含有水溶性聚合物的bdnf与nt－3的结合物的制作方法

专利名称：：含有水溶性聚合物的bdnf与nt－3的结合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类新的BDNF与NT-3的衍生物以及制备上述衍生物的方法，其中一种BDNF或NT-3的分子被连接到一种水溶性聚合物上。
背景技术：
：由于重组DNA技术发展的结果，目前作为治疗用的蛋白质能够以合适的形式足够大量地得到。上述蛋白质的化学衍生物可能会有效地阻止蛋白酶与该蛋白质骨架自身发生接触，从而防止降解。附加的优点可能包括在某种情况下提高该治疗蛋白质的稳定性和循环时间以及降低免疫原性。但应当指出的是一种具体蛋白质的改性效果是无法预测的。有一篇描述蛋白质改性以及融合蛋白的综述性文章，该文章发表在由英国伦敦Mediscript，MountviewCourt，FriemBarnetLane出版的FocusonGrowthFactors34-10(1992)上，作者为弗兰西斯。聚乙二醇(“PEG”或“peg”)为一种如上所述的已经用于治疗蛋白质产物(“聚乙二醇化的蛋白质”)的制备(“聚乙二醇化作用”)的化学部分(moiety)。例如，一种聚乙二醇化的腺苷脱氨酶Adagen现已获准用于治疗严重的组合免疫缺陷性疾病；聚乙二醇化的超氧物歧化酶已经用于治疗头部创伤的临床试验；聚乙二醇化的α干扰素已经用于治疗肝炎的I期临床试验的测试；聚乙二醇化的葡糖脑苷脂酶以及聚乙二醇化的血红蛋白现已报道正处于预临床试验。对于一些蛋白质而言，已经表明聚乙二醇的连接可以防止蛋白水解〔参见Sada等人，发酵生物工程杂志，71卷，137-139页(1991)〕。对于某些聚乙二醇部分的连接方法而言，人们是可以得到的。上述方法可参见美国专利US4,179,337(Davies等人)以及美国专利US4,002,531(Royer)。而对于综述性文章可以参见Abuchowski等人。其它水溶性聚合物也用于使蛋白质改性，诸如乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三氧杂环己烷，乙烯/马来酐共聚物，以及聚氨基酸(或者为均聚物，或者为随机共聚物)。对于聚乙二醇而言，已经使用多种方法将聚乙二醇分子连接到蛋白质上。一般说来，聚乙二醇分子是通过在该蛋白质中发现的一个活性基团连接到蛋白质上的。氨基(诸如那些在赖氨酸残基或N-末端处的氨基)对于这种连接是非常便利的。例如，上述Royer的专利指出采用还原性烷基化作用将聚乙二醇连接到一种酶上。公布于1993年4月28日的欧洲专利申请0539167指出采用PEG的imidate衍生物或同类的水溶性有机聚合物对带有自由氨基的肽以及有机化合物进行改性。美国专利US4,904,584(Shaw)涉及通过活性氨基将聚乙二醇分子连接，从而对蛋白质的赖氨酸残基进行改性。一种具体的已经经过化学改性的治疗蛋白质为粒细胞集落刺激因子，例如G-CSF〔参见欧洲专利公开文本EP0401384，EP0473268以及EP0335423〕。另外一个例子为在美国专利US5,264,209(Mikayama等人)中所描述的聚乙二醇化的IL-6。公布于1985年9月11日的欧洲专利申请0154316也报道了将淋巴细胞因子与一种聚乙二醇的醛反应。蛋白质分子的聚乙二醇化作用通常会生成一种经化学改性的蛋白质分子的混合物。举例说明，将含有五个赖氨酸残基以及一个位于N-末端的自由氨基的蛋白质分子按上述方法反应时，可能会生成一种多相混合物，其中一些有六个聚乙二醇部分，一些有五个，一些有四个，一些有三个，一些有两个，一些有一个，一些则一个聚乙二醇部分也没有。在含有若干个聚乙二醇部分的蛋白质分子中，该聚乙二醇部分可能不会在不同分子中连接在相同的位置上。一般说来，上述方法在蛋白质与聚乙二醇分子间需要一个连接部分。由Delgado等人所描述的方法〔参见“通过Tresyl氯化物的活化作用偶联PEG至蛋白质，及其在免疫亲合细胞分配中的应用”，《使用液相体系分离，在细胞生物学与生物技术中的应用》，Plenum出版社，纽约，纽约州(1989)，211-213页〕提及使用tresyl氯化物使得在聚乙二醇与蛋白质部分之间没有连接基团。由于tresyl氯化物的使用可能会产生毒性副产物，所以这一方法可能很难用于生产治疗产品中。Chamow等人〔参见BioconjugateChem.5133-140(1994)〕报道通过还原性烷基化作用采用单甲氧基聚乙二醇(“MePEG乙二醇”)的醛对CD4粘附素的改性。该作者报道经改性的CD4-IgG(至蛋白gp120)的体外结合量将按照与MePEG化程度的相应速度下降。目前已经知道脑衍生的生长因子(BDNF)与神经营养蛋白-3(NT-3)的属于一类明显的神经营养因子的多肽，该神经营养因子称作神经营养蛋白，该神经营养蛋白包括神经生长因子(NGF)。上述因子促进神经元的存活及其功能的维持，并且是用于治疗神经变性疾病的主要候选药物〔参见Barde等人，《神经元》第2期1525-1534页(1989)；Snider等人，《细胞》，第77期627-638页(1994)〕。在专利文献中已经描述了用于上述因子的鉴定以及重组生产的方法〔参见关于NGF的美国专利US5,169,762(Gray等人)，关于BDNF的美国专利US5,180,820(Barde等人)和美国专利US5,229,500(Barde等人)，以及关于NT-3的已经公开的PCT申请WO91/03569〕。发明概述简而言之，本发明一方面提供一种BDNF与NT-3的衍生物，其中该BDNF或NT-3的多肽部分被连接到一种水溶性的聚合物上。更具体地讲，本发明包括BDNF与NT-3的衍生物，其中该多肽与具反应活性的(即“经活化的”)水溶性聚合物部分反应，从而将该聚合物连接到多肽上。上述连接可能会通过此处所讨论的反应，诸如酰基化作用或烷基化作用来实现。含有聚乙二醇或其它水溶性聚合物的酰基化作用或烷基化作用可能会在其主产物被单-或多-衍生化的条件下进行。多衍生作用通常涉及将聚乙二醇或其它水溶性聚合物连接至该多肽的赖氨酸残基的ε-氨基上，并且还可能涉及将该聚合物连接到该多肽的N-末端上。单衍生作用优选涉及将该聚合物连接到一个BDNF或NT-3多肽部分的N-末端残基的α-氨基上，从而保证选择性地将一个水溶性聚合物部分连接到该多肽的N-末端上。上述作用基本上可以保证制备均一的聚合物/BDNF或聚合物/NT-3的结合物分子以及(如果使用聚乙二醇的话)制备聚乙二醇化的BDNF或NT-3分子，其中该分子是将该聚乙二醇部分直接偶联到该BDNF或NT-3部分上的。在与已知有用的营养因子BDNF和NT-3同样的用途上，本发明的BDNF与NT-3的衍生物也是有用的，它们尤其对于促进体外与体内神经元的存活与维持非常有用，并且在其它药剂当中也可以用作治疗人类神经变性疾病(诸如帕金森氏病，肌萎缩外侧早老性脑硬化(ALS)，杭廷顿氏病，视网膜变性，末梢神经病，以及阿耳茨海默氏病等等)的潜在的治疗剂。正如在下面进一步的实例中所显示的，与本发明相对应的衍生物也能够造成该分子通过脑组织的迁移能力的提高，从而使之更易于传递到定位于大脑中的治疗目标。在另一方面，也即下文将会进一步详细描述的方面，本发明提供一种用于制备上述种类的BDNF与NT-3的衍生物，其中水溶性聚合物，尤其是聚乙二醇被连接至位于该多肽(BDNF或NT-3)的N-末端α-氨基上，从而获得一组均一的衍生化的分子，即含有上述聚合物的该多肽的结合物。附图简要说明图1显示出一个BDNF(或NT-3)酰化的实例，其中采用单甲氧基聚乙二醇醛的N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)活性酯生成一种聚乙二醇化的产物。在该附图中，k代表与一分子的BDNF或NT-3反应的MPEG分子的个数，n代表用于该反应(其中对于分子量为100kDa的MPEG而言n＝2000，而对于分子量为2kDa的MPEG而言n＝40)中的MPEG的聚合程度，而m代表每个BDNF或NT-3分子的伯胺基的总数。图2显示出一个BDNF(或NT-3)非特异性的还原性烷基化作用的实例，其中采用单甲氧基聚乙二醇的活性醛生成一种聚乙二醇化的产物。在该图中，k，m和n与上述定义相同。图3显示出一个于该多肽N-末端残基α-氨基上BDNF或NT-3的位点特异的还原性烷基化作用的实例，采用单甲氧基聚乙二醇的活性醛生成一种基本上被单聚乙二醇化的产物(在该N-末端上)。图4显示出在一个外周神经功能丧失的体内动物模型中轴突被切(axotomized)的面部运动神经元的胆碱乙酰转移酶(ChAT)的免疫组织化学〔参见Yan等人，J.Neurosci.14(9)5281-5291(1994)〕。将成年雌性大鼠右侧的面部神经制成切片，并且每天按如下方式皮下治疗该动物共7天PBS(A)，每千克体重5毫克未聚乙二醇化的BDNF，毫克/千克(B)，0.3毫克/千克在N-末端聚乙二醇化的BDNF(C)，或0.3毫克/千克随机聚乙二醇化的BDNF(D)。在经PBS治疗的大鼠中，轴突被切(axotomy)造成损伤的面部核(A组为在右手侧的面部核)中ChAT免疫活性大大地降低。可是，用未聚乙二醇化的BDNF与聚乙二醇化的BDNF同时治疗(B组，C组与D组)会减弱由损伤引发的ChAT免疫活性的降低。符号如下所示FN，面部核；py，锥体束(pyrimidaltract)；Sp5，三叉神经脊束核。尺寸线(在D组中)代表1毫米。图5显示出随测试动物治疗的剂量-应答曲线，该治疗是在与图4相同的轴突被切的面部运动神经元的模型中用未聚乙二醇化的BDNF与聚乙二醇化的BDNF进行治疗的。该动物每天在指示的剂量下接受仅有溶剂(○)，含有未聚乙二醇化的BDNF(□)，N-末端聚乙二醇化的BDNF(●)或随机聚乙二醇化的BDNF(■)的皮下注射，持续这一阶段超过7天。所得的值以平均值±SEM(n＝4)的形式列出。上述数据先经ANVOA分析，随后经Dunnettt检验。*，p＜0.05；**，p＜0.01，p为BDNF治疗与溶剂的比值。图6是一幅条形图，该图表明在向右侧纹状体的中心单次注射以后，未聚乙二醇化的BDNF(“NAT-BDNF”)或聚乙二醇化的BDNF(“PEG-BDNF”)向活鼠大脑中的渗透。二十小时以后，该动物被灌注4％的多聚甲醛。移出该大脑并将其制成切片，随后采用Yan等人在Soc.Neurosci.Abs.201306(1994)中所描述的方法用一种对BDNF有特异性的抗体进行染色。BDNF渗透到大脑中的总量是通过所有的BDNF免疫活性组织切片的积分来定量的。所得的值以平均值±SEM(n＝4)的形式列出。上述数据经过Studentt检验分析。*，p＜0.0001。图7是一幅条形图，该图表明连续地局部注射超过7天以后，未聚乙二醇化的BDNF与聚乙二醇化的BDNF向活鼠大脑中的渗透。该BDNF的渗透总量的定量与图6中的相同。所得的值以平均值±SEM(n＝4)的形式列出。上述数据经过Studentt检验分析。*，p＜0.0001。图8显示出采用图7所述的方法，在向活鼠大脑中的纹状体灌注之后，未聚乙二醇化的BDNF(A组与B组)与聚乙二醇化的BDNF(C组与D组)通过脑组织向内部定位的多巴胺能神经元的逆向运输。B组与D组分别为A组与C组方形区域内的放大。A组中的符号有下述含义SNC，致密黑质；SNR，网状黑质；以及VTA，腹盖区。D组中的横线对于A组与C组表示500微米，而对于B组与D组表示200微米。发明详述考虑到本发明实际用途为天然(例如自然形成的)序列的BDNF与NT-3，及其片段、前体与相当于衍生于该天然序列的一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加，而所显示的生物学性质类似于该天然序列的多肽分子，例如嵌合体，类似物与同类物的分子。因此，除非另作特别声明以外，此处使用的术语“BDNF”与“NT-3”意指这些以上述任意形式存在的多肽。已知用于制备BDNF与NT-3的方法，其中特别是通过重组的方法，而该重组方法通常是获得大量产物的最实际的方法。在科学与专利文献中描述了一些有用的方法，其中包括那些列在上文所提及的美国专利US5,180,820与US5,229,500以及公开的PCT申请WO91/03569，所有的文献在此引入作为参考文献。对于本发明的实际用途而言，特别优选天然序列的BDNF与NT-3在原核细胞与真核细胞中进行重组表达，其中包括从人类的核苷酸序列表达的重组多肽产物(“r-HuBDNF”与“r-HuNT-3”)，也包括那些在细菌细胞中表达的位于N-末端残基处有一个蛋氨酸残基的重组的多肽产物(例如，“r-metBDNF”与“r-metNT-3”)。上述多肽的实例为具有显示在SEQIDNO1(“r-HuBDNF”)，SEQIDNO2(“r-metHuBDNF”)，SEQIDNO3(“r-HuNT-3”)与SEQIDNo4(“r-metHuNT-3”)的序列中的那些物质。BDNF与NT-3的聚乙二醇化可以通过本领域公知的任意一种聚乙二醇化反应进行〔参见例如FocusonGrowthFactors3(2)4-10(1992)；EP0154316；EP0401384；及其它本文所引用的与聚乙二醇化作用有关的出版物〕。该聚乙二醇化作用优选是通过与一个具反应活性的聚乙二醇分子(或一种类似的活性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行的。这些优选地用于聚乙二醇的衍生化作用的方法将在下面更为详尽地描述。酰化作用通过酰化的聚乙二醇化作用通常涉及将一个聚乙二醇(PEG)的活性酯的衍生物与一个BDNF或NT-3的多肽反应。实际上，任何一种活性的PEG分子均可能被用于进行上述多肽的聚乙二醇化作用。一个优选的经活化的PEG的酯为将PEG酯化至N-羟基琥珀酰亚胺(“NHS”)上。正如此处所使用的，“酰化作用”打算不加限制地包括下列类型的在BDNF或NT-3与一种水溶性聚合物之间的连接诸如PEG酰胺，氨基甲酸酯，氨基甲酸乙酯及其同类物〔参见BioconjugateChem.5133-140(1994)〕。反应条件可以从任意一种本领域已知的或随后有所发展的条件中选取，但是应当避免诸如使待改性的BDNF或NT-3的物质失活的温度，溶剂以及pH值的条件。通常所使用的反应条件将在下面进行描述。图6描述了用一种单甲氧基-PEG的NHS酯的典型反应。通过酰化的聚乙二醇化作用通常会生成一种聚乙二醇化的BDNF或NT-3产物，其中赖氨酸的ε-氨基是通过一个酰基连接基团聚乙二醇化的。优选该连接键为酰胺。也优选该生成产物基本上是被单-，双-或三-聚乙二醇化的(例如≥95％)。但是具有较高聚乙二醇化程度(达到BDNF与NT-3的赖氨酸ε-氨基酸基团的最大数目加上在BDNF或NT-3的氨基末端处的一个α-氨基)的某些物质通常是在依赖于所使用的特殊反应条件的含量下生成的。如果有某些要求的话，可以通过标准的纯化技术(包括尤其是透析，盐析，超滤，离子交换色谱法，凝胶过滤色谱法以及电泳)从含有未反应物质的混合物中分离出更纯的聚乙二醇化的物质。烷基化作用通过烷基化的聚乙二醇化作用通常涉及在有一种还原剂存在下将PEG的一种醛的衍生物与一种诸如BDNF或NT-3的多肽反应。通过烷基化的聚乙二醇化作用也能生成聚乙二醇化的BDNF或NT-3。图7显示出一个典型的生成一种聚乙二醇化产物的还原性烷基化作用。此外，人们可以如此处所述来控制该反应条件，从而基本上便于仅在BDNF或NT-3多肽的N-末端α-氨基上发生该聚乙二醇化反应(即一个单聚乙二醇化的物质)。图8显示出一个典型的与BDNF或NT-3生成一种单聚乙二醇化产物的还原性烷基化作用。在任意一种单聚乙二醇化作用或多聚乙二醇化作用的情况下，该PEG基团优选通过一个-CH2-NH-基团被连接在该多肽上。特别指出的是-CH2-基团，这种类型的键此处称作一个“烷基”键。通过还原性烷基化作用生产一种单聚乙二醇化产物的衍生化作用利用了不同类型伯胺基的(赖氨酸与其N-末端的比值)不同的反应性能，该伯胺基是在BDNF或NT-3的衍生化作用中可以利用的基团。上述反应是在某一pH值(参见下文)下进行的，而该pH值可以让人们利用赖氨酸残基的ε-氨基与该多肽N-末端残基α-氨基间pKa值的差异。通过这种选择性的衍生化作用，向一种多肽上连接含有一个活性基团(诸如一个醛基)的一种水溶性聚合物是可以控制的。与该聚合物的结合作用主要地发生在该多肽的N-末端上，而且其它具反应活性的基团诸如赖氨酸侧链氨基，不发生明显的改性作用。在一个重要的方面，本发明提供了一种基本上均一的单聚合物/BDNF或单聚合物/NT-3的结合物的分子制剂，而这表明BDNF或NT-3仅在一个单一的位置上被连接到一个聚合物分子上(例如≥90％)。更具体地讲，如果使用聚乙二醇的话，本发明也提供聚乙二醇化的BDNF或NT-3，其可能缺少抗原连接基团并且含有被直接耦联到该BDNF或NT-3多肽上的聚乙二醇分子。于是在一个优选的方面，本发明涉及聚乙二醇化的BDNF与NT-3，其中该PEG基团通过酰基或烷基键连接至BDNF与NT-3上。正如上述所讨论的，该产物可以被单聚乙二醇化或多聚乙二醇化(诸如含有2-6，优选2-5个PEG基团)。该PEG基团通常被连接到该多肽上，连接点位于该多肽链的α和/或ε氨基处，但是也应当预测到该PEG基团可以被连接至该多肽结构的任意一个氨基上，该结构在适宜的反应条件下，是具有足够的反应活性的以被连接至一个PEG基团。在酰化作用与烷基化作用的方法中所使用的该聚合物分子可以选自水溶性聚合物或其混合物。所选择的聚合物应当是水溶性的，以便于在液态环境下(诸如一个生理环境下)该聚合物所连接的多肽不发生沉降。所选择的聚合物应当被改性至具有一个单一的反应活性基团，诸如优选对于酰化作用而言的活性酯或对于烷基化作用的醛，以便于该聚合程度能够如本发明所提供的那样得到控制。一个优选的具反应活性的PEG醛为聚乙二醇丙醛(该物质在水中是稳定的)，或其单Cl-C10的烷氧基或芳氧基的衍生物〔参见美国专利US5,252,714〕。该聚合物可以是有支链的或无支链的。对于治疗用的最终产品的制备，优选该聚合物为可药用的。该水溶性聚合物可以选自例如聚乙二醇(单甲氧基-聚乙二醇)，葡聚糖，聚-(N-乙烯吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化的多元醇(例如甘油)以及聚乙烯醇。对于酰化反应而言，所选择的聚合物应当具有一个单一的反应活性酯基。对于本还原性烷基化作用而言，所选择的聚合物应当具有一个单一的反应活性醛基。一般说来，该水溶性聚合物将不从自然形成的糖残基中选择，因为上述物质通常可以通过哺乳动物重组表达系统方便地制得。该聚合物可以是任意分子量的，并且可以是有支链的或无支链的。此处所使用的一种特别优选的水溶性聚合物为聚乙二醇。正如此处所使用的，聚乙二醇意指包括任意一种形式的已经用于使其它蛋白质衍生化的PEG，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。通常可以在任意一种适宜的条件下进行该衍生化作用，其中的条件为将具有生物学活性的物质与经活化的水溶性聚合物分子进行反应的条件。用于制备聚乙二醇化的BDNF或NT-3的方法通常包括如下步骤(a)在某一条件下，将一种BDNF或NT-3的多肽与聚乙二醇(诸如PEG的一种具有反应活性的酯或醛的衍生物)进行反应，从而BDNF或NT-3被连接到一个或多个PEG基团上，以及(b)获得该反应产物。一般说来，酰化反应的最佳反应条件将在已知参数与所需结果的基础上逐个情况地进行测定。例如，PEG蛋白质的比值越大，聚乙二醇化产物的百分比也越大。在本发明的方法中，为了生成基本上为一组均一的单聚物/多肽的结合物分子，还原性烷基化作用通常包括如下步骤(a)在还原性烷基化反应的条件下、且在其pH值适于在该多肽的氨基末端α-氨基处进行选择性地改性的条件下，将一种BDNF或NT-3的多肽与一种具有反应活性的PEG分子进行反应，以及(b)获得该反应产物。对于基本上为一组均一的单聚物/BDNF或单聚物/NT-3结合物分子而言，该还原性烷基化作用的反应条件为那些允许该水溶性聚合物部分选择性地连接至该多肽N-末端上的条件。上述反应条件通常保证在该赖氨酸ε-氨基与N-末端α-氨基之间pKa值的差异(该pKa值为在50％的氨基被质子化、而50％未质子化的pH值)。该pH值也影响待用的聚合物与多肽之间的比值。一般说来，如果pH值较低，则需要聚合物与多肽的比值过量较大(即N-末端α-氨基的反应活性较差，则需要更多的聚合物来实现最佳反应条件)。如果该pH值较高，则聚合物多肽的比值不需要如此之大(即有较多的反应活性基团可以利用，于是需要较少的聚合物分子)。对于本发明的目的而言，该pH值通常落在3-9的范围内，优选3-6。另外一个重要的考虑为该聚合物的分子量。一般说来，该聚合物的分子量越高，可以连接到该多肽上的聚合物分子的数目越少。与此相仿，当优化上述参数时，该聚合物的分枝也应当考虑。通常分子量越高(或支链越多)，聚合物多肽的比值也越高。一般说来，对于此处所计划的聚乙二醇化反应而言，该聚合物优选的平均分子量为从大约2kDa至大约100kDa(该术语“大约”表示±1kDa)。一个更为优选的平均分子量为从大约5kDa至大约50kDa，并且特别优选从大约12kDa至大约25kDa。水溶性聚合物与BDNF或NT-3的比值通常在1∶1至100∶1的范围内，优选(对于多聚乙二醇化作用)1∶1至20∶1以及(对于单聚乙二醇化作用)1∶1至5∶1。通过采用如上所指示的条件，按照本发明的还原性烷基化作用提供了一种连接方法，其中该连接为将该聚合物选择性地连接到任意一种在氨基末端处具有一个α-氨基的BDNF或NT-3的多肽蛋白质上，并且提供了制备一种基本上为均一的单聚物/多肽的蛋白质的结合物。此处所使用的术语“单聚物/多肽结合物”意指一种组合物，该组合物由被连接到一个BDNF或NT-3分子上的单一聚合物分子所组成。该单聚物/多肽结合物含有一个在N-末端定位的聚合物分子，但该分子并非位于赖氨酸的侧链基团上。上述制剂优选为生产出大于80％的单聚合物/多肽结合物，并且更优选生产出大于90％的单聚合物/多肽结合物，同时还伴有可观测到的未反应分子的剩余物(即缺少该聚合物部分的多肽)。下面的实施例提供了一种至少有大约90％的单聚合物/多肽结合物与大约10％的未反应的多肽的制剂。该单聚合物/多肽结合物是具有生物学活性的。对于本还原性烷基化作用而言，还原剂在液体状态下应当是稳定的，并且优选该还原剂能够仅还原在还原性烷基化作用的初期步骤中所形成的席夫碱。优选的还原剂可以选自硼氢化钠，氰基硼氢钠，二甲胺甲硼烷三甲胺甲硼烷与吡啶甲硼烷所组成。一种特别优选的还原剂为氰基硼氢钠。其它的反应参数(诸如溶剂，反应时间，温度等)以及产物的纯化方法可以在已出版的，与含有水溶性聚合物的蛋白质的衍生化作用有关信息的基础上逐个情况地进行测定(参见本文所引用的出版物)。在以下的实施例中将给出典型的说明。通过酰化作用和/或烷基化作用的方法，人们可以选择制备一种聚合物/多肽的结合物分子的混合物，并且此处所提供的优点在于人们可以选择包含在该混合物中的单聚合物/多肽结合物的比例。因此如果需要的话，人们可以制备出与不同数目的聚合物分子(例如，双-，三-，四-，等等)相连接的不同多肽的混合物并且与采用本方法制备的该单聚合物/多肽结合物的材料化合，从而得到一种事先已确定好比例的单聚合物/多肽结合物的混合物。如上述所提及的，与本发明相应的聚合物/多肽结合物能够用于与已知有用的BDNF和NT-3相同的用途。从前已经表明上述多肽是有效的，例如可以用作促进体外神经元存活与维持的营养因子，从而可以进行研究并且在研究中使用神经元。上述细胞通常在培养中是很难保持其活性的。对于动物体神经学的研究而言，这些相同的生物学活性可以协助上述因子在体内的使用，并且也提供了一种潜在的治疗用剂，该治疗用剂用于治疗与神经元功能丧失有关的神经变性疾病。对于治疗用途而言，本发明的聚合物/多肽结合物可以配制于并且可以溶在任意一种无菌的生物相容的药用载体包括盐水，缓冲盐水，葡萄糖与水中进行施用。在治疗特殊的疾病或状况中发挥效用的BDNF/聚合物或NT-3/聚合物的结合物的用量依赖于上述疾病或状况的实质，并且该用量可以通过标准的临床技术进行测定。当有可能的时候，人们希望首先测定本发明的药物组合物在体外(例如在文献中所描述的BDNF与NT-3的生物测定系统)的剂量-应答曲线，并且随后在人体测定之前先在有用的动物体模型内进行测定。注射的方法包括皮内，肌内，腹膜内，静脉，皮下，鼻内，肺部与口腔给药。此外，人们可能想通过任意一种适宜的方式(包括心室内或鞘内注射)将该药物组合物引入到中央神经系统中。人们进一步可能还想在局部施用该药物组合物至需要治疗的区域。而上述要求是可以实现的，例如可以通过在外科手术期间借助导管通过注射进行局部灌注，或通过使用一种多孔的，无孔的，胶状的，纤维状的或薄膜状材料的植入物来实现。具体实施的描述根据本发明的具体的BDNF与NT-3衍生物的制备及其生理学与生物学特性显示在下文中。所给出的这些实施例更为详尽地描述了本发明，但是并不打算用于限制本发明。在这些实施例中，除非另作声明的以外，均使用在大肠杆菌中重组制备的人类的BDNF与NT-3(即r-metHuBDNF与r-metHuNT-3)。实施例1连接位点在N-末端α-氨基处的单MPEG(6kDa)-BDNF结合物的制备向溶于100mM磷酸钠(该溶液pH为4.0且含有20mMNaCNBH3)的r-metHuBDNF(2.5毫克/毫升)的一个冷却(4℃)并搅拌的溶液中加入两倍摩尔的过量的活化甲氧基聚乙二醇(MPEG)的醛，该醛的平均分子量为6,000道尔顿(即6kDa)。在该反应过程中，蛋白质改性的程度受尺寸排阻色谱的监测，该色谱使用一个Superose6HR10/30柱(Pharmacia)，用含有0.5M氯化钠、pH为6.9的100mM磷酸钠在0.4毫升/分钟的流速下进行洗脱。10小时后，经尺寸排阻色谱法的分析表明所有的多肽(该多肽在溶液中是以二聚物存在的)已经基本上转化成为两种可能的N-末端聚乙二醇化的衍生物的形式MPEG被结合到BDNF二聚物的一个或两个N-末端上。随后用无菌水将该反应混合物总共稀释五倍，并且将其加到一个HiLoad16/10SSepharoseHP离子交换柱(Pharmacia)上，再用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲溶液饱和该柱。在1毫升/分钟的流速下向该柱中装填反应混合物，并且用三倍柱体积的同样的缓冲溶液洗脱未反应的MPEG的醛。采用线性梯度洗脱两种形式的N-末端聚乙二醇化的BDNF二聚物，该线性梯度采用从0％至100％的20mM磷酸钠(其pH为7.5、含有0.75M氯化钠)，进行了五百分钟。含有该BDNF衍生物的部分被合并、浓缩并且无菌过滤。实施例2连接位点在N-末端α-氨基处的单MPEG(20kDa)-BDNF结合物的制备除了采用一种20,000道尔顿(20kDa)的甲氧基聚乙二醇(MPEG)的醛与pH值为5.0以外，重复实施例1的步骤。实施例3通过还原性烷基化作用采用MPEG的醛进行多MPEG(6kDa)-BDNF结合物的制备向溶于100mMBICINE(该溶液pH为8且含有20mMNaCNBH3)的r-metHuBDNF(10毫克/毫升)的一个冷却(4℃)并搅拌的溶液中加入四倍摩尔的过量的甲氧基聚乙二醇(MPEG)的活化醛，该醛的平均分子量为6kDa。在该反应过程中，蛋白质改性的程度受尺寸排阻色谱的监测，该色谱使用一个Superose6HR10/30柱(Pharmacia)，用含有0.5M氯化钠、pH为6.9的100mM磷酸钠在0.4毫升/分钟下进行洗脱。10小时后，经尺寸排阻色谱法的分析表明所有的多肽均已被MPEG进行了改性。随后用无菌水将该反应混合物稀释五倍、调整其pH值为7(使用磷酸)，并且将该混合物加到一个HiLoad16/10SSepharoseHP离子交换柱(Pharmacia)上，再用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲溶液饱和该柱。在1毫升/分钟的流速下向该柱中装填反应混合物，并且用三倍柱体积的同样的缓冲溶液洗脱未反应的MPEG的醛。采用线性梯度洗脱该MPEG-BDNF结合物，该线性梯度为500分钟内，从0％至100％的20mM磷酸钠，其pH为7.5、含有0.75M氯化钠。含有该MPEG-BDNF结合物的部分被合并、浓缩并且无菌过滤。实施例4通过还原性酰化作用采用MPEG的醛进行多MPEG(6kDa)-BDNF结合物的制备除了采用六倍摩尔的过量的MPEG的醛以外，重复实施例3的步骤。实施例5通过酰化作用采用活化的MPEG的衍生物进行多MPEG(6kDa)-BDNF结合物的制备向溶解在0.1MBICINE缓冲溶液(pH值为8)的r-metHuBDNF(6毫克/毫升)的一个冷却(4℃)并搅拌的溶液中加入四倍摩尔的过量的羧甲基MPEG的琥珀酰亚胺基酯，其平均分子量为6kDa。轻轻地搅拌使该聚合物溶解并且在同样的温度下维持该反应。在该反应过程中，蛋白质改性的程度受尺寸排阻色谱的监测，该色谱使用一个Superose6HR10/30柱(Pharmacia)，用含有0.5M氯化钠、pH为6.9的100mM磷酸钠在0.4毫升/分钟下进行洗脱。3小时后，尺寸排阻色谱表明所有的BDNF的二聚物均已被MPEG进行了改性。随后用无菌水将该反应混合物稀释四倍并且将该混合物的pH值调至7(使用0.5M磷酸)。将该溶液加到一个HiLoad16/10SSepharoseHP离子交换柱(Pharmacia)上，再用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲溶液饱和该柱。用三倍柱体积的同样的缓冲溶液洗脱未反应的MPEG的醛。采用线性梯度洗脱该MPEG-BDNF结合物，该线性梯度500分钟内从0％至100％的20mM磷酸钠其pH为7.5、含有0.75M氯化钠。含有MPEG-BDNF结合物的部分被收集、浓缩并且无菌过滤。实施例6通过酰化作用采用活化的MPEG的衍生物进行多MPEG(6kDa)-BDNF结合物的制备除了采用等摩尔比的反应剂以外，重复实施例5的步骤。实施例7通过酰化作用采用活化的MPEG的衍生物进行多MPEG(20kDa)-BDNF结合物的制备除了采用平均分子量为20kDa的MPEG的琥珀酰亚胺基丙酸酯以及为BDNF二聚物的六倍摩尔的过量的MPEG以外，重复实施例5的步骤。实施例8连接位点在N-末端α-氨基残基处的单MPEG(20kDa)-NT-3结合物的制备向溶于20mM醋酸钠(该溶液pH为4.0，含有150mM氯化钠与20mMNaCNBH3)的r-metHuNT-3(4.77毫克/毫升)的一个冷却(4℃)并搅拌的溶液中加入三倍摩尔的过量的活化MPEG，其平均分子量为20kDa。在该反应过程中，蛋白质改性的程度受尺寸排阻色谱的监测，该色谱使用一个Superose6HR10/30柱(Pharmacia)，用含有150mM氯化钠、pH为7.1的10mM磷酸钠在0.4毫升/分钟的流速下进行洗脱。10小时后，尺寸排阻色谱表明所有的蛋白质(该蛋白质在溶液中是以二聚物存在的)已经转化成为两种可能的N-末端聚乙二醇化的衍生物的形式MPEG被结合到NT-3二聚物的一个或两个N-末端上。随后用pH为7.1的20mM磷酸钠将该反应混合物总共稀释五倍，并且将其加到一个HiLoad16/10SSepharoseHP离子交换柱(Pharmacia)上，再用pH为7.1的20mM磷酸钠缓冲溶液饱和该柱。在1毫升/分钟的流速下向该柱中装填反应混合物，并且用三倍柱体积的同样的缓冲溶液洗脱未反应的MPEG的醛。采用线性梯度洗脱上述两种形式的N-末端聚乙二醇化的NT-3的二聚物，该线性梯度采用从0％至100％的20mM磷酸钠(其pH为7.1、含有0.4M氯化钠)。含有该MPEG-NT-3衍生物的部分被合并、浓缩并且无菌过滤。此外，MPEG-BDNF或MPEG-NT-3的结合物也可以通过采用不同平均分子量(例如在5kDa至50kDa的范围内)的MPEG的醛对BDNF或NT-3进行改性而获得，并且可以按照类似的方法进行制备。通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定所生成的聚乙二醇化的BDNF或NT-3结合物的均一性，其中该电泳使用10-20％或4-20％的预制的梯度凝胶(组合型分离系统)。为了描述每一种MPEG-BDNF或MPEG-NT-3物质的有效尺寸(流体动力学半径)，使用一个Superose6HR10/30(Pharmacia)凝胶过滤柱。在280纳米下通过紫外吸收检测该蛋白质。该BIO-RAD凝胶过滤标准物充当球蛋白分子重量的标记物。通过沉降平衡分析超离心法以及辅助基质激光吸收质谱分析法测定上述结合物的分子量。采用N-末端蛋白质序列与肽的谱图验证每一种N-末端MPEG-BDNF或MPEG-NT-3结合物的结构。实施例1-7中所制备的MPEG-BDNF结合物的体外生物学活性是通过该结合物对PC12/pcDneo-trk#18细胞的3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)2H-四唑的内盐摄取量的影响进行测定的。表1中总结了在制备该结合物中所使用的上述结果与基本的反应参数。表1MPEG-BDNF共轭物的特性与制备反应的主要参数的总结</tables>a-摩尔/BDNF二聚体的摩尔b-通过凝胶过滤测定的表观分子量n/a-不可应用的实施例9单MPEG(20kDa)-BDNF结合物对成年大鼠运动神经元的体内生物学活性的评定以前曾表明BDNF可以从自然发生的以及由轴突被切所引发的细胞死亡中救助正在发育的运动神经元〔参见Yan等人，《自然》360753-755(1992)；Oppenheim等人，《自然》360755-757(1992)；Sendtner等人，《自然》360757-759(1992)〕。现已表明轴突被切的成熟的运动神经元对外源BDNF的应答，并且更具体地讲，由不同的给药方式施用的BDNF减弱了成年大鼠面部运动神经中由轴突被切引发的乙酰胆碱转移酶(ChAT)免疫活性的降低。〔参见Yan等人，J.Neurosci.14(9)5281-5291(1994)〕。ChAT活性的降低表示运动神经元功能的丧失，这是因为ChAT是由运动神经元所产生的一种重要的神经递质。因此，上述研究表明BDNF可以作为一种成熟运动神经元疾病的潜在的治疗剂。在本研究当中评价了BDNF的N-末端聚乙二醇化与随机聚乙二醇化的物质对于体内损伤的成熟运动神经元的生物学活性。方法A.动物外科与治疗采用一种混合物(43毫克/毫升克他命盐酸化物，8.6毫克/毫升甲苯噻嗪与1.43毫克/毫升乙酰丙嗪)在0.7毫升/千克体重的剂量下麻醉成年的雌性Sprague-Dawley大鼠(总共有52只大鼠，每组n＝4)。在靠近茎突乳突孔的位置做右侧面部神经元的切片。从外科手术当天开始(0天)皮下治疗上述动物每天一次，共治疗七天。所使用的剂量为每千克体重0.1，0.3，1.0与5.0毫克的未聚乙二醇化的BDNF，N-末端单MPEG(20kDa)-BDNF结合物，或者随机多MPEG-BDNF结合物，上述物质均溶于PBS中。有一组大鼠仅用PBS治疗以作对照。每天测量动物的体重。B.ChAT免疫组织化学采用过量的麻醉剂杀死大鼠并且用PBS、再用溶于0.1M磷酸钠缓冲溶液(pH为7.2)中的4％的多聚甲醛经心室(transcardially)灌注上述大鼠。移取其脑干，用溶于PBS的30％的蔗糖对脑干进行冷冻保护，在滑动切片机夹盘上冷冻该脑干，并且通过面部神经核区切割80微米连续的冠状切片。随后采用大鼠抗ChAT的单克隆抗体(腹水，1∶500，Chemicon，Temecula，CA)、再通过Yan与Johnson在J.Neurosci.8(9)3481-3498(1988)中所描述的ABC方法(Vector实验室，Burlingame，CA)采用2微克/毫升第二生物素马抗鼠抗体进行免疫组织化学处理上述切片。C.免疫组织化学切片的定量使用一台偶联到NikonOptiphot-FXA显微镜上的定量电视显微镜520图象分析仪来定量ChAT染色的相对强度。使用一台配有Nikon-PlanApochromatic2X物镜的510纳米的窄频带过滤器(OrielCorp.，Stratford，CT)产生组织切片中面部核区的高对比图象。ChAT免疫反应活性的相对强度通过获得平均灰度强度进行测定，其中该强度为每一组圈出的核减去与ChAT底片(negative)的灰质相连的背景的染色。对于每一种动物而言，采用含有该面部核的三至四个切片进行定量。由于BDNF的治疗并不影响未损伤的面部核的ChAT的免疫染色，所以上述数据采用同一切片面部核损伤的与未损伤的相对光学密度的比值来表达。上述数据先通过ANVOA、再用Dunnettt检验进行统计分析。D.结果成年大鼠中的轴突被切会造成运动神经元中ChAT免疫反应活性的快速的且可再生的降低〔参见Lams等人，BrainRes.475401-406(1988)与Armstrong等人，J.Comp.Neurol.304596-607(1991)〕。为了评价未聚乙二醇化的BDNF与聚乙二醇化的BDNF对成熟运动神经元的影响，采用上述面部神经切片的示例来研究这些多肽对运动神经元中ChAT的表达的影响。在右侧面部神经切片七天后，ChAT的免疫反应活性从接受PBS治疗的损伤的面部核中大量消失(图4，A组，位于右手侧的面部核)。采用天然的BDNF(5毫克/千克，图4，B组)，N-末端单MPEG-BDNF结合物(0.3毫克/千克，图4，C组)与随机的多MPEG-BDNF结合物(0.3毫克/千克，图4，D组)进行的皮下治疗将随由损伤所引发的ChAT免疫反应活性的降低而发生显著地衰减。为了定量描述上述现象，测量了经ChAT免疫染色的切片的损伤与未损伤的面部核的平均光学密度。在与剂量有关的形式下，天然的，N-末端单MPEG-BDNF结合物与随机多MPEG-BDNF结合物均减少了由损伤所引发的ChAT免疫反应活性的降低(图5)。与载体对照相比，剂量为5毫克/千克的天然BDNF显示出由损伤所引发的ChAT免疫反应活性降低的显著衰减(p＜0.01)。在所检验的每一剂量下与载体对照相比以及在所检验的较低的最接近的剂量下与天然的BDNF相比，采用N-末端单MPEG-BDNF结合物或随机多MPEG-BDNF结合物的治疗会造成显著的提高(p＜0.01)。通过估算，比起天然的BDNF来，用聚乙二醇化的BDNF进行治疗使得剂量-应答曲线向左移动了大约二十倍(图5)，这表明聚乙二醇化的BDNF对于损伤运动神经元的效能的提高。实施例10在鸡胚DRG生物检定中N-末端单MPEG-NT-3结合物的体外生物学活性的评定采用Lindsay等人在Dev.Biol.112319-328(1985)中所描述的鸡胚后根神经节(DRG)验定法测量未聚乙二醇化的NT-3与N-末端单MPEG(20kDa)-NT-3结合物的比较生物学活性。简而言之，将每个储槽内的五个鸡胚(E8)后根神经节作为外植体在胶原基质内进行培养，该基质含有2毫升F14培养基，培养基中含有5％的标准的马血清。在相差显微镜下用肉眼评价该神经营养因子(包括未聚乙二醇化的与聚乙二醇化的)的效果，并且在0-5的程度内记录上述效果(0＝没有轴突的生长，5＝最大的轴突的生长)。在下表2中所报道的结果表明与未聚乙二醇化的NT-3相比，聚乙二醇化的NT-3可以允许无活性损失。鉴于经验的观点认为采用其它经体外分析的聚乙二醇化的蛋白质会产生生物活性的极大下降，本发明则给出了一个令人吃惊的结果。表2E8鸡DRG的体外生物检定样品浓度因子(纳克/毫轴突生长升)NT-30.51，2，2，3，354，4，5，-，-100.5，1，1，1，2500.5，0.5，0.5，1，1聚乙二醇化的54，4，4，2，2，NT-3503，3，2，2，15000，0.5，0.5，1，210003，3，2，1，0.5实施例11N-末端单PEG(20kDa)-BDNF结合物对成年大鼠体内生物学效应-通过脑组织渗透的进一步评价1.纹状体的单次注射将1微升未聚乙二醇化的BDNF或N-末端单MPEG(20kDa)-BDNF结合物(溶于磷酸缓冲盐水中浓度为1毫克/毫升)在体内注射到成年雌性大鼠大脑(n＝4)右侧的纹状体中心达18-20小时。二十小时后，采用过量的麻醉剂杀死上述动物，并且用PBS、再用溶于0.1M磷酸钠缓冲溶液(pH为7.2)中的4％的多聚甲醛经心室灌注上述大鼠。移取该大脑，用溶于PBS的30％的蔗糖对其进行冷冻保护，在滑动切片机夹盘上冷冻该大脑，并且切割成60微米连续的冠状切片。对于其免疫组织化学而言，随后采用1微克/毫升的兔的抗-BDNF的抗体、再通过如上所指出的ABC方法采用2微克/毫升第二生物素羊抗BDNF的抗体处理上述切片。当采用未聚乙二醇化与聚乙二醇化的BDNF的样品时，在纹状体的注射位点处均能看到非常强烈的染色。与未聚乙二醇化的BDNF相比，观测到聚乙二醇化的BDNF扩散到一个更大的组织区域，在图6中看到大约为前者的2.4倍。有许多位于黑质的神经元被标记为阳性(未显示出)。2.纹状体七天的灌注在超过七天的时间段内，成年雌性大鼠(n＝4)在纹状体处每天接受12微克或是未聚乙二醇化的BDNF或是N-末端单MPEG(20kDa)-BDNF结合物的灌注。在本研究中，所有两种形式的BDNF的渗透均比上述单一的注射方式要好。如图7所示，与天然的BDNF相比，聚乙二醇化的BDNF扩散到一个更大的区域，大约为前者的6.1倍。与采用未聚乙二醇化的BDNF相比(图8，A组与B组)，随着用聚乙二醇化的BDNF(图8，C组与D组)进行灌注，在致密黑质(“SNC”)与腹盖区(“VTH”)的许多神经元将更多地被阳性标记。在高能放大倍率下，BDNF-免疫反应活性呈点状并且位于节周神经原内，上述表明BDNF已经从神经末端被逆向运输到细胞体。在网状黑质(“SNR”)的中腹部所观测到的阳性染色位于神经网织内并且与任何细胞体均无关。上述染色是由于非特异性地扩散，而并非受体介导的逆向运输〔参见Ferguson等人，J.Comp.Neurol.313680-692(1991)〕。上述结果是非常显著的。一般说来，经实质施用到动物大脑后会发现BDNF穿过脑组织的扩散非常差。而本数据表明当采用一种聚乙二醇化的BDNF时，可以实现上述扩散能力的显著提高，从而暗示出至少对于上述注射方式而言，聚乙二醇化的BDNF具有潜在的较大的治疗效能。序列一览表(1)一般信息(i)申请人爱姆根公司(ii)发明名称BDNF与NT-3的衍生物(iii)序列数4(iv)联系地址(A)地址爱姆根公司(B)街道德哈威兰德巷1840(C)城市萨奥桑德奥克斯(D)州加利弗尼亚(E)国家美国(F)邮政编码91320-1789(v)计算机可读形式(A)存储媒体类型软磁盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件帕特汀瑞利斯#1.0，版本#1.25(vi)当前申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)名称麻匝，理查德J.(C)委托/文件(docket)号A-298(2)第一号序列鉴定信息(i)序列特征(A)长度119个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述第一号序列鉴定HisSerAspProAlaArgArgGlyGluLeuSerValCysAspSerIle151015SerGluTrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAspMetSer202530GlyGlyThrValThrValLeuGluLysValProGluSerLysGlyGln354045LeuLysGlnTyrPheTyrGluThrLysCysAsnProMetGlyTyrThr505560LysGluGlyCysArgGlyIleAsxLysArgHisTrpAsnSerGlnCys65707580ArgThrThrGlnSerTyrValArgAlaLeuThrMetAspSerLysLys859095ArgIleGlyTrpArgPheIleArgIleAspThrSerCysValCysThr100105110LeuThrIleLysArgGlyArg115(3)第二号序列鉴定信息(i)序列特征(A)长度120个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述第二号序列鉴定MetHisSerAspProAlaArgArgGlyGluLeuSerValCysAspSer151015IleSerGluTrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAspMet202530SerGlyGlyThrValThrValLeuGluLysValProValSerLysGly354045GlnLeuLysGlnTyrPheTyrGluThrLysCysAsnProMetGlyTyr505560ThrLysGluGlyCysArgGlyIleAspLysArgHisTrpAsnSerGln65707580CysArgThrThrGlnSerTyrAsxArgAlaLeuThrMetAspSerLys859095LysArgIleGlyTrpArgPheIleArgIleAspThrSerCysAsxCys100105110ThrLeuThrIleLysArgGlyArg115120(4)第三号序列鉴定信息(i)序列特征(A)长度119个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述第三号序列鉴定TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCysAspSer151015GluSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlaIleAspIleArgGly202530HisGlnValThrValLeuGlyGluIleLysThrGlyAsnSerProVal354045LysGlnTyrPheTyrGluThrArgCysLysGluAlaArgProValLys505560AsnGlyCysArgGlyIleAspAspLysHisTrpAsnSerGlnCysLys65707580ThrSerGlnThrTyrValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeu859095ValGlyTrpArgTrpIleArgIleAspThrSerCysValCysAlaLeu100105110SerArgLysIleGlyArgThr115(5)第四号序列鉴定信息(i)序列特征(A)长度120个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述第四号序列鉴定MetTyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCysAsp151015SerGluSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlaIleAspIleArg202530GlyHisGinValThrValLeuGlyGluIleLysThrGlyAsnSerPro354045ValLysGlnTyrPheTyrGluThrArgCysLysGluAlaArgProVal505560LysAsnGlyCysArgGlyIleAspAspLysHisTrpAsnSerGlnCys65707580LysThrSerGlnThrTyrValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLys859095LeuValGlyTrpArgTrpIleArgIleAspThrSerCysValCysAla100105110LeuSerArgLysIleGlyArgThr115120权利要求1.一种BDNF的衍生物，包含一种被连接到至少一种水溶性聚合物上的BDNF多肽。2.一种NT-3的衍生物，包含一种被连接到至少一种水溶性聚合物上的NT-3多肽。3.一种根据权利要求1或2的衍生物，其中所说的多肽是在细菌细胞中重组生产的。4.一种根据权利要求1或2的衍生物，其中所说的水溶性聚合物选自葡聚糖，聚(N-乙烯吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚丙二醇，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化的多元醇以及聚乙烯醇。5.一种根据权利要求4的衍生物，其中所说的水溶性聚合物为聚乙二醇。6.一种根据权利要求5的衍生物，其中所说的聚乙二醇为一种单甲氧基-聚乙二醇。7.一种根据权利要求5的衍生物，其中所说的聚乙二醇通过一个酰基或烷基键被连接到上述多肽上。8.一种根据权利要求5的衍生物，其中所说的聚乙二醇具有分子量为大约2kDa至大约100kDa。9.一种根据权利要求8的衍生物，其中所说的聚乙二醇具有分子量为大约5kDa至50kDa。10.一种将水溶性聚合物连接到一种选自BDNF与NT-3的多肽的方法，其中所说的水溶性聚合物有一个单一的具反应活性的醛基，所说的方法包括(a)在还原性烷基化作用条件下、且在pH值呈足够酸性可以使得位于所说多肽的氨基末端处的α-氨基具有反应活性的条件下，将所说的多肽与一种水溶性聚合物进行反应；和(b)分离所说的被连接到至少一种水溶性聚合物上的多肽。11.一种根据权利要求10的将水溶性聚合物连接到一种多肽上的方法，其中该方法进一步包括步骤(c)；将所说的被连接到至少为一种水溶性聚合物上的多肽从未反应的分子中分离出来。12.一种根据权利要求10的方法，其中所说的聚合物为可药用的。13.一种根据权利要求10的方法，其中所说的水溶性聚合物选自葡聚糖，聚(N-乙烯吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚丙二醇，均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化的多元醇以及聚乙烯醇。14.一种根据权利要求13的方法，其中所说的水溶性聚合物为聚乙二醇。15.一种根据权利要求10的方法，其中所说的pH值在大约3与大约9之间。16.一种根据权利要求10的方法，其中所说的还原性烷基化作用的条件涉及采用氰基硼氢钠作为还原剂。17.一种将聚乙二醇分子连接到一种选自BDNF与NT-3的多肽上的方法，其中所说的聚乙二醇有一个单一的具反应活性的醛基，所说的方法包括(a)在还原性烷基化作用条件下、且在pH值呈足够酸性可以使得位于所说多肽的氨基末端处的α-氨基具有反应活性的条件下，将所说的多肽与所说的聚乙二醇分子进行反应；(b)分离所说的被连接到聚乙二醇分子上的多肽。18.一种根据权利要求17的将聚乙二醇分子连接到一种多肽上的方法，其中该方法进一步包括步骤(c)将所说的反应产物从未反应的分子中分离出来。19.一种根据权利要求17的方法，其中所说的聚乙二醇分子具有分子量为大约2kDa至100kDa。20.一种水溶性聚合物与多肽的结合物，该结合物通过权利要求17的方法制备。21.一种基本上为均相的BDNF的制备，其中在所说的BDNF的N-末端α-氨基处进行单聚乙二醇化反应。22.一种基本上为均相的NT-3的制备，其中在所说的NT-3的N-末端α-氨基处进行单聚乙二醇化反应。23.一种提高BDNF的体内效能以治疗受损伤的运动神经元的方法，该方法包括使用一种BDNF的聚乙二醇化的衍生物。24.一种提高BDNF或NT-3穿过脑组织的迁移的方法，该方法包括使用聚乙二醇化的BDNF或NT-3。全文摘要神经营养性因子BDNF与NT－3的衍生物。已经通过将这些多肽连接到一种水溶性聚合物,例如聚乙二醇上制备而成。文档编号A61K38/22GK1173183SQ95197321公开日1998年2月11日申请日期1995年11月13日优先权日1994年11月14日发明者O·F·金斯特勒,Q·严申请人:安姆根有限公司