一种鉴定用于在动物细胞中激活氯传导的结合cftr的化合物的方法

专利名称：：一种鉴定用于在动物细胞中激活氯传导的结合cftr的化合物的方法
技术领域：
：本发明涉及一种方法，该方法可以鉴定用于治疗尖端(apical)氯传导降低的细胞(如囊状纤维变性细胞)的结合CFTR的化合物。本发明进一步涉及用于治疗此类细胞的化合物及其组合物。
背景技术：
：健康的动物细胞除需要其它条件和物质之外，还需要维持各种无机离子的跨细胞膜运动，使正常的离子平衡提供必要的跨细胞膜电位和促进生命活动的胞内离子强度。例如，动物中Na+、Cl+、K+和Ca++的跨膜运动使得K+和Ca++在不同细胞的不同发育阶段在胞内进行程度不同的聚积，而Na+大部分排斥于胞外。这些离子的跨膜运动由位于适当的离子通道位点的，与膜相连的依赖Na+/K+和依赖Ca++的ATP酶介导。据认为，氯离子以被动方式透过动物细胞，使胞外液与胞内液之间达到浓度平衡，从而由于整体的负胞内变化而导致胞内Cl-浓度偏低(underrepresentation)。但也有文献表明氯传导也被Cl-通道主动介导(见Edwards，神经科学(Neuroscience)，7，1335-1366(1982))。针对囊状纤维变性(“CF”)病理的研究结果为细胞水平离子传导缺损对人的健康的不同水平的致病作用提供了资料。CF有遗传基础，因为其在白种美国人中的发病率(在1/1600至1/2000活婴之间)与在黑种美国人中的发病率(约1/17,000活婴)不同。实际上，过去十年的研究表明一种可遗传的特定基因突变与CF的临床症状相关，所述症状包括外分泌腺和肺功能失常。更具体地说，CF是由囊状纤维变性跨膜调节物(CFTR)基因突变造成的，最普通的突变是508位的苯丙氨酸残基(Phe508，图1为CFTR蛋白的物理图谱)缺失。该突变的CFTR蛋白被称为ΔF508，其位点位于第一个核苷酸结合折叠(NBF-1)中。Schoumacher等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)87，4012-4016(1990)；Riordan等，科学(Science)245，1066-1073(1979)。更具体地说，该突变位于一段较长的NBF-1内部片段中，N末端侧连着WalkerA序列(458-471位氨基酸；又称“CFTR[458-471]”)，C末端侧连着相邻的C结构域(548-560位氨基酸；又称“CFTR[548-560]”)和WalkerB结构域(561-573位氨基酸；又称“CFTR[561-573]”)。位于CFTR[471]和CFTR[561]之间的中间序列的生理作用尚不清楚，该中间序列包括Iα、Iβ和Io多肽序列(见图1)。CFTR基因的某些突变，例如造成ΔF508的突变，导致跨CF上皮的电势差异常。该异常是由于细胞尖端氯(Cl-)传导降低。因而，例如CF患者的跨上皮细胞膜的氯和钠的运输均异常。还已知携带ΔF508突变的细胞有比正常水平高的结合内质网(此后被称为“ER”)的CFTR蛋白质，虽然野生型细胞在其ER中也保留并降解相当量的CFTR蛋白，但比ΔF508突变体的少得多。Ward等，遗传生理学杂志(J.Gen.Physiol.)，104，33a(1994)。该CFTR突变很明显是造成呼吸系统病理生理变化的原因之一。该病的几乎所有患者都患有慢性进行性呼吸系统疾病。大多数情况下出现胰功能失调，肝胆和生殖泌尿系统疾病也较频繁。虽然近年来囊状纤维变性患者的存活率有改善，但即使开发并广泛应用了支持及预防措施后平均存活年龄仍仅有28岁。目前治疗该病的努力集中于能够激活突变体CFTR基因产物或用其它方法造成患病细胞Cl-分泌增加的药物上。基因疗法是另一活跃的研究领域，可通过引入重组野生型CFTR基因，即没有导致功能异常的突变的CFTR基因，来修复阴离子传导缺损。近来有报道，用含氨氯吡咪(Knowles等，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)，322，1189-1194(1990))或ATP和UTP的混合物(Knowles等，新英格兰医学杂志，325，533-538(1991))的气溶胶来减缓气管上皮中Cl-的聚集，临床结果令人鼓舞。其它可用于治疗CF的药物亦见于报道。例如美国专利4,866,072号描述用9-乙基-6，9-二氢-4，6-二氧-10-丙基-4H-吡喃(3，2-g)喹啉-2，8-二羧酸或其药用衍生物来治疗CF。美国专利4,548,818号描述用3-烷基黄嘌呤治疗慢性阻塞性肺病(COPD)。美国专利5,032,593描述用1，3-烷基取代的8-苯基黄嘌呤或其药用盐治疗支气管缩小。美国专利5,096,916描述咪唑啉α-肾上腺素能阻遏剂和血管舒张剂如苄唑啉治疗COPD，包括囊状纤维变性，慢性支气管炎和气肿，或与气喘有关的COPD。过去曾用茶碱对哮喘和CF患者给药来增强肺功能。这种肺功能增强主要由支气管扩张造成，这是由于茶碱对平滑肌及炎症的作用。茶碱不仅抑制磷酸二酯酶，还拮抗腺苷受体。相应地，由于茶碱作用于多个位点，它明显地缺乏特异性，因而降低了治疗CF的效用。考虑到是对A1腺苷受体的拮抗而非对磷酸二酯酶的抑制刺激了CF细胞的氯外流，这种特异性的缺乏会导致不利的副作用，如对心脏、肾和/或中枢神经系统组织有害。另外，必须施用大剂量茶碱才能取得良好效果，因而增加了该化合物的高毒性副作用的危险。已检测了其它基本结构与茶碱类似的化合物，但未发现能激发CF细胞的氯外流，因而用于治疗囊状纤维变性的潜力不大。例如3-异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)的结构与茶碱相似，其活性无特异性，毒性高，因而不能用于治疗CF。化合物2-硫代-8-环戊基-1，3-二丙基黄嘌呤(2-硫代-CPX)，1，3-二丙基-8-新金刚烷基黄嘌呤(KW-3902)和1，3-二甲基-8-环戊基黄嘌呤(CPT)(见美国专利5,366,977号)也不能有效刺激氯外流。类似地，用单碳基团取代CPX(1，3-二丙基-8-环戊基黄嘌呤)的1或3位的丙基得到的化合物不能有效地刺激CF细胞的氯外流。很明显，微小的结构差别对一给定化合物能否有效地用于治疗CF的影响即使不是根本性的也是很显著的。相应地，若有一种方法能对化合物促进患病细胞氯离子传导的能力进行筛选，选出用于治疗囊状纤维变性患者的药剂候选物，这将会特别有用。上面引用的′977号专利和Eidelman等，美国国家科学院院刊，89，5562-5566(1992)公开了CPX是强力A1腺苷拮抗物，能促进一种人类上皮细胞系(CFPAC-1)的氯外流。CFPAC-1细胞系表达上述CFTRΔF508突变，可视为CF活性化合物的第一代筛选材料，进一步描述见实施例6。虽然′977号专利公开的CPX及其相关的黄嘌呤氨基同类物相对无毒，因而可用于CF治疗，但这些化合物对A1腺苷受体的拮抗作用表明这种治疗可能对动物有与CF疾患无关的附加影响。因而优选地避免应用这些化合物，或是任何有多重活性靶的化合物，因为应用这些化合物至少可能有害。强力、低毒、对腺苷受体特异性很少或没有的药物将是很理想的药剂，用于治疗尖端Cl-传导降低的细胞，如囊状纤维变性细胞。这样一种药物不仅用于治疗囊状纤维变性本身，还可用于治疗一般的COPD。本发明的一个目的是提供一种鉴定能激活受损的氯传导通道的化合物的方法。本发明的另一目的是提供一种修正氯传导受损的细胞中氯传导降低的方法。本发明的另一目的是提供一种治疗囊状纤维变性细胞的方法。本发明的另一目的是提供一种方法，用于治疗在囊状纤维变性跨膜调节物的508位氨基酸苯丙氨酸缺失的囊状纤维变性细胞。本发明的另一目的是提供用于这些方法的化合物，特别是新的黄嘌呤衍生物，它对腺苷受体的亲合性很小或没有，但仍能通过激发Cl-外流改善CF细胞的Cl-不平衡。本发明的这些及其它目的和优点，以及其它发明特征，在本文提供的发明描述中是显而易见的。发明简述本发明提供某些CFTR多肽，如Iα[SEQIDNO1]，它们能特异性地结合那些在ΔF508突变体细胞中激活与CFTR相关联的氯离子外流的化合物，但不结合那些不能激活与CFTR相关联的氯离子外流的化合物。此外，本发明提供一种方法，用于鉴定其它能激活与CFTR相关联的氯离子外流的化合物。该方法包括应用前述CFTR多肽作离子外流激活化合物的选择性结合剂。作为对该鉴定方法的进一步改进，还公开了具有与Iα位置相邻或重叠区域的氨基酸序列的其它CFTR多肽，如Iβ[SEQIDNO3]或Io[SEQIDNO4]，虽然它们与Iα位置相近或有重叠，但其对激活离子外流的化合物有不确定的或负的亲和性。前述鉴定法可用于鉴定能在离子外流缺陷的细胞如CF细胞，特别是带有ΔF508突变的细胞中激活离子外流的化合物。而且这些化合物在本发明的范围中进一步被筛选，得到对A1腺苷细胞受体或A2腺苷受体很少有或没有亲和性的化合物。这些化合物可相应地用于治疗尖端Cl-传导降低的细胞，如CF细胞。具体地说，本发明方法涉及将尖端Cl-传导降低的细胞与治疗有效量的对A1、A2或A3腺苷细胞受体很少有或没有亲和性的化合物相接触。本发明的化合物与CF细胞的接触导致这些细胞中Cl-外流。具体地说，本发明的方法涉及将细胞接触下式化合物其中R1和R3相同，是C1-C6烷基或C1-R6链烯基，R7是C1-C6烷基或氢，R8是C4-C8环烷基。这种化合物可进一步选自1，3-二丙基-7-甲基-8-环戊基黄嘌呤、1，3-二丙基-7-甲基-8-环己基黄嘌呤、环己基咖啡因、1，3-二烯丙基-8-环己基黄嘌呤及其药用衍生物。用于本发明方法的化合物在基本结构上类似于茶碱，但在R1、R3和R8位的取代基差别很大。由于类似茶碱的化合物的微小结构差别使化合物在CF治疗上无效或因其它原因失去效用，发现上述化合物可以有效激活CF细胞的氯外流是令人惊奇的。由于本发明的化合物的表观作用模式不涉及任何一种腺苷受体，因而这一发现特别出乎意料。附图简述图1是CFTR蛋白质的物理图谱，显示下列序列的位置WalkerA(氨基酸458-471)；Iα(氨基酸477至508)；Iβ(氨基酸509至539)；Io(氨基酸550至530)；C(氨基酸548至560)；WalkerB(氨基酸561-573)。图2描绘某些浓度为20μg/ml(5.2μM)，pH6.0的CFTR多肽和1mMCa++造成的嗜铬颗粒聚集。x轴单位为分钟，y轴单位为浊度变化(Δ540nM)。图3A描绘不同浓度Iα多肽存在时嗜铬颗粒的聚集。x轴单位是Iα多肽浓度(μg/ml)，y轴单位是浊度变化(Δ540nM)。进行反应以获取图2的数据，计算每种浓度Iα的初始速率。图3B是图3A中显示的数据的Hill图。Vmaxapp由数据的Lineweaver-Burk图(log(Vi/Vm-Vi)对log[Iα])的线性外推估算，并计算各条件的速率比。斜率(2.6)是Hill系数(nH)。图4A描绘不同pH值(x轴)下Iα造成的磷脂酰丝氨酸脂质体聚集(y轴是ΔA350/分钟)。Iα浓度是2μg/ml(0.6mM)。图4B描绘随时间(x轴，单位为分钟)测量的低浓度Iα多肽造成的磷脂酰丝氨酸脂质体聚集(y轴是ΔA350/分钟)。图5描绘CPX(x轴，单位为nM)对Iα多肽驱动的磷脂酰丝氨酸脂质体聚集(y轴是ΔA350/20分钟)的影响。嵌入图描绘在20分钟时CPX活化的浓度依赖性，其中y轴是ΔA350/20分钟，x轴是CPX浓度，单位为nM。图6描绘咖啡因(x轴为浓度，单位为nM)对Iα多肽驱动的磷脂酰丝氨酸脂质体聚集(在y轴上测量，单位是ΔA350/20分钟)的影响。嵌入图描绘在20分钟时CPX活化的浓度依赖性，其中y轴是ΔA350/20分钟，x轴是咖啡因浓度，单位为nM。图7描绘DAX浓度(x轴，单位为nM)对Iα多肽驱动的磷脂酰丝氨酸脂质体聚集(y轴，ΔA350/20分钟)的影响。嵌入图描绘在20分钟时DAX活化的浓度依赖性，其中x轴是DAX浓度，单位为nM，y轴单位为ΔA350/20分钟。图8描绘Iα多肽驱动的磷脂酰丝氨酸脂质体聚集的CPX与DAX活化的对比。x轴上CPX或DAX的浓度单位为nM，y轴单位为ΔA350/20分钟。图9描绘CFPAC细胞接触化合物1(茶碱)的[36Cl]-外流的研究结果。x轴代表化合物1的nM浓度，y轴代表氯外流速率，它是对照的百分数。图10描绘CFPAC细胞接触化合物5(CPX)的[36Cl]-外流的研究结果。x轴代表化合物5的nM浓度，y轴代表氯外流速率，它是对照的百分数。图11描绘CFPAC细胞接触化合物22(8-环己基甲基咖啡因)的[36Cl]-外流的研究结果。x轴代表化合物22的nM浓度，y轴代表氯外流速率，它是对照的百分数。图12描绘CFPAC细胞接触化合物17(1，3-二烯丙基-8-环己基黄嘌呤)的[36Cl]-外流的研究结果。x轴代表化合物17的nM浓度，y轴代表氯外流速率，它是对照的百分数。图13描绘在检测茶碱衍生物不同大小的8-环烷基取代基(x轴)对Ki值的影响(μM，y轴)时，对氯外流的研究结果。给出了大鼠皮层A1-腺苷受体(·)和大鼠纹状(striated)A2a-腺苷受体(Δ)上8-环烷基茶碱衍生物的亲和性。图14描绘在检测咖啡因衍生物不同大小的8-环烷基取代基(x轴)对Ki值的影响(μM，y轴)时，对氯外流的研究结果。给出了大鼠皮层A1-腺苷受体(·)和大鼠纹状A2a-腺苷受体(Δ)上8-环烷基咖啡因衍生物的亲和性。优选实施方案详述本发明提供对激活CFTR突变细胞中氯离子外流的化合物有正亲和性的多肽。本发明的多肽是CFTR蛋白的一部分，即图1中标志为Iα的片段，或是其功能差别不大的衍生物，如下所述。Iα被定义为跨477位至508位氨基酸的多肽，具有下列序列NH2-PSEGKIKHSGRISFCSQFSWIMPGTIKENEEF-COOH[SEQIDNO1]其中NH2和COOH基团之间的大写字母是各氨基酸的通用单字母符号，这种关于蛋白质的术语也用于下述SEQIDNO3和SEQIDNO4中。多肽Iα[SEQIDNO1]的制备可通过(1)用本领域熟知的方法作分析性或制备性多肽合成(见例如Atherton等，《固相多肽合成实用方法》(牛津大学出版社，1989))，(2)用本领域熟知的遗传工程方法通过适当地温育含有合适的DNA或RNA序列的微生物来表达Iα多肽(见例如Sambrook等，《分子克隆实验指南》(第2版，1989))，或(3)其它合适的方法。在本发明范围内还考虑到保守氨基酸变化，如本领域已知，这些变化不会造成多肽的电荷或构型变化，这构成本发明的其它实施方案。例如，据认为将异亮氨酸换成亮氨酸对Iα多肽的功能影响很小或没有。还考虑到Iα片段可能也有功能，因此这些片段限定了本发明的其它实施方案。用于构建克隆以合成Iα的合适DNA和/或RNA序列可利用遗传密码通过Iα氨基酸序列[SEQIDNO1]的逆向翻译和转录推得。DNA的“有义”和“反义”链中的一条或两条可用于遗传工程构建质粒以合成Iα。相似地，RNA序列也可构成“有义”或“反义”链。相应地，本发明也可以被认为是通过本文提到的RNA或DNA序列来实施的。可用任何合适的方法生成具有任一下列序列的RNA分子CCNUCNGARGGNAARAUHAARCAYUCNGGNCGNAUHUCNUUYUGYUCNCARUUYUCNUGGAUHAUGCCNGGNACNAUHAARGARAAYGARGARUUY[SEQIDNO2]其中A是腺嘌呤，G是鸟嘌呤，U是尿嘧啶，C是胞嘧啶，W是A或U，Y是C或U，R是A或G，H是A、C或U，N是G、A、C或U，各符号排成三联体以反映在生物体中翻译的密码子。这种与RNA相关的术语也被用于下面的SEQIDNO5和SEQIDNO6。本文也考虑那些通过翻译得到相同的多肽序列或其功能等价物的其它RNA序列。例如三联体UCN可被三联体AGY取代并且三联体CGN可被三联体AGR取代，得到的多肽序列没有改变。除了在RNA水平鉴定到的中性序列差异，上述使得到的氨基酸序列发生保守变化的核苷酸改变也在考虑之列，因此例如编码异亮氨酸的三联体AUH可被编码同分异构体亮氨酸的三联体CUN替换，而对所述的多肽的功能无明显影响。任一这种序列可连接入合适的核酸载体，用本领域熟知的方法在合适的细胞或病毒宿主中增殖表达。上述RNA分子的遗传互补物，即反义RNA，以及有义和反义RNA分子的DNA对应物也考虑作为本发明的实施方案。生成上述序列，其互补物或其DNA对应物以及下述序列的合适方法包括人工或自动的体外多聚核苷酸合成。这样的序列一旦被构建出来，可以将其连接到其它确定转录或翻译信号的核苷酸序列上，或其它可用作在细菌、病毒或动物细胞中增殖和/或表达的载体的核苷酸序列上。制备这样的核酸结构的方法在本领域已知。见Sambrook等，同上。多肽或其适当部分可单独使用或同另一化合物结合，该化合物可以是能共价连成另一多肽的一个或多个氨基酸、蛋白多糖、蛋白脂质、碳水化合物或其它合适的大分子。本发明的多肽与另一大分子的结合可通过共价键、氢键、吸附、吸收、金属键、范德华力、离子键或其它适当的分子间和分子内键或力或其任意组合来稳定。本发明的多肽的优选形式包括将多肽共价连接到适当的亲和层析基质(如纤维素)上，包括间氨基苯甲氧甲基纤维素、溴乙基纤维素、羧甲基纤维酰肼和纤维素环碳酸酯；6-氨基己酸；sepharose，包括sepharose4B、sepharose6MB、sepharose6B和巯基-sepharose4B；含有亲水丙烯酸、聚丙烯酰胺和琼脂糖的小珠；以及线性聚丙烯酰胺。适当的反应基元如酰肼、碳酸酯等和适当的激活物如溴化氰、羰基二咪唑、氯甲酸酯等，可以用本领域已知的方法和材料，如Sigma化学品公司1993年目录1612-1618页或其它来源提供的材料，应用到上述亲和层析基质上。Iα多肽的性质包括(1)当约1mMCaCl2存在时起始或造成牛嗜铬颗粒聚集，表观k1/2为22.2μg/ml或6.3μM(见图3A和3B)；(2)在约5.5至约7.5的pH范围内有活性，其中当pH约6.75时有50％活性(见图4A)；(3)与激活有ΔF508突变的细胞中氯离子外流的化合物合用时在起始或造成脂质体聚集上有协同效应，所述化合物包括CPX、咖啡因和N，N-二烯丙基环己基黄嘌呤(DAX)(分别见图5，6和7)；(4)与不激活有ΔF508突变的细胞中氯离子外流的化合物合用时不起始或造成脂质体的聚集，所述化合物包括2-硫代-CPX和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)等；(5)与腺苷有双相反应，其中在70至100mM的低腺苷浓度时，上述Iα多肽驱动的脂质体聚集有少量增加，腺苷浓度再高时未见这种活性增加，大于等于1μM时聚集活性受抑制；(6)对CPX表观KD为69±27nM，CPX是激活ΔF508细胞的氯离子外流的黄嘌呤衍生物。本发明还提供某些CFTR多肽，它们与Iα多肽相邻，但其特征明显不同。Iβ多肽是包含于CFTR509位至539位的一个氨基酸序列，它具有下列序列NH2-GVSYDEYRYRSVIKACQLEEDISKFAEKDNI-COOH[SEQIDNO3]Io多肽是包含于CFTR蛋白500位至530位的另一个氨基酸序列，它具有下列序列NH2-GTIKENEEFGVSYDEYRYRSVIKACQLEEDIS-COOH[SEQIDNO4]这些多肽与Iα多肽相邻或与之部分重叠，但均不驱动嗜铬颗粒或合成性脂质体的聚集，对本文公开的Iα多肽或激活氯离子外流的黄嘌呤衍生物的活性也没有影响。与上述关于Iα的保守氨基酸变化的讨论类似，也考虑将含有这种保守变化的多肽作为本发明的其它实施方案。如上述对Iα多肽的讨论，Iβ和Io多肽可作为游离多肽，其片段，或与其它大分子相结合的多肽来制备并使用。Iβ和Io可用于亲合层析，并用作Iα多肽的阴性对照。如同上面对Iα多肽的讨论，对应Iβ和Io的适当RNA和/或DNA序列可利用遗传密码，通过相应多肽蛋白质序列的逆向翻译/转录来鉴定。相应地可用任何适当的方法生成含有下列序列的RNA分子IβGGNGUNUCNUAYGAYGARUAYCGNUAYCGNUCNGUNAUHAARGCNUGYCARUURGARGARGAYAUHUCNAARUUYGCNGARAARGAYAAYAUH[SEQIDNO5]IoGGNACNAUHAARGARAAYGARGARUUYGGNGUNUCNUAYGAYGARUAYCGNUAYCGNUCNGUNAUHAARGCNUGYCARUURGARGARGAYAUHUCN[SEQIDNO6]与Iα序列类似，编码与SEQIDNO5和SEQIDNO6相同或功能上等价的序列的其它序列也在考虑之列。例如三联体UCN、GCN和UUR可分别由AGY、AGR和CUN替换，而不造成任何氨基酸序列上的不同。另外如上面对Iα序列讨论的，造成不确定氨基酸变化的核苷酸序列也被考虑作为本发明的其它实施方案。而且如Iα序列一样，SEQIDNO5和SEQIDNO6的RNA互补物以及由此预测的DNA对应物序列，也包括在本发明的实施方案中，并可由普通技术人员根据通用遗传密码来确定。上述Iα、Iβ和Io多肽或其功能等价物可用于一种方法，鉴定结合CFTR的化合物。该方法包括使假定的结合CFTR的化合物与Iα多肽在足以使二者结合的条件下相互接触，用适当方法确定这种结合是否发生，如发生则表明该假定的结合CFTR的化合物确实是结合CFTR的化合物。对于结合CFTR的化合物，希望用本方法鉴定的这些化合物与细胞的CFTR相互作用，优选的是突变的CFTR如ΔF508，来使CFTR介导的氯离子外流增大，或有可能恢复正常。结合CFTR的化合物与CFTR蛋白的这种相互作用可由离子键、疏水作用和范德华力的任一适宜组合提供，并且是CFTR氨基酸序列和结合CFTR的化合物的物化特性的函数。为了鉴定这些结合CFTR的化合物，优选地是检验用作针对CF的药剂的候选物，检验其与Iα多肽亲和性的正效应，以及与Iβ和/或Io不结合的不确定或负效应是有用的。用于鉴定结合CFTR的化合物的亲和性检测的条件可用本领域已知的常规技术最优化。该方法可能鉴定任一选择性结合(例如)Iα或不结合(例如)Iβ的适当化合物，该化合物是碳氢化合物，包括但不限于蛋白质、脂、核酸或其任一组合。结合CFTR的化合物的作用中令人感兴趣的有(1)加入合成的多糖脂质体制备物中(即包括该脂质体的组合物)起始或造成脂质体的聚集(描述见实施例1)；(2)加入嗜铬颗粒的制剂(即包括该嗜铬颗粒的组合物)中起始或造成该嗜铬颗粒的聚集(描述见实施例1)；(3)当ΔF508细胞氯离子外流的激活剂加入上述脂质体中时起始或造成其聚集的速率变大(见图5-7)。本发明范围内有用的氯离子外流激活剂包括CPX、咖啡因、N，N-二烯丙基环己基黄嘌呤，以及其它合适的化合物。氯离子外流激活物与Iα结合在一起检测时与Iα单独使用时的效应相比，促进脂质体聚集的速率全都增大。本发明进一步提供一种方法，用于治疗尖端Cl-传导降低的细胞，如囊性纤维变性细胞，并提供用于本发明方法范围内的新的化合物及其药物组合物。具体地说，治疗方法涉及将尖端Cl-传导降低的细胞接触治疗有效量的一种化合物，该化合物对腺苷细胞受体，尤其是A1-腺苷细胞受体或A2-腺苷细胞受体亲和力很小或没有，但仍激活Cl-外流。特别地，本方法涉及将细胞接触下式化合物其中R1与R3相同，为C1-C6烷基或C1-R6链烯基，R7是C1-C6烷基或氢，R8是C4-C8环烷基或其药用衍生物。这些化合物可依据其分别对一种腺苷受体(如A1或A2腺苷受体)的亲和力来表征。特别地，这些化合物的亲和性可以以Ki值表示，例如Ki值大于等于0.01。优选化合物的Ki值小于0.05。这种优选化合物包括R1和R3是甲基、丙基或烯丙基，R7是甲基或氢，R8是环戊基或环己基，具体地说是1，3-二丙基-7-甲基-8-环己基黄嘌呤，1，3-二丙基-7-甲基-8-环戊基黄嘌呤，1，3-二烯丙基-8-环己基黄嘌呤和8-环己基咖啡因之一。本发明的方法对治疗囊状纤维变性细胞特别有用。该方法特别优选治疗囊状纤维变性跨膜调节物508位苯丙氨酸缺失的囊状纤维细胞的治疗，尤其是发现于哺乳动物如人类患者中的囊状纤维变性细胞。用于本发明方法的化合物优选地不具有磷酸二酯酶活性。优选治疗有效量的该化合物无毒。最优选化合物本身无毒，即使有毒也利大于弊。更优选本发明的化合物对任何腺苷受体(如上面提到并由下面举例说明的A1或A2-腺苷受体)的亲和性水平低(例如Ki大于等于0.01mM)。对于A3-腺苷受体，本发明的化合物不可能与之有足够大的亲和性，因为大多数黄嘌呤不能置于A3-腺苷受体结合位点中。vanGalen等，医学研究综述(MedicinalRes.Rev.)，12，423-471(1992)。特别优选用于本发明方法的化合物是1，3-二丙基-7-甲基环戊基黄嘌呤(DP-CPX)，1，3-二烯丙基-8-环己基黄嘌呤(DCHX)和环己基咖啡因(CHC)；最优选的化合物是DCHX。以前未曾公开的这些化合物和含有这些化合物的药物组合物本身即本发明的实施方案。具体地说，本发明首次公开的化合物具有下式其中(a)R1和R3相同，是甲基或烯丙基，R7是乙基，环丙基甲基或氢，R8是环己基，条件是当R7是氢时R1是烯丙基，当R7是乙基或环丙基甲基时R1是甲基，或(b)R1和R3均为甲基，R7是氢或甲基，R8是环己基甲基或环庚基。根据上述结构的优选化合物是化合物17，即1，3-二烯丙基-8-环己基黄嘌呤(DCHX)。可选地，或另外，例如DP-CPX、CHC或DCHX的药用衍生物或其组合物作为进一步的实施例，可用于本发明方法，该方法为本发明提供另一个实施方案。最好这样的衍生物在本发明的治疗方法中有等价的治疗效用。用于本发明方法的化合物可通过任何合适的方式给药。本领域技术人员应当理解，本发明的化合物对动物(尤其是人)给药时有许多合适的方法，虽然某种具体药物的给药途径不止一种，但某一具体给药途径比其它途径反应更直接更有效。化合物优选地直接施用至患者肺部。优选地，化合物作为药用水溶液施用。更优选地，所施用化合物的水溶液含约0.001至约0.01％重量比的化合物，药用气溶胶是另一优选给药方式。气溶胶优选地含约0.001至约0.01％重量比的化合物。化合物亦可口服。这种情况下化合物给药量通常是每天约0.1至1mg/kg体重。用于口服的本发明化合物优选量是每天约0.1mg/kg体重，也可采用其它给药途径，如静脉内和腹腔内给药。施用化合物应使治疗有效浓度的化合物与体内患病细胞接触。本发明对动物，尤其是人的给药剂量应足以在一段合理的时间范围内于动物体内产生疗效。药量应根据选定化合物的强度、动物的情况及受治疗的动物的体重来确定。药剂大小也应根据对特定患者伴随特定的化合物给药及特定给药途径可能存在的毒副作用是否存在及其习性和范围来确定。通常本发明的化合物在低剂量时可以有效治疗。有效剂量范围是血液中约30nM至约100nM。相应地，化合物通常以相对低的剂量给药。化合物可以在药用载体中给药。本发明包括含有本发明化合物和药用载体的药物组合物。药用载体为本领域技术人员熟知。可部分地由特定化合物以及给药的特定方法选择载体。相应地，本发明的药物组合物有许多适当的制剂。适于口服的制剂包括(a)溶液，例如有效量的化合物溶于稀释剂如水或盐水中，(b)胶囊，香粉剂或片剂，各含预定量的活性成分如固体或颗粒，(c)于适当液体中的悬液，(d)适当的乳剂。片剂形式可包括下列的一种或多种乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、纤维素微晶、阿拉伯树胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、增湿剂、防腐剂、香味剂和医药相容载体。锭剂形式可包含香味剂中的活性成分，通常香味剂为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶；锭剂可含有惰性基质中的活性成分，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶乳剂，凝胶；其他给药形式除含活性成分外，还含本领域已知的此种载体。适于吸入给药的制剂包括气溶胶制剂，它被置于加压的可接受推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。活性剂可用适当赋形剂气溶胶化。适于静脉内和腹腔内给药的制剂例如包括水相或非水相的等渗无菌注射液，可含抗氧剂、缓冲液、细菌抑制剂、以及使制剂与接受者血液等渗的溶剂，或是含有悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水相或非水相无菌悬浊液。制剂可包装于单剂量或多剂量密封容器，如安瓿和小瓶中并存于冷冻干燥条件下，使用前仅需加入无菌液相载体(如水)用于注射。对上述无菌粉末、颗粒和片剂可临时配制注射溶液和悬浊液。诱导细胞Cl-外流的最适程度依赖于受治疗的具体疾病或状态，以及病人的稳定性与可能的副作用。使用适当的剂量和施用化合物方法，本发明提供对氯离子外流速率广泛范围的活化，例如从活化很小到基本上完全活化。本发明估计能有效治疗所有的其特征在于细胞尖端Cl-传导降低的病症，包括各种疾病。具体地说，预计本发明能治疗慢性阻塞性肺病，尤其是囊状纤维变性。下列实施例被用于进一步阐明本发明，而不是用于限制本发明的范围。实施例1本实施例描述用于评价某些CFTR多肽针对膜的活性的方法及其结果。脂质体聚集试验(assay)将磷脂酰丝氨酸(“PS”，得自Avanti)溶于氯仿，用已知的挤迫法(extrusionprocess)制备小的单层膜脂质体。用Lipex仪器在含10mMNa-HEPES，pH7.2和1mMEDTA的缓冲液中挤迫PS。脂质体稀释至终光密度于540nm为0.01，并与不同浓度的不同多肽和/或氯离子外流激活化合物温育。嗜铬颗粒聚集试验从当地屠宰场购得肾上腺，在宰杀后二小时内置于冰上运至实验室。如Brocklehurst等在《(多肽激素实用方法》(牛津大学出版社，K.Siddle和J.Hutton编，1990)237-255页的描述处理组织。在阶段梯度的甲泛影酰胺中用标准方法纯化嗜铬颗粒。重悬浮后根据描述(Brocklehurst等，同上)进行颗粒聚集试验。并从540nm光密度的初始增加估计会联蛋白(synexin)活性。简而言之，反应于室温进行，1ml石英杯中含有嗜铬颗粒，悬浮于0.3mol/l蔗糖的颗粒，40mmol/l组氨酸缓冲液pH6.0，会联蛋白和可变量的氯化钙。制备CFTR多肽在耶鲁大学分子生物学和生物物理系用标准固相法合成多肽。用反相HPLC纯化多肽，用本领域的熟知的标准方法直接化学测序，用氨基酸分析和质谱确证序列。具体的多肽是Iα[SEQIDNO1]，Iβ[SEQIDNO3]和Io[SEQIDNO4]。Iα[SEQIDNO1]驱动的嗜铬颗粒和脂质体聚集如图2所示，发现Iα多肽在1mMCaCl2存在时驱动牛嗜铬颗粒聚集。相反，相邻的Iβ多肽[SEQIDNO3]在嗜铬颗粒聚集试验中基本无效。相似地，重叠的Io多肽[SEQIDNO4]也无效。因此这些数据似乎表明Iα的活性为Iα序列特异性的。图3A给出的Iα活性滴定曲线显示k1/2，app是22.2μg/ml或6.3μM。这些数据的Hill图(见图3B)显示Hill系数(nH)是2.6。用磷脂酰丝氨酸脂质体作聚集靶观察到相似的数据，pH5.5至7.5范围的详细滴定曲线显示50％活性时的pH为约6.75(见图4A)。低浓度Iα驱动PS脂质体聚集如图2所示高多肽浓度下聚集反应被迅速起始，并遵循表观一级过程，5-10分钟内有效地到达平台。Iα驱动的聚集反应的协同性可由Hill系数定量看出(见图3A)，该图显示在低多肽浓度，聚集的起始速率很快变小。不过在更长的时间段里可看到仍发生相当多的聚集，虽然其动力学复杂。如图4B所示，动力学涉及初始停滞期约8-10分钟，然后是上升期与平台。Iα多肽小于2μM时由表观一级过程转化成更复杂的过程，在0.4和2μM之间该复杂过程明显显示剂量依赖性。相应地，Iα驱动上述膜聚集现象，而相邻的(Iβ)或部分重叠的(Io)多肽序列对于CFTR不驱动这种聚集。有效的内部负调控明确显示CFTR在Iα位点存在特殊的功能特性，该特性明显涉及膜。实施例2本实施例描述某些氯离子外流激活化合物与Iα的特异性结合以及某些不激活氯离子外流的化合物不能结合Iα。CPX用作能激活ΔF508突变体细胞氯离子外流的代表性化合物。在DMSO中制备mM浓度范围的CPX贮液。Iα多肽(100nM终多肽浓度)溶于100μl的含50mMTris(pH7.0)，300mM蔗糖和10mM谷胱甘肽的缓冲液。37℃温育1小时后，加入1-100nM3H-CPX(ICN，比活＝109Ci/mol)，进一步温育15分钟。作为置换研究，将未标记的CPX或其它黄嘌呤拮抗剂和核苷酸加入温育混合液中，再加放射性探针。混合液用标准点印迹仪滤过硝酸纤维素膜(NC)(Schleicher&amp;Schuell)。用0.3％聚乙烯亚胺(PEI)封闭滤膜可降低3[H]-CPX对NC滤膜的非特异性结合。然后用200μlTris缓冲液-NaCl溶液(50mMTrispH＝7.0，150mMNaCl)洗点印迹5次，切掉放射位点，用液体闪烁计数确定总的放射性。用10μM未标记的CPX预杂交作非特异性结合，从总的结合中减去非特异性结合得到3H-CPX对Iα的特异性结合。3H-CPX对Iα的结合是CPX浓度的可饱和函数。将数据拟合成Scatchard图，显示KD，app为69±27nM(n＝4)。由Scatchard图截距估计的Bmax值表明结合的Iα多肽的摩尔比小于1/2000。CPX、咖啡因、DAX和所有已知的氯离子外流激活物均能置换结合，但不激活氯离子外流的IBMX或2-硫代-CPX不置换结合。这些数据表明氯离子外流激活物特异性结合Id，CPX激活带有ΔF508突变的细胞的机制是通过与CFTR分子本身相互作用。而且由于氯离子外流激活物结合Iα而非氯离子外流激活物不结合Iα这种特异性，这种方法可用于鉴定其它的CFTR结合蛋白，这些蛋白可能对CF细胞有疗效。实施例3本实施例描述CPX对Iα驱动的PS脂质体聚集的影响。研究CPX对Iα驱动的PS脂质体聚集的影响。研究的CPX浓度介于1和30nM(观察到对含ΔF508细胞的激活)，介于30和100nM(观察到对上述细胞的最大激活)，直到1000nM(观察到对上述细胞激活的抑制)。如图5所示，仅有0.5μg/ml(0.18μM)Iα驱动的脂质体聚集很弱。但随着CPX浓度的增大，在停滞约5分钟后聚集反应被持续地激活。在100nMCPX时观察到最大激活速率和程度，此后随CPX浓度增大到300nM，激活又下降。图5的嵌入图显示每隔20分钟的反应程度。相应地，这些数据显示CPX对(1)含ΔF508细胞与(2)Iα聚集的作用的浓度依赖性相平行。实施例4本实施例描述其它黄嘌呤对Iα驱动的PS脂质体聚集的影响。本研究包括某些能激活ΔF508中氯离子外流的黄嘌呤衍生物(如咖啡因和N，N-二烯丙基环己基黄嘌呤(DAX)或不激活这种氯离子外流的黄嘌呤衍生物(例如2-硫代-CPX和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX))。图6给出PS脂质体聚集试验的结果。从图可看出，咖啡因激活Iα聚集的能力较低，似乎在高浓度不激活Iα聚集。图6的嵌入图显示每隔20分钟的反应程度，在检测的咖啡因浓度范围内，聚集根本不趋于水平。对于DAX，其强度与CPX范围相同，但浓度高达300nM亦未见失活(见图7)。图7的嵌入图显示每隔20分钟的反应程度。从这个角度，我们可以在同一图上(图8)比较CPX和DAX，可见DAX比CPX强度低至少半个数量级。不过对于氯离子外流，DAX和CPX的效力几乎相同。由于溶解度限制，DAX浓度不能很高。脂质体聚集试验包括了不能激活携带ΔF508突变的细胞的氯离子外流的化合物2-氯-CPX和IBMX，可见这些化合物在分别高至1和15μM的浓度范围内完全不能促进Iα驱动的脂质体聚集。相应地，Iα驱动的PS脂质体聚集试验给出的结果与能够以及不能激活氯离子外流的黄嘌呤衍生物的结果平行。实施例5本实施例描述腺苷对Iα驱动的PS脂质体聚集的影响。在PS脂质体聚集试验中包括有腺苷。腺苷对Iα驱动的脂质体聚集反应有小而明显的双相作用。在70-100nM的低浓度时，腺苷温和地激活聚集反应。不过在高浓度就失去了激活作用。腺苷浓度大于等于1μM时，聚集反应已被抑制得低于已经很低的对照水平。这些数据因此显示黄嘌呤、CPX和DAX明显与Iα多肽上亲和腺苷的位点相互作用。实施例6本实施例描述本发明以及以前公开的新的黄嘌呤衍生物的合成与化学分析。由黄嘌呤衍生物的N-7位置的烷基化得到化合物13、17、21和23，实验方法描述见Jacobson等，医学化学杂志(J.Med.Chem.)，36，2639-2644(1993)和Daly等，医学化学杂志，29，1305-1308(1986)。关于化合物8-12、14、18、19、20和25合成的描述见Jacobson等(生化医药学(Biochem.Pharmacol.)37，3653-3661(1988))；Shimada等(医学化学杂志，35，924-930(1992))；和Shamim等(医学化学杂志，32，1231-1237(1989))；化合物7、14、18和19由Müllet等(医学化学杂志，36，3341-3349(1993))和Shamin等(医学化学杂志，35，924-930(1989))公开。化合物1-5和26，以及2-氯腺苷购自ResearchBiochemicalsInternational(Natick，麻省)。化合物27由Thompson等(医学化学杂志，34，2877-2882(1991))公开。表1最大浓度％对照阈值％对照化合物R1，R3＝R7＝R8＝Ki，μM(A1)Ki，μM(A2)(nM)百分比(nM)百分比8-未取代1aMeHH8.525100150±301130±202MeMeH294810170±201120±303bMe，iBucHH716＞＞104---------8-环戊基4dMeH环戊基0.0111.4＞＞104---------5ePrH环戊基0.000460.3430200±101130±106PrMe环戊基2.311.4±1.41000180±4030125±307Pr，HfH环戊基0.0140.5830160±401130±208gPrH环戊基0.000660.31＞＞104---------9PrH3-氟环戊基0.042---＞＞300---------10PrH3-碘环戊基0.058---＞＞300---------11PrH环戊-3-基0.0450.640±0.061＞＞300---------12PrH新金刚烷基0.00130.3810170±201120±58-环己基13MeH环己基0.030±0.0151.04±0.203160±200.1130±2014MeMe环己基2817.13150±303150±3015MeEt环己基6.66±0.993.23±0.36＞＞104---------表1最大浓度％对照阈值％对照化合物R1，R3＝R7＝R8＝Ki，μM(A1)Ki，μM(A2)(nM)百分比(nM)百分比16Me环丙基甲基环己基8.23±1.624.53±1.37＞＞104---------17allylH环己基0.0656±0.01894.94±0.68103260±7030170±4018PrH环己基0.00150.423±0.055＞＞104---------19PrMe环己基2.79.24±0.375170±505170±5020PrH环己-3-烯基0.0100.905±0.128104150±30104150±3021MeH环己基甲基0.610±0.0765.47±0.86＞＞104---------22MeMe环己基甲基3.71±0.365.46±0.47＞＞104---------8-环庚基23MeH环庚基0.0659±0.01451.05±0.19＞＞104---------24MeMe环庚基19.5±2.53.27±0.98＞＞104---------8-stryryl或8-芳基25iMeMe3-氯280.05430160±3030160±3026jPrHp--OCH2CONH(CH2)2NH20.00120.08＞＞104---------非黄嘌呤拮抗剂279-乙基-6-环戊基腺嘌冷0.4417＞＞104---------a，茶碱；b，IBMX；c，1-甲基-3-异丁基；d，CPT；e，CPX；f，1-丙基-3-H-类似物(Müller等，医学化学杂志，36，3341-3349(1992))；g，2-硫代而非氧化；h，KW-3902；i，CSC；j，XAC烷基或环烷基羧酸与5，6-二氨基-1，3-二甲基尿嘧啶反应得到相应胺，包括5-(环庚酰基氨基)-6-氨基-1，3-甲基尿嘧啶和5-(环己基甲基羰基)-6-氨基-1，3-甲基尿嘧啶，方法如下将酸(1当量)溶于含1，3-二烷基-5，6-二氨基尿嘧啶(1.5当量)的最小体积的N，N-二甲基甲胺(DMF)中。加入1-(3-二甲基氨基-丙基)-3-乙基羰二亚胺HCl(1当量)，再加入催化量的(0.05当量)4-(N，N-二甲基氨基)吡啶和0.05当量的咪唑。将混合物在室温搅拌3小时，加入饱和的氯化钠溶液(对1，3-二丙基衍生物，需要加水)形成沉淀或不定形不溶部分。滤出不溶性残留物，溶于含足量甲醇的4N氢氧化钠溶液，得到澄清溶液。将混合物在60℃下加热2小时或加热到起始物质完全看不见为止，用TLC(硅板，CHCl3；CH3OH；HOAc；85∶10∶5v/v)来判断。混合物冷却后用6N盐酸水溶液调酸至pH1。沉淀用水清洗，干燥，用制备型硅板(85-95％CHCl3；5-15％甲醇；1-5％HOAc)进一步纯化。用VarianGEMINI-300FT-NMR仪300MHz质子核磁共振质谱确定新的化合物(并指认共振峰)。除非另有声明，化学位移被表示成四甲基硅烷低场的ppm。用VG7070F质谱仪EL模式或用质谱仪作化学电离质谱(NH3)确定新化合物。化合物15，16，22和24的代表性谱数据是1HNMRCDCl3δ3.42(S，3HN3CH3)；3.63(S，3HN5CH3)；3.89(S，6HOCH3)；5.06(S，2H，OCH2)；6.8(S，2H)；6.78(d，1H，J＝16Hz)；7.3-7.5(m，5H)；7.7(D，1H，J＝16Hz)；MS(Cl)m/e463(MH+基线)，375，357。由AflanticMicrolabs(Norcross，佐治亚州)进行碳氢和氮分析，±0.4％容许误差。应用上述技术的定性研究的总结见表2，给出了化合物15-17和21-24的分子式和元素分析。</tables>在生物实验前所有的黄嘌呤衍生物用薄层层析均判定为纯品。实施例7本实施例描述在将CFPAC细胞接触本发明的黄嘌呤衍生物时对这些细胞氯外流的测量，包括培养细胞和对其进行实验的方法。CFPAC细胞是胰腺癌细胞，对最普通的CFTR突变，即Phe508缺失(Schoumacher等，美国国家科学院院刊，87，4012-4016(1990))是纯合的。CFPAC细胞和CFTR转染的CFPAC细胞(CFPAC-47CFTR)得自R.Frizzell，阿拉巴马大学。破碎细胞以低密度接种于24孔COSTAR板上，培养基含有Iscove培养基，并添加了10％(v/v)热失活的胎牛血清，100单位/ml青霉素，100mg/ml链霉素，0.25mg/ml两性霉素和1％(wt/vol)谷氨酰胺，渗透压调至310mOsm。所有培养用物质均购自Biofluids(Rockville，马里兰州)。5小时后移走培养基，粘壁细胞于37℃在5％CO2/95％空气的气氛中生长48-72小时至汇合。每次实验前，细胞如下载入[36Cl-]。用实施例6给出的培养基洗汇合的细胞4次。然后在最后一次清洗液蒸发净后，每孔加入含约1.4×108cpm[36Cl]-(Amersham)的500μl培养基。细胞板在5％CO2/95％空气的气氛下37℃温育过夜，使[36Cl]-同位素达到平衡。起始外流实验时，将CPX和/或其它黄嘌呤衍生物的浓度加到细胞中，19℃温育15分钟。温育后，细胞用含150mM葡糖酸钠，1.5mM葡糖酸钾和10mMNa-Hepes(pH7.4)的冰冷的清洗培养基等分试样连续洗4次。然后于19℃加入500μl无碳酸氢盐的流动培养基，每孔在0、1、2、3、5、7和10分钟时各取出50μl等分试样开始取样。流动培养基含150mM葡糖酸钠，1.5mM葡糖酸钾，10mMNa-Hepes(pH7.4)，100μM丁苯氧酸以抑制协同转运蛋白造成的外流，不同浓度的CPX和其它药物，如A1-腺苷拮抗物和cAMP合成的激活物，后面的实施例描述为何需要这些药物。渗透压是310mOsm。每次流动实验后，加入20μl50％三氯乙酸至终浓度为5％，测量残留放射性。样品与1.5ml细胞闪烁流体混合，于BeckmanLS9000闪烁计数仪，窗口置于最大波长，检测2分钟。用渗透压计凝固点降低法测渗透压，见Eidelman等，同上，1992。用本发明的黄嘌呤衍生物重复氯外流实验至少4次，得到的数据总结于表1。另外每次重复实验的每个数据点由4个独立细胞的外流测量平均值计算得到。标有“最大波长(nM)”的列表示黄嘌呤衍生物对氯外流影响最大时的浓度，其右列代表氯外流受最大影响时相对对照的百分比。标有“阈值(nM)”的列代表能检测到黄嘌呤衍生物对氯外流影响时衍生物浓度，其右列代表最小检测时氯外流相对于对照的氯外流。由表1可见，最大激发范围是从约3nM(例如对化合物14)到超过104nM(例如对化合物3)。最大激发浓度时相对对照的百分比增加从约10％(即无效化合物如化合物2和12)到约260％+/-70％(化合物17)。氯外流阈值激发的黄嘌呤衍生物浓度约104nM(例如化合物20)。阈值激发浓度时相对于对照的百分比从约120％(化合物12)至约170％(例如化合物17)。由这些数据，并且由于对任何药物倾向用较低浓度来达到所需结果以使不需要的副作用降到最小，可见化合物6、7、13、14、17、19和25由于其在μM级或更低浓度激发氯外流的能力明显而成为优选化合物。图9-12形象地给出流动研究数据，化合物1即茶碱(图9)；化合物5即CPX(图10)；化合物22即8-环己基甲基咖啡因(图11)和化合物17即1，3-二烯丙基-8-环己基黄嘌呤(图12)。图9-12垂直轴代表放射性标记氯的[36Cl]-外流(FA)作为受试化合物浓度(水平轴)的函数。用标准方法log(FA)作时间的函数，线性回归计算得这些数据，并作为相对同一板上对照孔的恒定速率的百分比给出。用Quatro-Pro4.0程序处理数据。误差条代表4个实验的S.E.M.值(即n＝4)。观察图9-12可明显看出化合物1、5和22具有与对照相比能诱导出200％的外流速率的特性。化合物17也表现出比对照大于100％的外流能力，但与其它3种化合物比要小。图示给出结果的这四种化合物中，化合物1和22对两种受试的腺苷受体亲和性均小，化合物17对A1受体的亲和性较小(Ki≌0.07)，化合物5对A1受体的亲和性极大(Ki≌0.005)。尽管化合物17比例如化合物5对A1受体的亲和性小得多，但由表1可见，其绝对的氯外流能力要有效得多(化合物17最大值为对照的260％，而化合物5为200％)。实施例8本实施例描述检测腺苷受体结合的试验和这些试验的结果，这些试验用来确定本发明的新型黄嘌呤衍生物的部分性质。根据Hide等，分子药物学(Mol.Pharmacol.)41，352-359(1992)的方法制备大鼠脑片层膜和纹状膜，于37℃腺苷脱氨酶(2U/ml)处理30分钟后，-70℃贮存。腺苷衍生物的固体样品溶于二甲亚砜(DMSO)，用常规方法贮于-20℃。贮液用DMSO稀释至浓度≤0.1mM，然后加入液体培养基中。DMSO在检测培养基中的终浓度通常为2％。根据Schwabe等，Naunyn-Schmiedeberg医药丛刊(Naunyn-Schmiedeberg′sArch.Pharmacol.)，313，179-187(1980)和Jacobson等，医学化学杂志36，1333-1342(1993a)的描述测量大鼠脑片层膜中1nM[3H]N6-苯基异丙基腺苷(DupontNEN，Boston，麻省)与A1受体结合的抑制。37℃在总体积为0.5ml的50mMTris盐酸，pH7.4温育膜(～100μg蛋白每管)1.5小时。受试药品溶于DMSO，加入10μl等份试样中，得到DMSO终浓度2％。加入3ml含50mMTris盐酸pH7.4的缓冲液于5℃分开结合的和游离的放射性配体，然后用BrandelCellHarvester(Brandel，Gaithersburg，马里兰州)和WhatmanGF/B玻璃纤维滤膜真空过滤，再加共9ml缓冲液洗涤。用10μM2-氯腺苷确定非特异性结合。根据Jarvis等，药物实验疗法杂志(J.Pharmacol.Exp.Therap.)251，888-893(1989)的报道做5nM[3H]CGS21680(2-[4-[(2-羧乙基)-苯基]乙基氨基]-5′-N-乙基羧氨基腺苷)(DupontNEN，Boston，麻省)与A2a受体结合的抑制。25℃在总体积为0.5ml的含50mMTris盐酸pH7.4和10mMMgCl2的缓冲液温育膜(～80μg蛋白每管)1小时。受试药品溶于DMSO，加入10μl小份中，得到DMSO终浓度2％。用20μM2-氯腺苷确定非特异性结合。用上述BrandelCellHarvester过滤，用上述Tris·HCl/MgCl2缓冲液作洗涤缓冲液。根据每种化合物的IC50适当调整，用至少跨越3个数量级的6种不同浓度。IC50值用GraphPAD程序(InstituteforScientificInformation，科学信息研究所)非线性回归法计算机生成，用Cheng等的方法(生化医药学(Biochem.Pharmacol.)，22，3099-3108(1973)和KD值(Jacobson等，同上，1993a；Ukena等，FEBS快报，209，122-128(1986))对[3H]PIA和[3H]CGS21680结合分别转换成Ki值1.0和14nM。对所有黄嘌呤衍生物在表1的“Ki，μM(A1)”和“Ki，μM(A2)”列给出腺苷受体结合研究的结果。对某个特定受体亲和性高的受体拮抗物特征在于Ki值非常低，这可用上述对A1和A2受体的试验来确定。相应地，可见化合物与对A1受体亲和性高，而化合物6对受试的两种受体亲和性都低。图13-14也描述了上述受体研究得到的数据，重点在于确证改变8-环烷基取代物环大小对结合腺苷受体的影响。图中给出大鼠皮层A1-受体(实心圆，·)和大鼠纹状A2a-受体(空心三角，Δ)的数据。给出δ-环烷基茶碱衍生物(图16)和δ-环烷基咖啡因衍生物(图17)对A1-和A2-受体的亲和性。给出的数值是三次重复中二次或三次重复的平均值(+/-S.E.M.)。δ-环丁基衍生物的数据来自Jacobson等，医药化学杂志，36，2639-2644(1993b)。图13和14显示在茶碱(1，3-二甲基黄嘌呤)衍生物中，环戊基类似物化合物4对A1亲和性最高。咖啡因(1，3，7-三甲基黄嘌呤)衍生物中，环庚基类似物化合物24对A2a有些亲和性(6倍)，而小环(4-6)亲和性小或没有(Jacobson等，同上，1993b)。这些结构活性关系与同亲这些化合物激发Cl-外流的观察结果相差很大。整体考虑上述结果得出，化合物6、14、17和19在低浓度范围有足够的外流活性且对腺苷受体无活性。这些实施例的结果显示有可能(1)用体外脂质体和/或CFTR结合实验鉴定激活细胞氯离子外流的化合物；(2)用对A1或A2腺苷受体亲和性很小或没有的化合物，如化合物6、14、17或19激活CF细胞的氯外流。检验到最有效的化合物是化合物17。若一种药物能特异性激活CF细胞的氯外流，对腺苷受体的影响不大或没有，并且该药的作用不因其对其它组织的副作用而受损害，则该药具有大的医疗优点。所有本文引用的文献，包括专利、专利申请和出版物，均完整地在此引入作为参考。尽管本发明着重针对优选实施方案来描述，但本领域的普通技术人员应明显看出可以采用优选方法、化合物和组合物的变化形式，并且本发明可与本文具体描述的不同地实施。相应地，本发明包括在本发明精神实质与范围内由下面的权利要求限定的所有改进方案。序列表(1)一般资料(i)申请人THEUNITEDSTATESOFAMERICA，REPRESENTEDBYTHESECRETARY，DEPARTMENTOFHEALTHANDHUMANSERVICES(ii)发明题目一种鉴定用于在动物细胞中激活氯传导的结合CFTR的化合物的方法。(iii)序列数6(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容型(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(v)当前申请资料(A)申请号WO(B)提交日期1995年11月6日(C)分类(vi)在先申请资料(A)申请号US343714(B)提交日期1994年11月22日(2)SEQIDNO1的资料(i)序列特征(A)长度32个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQIDNO1ProSerGluGlyLysIleLysHisSerGlyArgIleSerPheCysSer151015GlnPheSerTrpIleMetProGlyThrIleLysGluAsnGluGluPhe202530(2)SEQIDNO2的资料(i)序列特征(A)长度96个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型mRNA(基因组)(xi)序列描述SEQIDNO2CCNUCNGARGGNAARAUHAARCAYUCNGGNCGNAUHUCNUUYUGYUCNCARUUYUCNUGG60AUHAUGCCNGGNACNAUHAARGARAAYGARGARUUY96(2)SEQIDNO3的资料(i)序列特征(A)长度31个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQIDNO3GlyValSerTyrAspGluTyrArgTyrArgSerValIleLysAlaCys151015GlnLeuGluGluAspIleSerLysPheAlaGluLysAspAsnIle202530(2)SEQIDNO4的资料(i)序列特征(A)长度32个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQIDNO4GlyThrIleLysGluAsnGluGluPheGlyValSerTyrAspGluTyr151015ArgTyrArgSerValIleLysAlaCysGlnLeuGluGluAspIleSer202530(2)SEQIDNO5的资料(i)序列特征(A)长度93个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型mRNA(xi)序列描述SEQIDNO5GGNGUNUCNUAYGAYGARUAYCGNUAYCGNUCNGUNAUHAARGCNUGYCARUURGARGAR60GAYAUHUCNAARUUYGCNGARAARGAYAAYAUH93(2)SEQIDNO6的资料(i)序列特征(A)长度96个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型mRNA(xi)序列描述SEQIDNO6GGNACNAUHAARGARAAYGARGARUUYGGNGUNUCNUAYGAYGARUAYCGNUAYCGNUCN60GUNAUHAARGCNUGYCARUURGARGARGAYAUHUCN9权利要求1.一种多肽，它选自Iα多肽[SEQIDNO1]、Iβ多肽[SEQIDNO3]和Io多肽[SEQIDNO4]。2.权利要求1的多肽，其中所述多肽与亲和层析基质共价连接。3.权利要求2的多肽，其中所述亲和层析基质是sepharose、琼脂糖、聚丙烯酰胺或纤维素。4.一种鉴定结合CFTR的化合物的方法，其包括将假定的结合CFTR的化合物与Iα多肽[SEQIDNO1]在足以使该假定的结合CFTR的化合物与Iα多肽结合的条件下相接触，确定结合是否发生，若有结合迹象则说明该假定的结合CFTR的化合物是结合CFTR的化合物。5.权利要求4的方法，其中结合CFTR的化合物对Iβ多肽[SEQIDNO3]或Io多肽[SEQIDNO4]有不确定的或负的亲和性。6.权利要求4的方法，其中结合CFTR的化合物在加入到含脂质体的组合物中时会造成脂质体聚集。7.权利要求4的方法，其中结合CFTR的化合物在加入到含嗜铬颗粒的组合物中时会造成嗜铬颗粒聚集。8.权利要求7的方法，其中该组合物基本上由溶于1mMCaCl2的嗜铬颗粒组成。9.一种治疗需接受治疗的哺乳动物的囊状纤维变性的方法，其包括施用治疗有效量的下式化合物其中R1和R3相同，为C1-C6烷基或C1-R6链烯基，R7是C1-C6烷基或氢，R8是C4-C8环烷基，其中该化合物与腺苷受体的Ki值至少为0.01。10.权利要求9的方法，其中R1和R3是甲基、丙基或烯丙基，R7是甲基或氢，R8是环戊基或环己基。11.权利要求9的方法，其中哺乳动物是人。12.权利要求11的方法，其中化合物选自1，3-二丙基-7-甲基-8-环戊基黄嘌呤，1，3-二丙基-7-甲基-8-环己基黄嘌呤，1，3-二烯丙基-8-环己基黄嘌呤和8-环己基咖啡因。13.权利要求12的方法，其中化合物是1，3-二烯丙基-8-环己基黄嘌呤。14.权利要求9的方法，其中化合物被施用到人的肺部。15.权利要求14的方法，其中化合物以含有约0.001至约0.01％w/w该化合物的含水药物组合物的形式施用。16.权利要求9的方法，其中Ki至少为0.05。17.一种下式化合物其中(a)R1和R3相同，为甲基或烯丙基，R7是乙基，环丙基甲基或氢，R8是环己基，条件是当R7是氢时R1是烯丙基，当R7是乙基或环丙基甲基时R1是甲基，或(b)R1和R3均为甲基，R7是氢或甲基，R8是环己基甲基或环庚基。18.权利要求17的化合物，其中化合物为1，3-二烯丙基-8-环己基黄嘌呤。19.一种药物组合物，它含有药用载体和下式化合物其中(a)R1和R3相同，为甲基或烯丙基，R7是乙基，环丙基甲基或氢，R8是环己基，条件是当R7是氢时R1是烯丙基，当R7是乙基或环丙基甲基时R1是甲基，或(b)R1和R3均为甲基，R7是氢或甲基，R8是环己基甲基或环庚基。20.权利要求19的药物组合物，其中化合物是1，3-二烯丙基-8-环己基黄嘌呤。21.一种多聚核苷酸，它选自Iα多聚核苷酸[SEQIDNO2]，Iβ多聚核苷酸[SEQIDNO5]和Io多聚核苷酸[SEQIDNO6]。全文摘要本发明提供一种方法,该方法可以鉴定用于治疗尖端氯传导降低的细胞(例如囊状纤维变性细胞)的结合CFTR的化合物。本鉴定方法用到CFTR蛋白的组成部分－Ⅰα多肽。本发明还提供一种治疗囊状纤维变性细胞的方法,该方法是通过将尖端氯传导降低的细胞与医疗有效量的用本发明的鉴定方法筛选到的化合物相接触而完成的。用于这种治疗的优选化合物对腺苷细胞受体亲和性很小或无亲合性。本发明提供用于实施本发明方法的新型化合物,以及含有这些化合物的药物组合物。文档编号A61K38/17GK1176648SQ95197439公开日1998年3月18日申请日期1995年11月6日优先权日1994年11月22日发明者H·B·波兰德,K·A·雅各布森申请人:美国政府卫生与公众服务部