结合并影响转运或翻译过程，最终改变蛋白合成，这种情况也是可能的。该组合物也可通过与细胞表面受体结合来发挥作用。
为简化以下讨论，将作一些解释，其中，对“活性TNF-α的分泌”或“TNF-α的活性”的调节的更广泛意义上的理解是依附于包括导致它们的实际机理或本发明的物质或组合物影响观测的TNF-α活性的增高或抑制的实际方式的这些短语。
本发明的物质包括可以从天然资源获得的羧酸化的和/或硫酸化的寡糖，该天然资源包括活有机体。例如，从低分子肝素(LMWH)部分，以及被酶，如由动物(哺乳动物)或微生物(细菌)得到的乙酰肝素酶的作用降解的胞外基质分离和精制出的活性物质。还有，活性物质的其它来源是酶处理的肝素(如，内糖基化酶降解的肝素)。
因此，术语“大体上纯的形式”意味着采用具体步骤从寡糖物质中除去非活性组份或具有相反作用的组份，并从混合物或上清液(如从酶降解得到的)分离活性部分或多个活性部分。具体地说，本发明权利要求的物质是从严格的层析方法得到的，在此层析方法中低压筛分凝胶层析(即Sephadex柱层析)只是精制流程图中的起始步骤。随后用低压分离、高压液相层析(HPLC)技术分离各个组份的寡糖。在各个活性物质的精制中，优选的这些步骤得到了基本上单一的组份。
这样一种优选的精制步骤可以包括，例如使含有活性物质的混合物(如，从低压凝胶层析得到的馏份)通过凝胶渗透HPLC或强阴离子交换(SAX)HPLC柱。这样，就能观察到和分离出含有选自双、三、四、五或六糖，优选双糖的寡糖物质。本发明的寡糖被羧酸化和/或硫酸化，因此，带有负电荷。本发明特定的实施方式优选包括含有三个负电荷基团的双糖。那些显示出特异性抑制活性的双糖拥有的分子量范围为约400到约2000，优选约400到1100。
本发明也提供一种生物分析法，该方法用于定量测定测试物质对活性TNF-α分泌的影响。该生物分析法包括如下步骤在含有不同浓度的测试物质的培养基中预先培养人体CD4+T细胞，加入一恒定量的激动剂，该激动剂在没有上述测试物质的存在下能通过T细胞有效地诱导TNF-α的分泌，在足够的一段时间后收集该培养物，并测定培养物中TNF-α的活性。优选的人体CD4+T细胞是从外周血中单核白血球得到的。适宜的免疫效应细胞激动剂包括T细胞特异抗原、分裂素、巨噬细胞激动剂、残余胞外基质(RECM，在下面的第四部分中定义)、昆布氨酸、纤维结合素等，但不局限于这些。
本发明依赖于通过下文中更具体描述的体外和体内生物方法测定的特定物质的特异调节活性。简要地说，用于本发明的物质显示出调节(或抑制或增强)与剂量依赖的活性TNF-α分泌的诱导有关的活性。就是说，百分抑制或增加对剂量(如，pg/ml物质)的图给出了钟形曲线，由此很容易看出最大百分抑制率(Inhmax)或增加率(Augmax)。因此，对这样的图上的每一点，都可以算出百分抑制或增加和其浓度或剂量之间的“比率”。在这种情况下，从最大百分抑制率或增加率(即Inhmax或Augmax)和测试物质的浓度或剂量的比率得出“特异调节活性”或“R”值，它们给出了这种最大百分调节数值。更进一步地讲，每次生物分析能够得出一个“R”值。因此，“R”值可与体外小鼠脾细胞分析、离体内(ex vivo)小鼠脾分析、体外人PBL分析和基于实验性DTH反应的体内分析相联系。如果未测得影响，指定“R”值为零。
本发明的另一个目的是一种调节哺乳动物体内细胞分裂素活性的方法，该方法包括给上述动物施用能有效抑制或增加上述动物体内细胞分裂素活性的量的物质，上述物质含有基本上纯净的羧酸化的和/或硫酸化的寡糖，并且该物质显示出一致值(a)非零的抑制性“R”值，该值是通过如下列方法测得(ⅰ)由体外生析分析法测得，即在0-约1×107pg/ml不同浓度的上述物质存在下，测定由活性人体CD4+T细胞分泌的TNF-α的相对活性，和/或(ⅱ)由体内生物分析法测得，即测定小鼠的实验性DTH反应的相对抑制性，所说的小鼠是用从约0至2μg/m小鼠的不同剂量的上述物质处理过的;或(b)非零的增加性R值，该值由体外生物分析测得，即在0-约1×107pg/ml不同浓度的上述物质存在下，测定由活性人体CD4+T细胞分泌的TNF-α的相对活性。
本发明还有另外一个目的是使用该活性物质制备用于治疗宿主的药物制剂的方法，该方法包括将该物质与药用载体混合得到单位剂量、优选低剂量的药剂，该药剂含有有效量的该物质。该药物制剂也可以含有稳定剂，如鱼精蛋白，稳定剂的量应足以使该物质在较长的一段时间后仍保持绝大部分起始活性(即使不是几乎全部的话)，如约3天后仍为约100%。保存温度应低于室温，如约-10到约10℃，优选4℃，此温度下，更高的起始活性得以保持，时间长达约4个月。
由于考虑到本发明的药物组合物施用于人类，故该药物组合物优选无菌的。通过本领域普通技术人员已知的方法来完成灭菌，这些方法包括使用无菌组份、加热灭菌或使该组合物通过无菌过滤器。
有一点是明显的，这就是本发明的一个主要目的提供一种治疗宿主，如哺乳动物体的方法，该宿主患有病症，该症状的严重程度能影响宿主的细胞分裂素的活性，上述治疗方法包括给这类宿主施用有效量的含有大体上纯的本发明的寡糖的活性物质或由此制得的药物组合物。根据具体宿主的病症，可以施用或者降低TNF-α的有效性或活性，或者相反地促进TNF-α的诱导或提高其活性的物质或组合物。这类组合物或药物制剂可以以低剂量、间隔5-8天施用一次，优选一周一次。依方便和有效及普通专业人员用常规实验法很容易确定的剂量，可以每天使用含寡糖(如，单、双、三、或四糖，优选含有双糖)物质的药物组合物，该组合物用于经非胃肠道使用、口服或局部给药。
本发明还涉及用于预防和/或治疗涉及诱导活性TNF-α分泌的疾病的药物制剂，该制剂含有可药用载体和以用于间隔5-8天服用的低有效剂量存在的低分子肝素(LMWH)，该LMWH能通过静止的T细胞和/或巨噬细胞对T细胞特异抗原、分裂素、巨噬细胞活激因子、残余胞外基质(RECM)、昆布氨酸、纤维结合素等的应答反应来体外抑制活性TNF-α的分泌。
在本发明的一个具体实施方式
中，其药物制剂中的LMWH的平均分子量为约3，000到6，000，并且可以在每个第五天或第七天施用一次。
提供一种间隔5-8天使用的药物制剂来预防和/或治疗涉及诱导活性TNF-α分泌的疾病，这也是本发明的一个目的，该药物制剂含有可药用载体，和以低有效剂量存在的低分子量肝素(LMWH)。
本发明的活性物质和组合物能抑制因使用抗原而引起的实验性滞后型过敏反应(DTH)，将在对皮肤施用该物质或其药物组合物后约5到7天施用抗原观察到的皮肤硬化的减轻与对皮肤未施用或施用该物质或其组合物但药效已过后再施用抗原的情况进行比较，结果证实了这一点。使用的抗原的例子包括破伤风、髓磷脂基蛋白、精制的蛋白衍生物、噁唑酮等，但不能限于这些。
进一步地说，本发明的目的是提供一种可以根据具体应用已知的任何方式施用的组合物或药物制剂，这些方式包括内服(包括口服或直肠给药)或经非胃肠道施用(包括局部或在雾化剂的协助下吸入给药)。优选的实施方式中，本发明的药物组合物是口服、皮下、肌内、腹膜内或静脉内给药。
因此，本发明用于例如延迟或预防同种移植排斥反应以及治疗或预防多种疾病，例如那些与免疫性相关的疾病，变态反应性疾病，炎症(特别是炎性肠疾病)、或后天免疫缺陷综合症(AIDS)。还发现本发明可用于治疗Ⅰ型糖尿病、牙周病、皮肤病、肝病、葡萄膜炎、风湿性疾病(特别是风湿性关节炎)、动脉粥样硬化、脉管炎或多出血症。
更进一步地，本发明通过施用本发明的物质来增加活性TNF-α的分泌而在肿瘤、病毒感染和细菌感染中发挥作用。肿瘤治疗的实例包括乳腺、结肠和前列腺癌，还有淋巴癌和其它基底细胞癌的治疗，但不限于这些。细菌感染治疗包括白喉、链球菌(感染)、肺炎、淋病、麻风病和结核的治疗，但不限于此。相似地，能用本发明治疗的病毒感染包括流感、肝炎、胃肠炎、单核细胞增多症、细支气管炎和脑膜炎，但不限于这些。
本发明特定的药物组合物中存在有低有效剂量的指定的LMWH活性物质。典型的，该药物组合物含有少于5mg这样一个低的剂量单位的LMWH活性物质，优选约0.3到约3mg，更优选含有1到1.5mg的一个低剂量单位。
本发明也泛泛地考虑到一种使用低分子量肝素(LMWH)来制备药物组合物的方法，该低分子量肝素能通过静止的T细胞和或巨噬细胞对免剂效应细胞激动剂的应答来抑制体外活性TNF-α的分泌，上述药物组合物以间隔达约5～8天给药一次，用于预防和/或治疗涉及诱导TNF-α分泌的病症，该方法包括将低有效量的LMWH与可药用载体混合。
本发明的另外一个目的涉及提供本发明的活性物质来源的方法，该方法包括分馏低分子量肝素、酶降解天然肝素(DH)或酶降解胞外基质(DECM)。
本发明还有另外的目的就是提供一种治疗主体或宿主所患与诱导活性TNF-α分泌有关的病症的方法，该方法包括给此类主体或宿主施用如上述的药物组合物，以间隔约5-8天，优选一周给药一次。如上进一步所述，含有活性寡糖的药物组合物也可以每天给药或最多每周间隔给药。
本发明也提供一种抑制活性TNF-α产生的药物组合物，它含有式(Ⅰ)的双糖或其可药用盐以及可药用载体，
其中X1为氢或硫酸基(sulfate);X2为氢或硫酸基;且X3为硫酸基或乙酰基，假如X3为硫酸基，则X1或X2的至少一个为硫酸基，并且如果X3是乙酰基，则X1和X2均为硫酸基。特别是，该药物组合物可以含有一种双糖，该双糖为2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸葡糖胺、4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺、2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺、或2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰基-6-O-硫酸葡糖胺。
本发明还构思一种增加活性TNF-α产生的药物组合物，该组合物含有4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰葡糖胺或其可药用盐及可药用载体。这类药物组合物当然可以采用各种给药方式，这些给药方式包括经非胃肠道给药、口服给药或局部给药，但不限于这些。
更进一步地说，提供了一种抑制活性TNF-α产生的药物组合物，它含有一种N-硫酸化或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可药用盐。此类化合物，如果是N-硫酸化的，在另外至少具有另一个硫酸基团，如果是N-乙酰化的，应至少具有两个硫酸基团。应注意的是，由于令人感兴趣的双糖中特定的“糖醛”酸部分的不饱和性(即在C-4与C-5间的双键，所以不存在与六元环平面中所必需的C-6羧基相关立体化学问题。因此，当C-4和C-9间有双键存在时，艾杜糖醛酸与葡糖醛酸相同。因而，术语“糖醛”酸的意义包含葡糖醛酸或艾杜糖醛酸。同样地，“糖酮”(“urono”)基可以理解为艾杜糖酮(idurono)或葡萄糖酮基(glucurono)。
还有，本发明的另一方面涉及一种用于增加活性TNF-α产生的药物组合物，它含有非硫酸化的N-乙酰化4-脱氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可药用盐及可药用载体。
本发明还考虑到了一种抑制主体中活性细胞分裂素产生的方法，该方法包括给该主体，例如哺乳动物(象人类患者)施用有效量的式(Ⅰ)的双糖或其可药用盐，
其中X1为氢或硫酸基;X2为氢或硫酸基;且X3为硫酸基或乙酰基，假如X3为硫酸基，则X1或X2的至少一个为硫酸基，并且如果X3是乙酰基，则X1和X2均为硫酸基。另一种涉及增加主体中活性细胞分裂素产生的方法包括给该主体施用有效量的双糖，该双糖为4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰基葡糖胺或其可药用盐。与本发明的目的相一致，这类方法包括每天或优选每周施用各个化合物或其可药用盐。
也可以用上述方法来抑制或增加主体中活性细胞分裂素的产生，该方法包括给该主体施用有效量的本发明药物组合物。
本发明也想到了使用N-硫酸化或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可用盐来制备预防或治疗由TNF-α的不适当产生所致或与TNF-α的不适量产生有关的疾病的药物组合物的方法，所说的化合物如果是N-硫酸化的应另外至少具有一个硫酸基团，如果是N-乙酰化的则应至少具有两个硫酸基团。
还想到了使用非硫酸化的4-乙酰化4-脱氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可药用盐来制备用于治疗TNF-α过量产生而引起的病症的药物组合物。
同样地，也提供了预防或治疗由主体的活性细胞分裂素的不适当产生引起或与此有关的病症的方法，该方法包括给该主体施用有效量的N-硫酸化或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可药用盐，该化合物如果是N-硫酸化的，另外应至少具有一个硫酸基团;如果是N-乙酰化的应至少具有两个硫酸基团。
还提供了治疗主体中活性细胞分裂素产生增高导致的病症的方法，该方法包括给该主体施用有效量的非硫酸化的N-乙酰化4-脱氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可药用盐的化合物。此类治疗在涉及自身免疫性疾病、肿瘤或某些形式的感染情况中特别有利，所说的感染包括由细菌、病毒或真菌诱导的那些感染。
本发明的其它目的涉及保护主体免受暴露于放射的有害影响的方法，该方法包括给该主体施用有效量的N-硫酸化或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可药用盐，该化合物如果是N-硫酸化的应另外至少具有一个硫酸基团，如果是N-乙酰化的，应至少具有两个硫酸基团。典型地，给该主体在放射暴露前施用本发明的化合物。更为有利地，在放射治疗期间可以利用该类公开化合物的放射保护性质。
并且，考虑到了抑制同种移植排斥的方法，该方法包括给该主体施用有效量的N-硫酸化或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可药用盐，该化合物如果是N-硫酸化的应另外至少具有一个硫酸基团，如果是N-乙酰化的，应至少具有两个硫酸基团。同种移植当然包括器官移植，器官移植包括以及、肝、肾或骨髓移植，但不限于此。该公开的方法也可用于皮肤移植。
还有，另一个目的涉及一种抑制主体中粘合分子的表达的方法，该方法包括给该主体施用有效量的N-硫酸化或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-葡糖醛酸葡糖胺或其可药用盐，该化合物如果是N-硫酸化的应另外至少具有一个硫酸基团，如果是N-乙酰化的，应至少具有两个硫酸基团。这类粘合分子的实例包括ICAM-1或ELAM-1，但不限于此。
还分开了一种用于定量测定测试物质对活性TNF-α分泌的影响的生物分析方法，该生物分析法包括如下步骤在含有不同浓度的测试物质的培养基中预先培养人体CD4+T细胞，加入一恒量的激动剂，该激动剂在没有上述测试物质的存在下能通过T细胞有效地诱导TNF-α的分泌，在足够的一段时间后收集该培养物，并测定培养物中TNF-α的活性。
对本领域专业人员来说，在进一步阅读了下列公开内容后，本发明另外的目的就十分清楚了，下文的公开内容包括对本发明具体实施方式
的详细描述。


图1说明了由用不同剂量的Fragmin治疗的大鼠组与仅接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)的对照组比较得到的佐剂关节炎(AA)评分。
图2说明了由以不同服法(包括单次治疗、每日治疗、间隔五天和每周一次的治疗)接受不变的20mg剂量的Fragmin的大鼠组得到的AA评分。
图3比较了每周施用Fragmin与肝素的有效性和对照组(PBS)两者的有效性。
图4说明了每天施用Fragmin、肝素或PBS的效果。
图5说明了由以不同低分子量肝素(包括Fraxiparin、Fraxiparine和Lovenox)每周或每天治疗的小鼠组得到的AA评分。
图6描绘了进行同种异体心脏移植并接受每周施用Fragmin或PBS的大鼠存活率的百分比。
图7表示了说明两组NOD小鼠的血糖水平的棒条图，其中一组接受Fragmin，另一组则仅接受PBS。
图8说明了包括人类自愿者的一次DTH实验结果。
图9描述了“钟状”剂量对用活性Fragmin表示的反应曲线。
图10说明了以失活的Fragmin表示的抑制活性的丧失。
图11显示了由凝胶过滤失活的Fragmin得到的不同馏份(包括馏份F2、F8、F10和F15)在206纳米处的吸收。
图12，12A和12B分别描述了不同剂量的活性Fragmin、馏份F15和馏份F10对于小鼠对DTH反应的敏感性的影响。
图14说明了从Sepharose4B柱分离Fragmin和乙酰肝素酶降解的ECM得到的多种馏份，其组号与在206纳米的吸收的关系。
图13和15比较了由Sepharose4B柱分离Fragmin和乙酰肝素酶降解的ECM得到的馏份的洗脱曲线。
图16表示一种寡糖产物(图13中的馏份5)，其在其抑制活性TNF-α分泌的能力中证明了相似的钟状剂量/反应曲剂。
图17表示抗TNF-α作用的最大面积在5.65和5.8间的亚级馏分。
图18A和18B分别描述了从HPLC分离Fragmin和乙酰肝素酶降解的ECM得到的层析谱。
图19描述了由Sepharose4B柱分离乙酰肝素酶降解得到的两组馏份F5和F8在206纳米的吸收。
图20A和20B分别在另一方面描述通过HPLC分离馏份F5得到的一个峰(馏份)在206和232纳米的吸收。
图21A和21B说明了从馏份F5得到的其它HPLC馏份的UV吸收。
图22描述了由Sepharose4B柱分离乙酰肝素酶降解的ECM得到的馏份F7和F8的UV吸收。
图23描述了从混合的馏份F7和F8的SAX-HPLC层析得到的大体上纯的峰L馏份)。
图24描述了脱盐制备图23中标志为“1”的峰馏份得到的另一个峰标志“A23/4”的峰。
图25A、25B和25C分别描述了由Sigma标志的H-0895、H-1020和H-9267的双糖标准物经SAX-HPLC柱分离得到的层析谱。
图26说明了从用乙酰肝素酶(MM5)处理的肝素提到的混合物的Sepharose4B柱的分离，得到馏份F7和F8。
图27说明了从单独的PC3乙酰肝素酶和肝素+PC3的Sepharose4B层析得到的各种馏份在206纳米的吸收。
图28A和28B描述了HPLC分离图26中的馏份F7得到的其它馏份。
图29描述了从HPLC分离Fragmin得到的馏份F90。
图30在另一方面描述了SAX-HPLC分离陈放的A23/4样品得到的层析谱。
图31描述了从HPLC层析(如图23所示)得到的ECM-衍生的双糖的20微克样品的质子NMR图谱。
图32描述了图31的样品的二维Cos图谱。
图33描述了图31NMR图谱的放大部分，它显示了异头质子的信号。
图34和35描述了两种分离的样品的FTIR光谱，其中一个样品表明有硫酸化化合物(图34)，另一个表明存在有部分脱硫的类似物(图35)。
图36A描述了得自图23的样品的甲基化衍生物在包含DTT∶硫甘油(1∶1)的溶剂系统中的质谱。
图36B描述了仅仅有溶剂系统的质谱。
图37A和图37B描述了相同的样品在不同的溶剂中的质谱，该溶剂为甲基硝基苯甲醇，图37A为该样品加该溶剂的质谱，图378为仅有该溶剂的质谱。
图38说明了比较双糖9392和1020对提高患实验诱导的佐剂关节炎的雌性Lewis大鼠的AA评分的影响的实验结果。
图38A说明了双糖0895对患实验诱导的AA的大鼠与对照鼠(PBS)的AA评分的影响比较。
图38B说明了在不同剂量下的葡糖胺处理对提高Lewis大鼠的AA评分的影响。
图38C相似地显示了不同剂量的葡糖胺对Lewis鼠的AA评分的影响。
图38D和38E说明了用双糖9392进行的进一步的实验结果，该实验中每周或每天施用双糖，在第0天(即，开始诱导AA时)或第12天(即，大鼠已患AA时)开始给药。
图38F和38G说明了一系列不同的有比较性的实验结果，该实验是用Lewis大鼠组测定每周施用的双糖9392对实验诱导的佐剂关节炎的抑制效果，并将该结果与已知的抗炎剂、磷酸地塞米松对实验诱导的佐剂关节炎的抑制效果进行比较。
图39说明皮下注射二糖1020对脂多糖(LPS)诱导的大鼠角膜炎的效果。
图39A表示了涉及不同剂量葡糖胺的放射保护作用与对照(PBS)比较的实验结果。
图39B表示了相似的放射实验，该实验包括施用不同剂量的双糖9392与对照(PBS)相比较。
图40和40A说明了描述本发明所选择的物质对同种异体排斥的抑制能力的实验结果。图40所示结果显示在移植前一天和移植后每周皮下注射了毫微克的双糖9392，5天能延滞50%的皮肤移植排斥水平。然而，300毫微克剂量的相同的双糖在5%的排斥中与对照(PBS)相比没有产生明显的差异。
图41说明了分别以双糖9392、葡糖胺或盐水治疗雌性NOD小鼠IDDM的效果。
图41A表示分别用双糖9392，葡糖胺或盐水处理过的雌性NOD小鼠的死亡率。需要注意，在图41和41A中，所有的雌性NOD小鼠均大约3个半月龄，就是说作为一个试样组的小鼠已经耐受了IDDM20%的发生率。
图42表示了对用雾化的抗原刺激的六只已免疫的大鼠经(B1、B2和B3)和不经(A1、A2和A3)H-9392处理的呼吸抑制(RD)评分。详见说明书。
图43代表了由实施例6.23中合成路线制备的4-O-(2-脱氧)-6-O-硫-2-硫代氨基-α-D-吡喃型葡糖基)-(2-O-硫-β-D-吡喃葡糖苷)糖醛酸。
一方面，本发明发现用低分子量肝素(LMWHs)治疗抑制了的T细胞和巨噬细胞分泌活性TNF-α的能力。另一方面，本发明描述了大体上纯的含有羧酸化和/或硫酸化的寡糖的其它物质集中代表了一种调节宿主中细胞分裂素，如TNF-α生物活性的方法。为简便起见，除非另有说明，用术语“物质”或“活性物质”来表示在本文公开的治疗方法中所用LMWHs，以及本文中分离出的基本上纯的羧酸化和/或硫酸化寡糖的物质。
在小鼠和人的滞后型过敏反应(DTH)抑制中能看到该作用的功能性表达，T细胞依赖于炎性反应，该反应可以是包括巨噬细胞和其它炎性细胞激发的。用能影响活性TNF-α产生的剂量的活性物质治疗能够抑制一种称作佐剂关节炎(AA)的自身免疫性关节炎。活性物质治疗还延长了同种异体心脏移植鼠和取消了胰岛素依赖的糖尿病metillus(IDDM)的NOD小鼠的存活。并且，类似的治疗防止了通过T细胞和巨噬细胞对损伤的或残余的内皮下胞外基质(RECM)，刺激物应答而诱导活性TNF-α产生。这种引起发出TNF-α诱导开始信号并导致炎症的残余内皮下胞外基质(RECM)与酶降解的胞外基质(DECM)可显著区别，本文中分离了酶降解的胞外基质中的选择组份，且看到这些组份或制止TNF-α活性或增加该活性。
因为血管损伤部位的TNF-α可能会在动脉粥样硬化过程中发挥作用，所以抑制损伤的内皮下ECM部位的TNF-α活性将改善动脉粥样硬化的发病过程。用LMWH活性物质进行治疗的最令人吃惊的方面是此类治疗当以低剂量隔周给药时最有效。高剂量的LMWH活性物质或每天给药剂量的LMWH活性物质对抑制TNF-α的分泌或免疫反应无效。
通过肝素的分馏或抑制解聚生产的低分子量肝素与肝素相比表示出增加的抗凝血作用和不同于肝素的药代动力学特性就它们皮下注射后的抗凝血作用而言，其半衰期为肝素的二倍，且生物利用度较高(Bratt.G.等，ThrombosisandHaemostasis(1985)53208;Bone，B.等，ThrombosisResearch(1987)46845)。
依据本发明，现在发现LMWH活性物质以亚抗凝血剂量隔数天给药能对预防和/或治疗与活性TNF-α的诱导有关的病症有效。并且，现已发现能够鉴别出含有1-10个糖单位，优选2-4个糖单位的寡糖的分离的物质，这些物质能够抑制或增加TNF-α的活性。这些分离的物质能够从例如一个活有机体的组织如酶作用的胞外基质的可溶性降解产物得到。
4.1.活性物质的来源本发明使用的LMWH是从平均分子量为3000～6000的LMWH衍生来的，分子量为3000～6000的LMWH例如欧洲专利EP0014184中公开的LMWH。某些LMWH可以不同商标名如，Fragmin，Fraxiparin
，Fraxiparine
，Lovenox
/Clexane
商购。
LMWH可以用几种不同的方式生产通过用乙醇分馏和/或分子筛如凝胶过滤或膜过滤存在于标准肝素中的LMWH和控制的化学(用亚硝酸、β-消除或高碘酸氧化)和酶(用肝素酶)的解聚法来富集。可以小心地控制解聚的条件以获得所需分子量的产物。通常使用亚硝<p>它含有钙、铁、锌、铜、磷多种微量元素;
它还含有天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸赖氨酸等多种氨基酸。
本发明食品采用物理方法制成，其制作工艺流程是清洗葛根并去皮→破碎→清洗分离→一次沉淀→加水搅拌过滤→二次沉淀→
本发明食品经湖北省农业科学院农业测试中心、武汉产品质量监督检验所、以及日本前忠株式会社检测分析，其感观指标、理化指标、卫生指标均达到和超过类似食品的技术指标和质量要求，它富含淀粉、蛋白、全糖和钙、铁、铜、锌、磷等微量元素，以及十多种氨基酸，是一种营养丰富的滋补保健食品，据《本草纲目》和《中药学》记载及临床验证，对头痛发热、口鼻生疮、咽喉疼痛、脾虚泻痢、祛风发散都具有较好的食疗效果，它无污染、无药害，鲜美可口，是一种很好的纯净天然保健食品。
本发明食品制作工艺合理，它不仅有效地从葛根中分离出其丰富的营养成份，使本发明食品达到和超过了类似食品的技术标准和质量要求，而且工效高，劳动强度及生产成本较低，浪费也较少。
以下详细说明本发明食品及其制作工艺过程。
本发明食品是以天然葛根为原料，分离制取葛根淀粉，经湖北省农科院农业测试中心分析，其感观、理化、卫生特性分别为表1、表2、表3所列
另一种用于分析本发明所用LMWH有效性的试验是实验性滞后型过敏(DTH)皮肤反应抑制实验，所述反应为一种T淋巴细胞依赖的对多种抗原的反应(例如，破伤风抗原、髓磷脂基蛋白(MBP)、精制的蛋白衍生物(PPD)，和噁唑酮)。LMWH还抑制T细胞对ECM及其蛋白组份的粘着。
将依据本发明有效的LMWH引入药物组合物，如可形成水溶液，该水溶液中可能含有氯化钠、稳定剂和其它适宜的非活性组份。优选的给药方式为注射、皮下或静脉给药，但本发明也包括其它任何适宜的给药方式，包括口服给药。
依据本发明，LMWH间约以多至约五到八天的间隔给药，优选每周给药一次。本发明的其它物质，特别是低分子量(低于2000)寡糖，可以以包括每天或每周给药的剂量服法用任何方便、有效的方式(如、经注射、口服或局部)给药。
4.2.LMWH制剂随时间的失活及加入稳定剂的影响本发明人研究的时间过程实验表明LMWH样品如Fragmin，在室温下72小时内和低温(如4℃)几个月内会丧失其抑制TNF-α活性的能力。
下面的6.1.部分中表Ⅺ说明在室温一天后，Fragmin活性的53%丧失掉了。约二天后，其活性的87%丧失，约三天后，显<claim>1、一种抑制活性TNF-α产生的药物组合物，含有式(Ⅰ)的双糖或其可药用盐以及可药用载体，
其中X1为氢或硫酸基；X2为氢或硫酸基；且X3为硫酸基或乙酰基，假定X3是硫酸基，则X1或X2中的至少一个为硫酸基并且如果X3是乙酰基，则X1和X2均为硫酸基。</claim><claim>2、权利要求1的药物组合物，其中所述的双糖是2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸葡糖胺。</claim><claim>3、权利要求1的药物组合物，其中所述的双糖是4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。</claim><claim>4、权利要求1的药物组合物，其中所述的双糖为2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。</claim>10)。然而通过用Sapharose 4B固体载体的低压筛分凝胶层析法(见图11，206nm时吸收率与馏分组号关系图)分离该失活物质揭示了具有抑制(F-15)和增强(F8、F2)作用(见图11和表ⅩⅢ)的活性馏份。失活的Fragmin中的抑制作用馏份(F-15)还抑制DTH反应(参见涉及活性Fragmin
的图12;涉及馏份F15的图12A和涉及馏份F10的图12B)。馏份F10对TNF-α产生及DTH反应性没有影响。
对由用乙酰肝素酶处理以含36S的硫酸基团标记的ECM得到的降解产物进行Sapharose 4B筛分凝胶层析分离。在此观察中使用几种类型的乙酰肝素酶。这些酶包括MM5(从Rad-Chemicals，Weizmann Industrial Park，Ness Ziona，Isreal购得，由人胎盘得到的哺乳动物乙酰肝素酶)，PC3(细菌的内切糖苷酶，如文献Shoseiov O.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1990).169667-672)的酶和一种得自细菌来源的酶，该细菌从IBEX Technologies，Quebec，Canada得到。图13中表示了放射活性(CPM)对馏份组号的图。另一个分馏Fragmin和分馏ECM-乙酰肝素酶的叠加的洗脱曲线图可以在图14中看到。下表Ⅰ中列出了Sapharose 4B低压分离的条件。
表ⅠSepharose4B层析条件柱:Sepharose4B(35cm×0.7cmID)载量:1-1.5ml流速:5ml/hr溶剂:PBS(PH=7.4)馏分:0.2-0.5ml/管检测器吸收设置:206nm,280nm分析各种馏份对TNF-α产生的影响，这些结果如下表ⅩⅤ所示。令人感兴趣的是，发现从两种来源得到的具有相似洗脱特性的馏分对TNF-α的产生和/或活性具有相似的定性生物效果。
图15和13分别描述了一种代表从LMWH(Fragmin)和36S-硫酸酯标记的ECM寡糖的Sepharose 4B柱得到的洗脱曲线，后者是通过精制MM5乙酰肝素酶生产的。图13中可以看到，ECM的乙酰肝素硫酸盐被酶降解产生具有与分馏的LMWH可比的洗脱特性的乙酰肝素硫酸盐碎片。
图16显示了一种寡糖产物(图13，Sepharose4B馏份＃5)，该产物是由ECM+乙酰肝素酶“汤”(即，由乙酰肝素酶降解的ECM得到的混合物)，它在其对活性TNF-α的分泌的影响中同LMWH具有基本相似的剂量/反应特性就是说，二者都表现出钟形剂量/反应曲线并且二者在约1pg/ml的浓度下显示最大抑制都约为90%，且在更低或更低浓度时均表现出较低活性。这样是十分有利的，即这些活性物质的给药包括了落在很容易确定的生理效果的“窗”内的剂量。
图17表示在图13的第5号峰的碎片的亚级馏分(在约5.65到约5.80之间)范围内，ECM降解的产物具有最高的抗TNF-α作用。
因此，乙酰肝素硫酸盐可以象LMWH通过乙酰肝素酶产生降解产物，该产生反馈于T细菌和巨噬细胞来阻断活性TNF-α的产生，结果导致TNF介导的炎症。
还已经发现用内切糖苷酶处理完整肝素得到的低分子量寡糖碎片对TNF-α活性表现出的调节作用。
4.4.由DECM和DH得到的LMWH馏分和碎片的HPLC分离利用高压液相技术(“HPLC”)以从LMWH(如Fragmin)、降解的ECM和降解的肝素试样获得较好分离的馏分。开始时，使用两种类型的HPLC条件。在第一组HPLC条件下，分离和离析多种单一的馏分;然后检测这些馏分调节活性TNF-α分泌的能力。令本发明者感到极为吃惊的是发现所选的馏分能增加宿主中TNF-α的活性，而其它馏分抑制了TNF-α的活性。然后使用第二组HPLC条件，依据各组份的分子量来更好地分离各种组份。
细胞分裂素调节表
在第一种HPLC条件中，使用装备有Guardcolumn Oligo(4cm×6mm I.D.)一根TSK-GEL G-Oligo-PW柱(30cm×7.8mm I.D.)。下表Ⅱ中给出了该条件(“HPLC I”)。在图18A和18B中分明说明了用HPLC I分离Fragmin和ECM+MM5乙酰肝素酶的具有代表意义的层析。
表ⅡHPLC层析条件柱:TSK-GELG-oligo-PW30cm×7.8mmID保护柱:Guardcolumnoligo4cm×6.0mmID循环(LOOP)200μl流速:0.5ml/min展开溶剂:0.2M磷酸盐缓冲液(PH=7.0)馏分:0.5ml/管检测器吸收设置:190nm～400nm下表Ⅲ中描述了第二种HPLC条件(“HPLCⅡ”)，且采用的条件与Pice，K.G.等在AnalyticalBiochem.((1985)150325-331)中描述的那些条件相似。因此，在系统中使用两根串联连结的柱一根ToyoSodaTSK-GELG3000SW(7.5mm×50cm)柱与一根G2000SW(7.5mm×50cm)柱相连。这些柱从Phenomenex公司得到的，它们与一根7.5mm×10cm的保护柱一起和G2000柱的入口端相连。在下面的6.11、6.14和6.15中描述了进一步实验的细节。
表ⅢHPLCⅡ层析条件柱:串联的ToyoSodaTSK-GELG3000SW(50cm×7.5mm)ID)和G2000SW(50cm×7.5mmID)保护柱:Guardcolumn(10cm×7.5mmID)循环:20或100μl流速:1ml/min展开溶剂:脱气的0.5MNaCl馏份:0.5ml/管检测器吸收设置:205nm,232nm在这些条件下，较小分子的停留时间比较大分子的长。
在另一种HPLC条件下(“HPLCⅢ”)，在有强阴离子交换(SAX)HPLC柱的协助下检测了选择的脱盐HPLC馏分的纯度。此类SAX-HPLC柱已知是根据分子中存在的带负电荷基团数目来分离相似大小的分子。在物质中带负电荷基团数目越多，它在柱中停留的时间越长。下表Ⅳ中列出了HPLCⅣ条件。
表ⅣHPLCⅢ层析条件柱:SAX-HPLC柱(25cm×4.6mmID,用Spherisorb装填,颗粒大小为5μm)循环1ml流速:1.5ml/min展开溶剂:线性梯度,下馏分:1ml/管检测器吸收定位:205nm,232nm线性梯度(见下面的6.15部分)在考虑了本文的公开内容后，对本领域普通专业人员来说，考虑并应用其它HPLC条件来分离和精制本发明的活性物质，这一点也是显而易见的。特别是，也可以采用十分有利的反相条件。例见Rice.K.G.等人的supra。
再次，不囿于理论，猜测TNF-α活性的增加是由于增加胞内活性TNF-α的产生、提高由宿主免疫应答细胞分泌的活性TNF-α的量或通过兴奋剂的作用增加发细胞分裂素的活性。
还认为通过相反的过程可以抑制TNF-α的生物活性，该过程不仅包括活性抑制物质产生的对TNF-α受体的竞争(如，用作或诱导其他用作TNF-α拮抗剂的物质产生的抑制性物质)而且还包括TNF-α和抑制性物质的复合物的形成，所说的抑制性物质的活性低于游离的TNF-α。另外，认为TNF-α和增加性物质的“烩合”复合物或许是TNF-α活性增加的原因。
4.5.活性测定本发明的能抑制TNF-α活性的和能增加TNF-α活性的活性物质，都能从含有它们的混合物分离和纯化出来。在某些情况下，这些活性物质经本文所述的有力的HPLC技术提纯为基本上单一的成份。
作为对这些物质纯度的进一步说明，测定了各种物质的特定调节活性。然而，起初采用咔唑分析法来测定在给定样品中的寡糖物含量(如糖的存在量)，该咔唑分析法以相似于Carney，S.L.在ProteoglycanAnalysis，APracticalApproach及Chaplin，M.F.和Kenneday，J.F.(Eds.)IRLPress，Oxford，Washington，D.C.(1986)P.129中公开的方式进行。以该方式可以测定微微克糖量。该分析法的过程如下面的第5部份所述。
下一步是用一种生物分析法来测定与该物质量相关的表观活性而得到剂量/反应图，所述分析方法在下文第5部分中有更详细的描述。这些生物方法可以在体外或体内条件下进行。
于是发现观察到的对TNF-α活性的抑制或增加依赖于测试样品中存在的此类物质的浓度或剂量，TNF-α活性的增加或抑制表示为没有本发明的物质存在下的TNF-α活性百分数。由此得到的表观活性轮廓图大约象图9和16中描述的铃状。观察到的每种物质的百分抑制或增加的最大值可以用Inhmax或Augmax表示，视情况而定。
如下文进一步所述，用于建立“理想”单位剂量(即，对应于Inhmax或Augmax的剂量)的生物分析法可以以体外或小鼠体内抑制或增加TNF-α活性或DTH分析为基础。另外，可以使用基于人细胞(如下文详述)的体外分析法。如本文定义的，特定的抑制活性或“R”值是Inhmax或Augmax与产生最大百分抑制或增加的“理想”剂量的比率。对体外分析法，该“R”值典型地以%×(pg/ml)-1表示。
如上所述，特定抑制活性也可以在体内条件下通过测定对小鼠或人的实验性DTH反应的抑制来建立。发现特定剂量的一种抑制性组合物抑制活性TNF-α分泌的能力与它抑制滞后型过敏反应的能力成正比，尽管同样的组合物在一种分析方法中比另一种方法中即在体外和体内分析方法间可能表现出更强的效力。在这种体内细胞介导的炎性反应中，抑制或增加的活性是十分重要的，因为DTH反应是包括在自身免疫性疾病、移植排斥、某些类型的血管炎症和过敏过程中的反映。因此，该测试的活性表示了它在这些类型和可能的其它疾病中的有效性，如下文详述。
而且，新的定量的特定调节活性可用于区分本发明的新的活性物质和那些已知的本文分开的但并未被本领域认为是具有细胞分裂素调节活性的物质，特定的抑制活性定义为Inhmax或Augmax与产生最大百分值的物质量或浓度(“理想”剂量)间的比率。简单地说，该特定比率在本文是指“R”值。因此，可以以术语最低“R”值可能通过表观活性与剂量曲线来计算，并且参考本公开文本的教导，该“R”值将超出与已知组合物相关的“R”值。
4.6.受益于本发明的疾病种类依据本发明能预防或治疗与涉及活性TNF-α分泌的诱导的病理过程相关的所有疾病，包括动脉粥样硬化和脉管炎及与此有关的病理过程;自身免疫性疾病，如类风湿关节炎，Ⅰ型糖尿病(胰岛素依赖的糖尿病metillous或IDDM)、多出血症、红斑狼疮、雷格夫斯病;过敏症;移植排斥;急性和慢性炎性疾病、如葡萄膜炎、肠炎、神经性厌食症(anorexianervosa);由败血症引起的出血性休克及AIDS中的HIV感染。在AIDS中，活性物质将抑制HIV的复制，由此来预防涉及AIDS的并发症(ARC)的发展。其它受益于调节细胞分裂素活性的治疗的疾病包括(但不限于这些)牛皮癣、天疱痤气管炎、肾病、肝病、骨髓疾病、白斑、脱发和肌炎。
并且，活性TNF-α的增加还可用于治疗肿瘤、细菌感染和病毒感染。本发明的增加活性TNF-α产生的物质在可药用载体中经非胃肠道、口服或局部给药也可帮助治疗皮肤癌，例如基础细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤。
在本发明活性物质的临床应用中，应该记住的是对某些类型疾病的成功治疗在很大程度上是在于体内平衡的恢复。对内分泌学家而言，这就暗示了应谨慎给药或有特定激素的拮抗作用。例如，胰岛素依赖型的糖尿病可以通过胰岛素替换疗法得到有效治疗;格雷夫斯患者可以通过抑制甲状腺释放的药理方法而受益。只有很少的疾病可以通过服用本来并不缺乏的激素而得到缓解。
细胞分裂素，例如TNF-α作为抗肿剂的用途提供了一种此类例子。对癌症病人，施用的免疫调节剂的比率是微不足道的。许多细胞分裂素，如TNF-α，在达到治获目的很久前就表现出具有剂量限制的毒性。在这种情况下，提高内源性产生的TNF-α的活性可以提供一种比以前想到的治疗方案更好且更有效的途径。
很明显，我们对TNF-α作用的理解是逐渐加深的，并且，毫无疑问，还将发现能够调节其活性的激素和物质的新的、有益的用途。具体想到的那些减轻疾病症状、预防疾病发作或提供治病的用途都在本发明范围之内，更不用说权利要求的组合物和药物制剂的全部用途了。
4.7.本发明的低聚糖物质的局部应用本发明的物质在局部给药的组合物中也找到了用途，例如用于水肿或炎症治疗的那些制剂中。的确在远超出单纯的治疗应用之外，本发明的物质在化妆品组合物的增补保护作用方面也找到了利用性，例如用在防晒液或晒黑液之类的化妆品组合物中。几乎没有防晒制液在阻隔存在于电磁光谱的紫外区域的所有有害波长(例如290-320nm)方面完全有效。因此，过度地暴露于太阳中常导致形成太阳红斑的急性病，并且延长、重复的暴露当然可以导致革质皮肤或更严重可导致皮癌。
这样，在化妆品制剂中，掺和本发明的活性物质特别考虑到是用于防护和保护皮肤，以及缓和医疗状况例如太阳红斑。在防晒或晒黑制剂中，包含本发明的有效量的低聚糖和一般的防晒剂是有利的。通常，活性物质的用量为给每公斤使用者提供约1μg-约100mg的剂量，优选约0.01mg-约10mg，最优选约0.1mg-约1mg。
所述化妆品组合物可包含本领域内普通技术人员熟知的一些通用的组分，如Kirk-othmer，在EncyclopediaofChemicalTechnology，第三版(1979)，卷7，PP.143-176中所述的。在防晒制剂中，添加本发明的活性物质提高了红斑产生的最小剂量(MED)，因而提高了太阳保护因子(SPF)。具体组分包括典型的防晒剂在Kirk-othmer见上在PP.153-154中列出。此外，局部制剂和化妆品配制剂可以如U.S.专利4199576号，4136165号和4248861号描述的来制备，上述文献本文将其全文引入作为参考。但是，本美容领域内的普通技术人员会明白，得到的组合物可为各种各样的形态，这些形态包括但不限于溶液、洗液、霜、膏、乳剂、喷洒剂或气溶胶。
4.8.代表性的剂量用法按照本发明确立，造成TNF-α抑制、DTH活性产生或抑制至少达50%的每Kg施用LMWH的最低剂量，被认为构成12个鼠抑制单位/Kg(12u/Kg)。由于鼠与人体在表面积和新陈代谢方面的差别，人体应当用LMWH的较低剂量治疗，所建立的鼠的12u/Kg相对应于人体的1u/Kg。例如，对TNF-α分泌和DTH反应性都能抑制的Fragmin
批号38609的有效剂量是每周施用5μg/鼠。由于每只鼠重约25g，相当于12u/Kg的Fragmin
38609的剂量是200μg/Kg鼠。因此，适用于人体的1u/Kg的剂量为200μg/Kg÷12＝16.67μg/Kg。那么，体重约70公斤的人，将要以约1.2mg剂量治疗，每7天皮下注射一次该单一剂量。由于每个人的生物活性不同，因此最佳剂量可与约1.2mg有差别，一般低于5mg，优选在0.3-3mg的范围内。
因此，将鼠的剂量用法转换成人体剂量的粗略公式如下人体剂量/Kg＝鼠剂量/Kg÷10或12
大鼠(rat)的有效的LMWH剂量可按如下事实所导出，即每公斤大鼠的LMWH剂量是每公斤小鼠(mouse)的剂量的一半，即6u/Kg。例如，如果Fragmin 批38609的12u是200μg/Kg，那么适宜于大鼠的6u剂量就是100μg/Kg或20μg/200g大鼠，一周施用一次。
对本发明的大多数低聚糖物质来说(它们已经从LMWH、降解的肝素和降解的ECM分离出来)，下面是通过活体内DTH生物测定来预计这些低聚糖物质用于人体的有效剂量的一种方法。
图12A示出了在活体内分离出的部分(F15)，它以0.1-5.0μg/鼠/周的范围抑制鼠体内的DTH。由于我们的鼠体重25g，在活体内的剂量大约是(0.1÷0.025Kg)4-200μg/Kg鼠/周(在活体外相当于0.01-10pg/mL)。
为了修正鼠类与人体之间表面积的差别，我们必须将鼠剂量/Kg除以12。
4-200μg/Kg鼠→0.33-16.67μg/Kg人体。
这样，一个体重70Kg的人接受高达约1.2mg(约1200μg)的剂量。为确保我们能覆盖各个人之间的差别，我们可以将这一剂量提高到约5mg，这个剂量值大大低于用来对凝固或血栓形成产生影响的类肝素(heparinoids)的任何剂量。因此，体重为70Kg的人的剂量将大约为5mg或少于5mg，优选约3mg或少于3mg，更优选1.5mg或少于1.5mg，而最优选1mg或少于1mg。
实际上，对高度净化过的本发明的材料来说，这包括已经由HPLC色谱法制备的那些材料，优选的剂量可能甚至更低。例如，二糖(下文将更详细地描述)已经发现显示出了抑制活性，当以约0.1μg-约0.5μg/Kg老鼠注射施用时。因此，对人体来说，使用纯化的二糖估计该剂量大约为0.01μg-约0.05μg/Kg人体重，或对体重为70Kg的人剂量为约0.7μg-约3.5μg。那么，对体重为70Kg的人的剂量的一般范围约是0.1μg-约100μg，优选约1μg-约10μg，使用的是二糖。对已知的二糖“标记物”，剂量可以稍高，下文会进一步讨论。
上述的有关剂量，可以每日施用数次或每天、每周一次，或甚至可以更大的间隔来施用，这取决于每个人的响应值。但是，对LMWHs来说，剂量间隔优选是每周，如上所述的。
本发明将通过下面非限制性实施例来进一步描述。
5.仅使用LMWH(Fragmin)的实验5.1.利用老鼠的脾脏细胞进行抑制活性TNF-α分泌的生物测定对在LMWH存在下、或无LMWH的情况下培养的脾脏细胞的上清液，或者在活体内用LMWH处理鼠或未处理鼠来得到的脾脏细胞，分析它们分泌活性TNF-α的能力。TNF-α生物测定是根据TNF-α对放线菌酮(CHI)-敏感的细胞的细胞毒性的影响和通过中性红吸收测定对它的定量分析来进行，参见WallachD.的描述，J.Immunol.(1984)1322464-2469。粗略地讲，测量了由在细胞的上清液中存在的TNF-α杀死的CHI-敏感的海拉(HeLa)细胞的量，就可与外源添加TNF-α的滴定曲线相比较来确定上清液中TNF-α的浓度。细胞的(生)活(能)力按如下方式来确定，即用中性红培养两小时，洗去过剩的染料，被细胞吸收的中性红用Sorenson's柠檬酸盐缓冲剂-乙醇混合物来提取，并且用MicroelisaAutoreader在570nm处量热法来定量它。
用LMWH处理过的鼠细胞按如下方式获得BALB/C种的雌鼠(25克，2月龄)，每组至少5只，皮下注射不同剂量的LMWH，一般在0.5-20μg/鼠范围。五天后，通过颈部错位将鼠杀死，移出脾脏，放尽红血细胞，脾脏细胞的悬浮液测定通过残留的外细胞基质(RECM)、伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)诱导响应而产生的TNF-α。
5.2.在活体内实验DTH反应性抑制的生物测定鼠的近交的BALB/C(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)族或远交(outbred)CD1(Weizmann Institute Animal Breeding Center，Rehovot，Israel)族用100μl的2%噁唑酮的丙酮/橄榄油(4/1，V/V)溶液局部涂敷刮过的腹部皮肤，使其敏感。五天后按如下方式得到DTH的敏感度鼠用20μl 0.5%OX(10μl局部施加到耳朵的每一侧)的丙酮/橄榄油溶液进行免疫处理。在免疫前当时和24小时及48小时后，用Mitutoyo工程的测微计测量耳朵的一恒定区域。测量耳朵的肿胀的人不知鼠的组别。耳朵肿胀的增值(△)以10-2mm或10-4英寸(+SE)为单位的平均值来表示，这取决于所使用的测微计。抑制的百分数按下式计算%抑制＝1-( (处理过的-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照) )鼠按实施例5.1用LMWH处理，在初步对OX敏感的前一天注射，在对OX敏感的第五天对鼠免疫以诱导产生DTH反应，如上所述。
阳性对照是免疫鼠没有用LMWH处理所得的DTH反应。阴性对照是通过初次实验(非免疫的)鼠的抗原产生的“底”肿胀。
5.3.活体外T细胞和巨噬细胞的TNF-α分泌的诱导Microtiter板制备如下将纤维蛋白(FN)或海带氨酸(Laminin)(LN)(sigma)加入平底96-孔板(Contar)中，其浓度为每孔1μg/50μlPBS，在16小时后移出。保留的结合位置通过向孔中加入2小时的BSA/PBS(10mg/ml)封闭，然后清洗掉。
涂ECM的孔的制备如下牛的角膜的内皮细胞在平底96-孔板中培养。内皮细胞的融合层溶解，CM整体与细胞碎屑分离(Gospodarowicz，D.等.，J.Biol.Chem.(1978)2533736)。通过用27G注射器针头轻轻地划剌ECM三次来制备破裂的或残余的ECM(RECM)，随后暴露的部位用BSA/PBS涂敷。休止的克隆鼠CD4+T细胞(称为K1)(它识别髓磷脂碱性蛋白(MBP))在培养液繁殖并维持，然后加入到孔中，每孔105个细胞，含或不含3×105同基因的脾的巨噬细胞，在每孔RPMI1640的100μl中，补加1%BSA和抗菌素。
利用专门的单克隆抗菌素(mAb)通过除去T和B细胞来净化脾巨噬细胞。从Genzyme(Cambridge.MA)得到抗-鼠性的TNF-αmAb，并稀释300倍。将这种稀释溶液的10μl部分加入每个孔中。将MBP(100μg/ml)、conA(2.5μg/ml)、LPS(1μg/ml)、FN(5μg/ml)和LN(5μg/ml)加入指定的孔中。
板在37℃在一增湿培养器中培养三小时。随后，收集孔中(每实验组4个孔)的内容物，离心分离，按5.1部分中的实施例所描述的对介质进行活性TNF-α分泌的测定即将培养巨噬细胞和淋巴细胞的上清液加入海拉细胞的培养液中，海拉细胞对被TNF-α的杀死是敏感的，在试验介质存在下通过与添加外源TNF-α的滴定曲线比较来测定这些死细胞。通过预培养的海拉细胞释出的中性红染料检查死细胞。这里示出了试验结果代表了由产生基本上相似结果的六个试验所得到的数据。
表Ⅴ表示通过与专门的抗原MBP(组4)、促细胞分裂剂ConA(组6)或LPS(组8)接触，T细胞与巨噬细胞一起培养可以诱导分泌TNF-α。但是在缺乏抗原或有丝分裂刺激下，通过残余的外细胞基质(RECM;组10)或通过ECM组分、纤维蛋白(FN;组12)或海带氨酸(LN组14)也可以诱导分泌TNF-α。完整ECM是TNF-α-弱的诱导剂(组16)。
表Ⅴ.通过专门的抗原MBP、ConA、LPS、RECM或ECM组分诱导T细胞和巨噬细胞分泌的TNF-α。
TNF-αKI细胞与(有)或没有分泌的TNF组诱导剂(无)与巨噬细胞一起培育-α(pg/ml)1无无502有653MBP抗原无304有9505ConA无1206有13007LPS无508有15009RECM无3010有90011FN无2012有65013LN无5014有50015ECM无3016有120
5.4.通过LMWHs调节TNF-α的分泌按5.3段的描述制备T细胞和辅细胞的培养液。在细胞培养的开始就将LMWH加入孔中。在培养3小时后，检查TNF-α的量。
表Ⅵ示出了通过专门的抗原(MBP;组4)促细胞分裂剂(ConA和LPS;组6和8)、RECM或ECM组分(组10、12和14)诱导的活性TNF-α的分泌在活体外存在LMWH(Fragmin 批号38609)下受到了抑制。由于被RECM诱导的TNF-α的分泌可能会引起动脉粥样硬化，因此被LMWH抑制的TNF-α在动脉粥样硬化中将是有益的。
表Ⅵ.在活体外诱导的TNF-α分泌的诱导由LMWH(Fragmin
批38609)所抑制。
5.5.用LMWH处理BALB/c鼠的活体外(EXvivo)实验为了检查将LMWH施用于鼠活体内对活体外的脾脏细胞分泌TNF-α的影响，进行如下的实验。
每组五只BALB/c鼠，用盐水稀释的不同剂量的LMWH(Fragmin
批号38609)处理，皮下注射。一周后，杀死受试动物，检查它们的排尽红血细胞的脾脏对应无RECM(A)的对照孔或用RECM(B)涂覆的孔的分泌TNF-α的能力。TNF-α分泌量的测量如5.1节描述的进行。表Ⅶ示出了实验结果，结果表明7天前一次注射LMWH 5μg，使由RECM诱导的TNF-α的分泌受到了抑制。LMWH较高或较低剂量的效果较差。因此，LMWH的最佳剂量在一周前施用于活体内是有效的。
表Ⅶ.对应于残留的ECM由T细胞介导的TNF-α分泌的活体外(EXvivo)抑制。
由脾脏细胞引起的活体外的TNF-αBALB/c鼠的LMWH分泌(pg/ml),所述细胞培养于:
处理(每周)A.无B.残留的ECM(%抑制)1无30400-20.5μg50380(5)31μg2590(78)45μg2560(85)510μg30140(65)620μg40320(20)
表Ⅷ示出了在抑制由LPS诱导的TNF-α的分泌中，在活体内LMWH Fragmin
批号38609的5μg剂量也有效。BALB/c(每实验组4只)用以盐水稀释的LMWH的标明的量处理，皮下注射。在一周后，给鼠腹膜内注射10mg LPS，4小时后杀死，它们的脾脏细胞排尽红血细胞后，在增湿的培养器中在RECM涂覆的孔中培养三小时。测量培养液的上清液中对应于RECM的TNF-α分泌的量。结果示于表Ⅷ。
表Ⅷ.用LMWH处理鼠来抑制由LPS介导的巨噬细胞活性TNF-α的分泌鼠的LMWH处理对应LPS的巨噬细胞活体外(μg)TNF-α的分泌(pg/ml)%抑制0690--0.15002813505051208220550205.6.利用各种LMWH来源的实验为检查不同的LMWH对抑制活性TNF-α分泌和对DTH响应的作用，鼠用标明的LMWH以不同浓度皮下施用处理。一周后，杀死其中的一些鼠，测量活体外应ConA的活性作用而诱导的活性TNF-α分泌(表Ⅸ)。剩余的鼠检查它们对抗原噁唑酮响应的能力(表Ⅹ)。结果示于表中，以与对应的LMWH未处理的鼠相比较的抑制百分数给出。
考查表Ⅸ和Ⅹ中所示的结果，可以得出如下两个结论1.不同批的LMWH，经相似的抗凝血效应(因子Ⅹ测定)对每种LMWH检测，它们对抑制活性TNF-α的分泌有不同的最佳剂量。甚至有些LMWH制剂，例如Clexane
批号4096对活性TNF-α的分泌在任何受试剂量时都没有抑制效果。因此，可得出结论，LMWH制剂的抗凝血效果与它抑制活性TNF-α分泌的潜力无关。两次不同的生物测定都是由制剂的不同的因子介导的。
2.特定剂量LMWH抑制活性TNF-α分泌的能力与它抑制DTH反应的能力毫无疑问地一致，抑制活性TNF-α分泌的LMWH制剂的最佳有效剂量也是抑制DTH反应的最佳有效剂量。
表Ⅸ.每周用不同的LMWH处理鼠抑制鼠的DTH的敏感性DTH抑制LMWH批号对应的DTH剂量"R"值(μg/gm mouse) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1Fragmin批号38609无25(+)对照-2(-)对照-0.022112-0.042310-0.2673(最大)3650.4620-200-批号45389无28(+)对照-2(-)对照-0.004266-0.04489(最大)22250.22413-0.4266-2290-
表IX(续)DTH抑制LMWH批号对应的DTH剂量"R"值(μg/gm mouse) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1Clexane批号2088无22(+)对照-2(-)对照-0.0041723-0.04387(最大)21750.21341-0.4230-批号2066无23(+)对照-2(-)对照-0.0042013-0.04865-0.2770(最大)3500.4770-批号4096无24(+)对照-2(-)对照-0.0427无效果00.226无效果00.424无效果0
表Ⅹ.每周用不同的LMWH处理鼠抑制活体外(EXVivo)活性TNF-α分泌。利用鼠脾脏细胞的生物测定。
ConA-诱导的LMWH批号剂量TNF分泌抑制"R"值(μg/gm鼠) (pg/ml) (%) %×(μg/gm)-1Fragmin批号38609无450对照-0.024255-0.0440012-0.26885(最大)4250.435022-24358-批号45389无320对照-0.00428013-0.047078(最大)19500.226018-0.429010-23104-Clexane
表X(续)ConA-诱导的LMWH批号剂量TNF分泌抑制"R"值(μg/gm鼠) (pg/ml) (%) %×(μg/gm)-1批号2088无400对照-0.00436010-0.046484(最大)22000.215238-0.43804-批号2066无350对照-0.0043386-0.0418554-0.219257(最大)2850.418655-批号4096无320对照-0.04335无效果00.2325无效果00.4330无效果05.7.用低剂量的LMWH治疗老鼠的辅药性关节炎(AdjuvantArthritis)(AA)辅药性关节炎是在一些老鼠种系中可诱导的一种实验病，是通过免疫接种结核分支杆菌而产生的(Pearson，C.M.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(1956)9191)。这种实验病被认为是人体风湿性关节炎的模型(Pearson，C.M.，ArthritisRheum.(1964)780)。关节炎似乎是由T淋巴细胞引起的，而T淋巴细胞认为是结核分支杆菌的一种抗原，该抗原与关节组织中的结构交叉反应(Cohen，I.R.，等.，ArthritisRheum.(1985)28841)。
Lewis鼠用在油中的结核分支杆菌(1mg)免疫接种，以诱导辅药性关节炎(Pearson.C.M.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(1956)9191)。五天后，这些鼠用标明的LMWH和/或肝素剂量皮下接种，并对关节炎的发展按如(Holoshitz，J.，等.，Science(1983)21956)描述的0-16级打分。所有的实验都是用Fragmin 批号38609进行。
为了研究响应Fragmin 的剂量(图1)，免疫接种以诱导AA的鼠每周皮下注射，在第五天后开始用0.5μg(○)、1μg(◆)、2μg(●)、10μg(◇)、15μg(△)、20μg(■)、30μg(▲)、40μg(X)注射和PBS对照(□)。20μg剂量在抑制关节炎中效果最好。
20μg Fragmin 的剂量对AA过程的影响示于图2PBS对照(□);在第五天处理一次(▲)、每日(●)、每第五天(○)、每周(■)处理。图中示出了在以五天间隔和在7天间隔施用Fragmin都抑制了关节炎。
图3示出每周施用Fragmin (批号38609)与标准肝素相比较对AA的效果。Lewis鼠免疫接种以诱导AA。在五天开始，以每周间隔用20μg剂量的Fragmin (●)、肝素(○)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)对照(□)进行皮下接种。在Fragmin 和肝素之间的在效力方面的结果戏剧性的不同Fragmin 完全抑制了关节炎，而肝素没有抑制效果。
如图示(图4Fragmin (批号38609)(●)、肝素(○)、PBS对照(□))，虽然在每日施用中肝素的抑制效果令人惊奇地高于Fragmin 的，但是发现每日施用LMWH的20μg剂量对AA没有抑制效果。
将几种其它的LMWH施用于为诱导AA而免疫接种的鼠，观察到相似的抑制效果。图5示出注射20μg剂量的Fraxiparin (每日(□)、每周(■));Fraxiparine (每日(△)、每周(▲));Lovenox /CLexane (每日(●)、每周(○))和PBS对照(X)。所有三种不同类型和来源的LMWHs当每周非每日施用时，都显著地抑制了关节炎。
5.8.用LMWH处理防止异源移植排斥Wistar鼠进行同种异体BN心脏移植(Ono，K.和Linsay，E.S.，J.Thorac.Cardiovasc Surg.(1969)45225-229)。从移植前的一天起，以7天间隔用20μg的Fragmin 或PBS对照进行皮下注射(图6，分别为●和○)，并记录生存率。排斥的日期是确定为移植的心脏停止跳动的那天，通过腹部触诊来检定。图6示出每周用LMWH剂量处理的鼠显著提高了心脏异源移植的成活率。
5.9.LMWH对NOD鼠的胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的生物作用
NOD种的鼠本能地发生一种Ⅰ型胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，它是人体IDDM可接受的模型(Castano，L.和Eisenbarth，G.S.，Annu.Rev.Immunol.(1990)8647-679)。在4-5周龄期开始发病，出现胰岛炎症，胰腺炎(insulitis)。胰腺炎逐渐损伤产生胰岛素的β-细胞，而该β-细胞对由TNF-α导致的损伤是敏感的。在大约4-5月龄期，大量的β-细胞遭受破坏，结果糖尿病加重。
为了测试用LMWH处理是否能影响IDDM进程，每组10只雌NOD鼠每周每只鼠皮下注射5μg的Fragmin
(批号38609)，测定的剂量以12只鼠为单位每Kg表示。对照组10只鼠注射盐水。在5月龄期时，所有鼠放血，利用标准方法(Elias，D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1990)871576-1580)测定IDDM的发展。图7示出对照鼠(“无”)有变态的血葡萄糖(400mg/dl)。与之对比，用LMWH处理的鼠有正常的血糖值(100mg/dl)。因此，用LMWH处理的确可以治愈IDDM病变。
5.10.过敏反应的LMWH处理在许多过敏病人中，用专门抗原或抗-IgE进行真皮内免疫立即导致风块和潮红反应，接着4-8小时后，会有一段时间持续肿胀和白血球浸润，称为后期皮肤反应。后期反应(LRP)2在皮肤(Solley G.O.等.，J.Clin.Invest.(1976)58408-420)中进行了粗略地描述。但是，现在已经明了的是，依赖IgE的反应的后期效应特别包括出血白细胞对反应部位的渗入，也在呼吸道和其它组织的位置上发生(LemansKi，R.F.和Kaliner，M.，inAllergyPrinciplesandPractice，卷1(1988)，Middeton，Jr.，E.等(Eds.)，PP.224-246)。的确，有说服力的争论是，在临床上在皮肤和呼吸系统这两方面依赖IgE的反应的显著效应反映了在LPR过程中在这些部位募集的白细胞的作用，而不是在抗原刺激后的早期释放的介导物的作用(Kay，A.B.J.AllergyClin.Immunol.(1991)87893-910)。
目前广泛地认为慢性过敏性疾病例如气喘和特应性皮炎主要是炎症过程的结果，这主要包括嗜曙红细胞和T细胞的渗入和活化(Kay，A.B.J.AllergyClin.Immunol.(1991)87893-910)。
几行证据支持这种假设，该假设为与LPRs相联系的白细胞的渗入是肥大细胞脱粒的结果。在人和实验动物中，按依赖IgE的某些其它机理诱导皮的肥大细胞脱粒的试剂也可以促进白细胞在反应部位的渗入(Solley，G.O.等.，J.Clin.Invest.(1976)58408-420;LemansKi，R.F.和Kaliner，M.，in Allergy，Principles and Practice，Vol.1(1988)，Middleton，Jr.，E.等.(Eds.)，PP 224-246;Kay，A.B.J.Allergy Clin.Immunol.(1991)87893-910)。对活化肥大细胞可以合成的介导物的一篇综述揭示出许多介导物，它们有助白细胞渗入LPBs中，它们包括脂质介导物，例如LTB4、LTC4、LTD4、PGD2和PAF(血小板活化因子)、以及几种肽或蛋白向化(chemotactic)因子(Holgate，S.T.等.，in AllergyPrinciples and Practice，Vol.1(1988)，Middleton，Jr.E.等(出版)，PP.135-178)。后几种试剂的大小范围是从四肽“过敏性嗜曙红细胞向化因子”到很高分子量的“中性白细胞向化因子”。
近来，已鉴定出与白细胞渗入相联系的介导物的更多的肥大细胞的选择物，包括与INF-α、IL-1α相似或相同的细胞分裂素(cytokine)，和少量分泌肽的MIP-1基因族的四个成员(Gordon，J.R.等，Immunol.Today(1990)11458-464)。这些细胞分裂素中的四种(TNF-α、IL-1α、MIF-1α和MIP-1β)已证实具有促进白细胞渗入的能力。
最近，(Wershil，B.K.等.，inJ.Clin.Invest.(1991)87446-453，通过使用肥大细胞缺乏的鼠证实，在依赖IgE的LPR期间，白细胞的募集依赖于肥大细胞，并且这种抑制通过局部施用抗TNF-α抗血清而部分阻滞。现在，可广泛接受的是，与依赖IgE的LPR有关的细胞的渗入/活化的抑制在缓和各种过敏疾病中是一种决定性的治疗方法(Barnes，P.J.N.Eng.J.Med.(1989)3211517-1527)。
令本发明人惊奇地是，发现在患被动皮过敏(PCA)鼠的依赖IgE的皮LPB期间，LMWH显著地抑制了白细胞的渗入。
鼠接受单克隆IgE抗DNP Ab(～20μg)皮下(i.d.)注射(进入双耳)。一天后，该鼠用DNP30-40-HSA的盐水静脉注射。在用DNP-HSA激发前或之后的不同间隔，通过用测微计测量耳朵的厚度来测定耳朵的肿胀。在所有实验中，通过颈部错位杀死鼠后，从PCA反应的部位得到了组织，并进行Giemsa-着色工序处理。LMWH在-2天通过S.C.注射(5μg/鼠)一次。
结果在PCA反应位置肿胀迅速扩大(在15分钟△为35×10-4英寸。)但是在对照部位(仅用稀释剂注射的耳朵)没有。在静脉内(i.v.)抗原刺激后，2-4小时间肿胀显著地减小。
在静脉内抗原刺激后6-8小时，逐时评价PCA和对照部位。在PCA部位的大部分肥大细胞呈现出广泛地或适度的脱粒。与上相反，在对照部位＜5%的肥大细胞呈现出明显的脱粒。在抗原刺激6小时后，仅在PCA部位有显著的中性白细胞渗入。这种渗入在用LMWH两天前预处理的鼠中显著地减少(到60%)。这种药物对肥大细胞脱粒的数量没有影响。这种药物对这些动物周围的血中的白细胞的总的和分类的计数没有影响。可以得出结论，LMW肝素抑制了与依赖IgE的后期的皮的反应相联系的细胞的渗入。此外，申请人还预期，施用LMWH对活性的皮过敏性的动物中的皮的LPR显示出了有益的效果(专门的IgE生产将是用DNP-HSAAlum来诱导)。还预计到对过敏性肺炎有相似的治疗效果(Tarayre，J.P.等.Int.J.Immunopharmacol.(1992)14(5)847-855。
5.11.人体DTH的LMWH处理图8示出了一个实验，其中一个40岁自愿受试的男人，体重85Kg，测试破伤风抗原对DTH的反应性(Merieux皮肤试验申请者)。在24小时和48小时，测量到约18mm的硬结。然后志愿者皮下注射3mg的Fragmin
(批号38609)进行处理。五天后，对志愿者再次测试其DTH对破伤风的响应，硬结抑制到约5mm。三周后(“恢复”)该志愿者再次测试DTH，试验呈阳性反应(在24小时和48小时硬结为23mm)。然后该志愿者进行如前的Fragmin
处理，7天后再测DTH反应性(“过7天”)。DTH又被抑制到约5mm的硬结。三周后发现DTH再次恢复。因此，低于5mg的LMWH剂量按5和7天间隔进行处理可以抑制人体中的DTH。
6.利用LMWH(Fragmin)和其它活性物质的实验6.1.LMWH(Fragmin)的TNF-α的抑制活性的稳定性研究Fragmin批号38609用标准盐水稀释到5μg/0.1ml的浓度。一些管形瓶内装物与等量的鱼精蛋白的硫酸盐(5μg)混合，然后管形瓶在室温下(21℃)贮存0-72小时(表Ⅺ)或在4℃贮存1-4个月(表Ⅻ)。然后按上述在活体内使用含或不含鱼精蛋白的硫酸盐的Fragmin，来抑制在BALB/c鼠中的DTH T细胞反应。对本发明的实验来说，阳性对照DTH是17.5±1.2×10-2mm(0%抑制)，完全抑制DTH是2.6±0.5×10-2mm(100%抑制)。
在20℃时LMWH的培养结果列于表Ⅺ中。表Ⅺ证实，在室温下培养72小时，LMWH失去了对依赖TNF-α、T细胞介导的DTH反应的抑制活性。反之，在室温下，肝素和LMWH仅慢慢失去其抗凝血药的活性。
表Ⅺ.Fragmin(批号38609，5μg/0.1ml)的抑制活性的稳定性，没有鱼精蛋白硫酸盐，在20℃针对DTH-反应。
编号小时DTH反应%抗-DTH反应性None 17.5±1.2 对照*0 2.6±0.5 100**249.6±1474815.7±1.6137217±0.80＊不抑制＊＊完全抑制6.2.在低温下抗-DTH反应性的损失和添加鱼精蛋白的稳定效果表Ⅻ示出了在4℃在四个月内在稀溶液中Fragmin失去了它抑制鼠T细胞DTH反应性的能力。添加相等浓度的鱼精蛋白硫酸盐并不影响DTH反应的抑制，但确实在4℃在四个月后，使这种活性完整保存下来。再者，这一结果与鱼精蛋白的正常作用相矛盾，当添加于肝素或Fragmin时，在其中鱼精蛋白硫酸盐中和了似肝素物质的抗凝血药效果。
表Ⅻ.在低温抗DTH-活性伴随时间的损失。添加鱼精蛋白的稳定效果。
Fragmin 月在鱼精蛋白 DTH(10-2mm) %抗-DTH(38609)4℃硫酸盐存在活性无无 无 15±1 对照*有 1 无 2.8±0.5 100**有1有3±0.4100有2无4±0.882有2有2.4±1100有3无9.6±0.855有3有3±0.5100有4无14.8±1.40有4有3±0.4100有0有3±0.5100＊不抑制＊＊完全抑制6.3.涂覆了ECM的板的制备涂ECM的孔的制备如下。
在屠宰后几小时内从屠宰室得到新鲜的切开的牛眼。在一防护罩中切开牛眼以除去角膜。然后用一手术刀将该角膜刺破或刮破，得到角膜的内皮细胞。这些细胞在组织培养板上用大约5ml介质培养，培养介质包括DMEM并添加10%胎牛血清、5%牛血清和抗菌素，例如1%链霉素或1%neostatin，和添加1%谷酰胺作为稳定剂。在接种大约2天后，这些细胞沉到板底，每4小时加入新鲜介质，在37℃在5%CO2增湿的培养器中培养。必要量，还可向介质加入一些纤维细胞生长因子，虽然加入FGF不是关键的。当细胞群集时(约二周后)，抽出上清液，然后细胞用1-2mls的胰蛋白酶胰蛋白化。
将80%的这些初始细胞(其余20%的初始细胞的处置在下文立即叙述)取出，并分成5份置入平底的96-孔板中。这些细胞在添加了4%葡聚糖T-40、10%胎牛清和5%牛血清的DMEM中培养。在37℃在10%CO2增湿的培养器中培育约7天后，使生成的内皮细胞群集层溶解。溶解缓冲剂包括含0.25%TritonX的PBS的0.025M NH4OH，使细胞在其中保持10分钟，然后倾析该缓冲剂。板上的内容物用PBS洗涤三次，并冷却到4℃。上述的方法使ECM完整牢固地粘附在孔的整个区域。而且生成的ECM不含核和细胞屑。涂ECM的板可在4℃贮藏至少三个月。
其余的20%初始细胞放置在一个板上，并用约5ml介质培养，该介质包括添加了10%胎牛血清、5%牛血清和如上述的抗菌素的DMEM。使细胞的这种二级植物变成群集物，并如上述用胰蛋白酶处理。将胰蛋白化的细胞再次分份，80%在5个板中在含4%葡聚糖T-40的生长介质中培养，而20%在如上述的一个板中培养。从一个板上这种80/20分份可以再进行一次。
6.4.硫酸盐化的(Sulfated)粘蛋白的降解35(S)O4标记的ECM用在1ml PBS和100μl 8.2M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(PH6.2)中的5μl MM5的肝素酶(heparanase)(4u/ml)在37℃培养48小时。收集介质，并以10000g力离心5分钟(任选)并在琼脂糖凝胶4B柱上通过凝胶过滤分析。用PBS以5ml/时的流速洗提2ml馏份，利用生物萤光闪烁流体进行放射性计数。
该35(S)O4-标记实验表明，ECM实际上是降解了，所生成的降解产物成功地释放出，而且恰当地通过琼脂糖凝胶4B柱滤出。硫酸盐化的粘蛋白降解有关的随后实验以非-标记的ECM进行，其降解产物通过它们在206或232nm处的吸收来监测。
酶的降解实验如上述，另外，通过将从琼脂糖凝胶柱上洗脱的降解粘蛋白负载于HPLC柱上而对降解产物(DECM)进一步纯化。琼脂糖凝胶柱馏分的HPLC分析是以如6.11描述的以及下述一种方式进行。降解产物的检出是通过在206nm处监测它们的吸收而实现的。
其它的酶降解实验利用PC3酶和从IBEX得到的肝素酶进行，得到了相似的结果。
6.5.人体CD4+T细胞的纯化CD4+T细胞是从如下述的健康人供血者得到的周围血的单核白细胞中获得的。单核细胞按Ficoll梯度离析，在陪氏培养皿中用含10%PCS和抗菌素的RPMT洗涤，在10%CO2增湿气氛中在37℃培养。一小时后，移出非粘性的细胞，并在10%CO2增湿气氛中在37℃在尼龙毛柱(Fenwall，IL)上培养45-60分钟。洗提非粘性细胞并洗涤。CD4+T细胞通过将洗提的细胞作用于下述单克隆抗体(mAb)的混合物进行阴性选择，这些mAb是抗-CD8、CD19和与磁球结合的CD14(Advanced Magnetics，Cambridge，MA)。回收未结合的细胞并检查它们的显型。得到的纯化过的细胞主要(＞90%)是CD3+CD4+，如FACScan分析测定的那样。
6.6.利用来自PBLS的人体CD4+T细胞生物测定TNF-α的活性。
25万个人体CD4+T细胞在7%CO2气氛下在37℃用不同浓度150μl的ECM降解产物预培养1.5小时。然后加入100μl的PHA(Wellcome Co.，England，1μg/ml)在平底96-孔板(Costar)中培养3小时。随后收集孔中的内容物(每实验组3-6孔)，离心分离，介质按前述的5.1节中描述测定TNF-α分泌。简要地讲，将培养淋巴细胞的上清液加入鼠纤维肉瘤细胞克隆(BALB/c.CL7)的培养液中。BALB/c.CL7细胞细胞在放线菌D(0.75μg/ml)存在下，对由TNF-α产生的杀伤是敏感的。Nophar，Y.等.J.Immunol.(1988)140(10)3456-3460。与添加外源TNF的滴定曲线比较，校正在试验介质中这些细胞的死亡。通过下述过程来测定细胞的变异性，即用MTT四唑鎓(Sigma，Cat.No.M2128)培养2小时，用异丙醇-HCl混合物提取细胞所吸收的染料，用Microelisa Autoreader量热法(在570nm)定量它。TNF-α分类是通过检查抗鼠科动物TNF-α mAb(稀释1/400;Genzyme，MA)的中和作用来进行的。
6.7.肝素降解在1mlPBS中的1mg肝素(Sigma)和100μl的25M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(PH6.2)用20μlMM5(5u/ml)在37℃培养48小时。然后在琼脂糖凝胶4B柱上通过凝胶过滤分析该反应产物。用PBS以5ml/小时的流速洗提2ml馏份。为对降解产物的进一步确定特征，利用ToyoSoda-GelG3000SW和G2000SW高性能液相色谱(HPLC)柱，对从琼脂糖凝胶柱洗提的波峰进行高性能液相色谱(HPLC)分离，如在6.11节和如下述的那样。
利用20μl的PC3进行其它的实验。用1mg肝素进行PC3的酶化反应，除了反应时间为24小时外，其它条件都与上述MM5相同的条件下进行。然后在琼脂糖凝胶4B柱上通过凝胶过滤分析反应产物(图29)。在活体外的生物检定结果示于下表ⅩⅨ中。
6.8.鼠中DTH响应的诱出和抑制效果的检查BALB/c鼠(每组至少5只)，用在丙酮/橄榄油中3%4-乙氧亚甲基-2-苯基噁唑酮(OX;BDHChemicals，GB)局部施用于刮过的腹部致敏。五天后诱出的DTH敏感性如下鼠用在丙酮/橄榄油中的0.5%OX激发免疫反应。在激发前当时和24小时后，用Mitutoyo工程的测微计(日本)测量鼠耳朵。测量耳朵肿胀的操作者不明确鼠的分组。为影响DTH响应，将在PBS中稀释的低分子量的免疫调节部分在预定的时间表以不同的浓度在皮下施用于处理过的鼠的背部。在处理期间和之后(＞2个月)检查处理过的鼠，临床上没有观察到大的副作用。
6.9.在筛分(Size)-排阻凝胶色谱柱上(Sepharose4B)分离LMWH(Fragmin)Fragmin(批号38609)和无活性的Fragmin在琼脂糖凝胶4B(Pharmacia)柱上通过凝胶过滤进行分馏。用PBS以5ml/小时的流速洗提出0.5ml馏分，并在206nm处监测吸收情况(在280nm处不吸收)。以馏分数对在206nm处的吸收值绘图，表示在图11。选择馏分的生物测定结果示于下面的表ⅩⅢ和ⅩⅣ。
表ⅩⅢ.全部Fragmin、Fragmin琼脂糖凝胶4B馏分和琼脂糖凝胶4B馏分的HPLC馏分对活性TNF分泌的影响，利用人体PBL生物测定。
浓度TNF活性的"R"值试验材料 (pg/ml) 生物测定(%) %×(pg/ml)-1活性部分/全体1最大抑制(90%)90惰性部分/全体a无作用0惰性部分/琼脂糖凝胶.
4B-F155最大抑制(50%)50
表XIII(续)浓度TNF活性的"R"值试验材料 (pg/ml) 生物测定(%) %×(pg/ml)-1惰性部分/琼脂糖凝胶.
4B-F10a无作用0惰性部分/琼脂糖凝胶.
4B-F81000增加最大(60%)0.06惰性部分/琼脂糖凝胶.
4B-F21000增加最大(30%)0.03部分/HPLC-F90b无作用0a浓度范围1μg/ml-0.001pg/ml.
b浓度范围1μg/ml-0.01pg/ml.
表ⅩⅣ.全体Fragmin和Fragmin的琼脂糖凝胶4B馏分对鼠的DTH敏感性的作用。
抑制剂量对DTH"R"值试验材料 (μg/gm鼠) (&gt;50%) %×(μg/gm)-1活性部分/全体0.250250惰性部分/全体0.2-0.004没作用0惰性部分/琼脂糖凝胶.
4B-F150.0045012,500惰性部分/琼脂糖凝胶.
4B-F100.2-0.004没作用06.10.涉及分离Fragmin和肝素酶降解的ECM的其它实验通过在琼脂糖凝胶4B柱上的凝胶过滤分馏Fragmin和肝素酶-降解的ECM。0.2ml的馏分用PBS以5ml/小时的流速洗提，在206nm处监测吸收情况。(在280nm处没有检测出吸收)。用馏分数对在206nm处的吸收值绘图，在图14中给出。所选择馏分的生物测定结果示于下表ⅩⅤ中。
表ⅩⅤ.DECM和Fragmin的琼脂糖凝胶4B馏分对活性TNF分泌的影响，利用人体PBL生物测定。
浓度TNF活性生物测定"R"值试验馏分 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1馏分/琼脂糖凝胶.
4B-F39100抑制最大(60%)0.6DEMC/琼脂糖凝胶.
4B-F3910,000抑制最大(85%)0.0085馏分/琼脂糖凝胶.
4B-F42a无作用0DECM/琼脂糖凝胶.
4B-F42a无作用0馏分/琼脂糖凝胶.
4B-F3210增加最大(55%)5.5DECM/琼脂糖凝胶.
4B-F4610增加最大(20%)2a在浓度为1μg/ml-0.001pg/ml。
6.11.利用高性能的液相色谱从Fragmin中分离活性物质利用两组高性能液相色谱条件进行两组实验。使用的初始柱型为30cm×7.8mm由经(I.D.)TsK-Gel
G-Oligo-PW柱和4cm×6mm(内径)保护柱。该柱用0.2M磷酸盐缓冲液，PH7.0以0.5ml/分流速洗提。收集的每个馏分的体积为0.5ml。
利用的第二种类型的HPLC是ToyoSodaTSK-GelG3000SW(7.5mm×50cm)和G2000SW(7.5mm×50cm)柱(串联)和购自于Phenomenex的7.5mm×10cm的保护柱。柱以1ml/分的速度用仔细地脱气的0.5MNaCl洗提。以每份0.5ml收集馏分。检测器置于232nm处，用0.02AUFS，而测量停留时间到±0.1秒。通过蓝色葡聚糖和叠氮化钠测量空隙体积和全部体积。收集物还在206nm处在与232nm处相同的条件下进行检测。
FragminHPLC馏分数对在206nm处的吸收值绘图，在图18A中给出。选择馏分的生物测定结果示于下表ⅩⅥ。所示结果证明某些物质能够抑制TNF-α的活性，而另一些能增加它的活性。
表ⅩⅥ.Fragmin的全部和HPLC馏分对活性TNF分泌的影响，利用人体PBL生物测定。
Fragmin浓度TNF活性的生物测定"R"值馏分 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1全部a10 最大抑制(40%) 4HPLC-F1100最大增加(60%)0.6HPLC-F310最大抑制(70%)7HPLC-F1610最大抑制(100%)10HPLC-F2210最大抑制(100%)10HPLC-F26100最大抑制(50%)0.5HPLC-F30100最大抑制(70%)0.7HPLC-F47100最大抑制(55%)0.55a让全部Fragmin样品在4℃老化90天。
6.12.利用高性能液相色谱从ECM分离活性物质按6.11节中讨论的通过高性能液相色谱进行从ECM中分离活性物质。
用ECMHPLC馏分数对在206nm处的吸收值绘图，示于图18B。选择馏分的生物测定结果示于下表ⅩⅦ。所示的结果证明从肝素酶介导的ECM的降解产物中分离出某些物质能抑制TNF-α的活性，而另一些物质能增加它的活性。结果还示出了从HPLC分离中得到的某些馏分对TNF的活性没有影响。
表ⅩⅦ.DECM的HPLC馏分对活性TNF分泌的影响，利用人体PBL生物测定。
DECM浓度TNF活性的生物测定"R"值馏分 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1HPLC-F1a没影响0HPLC-F5a没影响0HPLC-F1010抑制最大(60%)6HPLC-F1410抑制最大(70%)7HPLC-F17a没影响0HPLC-F251000增加最大(40%)0.04HPLC-F33100增加最大(40%)0.4HPLC-F3710增加最大(100%)10HPLC-F39100,000抑制最大(60%)0.0006HPLC-F42a没影响0HPLC-F461000增加最大(30%)0.03HPLC-F491000增加最大(30%)0.03HPLC-F61a没影响0a在浓度为1μg/ml-0.001pg/ml。
6.13.缩(对称)二氨基脲定量的糖类测定主要是将1500μl硼酸盐硫酸反应剂在冰浴中冷却。然后将试验溶液(250μl，含20μg糖醛酸/ml)小心地铺加在硼酸反应剂的表面上，并使其扩散10分钟。之后溶液彻底混合，置于沸水浴10分钟，然后在冰浴中冷却。将冷却的缩(对称)二氨基脲(50μl)加入混合物中，涡流搅拌(voltexed)，置于沸水浴上15分钟。冷却该溶液，并在525nm处记录吸收值。将试验结果与校正的溶液比较。
6.14.从ECM降解产物中分离二糖通过HPLC从牛角膜的内皮的已经过哺乳动物肝素酶(MM5)作用的ECM中分离二糖物质。
具体描述涂了ECM的板用20μl的哺乳动物肝素酶(0.5mg/ml)在1mlPBS缓冲液(通过用柠檬酸预先将PH调为6.2)中的混合液在37℃培养48小时。然后收集介质，并置于琼脂糖凝胶-4B柱上(35cm×0.7cm(内径))。移动相是PBS缓冲液，流速为5ml/小时。收集2.2ml馏份，在206nm处监测(图19)。琼脂糖凝胶4B馏分no.5(8.8-11ml洗提液体积)的样品(100μl)注入HPLC柱(ToyoSodaTSK-GelG3000SW(7.5mm×50cm)和G2000SW(7.5mm×50cm)，与购自Phenomenex的7.5mm×10cm的保护柱串联)。移动相是0.5MNaCl，流速1ml/分。收集1ml馏分，在206nm和232nm处监测(图20A和20B)。no1.峰(P1)物质在25ml烧瓶中冷冻干燥。样品含约20μg的在60mgNaCl中的低聚聚糖(用缩(对称)二氨基脲测定)。
样品的洗脱图形类似于从肝素(Sigma)解聚中工业上得到的二糖标准物或分子量“标记物”。
所述物质的最大抑制值，根据按相似方法得到的试样(参见，例如图21A中峰F73(洗提时间约44分钟)和进入F5/HPLC-F73在下表ⅩⅧ中)，利用人体PBLs，以浓度为约10pg/ml在一活体外TNF-α的抑制测定中估计为87%。生物测定如上述的进行。该样品利用SAX-HPLC柱可进一步提纯，如下文所述的那样。
6.15.包括SAX-HPLC色谱法从ECM降解产物中分离二糖涂了ECM的板用20μl的哺乳动物的肝素酶(0.5mg/ml)的1mlPBS缓冲液(用柠檬酸预先将PH调为6.2)在37℃培养48小时。然后收集介质，并置于琼脂糖凝胶-4B柱上(0.7×35cm)。移动相是PBS缓冲液，流速为5ml/小时。收集1.6ml的馏分并在206nm处监测(图22)。7-8号馏分合并，冷冻干燥，粉末在1/10的原始体积中再悬浮。样品(100μl)注入HPLC柱(ToyoSodaTSWK-GelG3000SW(7.5mm×50cm和G2000SW7.5×50cm，与购自Phenomenex的7.5mm×10cm的保护柱串联)，如前述。移动相是0.5MNaCl，流速1ml/分。收集1ml馏分，在206mm和232nm处监测(图23)。收集10个相同运行中标记“1”的峰。合并基本上均匀的馏分并冻干。
物料在2ml两次去离子水中再悬浮，并在Sephadex G-10柱(26×150mm)上脱盐，用两次去离子水(DD)以1.6ml/分的流速洗脱。收集一ml馏分并在232nm处监测和测量电导率(以测定NaCl含量)。合并脱盐馏分，冻干并在1ml DD H2O中再悬浮。将通过合并100μl再悬浮溶液和900μlPH为3.5的0.2MNaCl而制备的1ml样品注入分析用SAX-HPLC柱(4.6×250mm，用Spberisorb大小为5μm的颗粒装填)。流速1.5ml/分，采用如下的NaCl线性梯度程序时间/缓冲液(分)A(%)B(%)C(%)01000021000035386204038620450100047010005000100550010058100006010000A＝0.2MNaCl，pH3.5B＝1.5MNaCl，pH3.5C＝H2O在232nm处监测柱洗脱液(图24)，收集峰A23/4并测试对TNF的抑制。发现这SAX-HPLC馏分的抑制最大在浓度为0.1pg/ml时为60%，得出的“R”值为600%×(pg/ml)-1。
硫酸盐化程度不同的肝素二糖标准物在同一条件下注入SAX-HPLC柱。这些标准物的洗脱图形示于图25A-C。从这些图中可以看出，二糖标准物给出了不同的停留时间，未硫酸盐化的二糖(Sigma产品号H-0895)最快洗脱出来(图25A)，二硫酸盐化的二糖(Sigma产品号H-1020)在少于20分钟时洗脱出来(图25B)，三硫酸盐化的二糖(Sigma产品号H-9267)最后洗脱出(图25C)。三硫酸盐化的二糖标准物H-9267的停留时间与峰A23/4(即分别为23.07分对照和23.10分)所得到的非常相似。
6.16.活体外人体PBL生物测定各种物质的结果对由ECM降解得到的产物、包括图20的“P1”峰，利用人体PBLs对各种活性物质和原料“混合物”进行的活体外的生物测定结果示于表ⅩⅧ中。P1所得到的“R”值为10%×(pg/ml)-1，起始DECM“汤”所给出的“R”值为0.000053%×(pg/ml)-1。
表ⅩⅧ.ECM+MM5肝素酶(DECM“汤(Soup)”)，“汤(Soup)”的琼脂糖凝胶4B馏分和琼脂糖凝胶4B馏分的HPLC馏分对活性TNF分泌的影响，利用人体PBL生物测定。
浓度TNF活性的生物测定"R"值试验物料 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1DECM"Soup" 1×106抑制最大(53%) 5.3×106Seph.4B-F5100抑制最大(50%)0.5Seph.4B-F6100抑制最大(60%)0.6Seph.4B-F7,8100抑制最大(81%)0.8F5/HPLC-F7310抑制最大(87%)8.7F5/HPLC-F6510抑制最大(78%)7.8F5/HPLC-F2210抑制最大(33%)3.3F6/HPLC-F8610抑制最大(43%)4.3P110抑制最大(100%)10.06.17.从肝素的降解产物中分离低聚糖用与上述ECM降解的相似方式，对完整肝素用来自各种各样来源的肝素酶、本文命名这MM5和PC3(参见Shoseyov，O.等.Biochem.，Biopbys.RES.COMM.(1990)169667-672，PC3酶的制备)进行处理。在琼脂糖凝胶4B柱上(参见图26肝素+MM5琼脂糖凝胶4B馏分F7和F8，和图27肝素+PC3及只有PC3的琼脂糖凝胶4B色谱)分离出一些起始的降解混合物。其它的部分通过上述的HPLCⅡ方法进一步分离(参见图28A和28B的馏分F7/HPLC-F86、-F84和-F90)。“完整”的肝素和Fragmin也用HPLCⅡ条件进行处理，而选择的馏分进行相似的分离(从Fragmin分离出的HPLC-90示于图29)。在活体外利用人体PBLs对各种活性物质和原料“混合物”的生物测定结果示于表ⅩⅨ，包括肝素降解所得到的产物。
表ⅩⅨ.完整的肝素、肝素+MM5或PC3“汤(Soups)”和选择的琼脂糖凝胶4B及它的HPLC馏分对活性TNF分泌的影响，利用人体PBL生物测定。
浓度TNF活性的生物测定"R"值试验物料 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1完整的肝素a无作用0肝素/HPLC-F90a无作用0其它的肝素馏分F7/HPLC-F860.1抑制最大(26%)260F8/HPLC-F84a无作用0F8/HPLC-F90a无作用0肝素/PC3"Soup" 0.1-10×106无作用 0
表XIX(续)浓度TNF活性的生物测定"R"值试验物料 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1琼脂糖凝胶.
4B-F9100抑制最大(50%)0.5琼脂糖凝胶.
4B-F8100抑制最大(40%)0.4PC3onlya无作用0琼脂糖凝胶.
4B-F8a无作用0琼脂糖凝胶.
4B-F9a无作用0a在浓度为1μg/ml-0.01pg/ml6.18.用不同的物质处理的鼠在活体内的DTH反应性结果在活体内在生物测定条件下，测试各种物质，发现抑制鼠的实验DTH敏感性达不到程度取决于这些物质的纯化情况。鼠用上述5.1和5.2节的活性物质处理。通常，这些物质通过高压液相色谱纯化到基本上同质，“R”值为数万。一组实验结果示于表ⅩⅩ。
表ⅩⅩ.每周用各种物质处理鼠，和这些物质对鼠的DTH敏感性的影响DTH抑制剂量响应对DTH"R"值试验物料 (μg/gm鼠) (10-2mm) (%) %×(pg/ml)-1无-17.2±20-(-)对照2--0.5MNaCl-16.5±1.55-完整肝素a-无作用0Fragmin批号386090.23±185425DECMMM5"汤"a-无作用-Seph.4B-F60.032016.5±55-0.01616±210-0.003214±220-0.00067.1±165(最大)110,000
表XX(续)DTH抑制剂量响应对DTH"R"值试验物料 (μg/gm鼠) (10-2mm) (%) %×(pg/ml)-1F6/HPLC-F90.03211±240-0.0117±20-0.0026±0.570-0.00066±1.270(最大)120,000F6/HPLC-F110.0217±30-0.0113±125-0.0019.5±2.555-0.00062.8±0.590(最大)150,000F6/HPLC-F120.0218±20-0.0115±215-0.0018.2±1.560-0.00064±180(最大)130,000a在剂量范围为0.04-0.0004μg/gm鼠。
如表ⅩⅩ所指出的，完整肝素和起始的ECM+MM5“汤(Soup)”在活体内没有抑制效果。在后一种情况下，极可能是由于抑制和增加的因素互相抵销而导致无作用。与前期的实验结果相比(参见第一入口，表Ⅸ)，Fragmin(批号38609)的新鲜样品呈现适宜的“R”值。与在HPLCⅡ条件下得到的相应馏分比较，琼脂糖凝胶4B馏分表现一稍低的“R”值。
另一系列实验结果列于表ⅩⅪ中，证实了原始的ECM+MM5“汤Soup”没有任何影响。值得注意地是，HPLC Ⅱ的馏分no.F5/HPLC-L22当皮下注射入鼠体内时(“R”值＝454545%×(μg/gm)-1显示出了很高的专门调节活性，在以高剂量(“R”)值+5000%×(μg/gm)-1)时，也证实有口服活性albeit。在表ⅩⅪ中还表示出从ECM分离出的活性物质在活体内的专门调节活性大于从Fragmin得到的那些物质的。因此，明显的脱硫酸盐作用降低了本发明活性物质的专门抑制活性。实际上，在活体内的生物测定条件下，从这些脱硫酸盐的二糖中得到了增大的“R”值。
其它的实验也证实半乳糖胺、单糖或没有硫酸盐基的普通的糖都能够用作本发明硫酸盐化的低聚糖的抑制活性的拮抗药。因此，脱硫酸盐化的低聚糖可直接用作增大组分或用作羧酸盐化的和/或硫酸盐化的低聚糖的专门抑制活性的拮抗药。本研究者的观察结果还与某些物质(例如三硫酸盐化的二糖)做为到目前为止仍未鉴别出的活性TNF-α分泌的天然抑制剂的拮抗剂的机理一致。
表ⅩⅪ.用各种物质皮下处理的鼠的活体内的DTH反应性数据DTH抑制剂量响应最大"R"值试验材料 (μg/gm鼠) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1ECM+MM5a20.4±0.7Noaffact0"Soup"F5/HPLC-L22 0.008b13.2±1.3 40±12% 5,000F5/HPLC-L220.0001329.7±1.360±17%454,545FRAGMINFR/HPLC-20.000488.5±1.370±20%145,833a剂量范围为0.04-0.0004μg/gm鼠。
b口服。
阳性对照组的DTH响应为20.0±1.1而阴性对照组的DTH响应为2.0±1.0。
6.19.在活体内SAX-HPLC馏分与已知二糖标记物的活性比较在活体内的条件下，测试二糖标记物，以确定它们对鼠的有关的DTH反应性的抑制能力。如表ⅩⅫ所示，当将标记物皮下注射入鼠体内时，两种标记物(H-1020和H-9267)显示出了适度的活性，“R”值为140000-160000%×(μg/gm)-1之间。标记物H-1020再口服测试，还发现有最中等的活性(“R”值＝531%×(μg/gm)-1)。H-1020标记物是一种O，N-二-硫酸盐，而H-9267标记物是一种O，O′，N-三-硫酸盐。它们的结构描述如下。
如表ⅩⅫ中所示的，得到的SAX-HPLC馏分L22/SAX-A23/4(图24)对F5/HPLC-L22的已经较高的专门调节活性提供了进一步的改进，与F5/HPLC-L22(表ⅩⅪ)的“R”值454545%×(μg/gm)-1相比，它给出的“R”值为630303%×(μg/gm)-1。但是发现，通过SAX-HPLC柱的停留时间与H-9267的停留时间几乎相同的这种二糖物质，在室温下PH3.5的条件下在数天内失去了它的硫酸盐基团。因此，对通过SAX-HPLC柱的老化样品的再分析就揭示出了在23.10分钟时原来峰为三个主峰所代替，命名为2039/1、2039/2和2039/3(图30)，它们的停留时间都比A23/4短。与H-1020标记物有相似停留时间的峰2039/3极可能已失去了一个N-硫酸盐基团。峰2039/1和2039/2看起来对应于单硫酸盐化的或完全脱硫酸盐化的二糖。(它们的停留时间与二糖标记物、H-0895、没有硫酸盐基团的N-乙酰氨基葡糖胺基聚糖(N-acetylglycosaminoglycan)相当。
各个收集这些“脱硫酸盐化”的物质，并在活体内DTH生物测定条件下进行测试，令人惊奇地发现只具有中等抑制活性或无抑制活性。(参见表ⅩⅫ)。的确，在活体外人体PBL测定条件下，所有三个峰表示出活性TNF-α分泌的增加。在活体外的这些结果示于下表SAX-HPLC浓度增加最大"R"值峰 (pg/ml) (%) %×(pg/ml)-120391/11552039/2135352039/314242
表ⅩⅫ.利用在皮下施用的不同的二糖，在活体内的其它试验结果DTH抑制剂量响应最大"R"值试验材料 (μg/gm鼠) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1PBS-18.6±0.7--(阳性.对照)未经处理-1.4±0.2--(阴性.对照)SAX-HPLC馏分A23/40.0001323±183680,3032039/30.00053.1±1.183166,0002039/10.00013218.5±1.1没作用0"标记物"H-10200.00054.7±0.773146,000H-1020 0.128a5.9±0.9 68 531H-92670.00053.5±180150,000a口服施用
6.19.1.选择的二糖对调节活体内活性TNF-α产生的能力的其它实验结果。
进行其它的试验，其中选择二糖的分子从SigmaChemicalCo购得并在这里由它们各自的Sigma目录号来识别，测试它们对在鼠体内的试验DTH反应抑制或增加的能力，并由此提供它们调节由这些哺乳动物产生活性TNF-α能力的标度。
具体讲，CD1鼠(购自WeizmannInstituteAnimalBreedingCenter，Rehovot，Israel)，每组4-12只，按5.2或6.8节的描述进行处理。
各种试验结果汇总于下表ⅩⅩⅢA。从表中可以看出，所测试的11种二糖中的四种响应施用的噁唑酮，对鼠的耳朵肿胀显示出了抑制效果。T细胞-介导的炎症的响应的抑制因而被看被是一种标志，即标志显示非零“R”值的二糖，可以向下调节活性TNF-α的产生。从表中所列出的结果知，“R”值的范围是从较适中的65000%×(μg/gm)-1到约1500000%×(μg/gm)-1内。还应指出，高“R”值对感兴趣活性化合物不是必须的特征。具体说，在其范围内具体化合物显示生理效果的剂量“窗”应该是尽可能的宽，使得所施用的剂量落在有效剂量之外的可能性减小。如表ⅩⅩⅢA的脚注中表明的，分子H-9392在测试的化合物中有最宽的剂量窗，为0.000132-0.004μg/gm。
实验结果同等地证明所测试的11种二糖中的一种对增大由实验DTHT细胞反应产生的肿胀有令人惊奇的能力。化合物H-0895没有硫酸盐基团，它在约1.2μg的二糖/gm鼠的很低的剂量下对肿胀程度显示出了巨大的影响。产生的“R”值约7670000%×(μg/gm)-1在目前是无可比拟的。
表ⅩⅩⅢA.在活体内利用皮下施用的各种二糖标记物的其它试验结果。
剂量 DTH 抑制max"R"值试验材料 (μg/gm) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1H-9392a0.0012 4.2±0.7 78 6.5×104(17.8±0.9)H-1020b0.0004 6.7±1.1 66 1.65×105(19.6±1.2)H-9267c0.0004 7.2±1 64 1.60×109(19.6±1.2)H-9517d0.00004 7.6±1 62 1.55×106(20.4±0.7)H-0895e0.0000012 37.3±0.7 +92 7.67×107(18.9±0.7)H-9017fN.E. 0H-8642gN.E. 0H-9142hN.E. 0
表XXIIIA(续)剂量 DTH 抑制max"R"值试验材料 (μg/gm) (10-2mm) (%) %×(μg/gm)-1H-8767iN.E. 0H-8892jN.E. 0H-1145kN.E. 0aH-9392是2-O-硫酸盐基-4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸盐葡糖胺。这一数据系列的PBS(阳性对照)值在圆括号内给。未经处理的(未免疫的)鼠的肿胀为2.0±0.5mm。对上述的所有计算都利用这一值。抑制≥50%对照的有效剂量为0.000132-0.004μg/gm。
bH-1020是4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸盐基-6-O-硫酸盐葡糖胺。抑制≥50%对照的有效剂量范围为0.00004-0.0004μg/gm。在该表中示出的“R”值与在表ⅩⅩⅢ中先前给出的“R”值相比是有益的。这些结果表明不同组的CD1种鼠活体内测试方法有相当好的再现性。
cH-9267是2-O-硫酸盐基-4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸盐基-6-O-硫酸盐葡糖胺。抑制≥50%对照的有效剂量范围是窄小的。
dH-9517是2-O-硫酸盐基-4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰基-6-O-硫酸盐葡糖胺。抑制≥50%对照的有效剂量范围为0.00004-0.00012μg/gm。
eH-0895是4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰基葡糖胺。该结果表明DTH反应的增加。增加≥50%对照的有效剂量范围为0.000001-0.00004μg/gm。
fH-9017是4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-6-O-硫酸盐葡糖胺。“N.E.”表明在试验剂量范围为0.000004-4μg/gm鼠时，没有观察到有影响。
gH-8642是4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰基-6-O-硫酸盐葡糖胺。
hH-9142是2-O-硫酸盐基-4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧葡糖胺。
fH-8767是2-O-硫酸盐基-4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰基葡糖胺。
jH-8892是2-O-硫酸盐基-4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-6-O-硫酸盐葡糖胺。
kH-1145是4-脱氧-4-烯-艾杜糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-N-硫酸盐葡糖胺。
四种抑制性二糖化合物H-9392、H-9517、H-1020和H-9267的结构表示如下抑制化合物
在所测试的11种二糖中，有六种未能显示出任何一致的作用，因此，它们可以归为“中性”类。这些中性化合物的结构如下所示。
中性化合物
在11种二糖中，有一种二糖扩大了试验DTH反应的影响。这种化合物H-0895有如下所示的结构。
因此，能够提出表征抑制化合物的结构特征的通式。这种通式(H-GENUS)如下所示。
其中，X1是H或SO3-;X2是H或SO3-;和X3是SO3-或COCH3，条件是如果X3是SO3-，那么X1或X2至少之一是SO3-且如果X3是COCH3，那么X1和X2都是SO3-。对于有相当宽的有效剂量窗口的化合物来说，X1是优选SO3-，X2优选H，和X3优选SO3-(即H-9392有最宽的有效抑制剂量窗口)。
人们从上述的结果中可观察到，对于抑制作用来说，葡糖胺氮的优选的取代基是硫酸盐基团。硫酸盐基在葡糖胺(X3)的2-N位，而刚好另一个硫酸盐基或在艾杜糖醛酸基的的2-位或葡糖胺的6-位时观察到了抑制活性。在羟基的两个位置都存在硫酸盐基也有抑制活性，但是缺少任一个其它的硫酸盐基(如在H-1145中)就产生“中性”化合物。
做为对比，在葡糖胺的2-N位引入乙酰基要求存在二个其它的硫酸盐基，分别在艾杜糖醛酸(X1)的2-位和葡糖胺(X2)的6-位。在葡糖胺的2-N位缺少任何取代基，产生带正电荷的铵基，实际上消除了抑制效果，这可由所有测试的化合物H-9017、H-8892和H-9142都是“中性的”的事实来证明。在艾杜糖醛酸的2-位或在葡糖胺的6-位有一个或二个硫酸盐基没有明显的作用。
最后，在X3中有乙酰基与在X1和X2中都没有硫酸盐基相组合，导致调节活性的增加(H-0895)。
人们应当注意，在二糖中存在负电荷与它的抑制TNF-α产生的能力之间高度一致。带正电荷的铵取代基的存在导致“中性”，而电中性的化合物H-0895增加了活性TNF-α的产生。
表ⅩⅩⅢB.从活体内涉及商购二糖的DTH研究结果发现的经验规律。
在H-GENUS中的Xn的同一性观察的X3X2X1活性SO3-SO3-SO3-抑制SO3-SO3-H 抑制SO3-H SO3-抑制SO3-H H 中性COCH3SO3-SO3-抑制COCH3SO3-H 中性COCH3H SO3-中性COCH3H H 扩大剂H2+SO3-SO3-中性H2+SO3-H 中性H2+H SO3-中性6.19.2.选择的单糖对活体内产生活性TNF-α的调节能力的结果在进行的其它实验中，选择的单糖是从Sigma购得，测试它对活体内产生TNF-α的调节能力。利用与前节中所述的基本上相同的方法，每组6只CD1鼠用各种对照和试验物质接种并处理，以测定皮下注射物质对试验动物的实验DTH反应的任何效果。这些实验结果示于下表中。
表ⅩⅩⅢC.在活体内利用皮下施用的各种单糖的其它试验结果试验物料剂量 DTH 抑制max"R"值(μg/gm)-1(μg/gm) (10-2mm) (%) %XGlcNa0.000012 5±0.7 75 6.25×106(19.7±1.2)0.4 2.3±0.9 88 2.2×102(19.7±1.2)GlcN-2SbN.E 0GlcN-3ScN.E. 0GlcN-6SdN.E. 0GlcN-2,3Se0.0012 6.3±1 68 5.67×104(19.7±1.2)
表XXIIIC(续)试验物料剂量 DTH 抑制max"R"值(μg/gm)-1(μg/gm) (10-2mm) (%) %XGlcN-2,6Sf1.2 7.7±1 61 5.08×10(19.7±1.2)NAc-GlcNgN.E 0GalNh0.00004 8.9±0.6 50 1.25×106(18.9±0.7)0.12 6.5±0.7 67 5.58×102(18.9±0.7)aGlcN是葡糖胺或2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。抑制≥50%对照发现有两种有效剂量范围0.000004-0.00004μg/gm和0.004-4μg/gm。
bGlcN-2S是D-葡糖胺或-2-N-硫酸盐。“N.E.”表明在测试的剂量范围内0.000004-4μg/gm鼠，没有观察到任何效果。
cGlcN-3S是D-葡糖胺或-3-硫酸盐。
dGlcN-6S是D-葡糖胺或-6-硫酸盐。
eGlcN-2，3S是D-葡糖胺或-2，3-二硫酸盐，抑制≥50%对照的有效剂量范围是窄小的。
fGlcN-2，6S是D-葡糖胺或-2，6-二硫酸盐，抑制≥50%对照的有效剂量范围是窄小的。
gNAC-GlcN是乙酰基葡糖胺。
hGalN是D-半乳糖胺。抑制≥50%对照的两个有效的剂量范围是0.00004-0.00012μg/gm和0.04-4μg/gm。
在单糖的4-位的羟基的立体化学决定糖是葡糖胺(α-面)还是半乳糖胺(β-面)，如下所示。
因此看起来，在单糖中N-乙酰化或有一个硫酸盐基要影响葡糖胺抑制鼠体中的DTH反应的能力。
6.19.3.用选择的单糖和二糖治疗大鼠的辅药关节炎(AA)AA是在6-8周龄如在5.7节中描述的雌性Lewis大鼠中诱导产生的。每组5-10只大鼠的实验组在诱导实验关节炎前一天通过皮下注射试验物质来处理，此后每周进行重复处理。效果(如果有)如在5.7节中描述的那样评分。
在三个试验的二糖中，H-9392表明相对于仅接收盐水(0.1ml)的对照组的大鼠来说，对于降低AA记分方面有最明显的效果。如图38所示的，H-9392，以120ng/大鼠或0.6ng/gm大鼠施用，在诱导24天后，AA破坏性的炎症几乎完全(高达约90%)被抑制了，在24天后，相对于对照组H-1020对AA发展的抑制为约30%。反之，扩展剂H-0895，在以两种剂量值0.1和0.4ng/大鼠诱导的约两周内，显示增加了AA的发展。但是这种效果此后快速消退直至到24天，AA的记分与对照组的值基本上没有差别。(参见图38A)。
另一方面，还发现某些单糖在这种大鼠模式中显示出了活体内的抑制效果。如图38B所示，以三种剂量值进行的葡糖胺处理对AA的发展的抑制达对照值的约60-80%。半乳糖胺也显示出了抑制效果，但是比葡糖胺的抑制程度小得多。(参见图38C)。
最有意义的是，用H-9392进行的其它的试验，其中二糖从0天开始(AA诱导开始)或从第12天开始(大鼠已患AA)每周或每天施用，在所有情况下，对AA的严重程度显示出阳性抑制。这些实验结果示于图38D(每周)和38E(每天)。如图38D所示，从第12天开始每周施用H-9392的结果，即甚至在大鼠已经患有AA后，与对照组相比至少与从开始诱导(0天)即进行每周处理同样有效。图38E表明虽然对患鼠的每日处理不象在诱导开始即进行每日处理那样有效，但是与对照组相比对已患有关节炎的大鼠的每日处理对于降低AA记分仍然高度有效。
这些结果戏剧性地表明本发明的物质不仅在防止严重关节炎的发展方面有效，而且在治疗已患关节炎方面也有效。此外，本发明的研究工作还证实了虽然前述的LMWHs仅在每周施用时显示出了抑制特性，但是本发明的二糖物质当每周或每日施用时，都能够显示出有用的抑制活性。
做为对本发明化合物在治疗实验-诱导AA方面的优越性的进一步说明，进行独立的对比系列实验，其中Lewis大鼠组(每组5只)用地塞米松磷酸盐(购自Sigma，已知的消炎药)或二糖9392皮下注射治疗。在辅药关节炎(AA)病诱导后12天开始治疗，由二个疗程组成第一疗程包括每日注射已知的消炎药;第二个疗程包括每周注射已知的消炎药或二糖。在所有情况下，用在0.1ml磷酸盐缓冲溶液中的100μg已知消炎药给每只大鼠施用，而也在0.1ml磷酸盐缓冲溶液中的120ng二糖也给每只大鼠施用。对照组的大鼠仅注射0.1ml的磷酸盐缓冲溶液。对已知消炎药的每日剂量疗程，在诱导后17天结束治疗，对已知消炎药或二糖的每周剂量疗程，在诱导后26天结束治疗。
上述实验的结果示于图38F和38G。检查图38F时，人们看到在第一周治疗期间，每周施用二糖9392比每日施用米地塞松磷酸盐要好。但是值得注意的是，在治疗结束后(在26天后)，每日接受米地塞松磷酸盐的大鼠组开始复发，而二糖组继续改进。在AA的诱导后30天，二糖组远比米地塞松磷酸盐组要好。
而且，比较每周米地塞松磷酸盐与每周二糖9392的效果，如图38G所示，人们看到在AA诱导后30天，每周施用米地塞松磷酸盐在AA记分的严重程度上仅适度降低。反之，在AA诱导后30天，每周施用二糖9392对实验诱导的辅药性关节炎导致几乎完全抑制。再者，应特别注意的是，在用米地塞松磷酸盐的每周治疗结束后，大鼠的辅药关节炎又复发。然而如前面所指出的，用二糖9392治疗的大鼠既使在二糖的施用停止后，仍继续改进。
因此，每周施用二糖9392的效果优越于在长期限内每日或每周施用米地塞松磷酸盐。而每日或每周施用米地塞松磷酸盐的大鼠在治疗结束后，疾病复发，用二糖治疗的大鼠继续显示改进AA的记分，反映出在治疗后对疾病的继续抑制。
6.19.4.有关多脂糖(LPS)-诱导的大鼠角膜炎的实验结果。
LPS-诱导的角膜炎是依赖于TNF的，如Vanderhagen，C.和其同事(在Netherlands)的研究工作所表明的“KineticsofIntraocularTNF和IL-6inEndotoxin-InducedUveitisintheRat”，提出出版。利用30-标准(gauge)针头将LPS(5ng)注射入Lewis大鼠的角膜。一天后，每组2只(或每组四只眼)的独立组的大鼠皮下注射磷酸盐缓冲盐水(0.05ml)或H-1020(以50ng/鼠或200ng/鼠剂量)。结果(如果有的话)按如下评分水肿0-3分新血管形成0-3分充血1/0分肿胀1/0分出血1/0分瞳孔缩小1/0分Synaechi1/0分(虹膜粘附到晶状体或角膜上)眼前房积脓1/0(在前腔的脓和血)模糊的角膜1/0分其中将分的总数用作总记分。
从(图39)图示的结果可以看出，与对照组比较，50ng/大鼠剂量可有效地抑制局部LPS-诱导的炎症作用。令人感兴趣的是，200ng/大鼠的剂量未能提供有意义的效果。
6.19.5有关多脂糖(LPS)-诱导的大鼠的眼色素炎的实验结果。
眼色素炎是响应系统施用的LPS的眼前腔炎症。像在局部施用LPS的前节中产生的炎症那样，眼色素炎是依赖于-TNF的。在本实验中，Lewis大鼠，8-10周龄，每组8只眼，在第一天用H-9392(剂量为32ng/大鼠或500ng/大鼠)或盐水(0.1ml)处理。在第二天，在每个脚垫注射2mg/ml的LPS溶液(50μl);每只大鼠接收的总剂量为200μgLPS。在第三天，每只眼上开口，测量蛋白质的总浓度，做为对炎症程度的定量评价。这些实验结果表示如下大鼠治疗中值蛋白质(mg/ml)无LPS-0.36LPS盐水18.4LPS32ngH-93925.2LPS500ngH-93924.8因此，以其中的任一剂量单一的施用H-9392可有效地抑制由系统施用LPS在鼠中产生的炎症，相对对照组抑制为约70%。
6.19.6.选择物质的有关辐射防护效果的实验结果。
雌BALB/c鼠组，8周龄，每组5-10只，在照射前一天，皮下注射盐水(0.1ml，对照)、H-9392(30ng/鼠)，或葡糖胺(10000ng/鼠)，以后每周注射，直到在第30天时，实验结束。所有实验鼠利用60Coγ放射源照射700拉德的剂量。
然后在30天内期间，记下不同鼠组内的死亡率。结果表明仅接收盐水的鼠到30天时，死亡率为100%，而已经用H-9392预处理的鼠，在同期内死亡率仅为40%。已用葡糖胺注射的鼠组也远远好于对照组，在同期内的死亡率仅为20%。
因此，用本发明的试验物质进行预处理，能使得预处理的鼠在经过照射历程后生存下来，而该照射历程一般对不用本发明试验物质预处理的鼠组在30天内导致100%的死亡率。
在独立的实验组中，BALB/c鼠组(一组5只)也经受750拉德的γ-射线的照射，不同之处只是这些鼠在照射前一天，在照射后的第6天和在照射后的第13天再一次用试验物质(盐水0.1ml/鼠、H-93920.3、3、30和300ng/鼠和葡糖胺1、10和100μg/鼠)处理。在第三次即最后施用后全部治疗结束。该实验结果示于图39X(盐水和葡糖胺)和图39Y(盐水和H-9392)，并表明在照射后的第22天，对照组的所有动物都死亡，但是在30ngH-9392组中至照射后第30天仅有一只鼠死亡。300ngH-9392和1μg葡糖胺治疗历程表明对抑制在照射后的死亡率有适度的活性。
因此这些结果表明在癌症治疗方面感兴趣的物质的可利用性，其中与照射处理相联系的毒性通过预施用本发明的化合物可被惊人地减少。这种方法也许可能允许提高照射剂量以达更高的有效值而不出现毒性付作用。如上述试验所述的，本发明的化合物既使当处理限于三次施用二糖时，在某些很低的剂量下，仍然高度有效。
6.19.7.选择物质抑制同种[异体]移植物排异的能力。
在鼠皮肤移植排异实验中测试H-9392的作用。具体说，按照Baharav，E.等的方法，J.Immunol.Methods(1986)90143-144将C57BL/6供者鼠(H-2b)的皮肤移植施加于受者BALB/c鼠(H-2d)上。通过移植物的脱落测量出现排异的天数。对对照组(仅用0.1ml盐水注射)也测定出现排异的天数，在移植前一天和移植后每周实验组通过皮下注射接收3ng或300ng的H-9392。结果图示地示于图40和40A，可见3ng/鼠剂量将出现皮肤移植排异50%的值的时间推迟了5天。但是，相同的化合物，以300ng/鼠施用，相对于对照组在50%排异时未能产生有意义的差别。这些结果是很有意义的，完全地异体皮肤移植的排异被认为是已知的最有力地免疫响应。
6.19.8.选择物质对NOD鼠中IDDM发育的抑制能力。
众所周知，NOD鼠用作人类糖尿病Ⅰ型的贴切的模型。的确，在我们鼠群中所有的雌性NOD鼠中，在4-5月龄期，都自发地得了糖尿病。由于Ⅰ型的糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病毒(mellitus)(IDDM)被认为是一种可由自动反应的T细胞沉淀的自免疫疾病，因此对本发明的选择化合物测试调节这种T细胞-介导的自免疫反应的能力。
这样，雌性的NOD鼠组，一组6-10只，用盐水(0.1ml)、H-9392(30ng/鼠)或葡糖胺(10000ng/鼠)皮下注射处理。所有的鼠都是约3.5月龄，如图41所示，表明一个组的鼠已经持续了20%的IDDM发病率。通过鼠的血液中的葡糖值可以监测IDDM发病率。非糖尿病鼠显示出血液中的平均葡萄糖值为140±10mg/ml。如果一只鼠的血液中的葡萄糖值等于或超过200mg/ml(即是大于“正常”值的标准偏差的约三倍)的话，那么该鼠被认为是得了糖尿病。为了更简便，利用ClnstixTM测试片(Ames)测量葡萄糖尿值。这个试验提供的记分为0-+3，在两个独立时间其记分为+2或更大就认为是是糖尿病的阳性象征。
这样人们惊奇地发现，H-9392和葡糖胺对在NOD鼠中糖尿的出现有抑制作用，在4.5月龄时，当所有对照组的鼠被认为患了糖尿病时，葡糖胺处理的鼠的仅约65%开始患糖尿病，而在H-9392处理的鼠中受这种病影响的少于50%。
换言之，图41A表明到5月龄，所有对照组的鼠由于患糖尿病都死了。反之，在同一期间内，用10000ng的葡糖胺处理的鼠仅约一半死亡。相当惊人的是，在相同的时间内，用30ngH-9392处理的鼠无一只死亡，即H-9392的结果图形与X-轴重合。
6.19.9.选择的二糖对内皮细胞(EC)产生的由TNF-α-诱导的粘性分子ICAM-1和ELAM-1的表达的影响粘性分子如ICAM-1和ELAM-1在涉及炎症响应的白细胞的识别和随后的“滚动”(即粘附到内皮上和通过内皮的迁移)是关键的。在响应活性TNF-α中，内皮细胞(EC)表达ICAM-1和ELAM-1。这样，通过上调白细胞粘附和迁移的信号TNF-α就可以扩大炎症。为测定本发明的二糖物质对TNF-α-诱导的EC对ICAM-1和ELAM-1的表达的影响，进行如下的实验。
新鲜分离的人体脐静脉EC在含10%FCS、8%人体血清、抗生素和50μg/ml内皮细胞生长因子(EC-GM;Sigma，St.Louis，MO)的M-199(Gibco实验室)中生长。通过将0.1ml EC-GM介质(3.5×105细胞/ml)加到平底96-孔板中(NunK RosKilde，DenmarK)来种植EC。
汇集的单层培养物进行洗涤并用各种浓度选择的二糖化合物在50μl的M-199中在37℃下培养一小时。然后洗去该化合物，培养物在预制的在EC-GM中的TNF-α200IU/ml培养过夜。细胞在37℃用含1%FCS(HanK's1%)HanK's溶液洗涤三次，用在PBS中的2%的戊二醛固定。所述细胞然后用1%的HanK's洗涤三次，用在PBS中的2.5%BSA封闭，再用1%的HanK's洗涤二次。抗-ICAM-1和ELAM-1mAb(Genzyme，CambridgeMA;在PBS中稀释1/1000)与细胞在22℃培养一小时，然后用1%的HanK's彻底洗涤三次。过氧化酶-结合的山羊抗-鼠Ab(Sigma，稀释1/1000)与细胞培养一小时，随后洗掉。在加入通过将OPD氢氯化物片溶于水(OPD是用于过氧化酶的一种作用物，可从Sigma，Cat.No.P9187得到)来制备的O-亚苯基二胺(OPD)，在ELISA阅读器中在492nm处检测吸收率。样品分三份测定，对至少三次不同的测定计算平均值。
表ⅩⅩⅢD.二糖对由响应预制TNF-α的内皮细胞对粘性分子的表达的影响。
EC的TNF-α抑制化合物重组的人体TNF-α诱导的的处理 [pg/ml] 粘性分子(O.D 492)*:
无无0.12±0.010.18±0.01有无1.2±0.12.2±0.2有9392[50]0.6±0.11.0±0.04有9392[100]0.9±0.071.4±0.03有1020[50]0.7±0.051.2±0.1有1020[100]0.9±0.031.5±0.07＊ELAM-1和ICAM-1的表达是通过专门的单克隆抗体的ELISA粘接来检定。
上述的实验证实EC用二糖化合物9392及1020预处理赋予了EC显著的耐预制TNF-α的能力。由TNF-α诱导的粘性分子的EC表达的上调被抑制达50%。这些结果意味着本发明的化合物可以影响TNF-α(例如EC)的靶细胞、以及产生TNF-α(例如T细胞、巨噬细胞)的细胞，不仅抑制活性TNF-α的产生，而且也抑制响应TNF-α(即细胞分裂素周边接收的调节)的靶细胞的倾向。因此，某些病理通过施用本发明的物质会产生有利影响，即赋予TNF-α的靶细胞一种对抗该细胞诱导的炎症响应能力，所述的响应是由活性T-细胞和原噬细胞诱发的。
6.19.10.H-9392物质对抑制大鼠中实验过敏性气喘的病症的能力实验过敏性支气管气喘是鼠的一种直接型的过敏性反应，该鼠已经过免疫然后通过吸入一种刺激性抗原的气溶胶化溶液来再激发。(Edelman，等.，Am，Rev.Resp.Dis.(1988)1371033-37)。这种实验疾病的病因学和病理学非常相似于自然出现的人体对应物。
为了评价H9392物质对阻止支气管气喘攻击的能力，6只雄性的BrownNorway大鼠通过皮下注射1mg OVA与200mg AlOH/ml的0.9%盐水悬浮液用卵白蛋白(OVA)刺激，并在当天在腹膜内注射含6×166加热杀死的Bordetella百日咳菌(Pasteur Merieux，S.V.)的1ml溶液。后续激发为吸入在Devilbiss Nebulizer中的以6L/分的空气流操作的气溶胶化OVA(1mg/ml溶液)5分钟。呼吸窘迫的响应(RD)记分为0级，没有窘迫的病症;一级，呼吸急促;二级，中度呼吸困难;三级，严重呼吸困难，张开咀;四级，意识丧失和肌肉紧张。初次免疫后第十六天，所有动物经受起始的气溶胶化剂的激发以建立阳性对照。将动物编号，使得观察者不熟悉受试动物的历史。所有的大鼠对OVA敏感，在所有动物中都均匀地诱发出气喘。
在30天时，动物分成两组，给予盐水(对照组A)或30ngH-9392物质，S.C.，(组B)，如上述在35天激发。结果示于图42。如图42所示，在30天时仅接受盐水的动物产生3或4级呼吸窘迫。用H-9392物质处理的动物仅表现为呼吸急促。结果表明，施用H-9392物质(在第二次激发前5天)于已建立了过敏感性的动物，阻塞了气喘的攻击。
6.20.对市售衍生于肝素的低原糖的活体外的人体PBL生物测定结果对衍生于肝素的二糖和多糖的分子量为1800-18000的商购样品测试生物活性。结果示于表ⅩⅩⅢ。如所得数据证明的，所有的测试样品，除一个外，均为无作用或无规律性的影响。如表的脚注中说明的，如果对所有三次生物测定试验没有得到相同的定量结果，那么对该入口的实验结果就标明为无规律性。(在本文表示生物测定结果的所有表中的每个入口，都是至少三次试验的结果。在人体PBL生物测定中，每次试验所使用的血是从不同的个体抽取的。)表ⅩⅩⅢ.商购的肝素二糖对活性TNF分泌的影响，利用人体PBL生物测定。
浓度TNF活性生物测定"R"值试验材料a(pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1H 9517 b 无规律性c-H8642b无规律性-H8767b无规律性-H0895b无规律性-H8892b无作用0H9017b无作用0H9142b无规律性-
表XXIII(续)浓度TNF活性生物测定"R"值试验材料a(pg/ml) (%) %×(pg/ml)-1H9267b无规律性-H1020l25%至35%25至35H9392b无规律性-MW 1,800de 无规律性 -MW2,400e无规律性-MW3,000e无规律性-MW3,600e无规律性-MW4,200e无规律性-MW4,800e无规律性-MW5,400e无作用0MW6,000e无作用0MW9,000e无作用0MW16,000e无规律性-MW18,000e无规律性-a见于SigmaChemicalCo.ProductCatalog(1992)的产品号。
b在1μg/ml-0.01pg/ml浓度范围。
c利用从三个独立的个体得到的PBLs对每种试验材料进行三次生物测定。对某一试验材料的试验结果标明“无规律性”，如果所有三次生物测定没有得到相同结果(即抑制、扩大或没作用)。
d各种肝素低聚糖部分的分子量的表示，如在SerbioProductCatalog(1991，12，26)。
e在浓度为1μg/ml-0.01pg/ml范围。
6.21.在活体外人体PBL生物测定相对根据mAb的kit测定的结果将在活体外按照本文描述的人体PBLs生物测定所得活性数据与基于通用单克隆抗体的kit测试结果相比较表明，在被测试的介质的蛋白质比通过人体生物测定的“活性”TNF要多得多。结果示于表ⅩⅩⅣ。例如，在“对照”量(约274pg/ml)中的T细胞产生的蛋白质量和当FragminHPLC-F16存在(约200Pg/ml)时，T细胞产生的蛋白质的量间的差别不象对同样的样品(活性约100%的改变)在通过人体PBL测定的活性检定中那样存在有戏剧性的差别。因此，人们从这些结果就得出结论，虽然活化免疫效应基因细胞可分泌显著量的TNF蛋白质，但是甚至在有本发明的活性物质存在的条件下，仅少量比率分泌的蛋白质对杀死TNF-敏感细胞是有足够活性的。这一结论支持了产生的TNF有活性和无活性两种形态的想法。
表ⅩⅩⅣ.通过人体生物测定检定的TNF活性对通过mAb免疫测定工具检定的蛋白质量的比较。
TNF活性的mAbkit测定生物测定TNF试验材料(%杀死)(pg/ml)无45control273.9对照FragminHPLC-F1 72 增加max(60%) 284.5 增加max(3.8%)HPLC-F3 13.5 抑制max(70%) 224 抑制max(17.9%)HPLC-F16 0 抑制max(100%) 199 抑制max(27%)DECMHPLC-F10 18 抑制max(60%) 225 抑制max(17.5%)HPLC-F14 13.5 抑制max(70%) 232 抑制max(15%)HPLC-F25 63 增加max(40%) 292 增加max(6.5%)HPLC-F37 90 增加max301 增加max(10%)6.22.衍生于ECM的二糖的结构特征的初步研究结果如上所述，在HPLC Ⅱ色谱法提纯(图23)和脱盐后，得到ECM衍生的二糖的20μg样品。在SAX-HPLC条件下进行后续纯化后证实该样品的纯度为90%以上(图24，在23.10分处有峰A23/4。)。该样品的质子NMR谱(图31)表明存在带有重复脂族-CH2-基的杂质。不过值得注意的是，在活体内和外的生物测定的条件下，SAX-HPLC纯化的测试结果为阳性抑制。
在D20，500MHz 23℃下，记录下质子NMR谱。还记录2-维的COSY谱。最终的基体大小为512×512，预饱和的N-COSY，1536扫描(图32)。典型的糖信号确证存在于一维和2-D光谱中在3-5.5ppm之间。对异头物的(anomeric)质子的双重信号发现是在5.39ppm，有一3Hertz的偶合因子(图33)，与在α构型中存在的葡糖胺糖单元相一致。
异头物质子的化学位移与被认为是胎盘肝素酶的β-半乳糖专一性一起导致了试验性的结论是二糖在非还原端有一葡糖胺，为α-构型，在还原端连接1→4葡糖醛酸基。而且，在6ppm时没有信号表明二糖是饱和的(即在葡糖胺基的C4-C5处没有双键)。因此，肝素酶不是一消除酶(eliminase)，而好象是一种水解酶。
FTIR光谱用设置发射膜检测器的Mattson Galaxy 6020来记录;DIGS分辨率为2cm-1;利用ZnSe窗口128扫描。图34-35表明各自存在硫酸盐化的化合物和部分脱硫酸盐的类似物。具体讲，图34在3500-3000(羧基和羟基的特征)、1594(羰基)、1394、1121、1107、1074、1005、993、936和852cm-1显示出吸收，至少在其中的一些处，特别是最后，是与硫酸盐相联系的。
失去一些硫酸盐的甲基衍生物的质谱按JeolJMSHX/110AFAB得到。在E＝6KV，发射电流＝10mA，加速电压为10KVF，来利用Xe射线。首先，在乙酸介质中用重氮甲烷处理低聚糖样品来制备甲基衍生物。其次甲基化了的产物用乙酸乙酯萃取。在背景上观察到特征离子有M/Z(M+H+)＝531。因此，人们相信，对甲基化的衍生物，数据与分子量为约530一致。为了检验这些结果，利用两种不同的基质DTT∶硫甘油(1∶1)和甲基硝基苄基醇(分别为图36A-B和37A-B)。“A”光谱与样品+基质相对应，而“B”光谱仅与具体基质有关。
根据这样的质谱数据，对甲基化的(部分脱硫酸盐的)衍生物可以提出试验性的化学式C13H23NO17S2，MW＝529.47。
4-O-(2-脱氧-6-O-硫代-2-硫氨基-α-D-吡喃(型)葡糖基)-(2-O-硫代-β-D-吡喃葡糖苷)糠醛酸是按照下面的规定合成的。
6.23.4-O-(2-脱氧-6-O-硫代-2-硫氨基-α-D-吡喃(型)葡糖基)-(2-O-硫代-β-D-吡喃葡糖苷)糠醛酸的合成6.23.1.6-O-乙酰基-2-重氮基-3，5-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃(型)葡糖基氯化物的制备从1，6-脱水-μ-D-吡喃(型)葡糖基[1]制备2-O-甲苯磺酰基-1，6∶3，4-二脱水-β-D-吡喃半乳糖[2]，按照Cerny等(1961)Coll.Chech.Chem.Cos.262547。从2-O-甲苯磺酰基-1，6∶3，4-二脱水-β-D-吡喃(型)葡萄糖[2]制备2-O-甲苯磺酰基-1，6-脱水-β-吡喃(型)葡萄糖[3]，按照Cerny等，(1965)，Coll.Chech.Chem.Soc.301151。
从2-O-甲苯磺酰基-1，6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖[3]制备1，6∶2，3-二脱水-β-D-吡喃甘露糖[4]，按照Stanek和Cerny(1972)SYNTHeSISP.698。从1，6∶2，3-二脱水-β-D-吡喃甘露糖[4]制备6-O-乙酰基-2-重氮-3，4-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃[型]葡糖基氯化物[A]，按照Paulsen和Slenzel(1978)Chem.Ber.1112334。
6.23.2.(苄基-2-O-乙酰基-3-O-苄基-β和α-L-吡喃[型]葡糖苷)糖醛酸甲酯的制备按Stevens(1978)，MethodsCarbohydr.Chem.6124，从D-葡萄糖[5]制备1，2∶5，6-二-O-异亚丙基-α-D-呋喃[型]葡萄糖[6]。按照Whistler和Lake(1972)，MethodsCarbohydr.Chem.6286，从1，2∶5，6-二-O-异亚丙基-α-D-呋喃[型]葡萄糖[6]制备3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃[型]葡萄糖[7]。
按照Jacquinet等，(1984)，Carbohydr.Res.130221，从3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-D-呋喃[型]葡萄糖[7]制备(苄基-2-O-乙酰基-3-O-苄基-β和α-L-吡喃[型]葡糖苷)-糠醛酸甲酯。
6.23.3.6.23.1和6.23.2产物的缩合按照Jacquinet等，(1988)，Carbohydr.Res.174253使上述6.23.1和6.23.2节的产物进行缩合反应。按照Jacquinet等(1984)(supra)进行O-脱乙酰化反应、水解反应、O-硫酸盐化作用、还原反应和脱苄基化作用，制得4-O-(2-脱氧-6-O-硫代-2-硫氨基-α-D-吡喃[型]葡糖基)-(2-O-硫代-β-D-吡喃葡糖苷)糠醛酸，按照Rice等，(1985)，Anal.Biochem.150325通过SAX-HPLC将其进一步纯化。在图43中示出了这种产物的结构，人们认为与本文上述的其它化合物相比较，它具有相同的生物活性。
本领域内的普通技术人员十分清楚，由此还可预见到在本说明书中没有具体叙述的其它的组合物及方法。这些其它的组合物及方法都被认为是在本发明的范围和实质内容内的。因而，本发明不应该受本文公开的一些特征实施方案的限制，而仅受后述的权利要求书的限制。
本文引述的所有参考文献公开的内容本文都结合作为参考。
权利要求
1.一种抑制活性TNF-α产生的药物组合物，含有式(Ⅰ)的双糖或其可药用盐以及可药用载体，
其中X1为氢或硫酸基；X2为氢或硫酸基；且X3为硫酸基或乙酰基，假定X3是硫酸基，则X1或X2中的至少一个为硫酸基并且如果X3是乙酰基，则X1和X2均为硫酸基。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述的双糖是2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸葡糖胺。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述的双糖是4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。
4.权利要求1的药物组合物，其中所述的双糖为2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。
5.权利要求1的药物组合物，其中所述的双糖为2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰基-6-O-硫酸葡糖胺。
6.一种用于增加活性TNF-α产生的药物组合物，含有4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰葡萄糖胺或其可药用盐以及可药用载体。
7.权利要求1或6的药物组合物适于经非胃肠道给药。
8.权利要求1或6的药物组合物适于口服给药。
9.权利要求1或6的药物组合物适于局部给药。
10.一种用于抑制活性TNF-α产生的药物组合物，含有一种化合物和一种可药用载体，该化合物为N-硫酸化的或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可药用盐，上述化合物如果是N-硫酸化的，应另外至少具有一个硫酸基团，上述化合物如果是N-乙酰化的应至少具有两个硫酸基团。
11.一种用于增加活性TNF-α产生的药物组合物，含有非-硫酸化的N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-葡糖醛葡糖胺或其可药用盐以及可药用载体。
12.一种抑制主体中活性细胞分裂素产生的方法，包括给上述主体施用有效量的式(Ⅰ)的双糖或其可药用盐;
(Ⅰ)的化合物，其中X1为氢或硫酸基;X2为氢或硫酸基;且X3为硫酸基或乙酰基，假定X3是硫酸基，则X1或X2中的至少一个为硫酸基，并且如果X3是乙酰基，则X1和X2均为硫酸基。
13.一种增加主体中活性细胞分裂素的产生的方法，包括给该主体施用有效量的双糖或其可药用盐，上述双糖为4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰基葡糖胺。
14.权利要求12或13的方法，其中所述化合物或其可药用盐是每日给药的。
15.权利要求12或13的方法，其中所述化合物或其可药用盐是每周给药的。
16.权利要求12或13的方法，其中所述化合物或其可药用盐是经非胃肠道、口服或局部给药的。
17.一种抑制主体中活性细胞分裂素产生的方法，包括给上述主体施用有效量的权利要求10的药物组合物。
18.一种增加主体中活性细胞分裂素产生的方法，包括给上述主体施用有效量的权利要求11的药物组合物。
19.一种用化合物来制备用于预防或治疗由TNF-α的不当产生引起的或与此有关的病症的药物组合物的方法，上述化合物为N-硫酸化的或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可药用盐，上述化合物如果是N-硫酸化的，应另外至少具有一个硫酸基团，且上述化合物如果是N-乙酰化的应具有两个至少硫酸基团。
20.一种用非-硫酸化的N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-糖醛葡糖胺化合物或其可药用盐制备用于治疗与增加TNF-α产生有关的病症的药物组合物的方法。
21.一种预防或治疗由于受治疗者中的活性细胞分裂素的不当产生引起的或与此有关的病症的方法，包括给上述受治疗者施用有效量的化合物，该化合物为N-硫酸化的或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可药用盐，上述化合物如果是N-硫酸化的，应另外至少具有一个硫酸基团，且上述化合物如果是N-乙酰化的应至少具有两个硫酸基团。
22.一种治疗与受治疗者中活性细胞分裂素的产生增多有关的病症的方法，包括给上述受治疗者施用有效量的非硫酸化的N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可药用盐。
23.权利要求19或21的方法，其中所述化合物为2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸葡糖胺。
24.权利要求19或21的方法，其中所述化合物为4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。
25.权利要求19或21的方法，其中所述化合物为2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-硫酸基-6-O-硫酸葡糖胺。
26.权利要求19或21的方法，其中所述的化合物为2-O-硫酸基-4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰基-6-O-硫酸葡糖胺。
27.权利要求20或22的方法，其中所述的化合物是4-脱氧-4-烯-糖醛酸-(α-1，4)-2-脱氧-2-N-乙酰基葡糖胺。
28.权利要求19或21的方法，其中所述的病症为自身免疫性疾病。
29.权利要求19或21的方法，其中所说的病症选自胰岛素依赖的糖尿病、牙周病、炎性肠疾病、皮肤病、葡萄膜炎、类风湿疾病、慢性炎症、多出血症、红斑狼疮、动脉粥样硬化、关节炎、脉管炎和过敏症。
30.权利要求20或22的方法，其中所说的病症是肿瘤、病毒感染、细菌感染或真菌感染。
31.权利要求20或22的方法，其中所说的病症是基础皮肤癌，鳞状细胞癌或黑素瘤。
32.权利要求12、13、17、18、21或22的方法，其中所说的细胞分裂素选自IL-1、IL-6、IL-8或TNF-α。
33.一种治疗受治疗者疾病的方法，包括给上述受治疗者施用有效量的化合物，该化合物为N-硫酸化的或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可药用盐，上述化合物如果是N-硫酸化的，应另外至少具有一个硫酸基团，且上述化合物如果是N-乙酰化的应至少具有两个硫酸基团;上述疾病选自胰岛素依赖的糖尿病、牙周病、炎性肠疾病、皮肤病、葡萄膜炎、类风湿疾病、慢性炎症、多出血症、红斑狼疮、动脉粥样硬化、关节炎、脉管炎和过敏症。
34.一种用于治疗疾病的药物组合物，含有化合物和可药用载体，该化合物为N-硫酸化的或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可药用盐，上述化合物如果是N-硫酸化的，应另外至少具有一个硫酸基团，且上述化合物如果是N-乙酰化的应至少具有两个硫酸基团;上述疾病选自胰岛素依赖的糖尿病、牙周病、炎性肠疾病、皮肤病、葡萄膜炎、类风湿疾病、慢性炎症、多出血症、红斑狼疮、动脉粥样硬化、关节炎、脉管炎和过敏症。
35.权利要求34的药物组合物是单剂量形式的。
36.一种抑制受治疗者同种异体移植排斥的方法，包括给上述受治疗者施用有效量的化合物，该化合物为N-硫酸化的或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可药用盐，上述化合物如果是N-硫酸化的，应另外至少具有一个硫酸基团，且上述化合物如果是N-乙酰化的应至少具有两个硫酸基团。
37.权利要求36的方法，其中所述的同种异体移植为器官移植。
38.权利要求37的方法，其中所说的器官为心脏、肝脏、肾脏或骨髓。
39.权利要求36的方法，其中所说的同种异体移植为皮肤移植。
40.一种抑制受治疗者粘着分子表达的方法，包括给上述受治疗者施用有效量的化合物，该化合物为N-硫酸化的或N-乙酰化的4-脱氧-4-烯-糖醛葡糖胺或其可药用盐，上述化合物如果是N-硫酸化的，应另外至少具有一个硫酸基团，且上述化合物如果是N-乙酰化的应至少具有两个硫酸基团。
41.权利要求40的方法，其中所说的粘着分子是ICAM-1或ELAM-1。
42.一种用于定量测定被测试物对活性TNF-α分泌影响的体外生物分析法，该生物分析法包括如下步骤在含有不同浓度的测试物质的培养基中预先培养人体CD4+T细胞，加入一恒量的激动剂，该激动剂在没有上述测试物质的存在下能通过T细胞有效地诱导TNF-α的分泌，在足够的一段时间后收集该培养物，并测定培养物中TNF-α的活性。
43.一种用于调节受治疗者中细胞分裂素活性的药物组合物，含有有效抑制或增加上述受治疗者中细胞分裂素活性的物质，上述物质含有羧酸化和/或硫酸化的寡糖或其可药用盐和可药用载体，并且上述物质表现出非零的如由测定小鼠的相应的实验性DTH反应的体内分析方法测定的“R”值，所述的小鼠是以范围从0到约2μg/gm小鼠的不同剂量的上述物质处理过的。
44.权利要求43的药物组合物，其中所说的物质能有效抑制上述受治疗者中细胞分裂素的活性，所述的物质表现出非零的抑制性“R”值。
45.权利要求43的药物组合物，其中所说的物质能有效增加上述受治疗者中细胞分裂素的活性，所述的物质表现出非零的抑制性“R”值。
46.权利要求43、44或45的药物组合物，其中所述的寡糖是双糖。
47.权利要求43、44或45的药物组合物，其中所述的寡糖是羧酸化的双糖。
48.权利要求43、44或45的药物组合物，其中所述的寡糖是羧酸化和硫酸化的双糖。
49.权利要求45的药物组合物，其中所述的寡糖是羧酸化的但非硫酸化的双糖。
50.权利要求43、44或45的药物组合物，其中所述的细胞分裂素选自IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α。
51.权利要求46的药物组合物，其中所述的细胞分裂素是TNF-α。
52.权利要求44的药物组合物，其中所述的物质为H-1020或其可药用盐。
53.权利要求44的药物组合物，其中所述的物质为H-9517或其可药用盐。
54.权利要求44的药物组合物，其中所述的物质为H-9392或其可药用盐。
55.权利要求44的药物组合物，其中所述的物质为H-9267或其可药用盐。
56.权利要求44的药物组合物，其中所述的物质为H-0895或其可药用盐。
全文摘要
本文公开了含基本上是纯化状的羧基化的和/或硫酸化的低聚糖的物质，包括含该物质的组合物和使用该物质的方法，本文公开的物质能够用来调节宿主中细胞分裂素的活性。例如，Tumor Nccrosis Fac-tor Alpha(TNF-α)的分泌可以通过给宿主施用有效量的含有基本上为纯化状的专门的低聚糖的物质或它们的组合物来抑制或增加。因此，本发明也是关于药物组合物和它们在防止和/或治疗涉及活性细胞分裂素例如TNF-α分泌的诱导的病理过程的应用。本发明还是关于诱发宿主对存在的包括病原体的活化剂的所需的有关免疫系统的响应。本发明的物质和医药组合物可以很低的有效剂量每日施用，一般低于0.1mg/kg人体，或以高达约5—8天的间隔使用，优选每周一次施用。
文档编号A61P3/08GK1093904SQ93121328
公开日1994年10月26日 申请日期1993年11月10日 优先权日1992年11月10日
发明者I·R·科恩, O·里德, L·卡哈龙, O·索塞耶夫, R·马加力特 申请人:耶达研究及发展有限公司