专利名称：含有提高了水溶解度的非水溶性或微水溶性化合物的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及提高了水溶解度的含非水溶性或微弱水溶性化合物组合物。具体地说，本发明涉及含有非水溶性或微弱水溶性化合物的组合物，所说的化合物可用作药物、化妆品、农用化学品、食品和饮料等，化合物的水溶解度因其与作为新的环糊精衍生物的支链环糊精-羧酸结合而得以提高。
在医药领域中，最常见和重要的问题是如何提高非水溶性或微水溶性药物的水溶解度。环糊精已被用作食品添加剂或化妆品添加剂，或者用于提供适当的挥发度或改良口味或味道，或改善乳化作用、成粉或稳定性，以及提高药物或农用化学品的溶解度。据信，环糊精的这些效果是通过在环糊精中形成含有医药组合物之活性成份的复合物而产生的。
环糊精的各种同系物是已知的。它们的水溶解度随其种类不同而异。例如，α、β和γ环糊精分别由6、7和8个葡萄糖单位组成，它们以一种成环的方式相连接，并且据报导α、β和γ环糊精的水溶解度分别为大约15%、2%和23%。
有时，为了使用环糊精提高非水溶性或微水溶性化合物的水溶解度，环糊精本身必须有高水溶解度。然而，常规使用的环糊精的水溶解度都不能令人满意。
在药品中用于提高非水溶性和微水溶性化合物之水溶解度的环糊精，因为其作为注射液等用于人体，所以必须是对人体高度安全的。这样，需要有与药物形成适当的复合物，以促进药物在水中的溶解，而对人体又无不良作用的环糊精。
本发明的主要目的是提供一种含有提高了水溶解度之非水溶性或微水溶性化合物的组合物。
本发明的另一个目的是提供提高非水溶性或微水溶性化合物在水中的溶解度的方法。
本领域技术人员可从参考附图从下面的描述中了解本发明的这些及其他目的和优点。
本发明人已深入研究了使用环糊精提高非水溶性或微水溶性化合物的水溶解度。结果发现，使用具有某些改良特征的新的环糊精，可实现上述目的。从而完成了本发明。
本发明提供一种含有非水溶性或微水溶性化合物及支链环糊精-羧酸的组合物。
本发明还提供一种提高非水溶性或微弱水溶性化合物在水中之溶解度的方法，该方法包括使水溶性或微弱水溶性化合物与支链环糊精-羧酸相结合。
图1显示6-0-环麦芽-庚糖基-(6→1)-α-α-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钠(β-CyD-G2-COONa)和β环糊精(β-CyD)对兔红细胞的均裂作用。
图2显示β-CyD在0.1M等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，于37℃对人红细胞的均裂作用。
图3显示支链环糊精-羧酸盐和支链环糊精对α淀粉酶的稳定性。
图4显示支链环糊精-羧酸盐和支链环糊精对葡糖淀粉酶的稳定性。
图5显示支链环糊精-羧酸盐和支链环糊精对支链淀粉酶的稳定性。
图6显示支链环糊精-羧酸盐和支链环糊精对β-葡糖苷酸酶的稳定性。
用于本发明的支链环糊精-羧酸包括其游离羧酸，和其与碱金属(如锂、钠、钾等)、碱土金属(如铅、镁等)等形成的盐。这些支链环糊精-羧酸可以单独使用或联合使用，或者作为它们的游离羧酸与其盐的混合物使用。
支链环糊精-羧酸是在环糊精环的至少一个葡萄糖单位的6-0位上具有至少一个含羧基有机基团的环糊精。
在支链环糊精-羧酸中的环糊精环例如具有6、7或8个葡萄糖单位。环糊精环较好有7个葡萄糖单位。环糊精的例子包括α环糊精、β环糊精和γ环糊精。
优选的是，含羧基有机基团有1至3个葡萄糖单位，并且在有机基团中至少一个葡萄糖单位的羟甲基基团被氧化成羧基基团。另外优选的是，该有机基团是2-羧乙基或2-羧基-2-羟乙基。
支链环糊精-羧酸的例子包括6-O-环麦芽己糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸(以下缩写为α-CyD-G2-COOH;下列其它化合物的缩写同样也表示在括号中)、6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸(β-CyD-G2-COOH)、6-O-环麦芽辛糖基-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸(γ-CyD-G2-COOH)、6-O-环己麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸(α-CyD-G1-COOH)、6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸(β-CyD-G1-COOH)、6-O-环麦芽辛糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸(γ-CyD-G1-COOH)、2-O-(6-环麦芽己糖基)-乙酸(α-CyD-CH2COOH))、2-O-(6-环麦芽庚糖基)-乙酸(β-CyD-CH2COOH)、2-O-(环麦芽辛糖基)-乙酸(γ-CyD-CH2COOH)、3-O-(6-环麦芽庚糖基)-丙酸(3-羟基丙基-β-CyD-COOH)、2-羟基-3-O-(6-环麦芽庚糖基)-丙酸(2，3-二羟丙基-β-CyD-COOH)、7c-二-O-[α-D-葡糖醛酸基-(1→4)-O-α-D-葡糖基]-(1→6)-麦芽庚糖(二麦糖基-β-CyD-COOH)及它们的上述盐。
具体地说，6-O-环麦芽己糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸(α-CyD-G2-COOH)、6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸(β-CyD-G2-COOH)和6-O-α-环麦芽辛糖基-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸(γ-CyD-G2-COOH)是分别含有α-环糊精(含有6个葡萄糖单位)、β-环糊精(含有7个葡萄糖单位)和γ-环糊精(含有8个葡萄糖单位)的支链环糊精-羧酸。在这些支链环糊精-羧酸中，麦芽糖作为分支通过α-(1→6)键连接到环糊精环的一个葡萄糖单位上，并且使麦芽糖末端葡萄糖单位第6位上的羟甲基(-CH2OH)被氧化成羧基而得到葡糖醛酸。
6-O-环麦芽己糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸(α-CyD-G1-COOH)、6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸(β-CyD-G1-COOH)和6-O-环麦芽辛糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸(γ-CyD-G1-COOH)是新的支链环糊精-羧酸。在这些支链环糊精-羧酸中，葡萄糖作为分支通过α-(1→6)键连接环糊精环中的一个葡萄糖单位上，而且葡萄糖分子第6位上的羟甲基(-CH2OH)被氧化成羧基，而生成葡糖醛酸。
此外，2-O-(6-环麦芽己糖基)-乙酸(α-CyD-CH2COOH)，2-O-(6-环麦芽庚糖基)-乙酸(β-CyD-CH2COOH)，和2-O-(6-环麦芽辛糖基)-乙酸(γ-CyD-CH2-COOH)，也都是新的支链环糊精-羧酸，其中羧甲基基团作为分支连接到环糊精环的一个葡萄糖单位上。
例如可按下述方法制备这些新的环糊精-羧酸或其盐。
如制备6-O-环麦芽己糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-葡糖醛酸(α-CyD-G2-COOH)、6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸(β-CyD-G2-COOH)和6-O-环麦芽辛糖基-α-D-葡糖基-(1→6)-O-α-D-葡糖醛酸(γ-CyD-G2-COOH)或其盐时，须首先制备麦芽糖基-α-环糊精(G2-α-CyD)、麦芽糖基-β-环糊精(G2-β-CyD)和麦芽糖基-γ-环糊精(G2-γ-CyD)。例如，可使用由伪单胞菌属微生物产生的异淀粉酶(Susumu Hizukuri，Amilase Symposium(1985))，使α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精与麦芽糖缩合，制得这些环糊精衍生物。该异淀粉酶是一种由Harada等人(Biochim Biophys，Acta，212，458(1970))公开的酶，用于水解糖原或支链淀粉的α-(1→6)键，以得到直链淀粉样直链多糖。可利用异淀粉酶水解作用的逆反应完成上述缩合。
例如，可在适当缓冲液中，使β环糊精、麦芽糖和异淀粉酶于40至65℃反应约48小时，以得到麦芽糖基-β-环糊精。所用麦芽糖和异淀粉酶的量分别为每摩尔环糊精0.5至2mol，和50，000至200，000单位(U)。
例如，β环糊精、麦芽糖和异淀粉酶在适当缓冲液中于40至65℃反应约48小时，得到麦芽糖基-β-环糊精。麦芽糖和异淀粉酶的用量分别为每摩尔环糊精0.5至2mol和50，000至200，000U。1U异淀粉酶是指每分钟生成1μmolD葡萄糖的还原本领或需的酶量(Agric.Biol.chem，41，2077(1977))。一般将反应混合物冷却以沉淀出过量的环糊精，并回收已沉淀的环糊精。然后经柱层析纯化残留物以得到麦芽糖基-β-环糊精。用于制备麦芽糖基-β-环糊精的环糊精不只限于含7个葡萄糖单位的β环糊精。例如，也可以使用含6个葡萄糖单位的α环糊精和含8个葡萄糖单位的γ环糊精。葡萄糖单位的数目越多，环糊精和麦芽糖之间的反应速率越高。
然而，使如此得到的支链麦芽糖基-环糊精分支部分中葡萄糖的羟甲基基团(-CH2OH)氧化成羧基，得到新的支链环糊精-羧酸。氧化较好按照EP-A-0599646(日本专利申请NO.5-288284)中所述的方法，式其改动方法完成，例如使用伪葡糖杆菌属(Pseudogluconobacter)的微生物进行微生物学选择性氧化。即，优选的方法包括(ⅰ)使麦芽糖基-环糊精与能够将支链部分葡萄糖中的羟甲基氧化成羧基的伪葡糖杆菌属的微生物，或可将其羟甲基氧化成羧基的加工材料接触并反应，(ⅱ)产生并积聚麦芽糖基-环糊精-羧酸，以及(ⅲ)最后收集之。可按照例如USP4877735(JP-A1-85088)或EP-A-221707中所述的方法制备微生物细胞或其培养液。
只要能够将糖的羟甲基基团和/或含OH半缩醛部分氧化成羧基基团，任何伪葡糖杆菌属的微生物均可使用。它们包括经用化学诱变剂例如亚硝基胍处理、紫外光照射等正常诱变，或基因重组等方法所得到的这些微生物的突变体。但较好选用糖或酮伪葡糖杆菌(Pseudogluconobactersaccharoketogenes)。其实例包括EP-A-221707中公开的下列微生物。
糖生酮伪葡糖杆菌K591s菌株FERMBP-1130，IFO14464糖生酮伪葡糖杆菌12-5菌株FERMBP-1129，IFO14465糖生酮伪葡糖杆菌TH14-86菌株FERMBP-1128，IFO14466糖生酮伪葡糖杆菌12-15菌株FERMBP-1132，IFO14482糖生酮伪葡糖杆菌12-4菌株FERMBP-1131，IFO14483糖生酮伪葡糖杆菌22-3菌株FERMBP-1133，IFO11484。
如上所述，该方法中可使用伪葡糖杆菌属微生物本身的微生物细胞。或者，也可使用它们的加工材料。加工材料的例子包括微生物的培养液。另外，还可使用由微生物产生的酶。对于假葡糖杆菌属微生物来说，酶一般是在细胞内积聚的。为方便起见，通常使用微生物细胞本身，使之与糖类原料接触并反应以生成相应的羧酸。最好使用静心细胞。
可按照JP-A1-85088中所述的方法制备这些细胞和其培养液。即，从斜面培养物制备种子培养物并进行主培养，以得到培养液。如必要时，可离心培养液，然后收集沉淀物并用盐水将沉淀物淋洗几次。可使用所得沉淀物进行微生物反应。可在含有可同化的营养素即碳源(如葡萄糖、蔗糖、淀粉等糖或胨、酵母浸育等有机材料)、氮源(如铵盐、尿素、玉米浸泡液的浓缩液、胨等含无机或有机氮化合物)、无机盐(如钾、钠、钙、镁、铁、锰、钴、铜、磷、酸、硫代硫酸等的盐)，以及微量营养素、维生素和辅酶(如ConA、泛酸、生物素、硫胺素、核黄素、黄素单核苷酸(FMN)等)、氨基酸(如L-半脘氨酸，L-谷氨酸等)或含有它们的天然物质的液体培养基中，在通气条件下培养微生物。可使用如此得到的培养物本身。培养在pH4-9，较好为pH6-8条件下进行。
虽然培养时间依据所使用的特定微生物，培养基的特定组成而异，但较好为10至100小时。培养温度一般在10至40℃，较好为25-35℃。培养开始后，当向培养基中加入至少一种稀土元素时，可更有效地产生所需的产物。向培养基中加入的稀土金属的例子包括钪(Sc)、钇(Y)、镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)等。这些稀土金属可以粉末金属或金属片的形式加入，或者可作为含有它们的化合物如氯化物，碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氧化物或草酸盐使用。它们可以单独或联合使用，例如可以同时使用碳酸铈和氯化镧。此外，也可以使分离和纯化这些元素期间制得的粗材料。加入培养基中的稀土元素的量应不使所使用的微生物的生长受到抑制，其用量选择范围一般为0.000001至0.1%(w/v)，较好为0.0001至0.05%(w/v)。可预先将元素加到培养基中。或者可在保温期间将它们连续或间断地加入培养基中。
将参予反应的糖溶解或悬浮在水中或与水混溶的甲醇、丙酮、聚乙二醇等溶剂中，并可使所得溶液或悬液与微生物接触。对所用溶剂的量没有特殊限制，只要不延缓反应即可，并且一般底物浓度范围为0.1至20%(w/v)，较好为1至15%(w/v)。微生物氧化反应可在10至40℃，较好在25至35℃下完成。反应较好在通气条件下完成，例如以0.1至5升/分钟的速率通气，必要时可以50-2，000rpm的速率进行搅拌。虽然反应时间可根据所用糖的伯羟基和/或半缩醛羟基的性质而定，但反应一般可进行5分钟至3天，较好1至24小时。较好适当调整反应pH。反应一般在pH4至9，较好在pH6至8条件下进行。只要不抑制反应的进行，可以使用任何碱来调整pH。碱的例子包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、氢氧化镁、氢氧化铁等无机碱，吗啉代乙基磺酸钠，吗啉代乙基磺酸钙等有机碱。
也可加入阴离子交换树脂，以在没有使用中和剂如上述碱金属调整pH的条件下，选择性地控制反应进行。具体地说，当进行选择性反应以得到一当量氧化产物时，较好向其中加入阴离子交换树脂。只要能吸附所产生的羧酸，任何阴离子交换树脂均可使用。特别可优选苯乙烯型和丙烯阴离子交换树脂。其例子包括Amberlite(产品名，Organocorp.)IRA-400，IRA-401、IRA-402、IRA-410、IRA-900、IRA-910、IRA-35、IRA-68、IRA-94s等，以及Diaion(产品名，MitsubisiKaseiCorp)SA-10A、SA-20A、PA-306、PA-308、PA-406、WA-10、WA-11、WA-20、WA-30等。
当作为底物加入的糖(即有羟甲基基团和/或半缩醛羟基部分的单糖、寡糖或其衍生物、式多糖或其衍生物)已从反应混合物中消失时，停止搅拌，从反应混合物中分离出阴离子交换树脂并用适当溶剂洗脱以得到所需产物。洗脱液的例子包括水溶液如盐水溶液或碱金属盐的水溶液;或盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸等的酸性水溶液。可收集如此洗脱并积聚的糖-羧酸，并按照已知方法或其改动方法进行纯化。
当作为起始材料的上述糖与上述伪葡糖杆菌属的微生物或其加工材料接触以进行氧化时，糖被区域特异性地和分步地氧化，以依据伯羟基或半缩醛羟基部分的数目或性质得到相应的糖-羧酸。这就是由伪葡糖杆菌属的微生物细胞或其加工材料进行氧化的特征。
如所需产物可以很容易地分离时，可在含有上述糖的培养基中培养伪葡糖杆菌属的上述微生物。培养可在相似于制备上述培养物的条件下进行。
可用已知方法或其改动方法收集并纯化如此产生并积聚的环糊精-羧酸。例如，可单独或联合使用过滤、离心、用活性碳或吸附剂处理、溶剂提取、层析、沉淀、盐析等已知的常规方法分离并纯化所需产物。
如上所述，在阴离子交换树脂存在下进行氧化时，静置或离心反应混合物以从反应混合物中分离出阴离子交换树脂。然后用洗脱液洗脱阴离子交换树脂，合并洗脱的含所需产物的部分，并用上述已知方法或其改动方法分离并纯化所需的环糊精-羧酸。
可作为其游离羧酸或其盐制得所需环糊精-羧酸。当作为其游离羧酸制得时，可用常规方法将游离羧酸转化成它的盐。另外，当在碱金属如铁、锂、钠或钾，或碱土金属如镁或钙存在下进行培养时，可在产生并积聚糖-羧酸时生成糖-羧酸的盐。可基于元素分析、熔点、比旋光本领、红外吸收谱、NMR谱、层析谱等鉴定如此制得的产物。
可按照如上述者相同的方法产生α-CyD-G1-COOH、β-CyD-G1-COOH、γ-CyD-G1-COOH、α-CyD-CH2COOH、β-CyD-CH2COOH、γ-CyD-CH2COOH、3-羟丙基-β-CyD-COOH、2，3-二羟丙基-β-CyD-COOH及二麦芽糖基-β-CyD-COOH等其他糖或其盐。
已知水溶解度可因在环糊精中引入作为支链的取代基如麦芽糖、葡萄糖、2-羟丙基、2，3-二羟丙基等而得以增加。例如，G2-β-CyD的水溶解度是β-环糊精的几十倍。然而已经发现，可经氧化G2-β-CyD末端麦芽糖之6位上的羟甲基基团制得相应的环糊精-羧酸或其盐，而进一步增加水溶解度。例如，β-麦芽糖基-β-环糊精的糖-羧酸衍生物(其为环糊精的第一个羧酸衍生物)，具有显著增加的水溶解度(＞200g/100ml水，25℃)。换句话说，已发现本发明中使用支链环糊精-羧酸可极大地增加在水中的溶解度，结果含有作为主体化合物之β-CyD-G2-COOH和/或其盐的包合物，要比含有作为主体化合物之β环糊精的包合物有更高的水溶解度，并且有可能以很高的浓度得到非水溶性或微水溶性化合物的水溶液。
此外，也已发现这些新的环糊精-羧酸要比已知的环糊精有较低毒性，对活体比β环糊精有较小有害作用(如破坏红细胞)，对血液更为安全，并且不容易被酸或酶分解。
因此，在本发明中，可将其与支链环糊精-羧酸一起配成组合物，而提高非水溶性或微水溶性化合物的水溶解度。
对待使用的非水溶性或微水溶性化合物没有特殊限制，并从用作药物的活性成分的在水中不溶或微溶的药物，以及用作化妆品、食品和饮料，农业化学品、兽药等需要提高其水溶解度之活性成分的化合物中适当选择。
用作医药或兽药之活性成分的非水溶性或微水溶性药物的例子包括解热心痛抗炎剂，如水杨酸、萨匹林(Sulpyrine)、氟芬那酸、双氯芬酸、吲哚美辛、丙氯吗嗪、丙氯拉嗪、三氟培拉嗪(trifluoperazine)、阿托品、东茛菪碱、吗啡、哌替啶、Levorphand、羟吗啡酮或其盐等;安神药如安定、氯羟去甲安定、去甲羟安定等;抗微生物剂如灰黄霉素、兰卡霉素(J.Antibiotics，38，877-885(1985))、吡咯化合物(如2-[(1R，2R)-2-(2，4-二氟苯基)-2-羟基-1-甲基-3(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基]-4-[4-2，2，3，3-四氟丙基)苯基]-3-(2H，4H)-1，2，4-三唑酮(triazolne)、氟康唑、甲曲康唑等)等;抗生素如庆大霉素、地贝卡星、卡内多霉素、青紫霉素、托伯拉霉素、丁胺卡那霉素、新霉素硫酸酯、紫苏霉素、四环素、土霉素、罗利四环素、多四环素、氨苄青霉素、哌拉西林、替卡西林、头孢噻吩、头孢替安、cefotamhexetyl、头孢磺啶、头孢克肟、头孢美唑、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢唑肟、拉氧头孢、噻那霉素、Sulfazecin、azthreonam式其盐等;抗肿瘤剂如6-O-(N-氯乙酰基氨基甲酰)-夫马菌醇(fumag;1101)情来霉素、氨甲嘌呤、放线菌素D、绿裂霉素C、红比霉素、阿霉素、新制癌菌素、胞嘧啶、阿糖苷、氟尿嘧啶、四氢呋喃基-5-氟尿嘧啶、Picibanil、香茹糖、左旋四咪唑、bestatin、叠氮美克、甘草皂甙等;抗脂血症剂如安妥吩、2-氯-3-[4-(2-甲基-2-苯基丙氧基)苯基]丙酸乙酯(Chem.Pharm.Bull，38，2792-2796(1990))等;镇咳祛痰剂如麻黄碱、甲基麻黄碱、诺斯卡品、可待因、二氢可待因、烯氧氯酰胺、氯苯嗪酮、匹考哌哒吩、氯哌斯汀、普罗托醇、异丙肾上腺素、羟甲叔丁肾上腺素、间羟叔丁肾上腺素或其盐等;肌肉松驰剂如普立地诺、筒箭毒碱、泮库铵(Pancuronium)等;抗癫痫剂如苯妥英、乙琥胺、乙酰唑胺、氯氮卓等;抗溃疡剂如甲氧氯普胺等;抗抑郁剂如米帕明、氯米拉吩、诺普替林、苯乙肼等;抗变态反应剂如苯悔拉吩、氯非尼拉敏、曲吡那敏、甲地嗪、克立啉唑、二苯拉林、甲氧苯那敏等;强心剂如反二氧樟脑、茶碱醇、氨茶碱、依替褐林等;抗心律失常剂如普萘洛尔、阿普洛尔、布非洛尔、氧烯洛尔等;血管扩张剂如oxyphedrin、地尔硫 、妥拉啉林、梅索苯定、巴美唑等;降压利尿剂如溴化六烃季胺、戊双吡铵、美加明、乙肼苯哒嗪、可乐宁等;抗糖尿剂如格列嘧拉、qlybiside、苯乙福吩、丁福吩、二甲双胍等;抗结核剂如异烟肼、乙胺丁醇、对位氨基水杨酸等;麻醉药拮抗剂如烯丙左吗喃、丙烯吗啡、那诺松或基盐等;激素制剂如类因醇激素(如地塞米松、己烷雌酚、甲硫咪唑、倍地米松、氟羟脱氢皮脂甾醇、去炎松、肤轻松、强的松、氢化可的松、雄三醇等);脂溶性维生素如维生素A(如维生素A1、维生素A2、棕榈酸视黄酯等)、维生素D(如维生素D1、D2、D3、D4和D5等)、维生素E(如α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和二-α-生育酚烟酸酯)、维生素K(如维生素K1、K2、K3和K4)叶酸(维生素M)等。也可以使用上述维生素的各种衍生物。维生素衍生物的例子包括维生素D3衍生物，如5，6-反式胆钙化醇、25-羟基胆钙化醇、1，2-羟基胆钙化醇等;维生素D2衍生物如5，6-反式麦葡钙化醇等。
微水溶性药物的其他例子包括吡罗昔康、双醋瑞因、地系硫 、乙酸甲地孕酮、硝苯地平、尼麦角林、酮洛芬、萘普生、布洛芬、前列腺素等。
用作化妆品之活性成分的非水溶性或微水溶性化合物的例子包括肉桂酸甲酯、肉桂酸乙酯、dl-α-生育酚乙酸酯、α-生育酚(维生素E)、三氯碳酰苯胺、丁子香酚、异丁子香酚、甲基苯基甘油酸乙酯、乙酸香叶酯、胡椒醛、月桂酸己酯、芷香酮、乙酸肉桂酯、油酸癸基酯、乙酸松香酯等。
用作农业化学品之活性成分的非水溶性或微水溶性化合物的例子包括benomyl、carbendazim、fuberidazole、thiophanate、thiomethylphanate、triamol、prochloraz、oxadixyl、dazomet、captan、captafol、quinomethionate、Vancor(已登记的商标)probenazole、diethofhcarb、ferimzone等。
可用作食品或饮料之活性成分的非水溶性或微水溶性化合物的例子包括L-硬酯酸抗坏血基酯、苯甲酸、芷香酮、异丁子酚、麦角钙化醇(维生素D2)、丁子香酚、羟基苯甲酸丁酯、对位羟基苯甲酸异丙酯、β胡萝卜素、香茅醇甲酸酯、胆钙化醇(维生素D3)、甲酸月桂酯、乙酸苯乙基酯、月桂酸乙酯、二丁基、羟基二甲苯、维生素A油、乙酸烯丙酯、棓酸丙酯、甲基β-甲基酮、叶酸、四丁酸核黄素、卵磷酯、二-α-生育酚等。
本发明中，对支链环糊精-羧酸与非水溶性或微水溶性化合物的混合比例没有限制，并可有很宽的选择范围。但考虑到非水溶性或微水溶性化合物的水溶解度，所使用的支链环糊精-羧酸的量一般为每摩尔非水溶性或微水溶性化合物约0.1至20mol，较好0.1至10mol，更好0.2至5mol。
可按已知方法，将支链环糊精-羧酸与非水溶性或微水溶性化合物混合来制备本发明的组合物。简单地说，例如可按下列四种方法制备包含在支链环糊精-羧酸中的非水溶性或微水溶性化合物的包合物(1)共沉淀方法(Crassonsetal.，5thInt.Conf.PharmaceticalTechnology，Paris，May30toJune1，1989)，(2)冷冻干燥或喷雾干燥方法(Korozumietal.，Chem，Pharm.Bull，23，2062(1975);Kataetal，Pharmazie39，856(1984))，(3)相溶解度曲线结晶方法(Vekamaetal.，Int.J.Pharmc10，1(1982))，(4)研磨方法(J.Szejtlietal，“Cyclodexrinsandtheirinclusioncomplexes”，AkadeimialKiado，Budepest(1982)，P.109-114;KyowaJap.Prov.Pat.Pubin，No.106698(1982))。
具体地说，可按下述方法制备包合物(1)将欲包合在包合物中的化合物加到支链环糊精-羧酸(下文有时称之为环糊精)的水溶液中。搅拌混合物，必要时在加温下搅拌。经过滤、离心等方法除去来剩余反应的待包合化合物，得到包合物。
(2)将环糊精溶解在水中，并向其中加入待色合的化合物。将两者混合10分钟至几小时，然后冻干(M.Kurozumietal.，Chem.Pharm.Bull.，23，142(1975))得到粉末。将该粉末溶解在水中，并除去待包合的未反应化合物得到包合物的水溶液。
(3)将待包合的化合物首先溶解在适当的水溶性有机溶剂中。使该溶液与水溶液中的环糊精接触。然后真空下蒸发或冻干除去有机溶剂和水(EP519428;JP-A5(1993)178765(日本专利申请NO.03-150507，日本专利申请NO.03-230489))，并向残留物中加水使之溶解，除去欲包合的未反应化合物，得到包合物水溶液。
(4)当将酸性化合物包合在包合物中时，将其溶解在氨水中并向其中加入环糊精，然后将混合物冻干。冻干期间，除去过量的氨水并得到作为酸性化合物之铵盐的包合物。
(5)将等包合的化合物溶解在亲脂性有机溶剂(如乙醚等)中，使溶液与环糊精的饱和水溶液混合。将混合物强烈振荡10分钟至几小时，然后在冷处放置过夜以沉淀出包合物。离心或过滤分离沉淀物。将所得粉末溶解在水中得到包合物的水溶液。
(6)混合待包合的粉末化合物与粉末状的环糊精，向其中加入小量的水。捏和该混合物(Y.Nakaietal.，Chem.Pharm.Bull.，26，2419(1978))，然后必要时冻干。
(7)使环糊精的水溶液与待包合化物的水溶液混合，得到包化合物的水溶液。
在许多情况下，用已知产生包合物的方法如此制得的水溶液或粉末，都含有包合物或由静电或疏水相互作用或氢键形成的复合物。因此，本发明中使用的术语“包合物”不仅指包合物或复合物本身，而且还含有包合物、复合物、待包合的游离化合物和/或游离环糊精的混合物。即，除包合物或复合物外，所得到的粉末和水溶液还可含有未被包合或复合的非水溶性或微水溶性化合物，和/或游离环糊精。这样的包合物本身和粉末及水溶液具有极高的水溶解度，并可迅速溶解在水中。
本发明的组合物可以是如此得到的水溶液或粉末本身，或者必要时可以是使用已知添加剂(如赋形剂，粘结剂或润滑剂)制成的有适当剂型的医药组合物、化妆品组合物、可吃或饮用的组合物、农用组合物、兽药组合物等。
例如，为改善按上述方法制得的粉末的性质(置入储存瓶或小瓶中的填充容量、比容、去静电等)，可加入糖、抗菌剂、稳定剂、抗静电剂等。例如，当制备注射液时，以此操作步骤制得的粉末很容易溶解在使用蒸馏水式氯化钠和糖(如葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇等)制得的等渗水溶液中。溶解后，可经静脉内、肌肉内、皮下等途径将所制得的含活性成分的可注射制剂，以体内治疗的有效浓度注射到器官中，或直接注入肿瘤的中心或肿瘤的切除部分。当制备口制剂时，可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、细颗粒剂、包衣制剂、滴剂、液体制剂等。在配制这些制剂时，可使用已知的赋形剂、润滑剂、粘结剂、分散剂、稳定剂、着色剂及吸收改善(促进)剂等。
也可按常规方法将上述粉末配制成可注射或口服制剂以外的剂型。例如制成可经鼻、口腔、靭带下部分、直肠、子宫或阴道的粘膜给药的制剂、透皮制剂及植入制剂。上述各种制剂均可成型为各种控制释放的制剂或定靶治疗的制剂，而且可将本发明的组合物用作这些制剂的原料。
如上所述，用于本发明的支链环糊精-羧酸可提高非水溶性或微水溶性化合物的水溶解度，并对活体具有高安全性。因此，它对于注射液、口服制剂、口腔给药的制剂(如片剂、含服剂等)、靭带下制剂、滴眼剂、糖浆、皮肤给药的外用制剂、透鼻制剂、经肺给药的制剂、直肠栓制剂或应用于粘膜的制剂等制型的医药组合物或兽药组合物是十分适用的，并且适于用作人体或人类以外的哺乳动物(如猴、猫、狗等)的药物。
可使用适当的添加剂，以常规方法制备医药组合物、兽药组合物、化妆品组合物、农用组合物、食用或饮用组合物等。
如上所述，按照本发明与支链环糊精-羧酸组合的非水溶性或微水溶性化合物比单独的非水溶性或微水溶性化合物有更高的水溶解度。此外，例如β-CyD-G2-COOH可改善非水溶性或微水溶性化合物的水溶解度，达到与β环糊精合用之非溶性性式微水溶性化合物的几十倍。再者，支链环糊精-羧酸对活体的不良作用(如破坏红细胞)比β-环糊精小，因此对血液是高度安全的。还有，β-CyD-G2-COOH很难被酸或酶分解，因此本发明的组合物对包括人在内的哺乳动物是很安全的。
下列实施例，实验和参考实施例进一步详细举例说明本发明，但不构成对其范围的限制。
实施例1将抗肿瘤剂6-O-(N-氯乙酰氨甲酰基)夫马菌醇(fumagillol)(100mg)溶解在乙醇(4ml)中。分别从该溶液开始，将6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钠(β-CyD-G2-COONa)(744mg)和β环糊精(下文缩写为β-CyD)(579mg)分别溶解在水(15ml)中(抗肿瘤剂β-CyD-G2-COOH或β-CyD＝1∶2(摩尔比))。将水溶液加到乙醇溶液中，并搅拌混合之。真空下冻干所溶液后得到粉末。将水(1ml)加到粉末(100mg)中，得到均质水溶液，即本发明的组合物。
另一方面，将抗肿瘤剂单独加到水中，于25℃下将混合物强烈振荡4小时并通过0.22μm滤膜过滤。
用高效液相层析法(HPLC)检测上述均质水溶液中和滤液中的抗肿瘤。结果，得出表1所示的溶解度。
表1抗肿瘤剂溶解度的比较抗肿瘤剂溶解度的比较本发明39.7mg/ml与β-CyD组合的抗肿瘤剂16.3mg/ml单独抗肿瘤剂1.8mg/ml如表1所示，与单独使用抗肿瘤剂或合用β-CyD相比，加入β-CyD-G2-COONa显著增加了抗肿瘤剂的水溶解度。
实施例2
按照实施例1中所述的同样方法，将6-O-(N-氮乙酰氨甲酰基)夫吗菌醇(100mg)溶解在乙醇(4ml)中。分别将6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钠(下文缩写为α-CyD-G2-COONa)(622mg)和α-环糊精(下文缩写为α-CyD)(642mg)分别溶解在水(15ml)中(抗肿瘤剂α-CyD-G2-COONa或α-CyD＝1∶2(摩尔比))。将水溶液加入乙醇溶液中并搅拌混合。真空下冻干所得溶液得到粉末。向粉末(100mg)中加入水(1ml)得到均匀的水溶液，即本发明的组合物。另一方面，将抗肿瘤剂单独加到水中，于25℃将混合物强烈振荡4小时，并通过0.22μm滤膜过滤。
用高效液相层析法(HPLC)检测上述均质水溶液中和滤液中的抗肿瘤剂。结果得到如表2中所示的溶解度。
表2抗肿瘤剂溶解度的比较本发明32.1mg/ml与β-CyD合并的抗肿瘤剂13.6mg/ml单独抗肿瘤剂1.8mg/ml如表2所示，与单独使用抗肿瘤剂或合用α-CyD-相比，加入α-CyD-G2-COONa显著增加了抗肿瘤剂的水溶解度。
实施例3按照实施例1中所述的同样方法，将头孢菌素抗生素(一)-7β-[(Z)-2-(5-氨基-1，2，4-噻二唑-3-基)-2-甲氧基亚氨基乙酰胺]-3-(1-咪唑并[1，2-b]哒嗪鎓)甲基-3-头孢-4-羧酸酯(100mg;游离态)溶解在乙醇(4ml)中。分别将6-O-α-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸钠(β-CyD-G2-COONa)(580mg)和β环糊精(β-CyD)(451mg)溶解在水(15ml)中(抗肿瘤剂β-CyD-G2-COONa)或β-CyD＝1∶2(摩尔比))。将水溶液加到乙醇溶液中并搅拌混合。真空下冻干所得溶液后得到粉末。向粉末(100mg)中加入水(1ml)得到均质水溶液，即本发明的组合物。另一方面，单独将抗生素加到水中，于25℃下将混合物强烈振荡8小时，并通过0.22μm滤膜过滤。
以高效液相层析法(HPLC)检测上述均质水溶液和滤液中的抗生素。结果得出如表3所示的溶解度。
表3抗生素溶解度的比较本发明38mg/ml与β-CyD合并的抗肿瘤剂14mg/ml单一抗肿瘤剂2.5mg/ml如表3所示，与单独使用抗生素或合用β-CyD-相比较，加入β-CyD-G2-COONa)显著地增加了抗生素的水溶解度。
实施例4按照实施例1所述的同样方式，从抗真菌剂2-[(1R，2R)-2-(2，4-二氟苯基)-2-羟基-1-甲基-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基]-4-[4-(2，2，3，3-四氟丙基)苯基]-3-(2H，4H)-1，2，4-三唑酮(100mg)和6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钠(β-CyD-G2-COONa)(551mg)(抗真菌剂β-CyD-G2-COONa＝1∶2(摩尔比))的冻干粉末。同样，从抗真菌剂和β环糊精(β-CyD)(抗真菌剂β-CyD＝1∶2(摩尔比))制得冻干粉末。按实施例1中所述的同样方法检测这些粉末和单一抗真菌剂的溶解度。结果如表4所示。
表4抗真菌剂溶解度的比较本发明0.32mg/ml与β-CyD合并的抗肿瘤剂0.12mg/ml单一抗真菌剂0.005mg/ml如表4所示，与单独使用抗真菌剂或合用β-CyD的情况相比，加入β-CyD-G2-COONa显著地增加了抗真菌剂的水溶解度。
实施例5按照实施例1所述的同样方法，从抗脂血症剂安妥明(100mg)和6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(1→6)-O-α-D-葡糖醛酸钠(β-CyD-G2-COONa)(1232mg)(安妥明β-CyD-G2-COONa＝1∶2(摩尔比率))制得冻干粉末。同样，从安妥明和β环糊精(β-CyD)(安妥明β-CyD＝1∶2(摩尔比))制得冻干粉末。按照实施例1中所述的同样方法检测这些粉末和单一安妥明的水溶解度。结果示于表5中。
表5安妥明溶解度的比较本发明4.18mg/ml与β-CyD合并的安妥明0.161mg/ml单一安妥明0.082mg/ml如表5所示，与单独使用或联合β-CyD使用安妥明的情况相比较，加入β-CyD-G2-COONa显著增加了安妥明的水溶解度。
实施例6将6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-O-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钠(β-CyD-G2-COONa)(7.5mg)溶解在水(5ml)中。加入安神剂安定(约3mg)，于25℃将混合物强烈振荡8小时，过滤并通过Millipore滤膜(0.22μm)过滤以分离上清液。使用β环糊精(β-CyD)代替上述β-CyD-G2-COONa并单独使用安定，以同样方法进行实验并以HPLC检测溶解在所得滤液中的安定的浓度。结果如表6所示。
表6安定溶解度的比较本发明0.511mg/ml
与β-CyD合并的安定0.198mg/ml单一安定0.055mg/ml如表6所示，与单独使用安定或合用β-CyD的情况相比，加入β-CyD-G2-COONa显著地增加了安定的水溶解度。
实施例7按照权利要求6所述的方法，但使用抗炎剂氟灭酸(约6mg)代替安定，测定单一氟灭酸或其与β-CyD-G2-COONa或β环糊精合并时的水溶解度。结果如表7中所示。
表7氟灭酸溶解度的比较本发明2.11mg/ml与β-CyD合并的氟灭酸0.81mg/ml单一氟灭酸0.071mg/ml如表7所示，与单独使用氟灭酸或合用β-CyD的情况相比较，加入β-CyD-G2-COONa显著地增加了氟灭酸的水溶解变。
实施例8按照实施例6中所述的同样方法，但使用激素制剂睾酮(约6mg)代替安定，检测单一睾酮或其合并β-CyD-G2-COONa或β-CyD时的溶解度。结果如表8所示。
表8睾酮溶解度的比较本发明1.42mg/ml与β-CyD合并的睾酮0.086mg/ml单一睾酮0.029mg/ml如表8所示，与单独使用睾酮或合用β-CyD的情况相比，加入β-CyD-G2-COONa显著地增加了睾酮的水溶解度。
实施例9按照实施例6所述的同样方法，使用抗癫痫药苯妥英(约4mg)代替安定，检测单用苯妥英或合用β-CyD-G2-COONa或β-CyD时的水溶解度。结果如表9所示。
表9苯妥英溶解度的比较本发明896μg/ml与β-CyD合用苯妥英281μg/ml单用苯妥英27μg/ml如表9所示，与单用苯妥英或合用β-CyD的情况相比，加入β-CyD-G2-COONa显著地增高苯妥英的水溶解度。
实施例10按照实施例6中所述的同样方法，使用维生素K2(约2mg)代替安定，检测单用维生素K2或与β-CyD-G2-COONa或β-CyD合用时的水溶解度。结果如表10所示。
表10
维生素K2溶解度的比较本发明67.4μg/ml与β-CyD合用的维生素K20.001μg/ml单一维生素K20.0005μg/ml如表10所示，与单用维生素K2或合用β-CyD的情况相比，加入β-CyD-G2-COONa显著地增加了维生素K2的水溶解度。
实施例11按照实施例6所述的同样方法，但使用抗炎剂消炎痛(约4mg)代替安定，检测单一消炎痛或与β-CyD-G2-COONa或β-CyD组合时的溶解度。结果如表11所示。
表11消炎痛溶解度的比较本发明134μg/ml与β-CyD组合的消炎痛54μg/ml单一消炎痛23μg/ml如表11所示，与单用消炎痛或合用β-CyD的情况相比，加入β-CyD-G2-COONa显著地增加了消炎痛的水溶解度。
实施例12向抗真菌剂灰黄霉素(100mg)中加入6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钠(β-CyD-G2-COONa)(313mg)(灰黄霉素∶β-G2-COONa＝1∶1(摩尔比))。混合这两种成分，并将混合物加到转鼓式磨粉机(不透钢园筒(30mmφ×50mm)，5个无透钢球(各10mmφ))。向其中加入小量水(蒸馏水)，以300次/分钟的速度将所得混合物强烈振荡约6小时并真空冻干得到粉末。另外以同样方式，制得β环糊精(β-CyD)(238mg)的粉末(灰黄霉素∶β-CyD＝1∶1(摩尔比))。将水加到如此制得的粉末(100mg)中，得到其水溶液。另一方面，单独将灰黄霉素加到水中，将混合物于25℃强烈振荡6小时并通过0.22μm膜滤器过滤。
用分光光度法(ShimadzuCorp.，UB-240分光光度计)检测上述滤液中的灰黄霉素。所得结果如表12中所示。
表12灰黄霉素溶解度的比较本发明410μg/ml与β-CyD组合的灰黄霉素30μg/ml单一灰黄色霉素23μg/ml如表12所示，与单独使用灰黄霉素或合用β-CyD的情况相比，加入β-CyD-G2-COONa显著地增加了灰黄霉的水溶解度。
实施例13按照实施例所述的同样操作步骤和同样装置，将β-CyD-G2-COONa(230mg)加入抗糖尿剂醋磺环己脲(50mg)中，(醋磺环己脲∶β-CyD-G2-COONa＝1∶1(摩尔比))，振荡该混合物并真空冻干后得到粉末。按同样操作方法，以β-CyD代替上述β-CyD-G2-COONa制得粉末。向各如此制得的粉末(100mg)中加入水以溶解之。另一方面，单独将醋磺环己脲加入水中，于25℃将混合物强烈振荡6小时并通过0.22μm膜滤器过滤。用紫外分光光度仪(Shimadzu Corp.，UV-240)检测上述滤液中的醋磺环己脲。结果如表13所示。
表13醋磺环己脲溶解度的比较本发明211.6μg/ml与β-CyD合并的醋磺环己脲81.4μg/ml单一醋磺环己脲28.1μg/ml如表13所示，与单独使用醋磺环己脲或合用β-CyD的情况相比，加入β-CyD-G2-COONa显著地增加了醋磺环己脲的水溶解度。
实施例14按照实施例6中所述的同样方式，将6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钠(下文缩写为α-CyD-G2-COONa)(75mg)溶解在水(5ml)中，向其中加入激素制剂睾酮(约4mg)，并将混合物于25℃强烈振荡8小时，离心并通过Millipore滤膜(0.22μm)过滤，以分离出上清液。使用α-环糊精(α-CyD)代替α-CyD-G2-COONa或单独使用睾酮完成上述同样操作。用紫外分光光度仪(ShimadzuCorp.，UV-240)检测所得滤液中溶解的睾酮浓度。结果示于表14中。
表14睾酮溶解度的比较本发明1.38mg/ml与β-CyD合并的睾酮0.22mg/ml单一睾酮0.029mg/ml如表14所示，与单独使用睾酮或合用α-CyD相比，加入α-CyD-G2-COONa显著地增加了睾酮的水溶解度。
实施例15按照实施例6中所述的同样方式，将2-羟基-3-O-(6-环麦芽庚糖基)丙酸钠(下文缩写为β-CyD-CH2CH(OH)-COONa)(75mg)溶解在水(5ml)中，向其中加入激素睾酮(约4mg)，于25℃下将混合物强烈搅拌8小时，离心并通过Millipore滤膜(0.22μm)过滤，分离出上清液。使用β-CyD代替β-CyD-CH2CH(OH)-G2-COONa或使用单一睾酮进行同样操作。用紫外分光光度仪(Shimadzu Corp.，UV-240)检测溶于所得滤液中的睾酮浓度。结果如表15所示。
表15睾酮溶解度的比较本发明940μg/ml
与β-CyD合并的睾酮86μg/ml单一睾酮29μg/ml如表15中所示，与单独使用睾酮式加入β-CyD的情况相比，加入β-CyD-CH2CH(OH)-COONa显著增加了睾酮的水溶解度。
实施例16按照实施例1中所述的同样方法，从安妥明(1g)和β-CyD-G2-COONa(12.3g)制得真空冻干的粉末。按照生产片剂的常规方法，将此粉末加到揉合容器中，并与HPC-L(羟丙基纤维素-L)(2g)、甲基纤维素(6.5g)和硬酯酸镁(0.1g)混合。再加入纯化水(5ml)，对混合物进行湿性揉和，然后真空干燥得到粉末。将此粉末研磨后得到颗粒。将220mg颗粒放在成片模(6mmφ)中并以1吨压力压制成片，得到100片安妥明(每片10mg安妥明)，即本发明的组合物。
实施例17按照实施例1中所述的方法从苯悔拉吩(5g)和β-CyD-G2-COONa(20g)制得真空冻干的粉末。按照生产滴鼻剂的常规方法，将该粉末溶解在分别制备的等渗磷酸盐缓冲液(1000ml，pH7.4)中。加入防腐剂对位羟基苯甲酸丁酯(0.005g)并溶于其中。通过膜滤器将溶液过滤除菌并充入20ml滴鼻剂容器中，得到各含0.5%苯拉吩/20ml的50份本发明的组合物。
实施例18
按照实施例1中所述的同样方法，从消炎痛(2g)和β-CyD-G2-COONa(16g)制得真空冻干的粉末。按照生产直肠栓剂的常规方法，将witepsol W-35(82g)加热到55-60℃使之熔化，将上述粉末加入其中并用搅拌器分散均匀，然后倒入容器中成型为2g重的栓剂，并缓慢冷却后得到成型栓剂。如此，得到50份各含40mg消炎痛的本发明栓剂组合物。
实施例19按照制备化妆品的常规方法，将微晶蜡(10g)、黄色蜂蜡(5g)、凡士林(6g)、含水羊毛腊(6g)、角鲨烷(36g)、十六烷基己二酸酯(8g)和聚氧乙烯(20mol)脱水山梨醇-油酸酯(4g)加到干燥的容器中，加温至70-80℃并搅拌后得到溶液(A组合物)。在另一容器中，于室温下将维生素E(0.01g)和麦芽糖基-β-环糊精羧酸(β-CyD-β2-COONa)(0.1g)溶解在纯水(21.4g)中。加入丙二醇(2.5g)、香料(0.5g)和适当量的对位羟基苯甲酸-丁酯，加入到大约70℃并搅拌后得到溶液(B组合物)。然后，搅拌下将B组合物与A组合物一点点地混合，得到乳化剂。该乳剂经脱气、过滤和缓慢冷却后得到100g面乳，即本发明的组合物。
实施例20按照生产农用化学品粉末的常规方法，称取ferimzone(10g)和麦芽糖基-β-环糊精-羧酸(β-CyD-G2-COOH)(80g)，加到纯化水(200ml)中并经搅拌溶解之，然后真空干燥得到粉末。研磨该粉末，然后通过振荡筛选择颗粒大小为20至30μ的粉末。如此得到80g粉末。按常规方法，将经筛分得到的颗粒大小为20至30μ的D-sorbit粉末(20g)与粘土粉末(100g)在混合器中混合。将上述ferimzone/β-CyD-G2-COOH粉末(80g)加入其中，充分混合后得到抗水稻胚芽的农用化学品粉末(200g)，即为本发明的组合物。
实施例21将维生素E(0.05g)加到麦芽糖基-β-环糊精羧酸(β-CyD-G2-COOH)(0.5g)在纯化水(100ml)中形成的水溶液内并溶解之。在真空中将所得溶液冻干得到粉末(0.55g，较正水含量后)。按照生产蛋黄酱食品的常规方法，将该粉末加到混合容器中。另外，加入芥末(59)、盐(12.5g)、胡椒(1.25g)、糖(8g)和化学调味料(0.75g)并混合使颗粒消失。然后，加入蛋黄(80g)并使用搅打器充分混合，再加入食醋并充分混合。然后于搅拌下加入沙拉油(15g)。再加沙拉油(5g)后，混合物变硬，加入食醋(45g)并分散之。快速搅拌下加入沙拉油(800g)。最后，用食醋(5g)适当调合混合物的味道得到食用蛋黄酱(1kg)，即本发明的组合物。
实验1将兔红细胞加到10mM等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4)中制成0.25%悬液。向其中加入6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钠(β-CyD-G2-COONa)使其浓度变成1至40mM。将混合物37℃振荡30分钟后离心分离上清液。用分光光度计(UV-240，Shimadzu Corp.)检测所得上清液中血红蛋白的吸光率(在543nm)，确定由β-CyD-G2-COONa的作用而胀破的红细胞的量。使用在水中而不是在等渗磷酸盐缓冲液中胀破的血红细胞的量作为标准(100%)，并以所指出的相对比例作为溶血比例。溶血比例与环糊精浓度间的关系如图1中所示。
此外，按照上述同样方法使用β-环糊精(β-CyD)代替β-CyD-G2-COONa，测定溶血比例。表1中给出了这一结果连同上述结果以便比较。从表1可以看出，β-CyD-G2-COONa比β-CyD有小得多的溶血作用。
实验2试验6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钠(β-CyD-G2-COONa)对人红细胞的溶血作用。将人红细胞加到0.1M等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4)中制得20%悬液。将此20%红细胞悬液(100μl)加到含有β-CyD-G2-COONa(浓度为5至30%mM)的等渗缓冲液(4ml)中。将混合物37℃放置30分钟，然后离心分离上清液。使用分光光度仪(U-1080，Hitachi，Ltd.，Japan)检测所得上清液中血红蛋白的吸光率(于543nm)，确定因β-CyD-G2-COONa的作用而胀破的红细胞的量。用在水中而不是在等渗磷酸盐缓冲液中胀破而产生的血红蛋白量作为标准，并以相对比例作为溶血比例。溶血比例与环糊精浓度间的相互关系如图1中所示。
此外，按照上述同样方法但使用β-环糊精(β-CyD)、β-CyD-G1和β-CyD-G2代替β-CyD-G2-COONa，检测它们的溶血比例。此结果并连同上述结果一起在表2中给出，以便比较。从图2中可以看出，β-CyD-G2-COONa具有比β-CyD、β-CyD-G1或β-CyD-G2小得多的溶血作用。
实验3利用大鼠试验6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸(β-CyD-G2-COOH)的毒性。使用四只雄性大鼠。将β-CyD-G2-COOH溶解在无菌水中。将该溶液以每天1ml/kg、3ml/kg和10ml/kg(分别含有100mg/kg、300mg/kg和1000mg/kg的β-CyD-G2-COOH)的剂量经静脉内注入大鼠体内，持续给药2周。
该试验中未见大鼠死亡。动物的一般表现、食物摄入量、体重、尿沉渣、血液学检查等均未见异常。病理学和组织学检查未见有如坏死等严重改变。
作为对照，按同样方法研究了β-CyD-G2的毒性。在给予300mg/kg和1000mg/kgβ-CyD-G2的实验组动物，观察到耳廓潮红和四肢末端肿胀。在给予1000mg/kgβ-CyD-G2组的动物，尿检查可见潜血和LDH与NAG增加。在给予300mg/kg和1000mg/kgβ-CyD-G2组，病理学和组织学检查可见有肾小管上皮细胞空泡形成和坏死。
实验4用下述方法试验6-O-α-D-葡糖醛酸基-(1→4)-α-D-葡糖基-β-环糊精钠盐(6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钠)(β-CyD-COONa)对各种酶的稳定性。使用6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精作为对照。
试验方法将所述量的各种酶加到10mM待试验的环糊精水溶液中。将混合物在水溶液中37℃放置。取50μl各混合物样品，将其100℃加热15分钟使酶失活，于150，000rpm离心15分钟，通过MilliporeUSY-1(分辨分子量10，000)过滤，稀释10倍并进行HPLC分析。
HPLC分析条件柱NH2P-50(Asahipak)迁移相CH3CNiH2O＝4852，其中加入0.005mM的PIC试剂。
流速0.8ml/分钟检测RI根据上述对各样品的HPLC分析结果确定0至120分钟对余留环糊精的比例。
所用酶与酶浓度间的关系示于表16中。
表16
酶与所用酶的浓度酶来源所用酶的浓度(单位/ml)枯草芽孢杆菌α淀粉酶20(wakopurechemical)根霉菌葡糖淀粉酶2(wakopurechemical)肺炎克雷伯氏菌支链淀粉酶10(Hayashibara生产)小牛肝β-葡糖苷酸酶700(wakopurechemical)各酶单位的定义如上述各生产率提供的酶使用说明书中所述。
结果图3至6中显示了在通过的时间内剩余6-O-α-D-葡糖醛酸基-(1→4)-α-D-葡糖基-β-环糊精Na盐(支链环糊精-羟酸盐)和-6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精(支链环糊精)之比例的改变。图中，黑三角代表支链环糊精-羧酸盐，黑点代表支链环糊精。
图4-6清楚地表明，在用葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和β-葡糖酸酶进行酶促处理时，支链环糊精-羧酸盐比6-O-麦芽糖基-β-环糊精(作为对照)更为稳定。对于α淀粉酶的酶促处理，则两种β环糊精几乎有相同的稳定性，如图3所示。
尤其是，在研究支链淀粉酶的酶促处理时，可见约有60%作为对照的6-O-α麦芽糖基-β-环糊精被破坏，而支链环糊精-羧酸盐则是稳定的。
实验5按照实施例1中所述的同样方法，将β-CyD-G2-COONa的水溶液加到抗肿瘤剂红豆杉醇(125μg)在甲醇内的溶液(25μl)中，使β-CyD-G2-COONa对红豆杉醇的摩尔比例变为1∶2、1∶10和1∶20。将混合物于30℃搅拌24小时。向反应混合物中加入水到终体积为5ml，并通过孔径为0.2μm的Millipore滤膜过滤。将滤液冻干得到无色粉末。
将该粉末溶解在水中，用HPLC检测1mg冻干粉末中的红豆杉醇的量。
HPLC条件柱μBondapackC18(3.9mm×15cm)迁移相MeOH∶H2O＝3∶2流速0.7ml/分钟检测UV230nm注入器10μl
△红豆杉醇Rt＝12.3结果以1∶10摩尔比例制备的冻干的粉末2.09μg/ml以1∶20摩尔比例制备的冻干的粉末1.85μg/ml结果表明以1∶10至1∶20的摩尔比例加入β-CyD-G2-COONa增加了红豆杉醇的溶解度。
参考实施例将麦芽糖基-β-环糊精(30g)加入糖生酮葡糖杆菌的溶液(1升)中在以1升空气/分钟通过和800rpm条件下32℃反应1小时。然后以8000rpm对该反应混合物进行冷离心以除去细胞。使上清液通过HP-20柱(1.5升)并用水(2升)洗。合并用2%含水甲醇溶液洗脱的各管，浓缩并冻干后得到6-O-[α-D-葡糖醛酸基(1→4)-α-D-葡糖基]-β-环糊精钠盐(β-CyD-G2-COONa)(25g)。该化合物的物理和化学性质如下所述。
化合物6-O-α-D-葡糖醛酸基-(1→4)-α-D-葡糖基-β-环糊精Na盐(也称为6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-D-α-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸Na盐)(原料6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精)13C-NMRNa saltD2O(270 MHz)δppm61.69，61.89，68.54，71.84，72.16，72.47，73.14，73.21，73.30，73.49，73.57，74.23，74.33，74.50，74.71，79.62，82.52，82.57，82.74，83.02，100.01，101.58，103.25，103.31，103.37，177.84
元素分析C54H87O46Na·10H2O的计算值C，38.71;H，6.43测定值C，38.87;H，6.47mp＞260℃(分解)[α]20D＝+146.9°(C＝0.61%水)溶解度＞200g/100ml(25℃，H2O)(对照6-O-α-D-葡糖基-(1→4)-α-D-葡糖基-β-环糊精150g/100ml(25℃，H2O))于60℃在0.1NHCl中的半寿期8小时(对照6-O-α-D-葡糖基-(1→4)-α-D-葡糖基-β-环糊精5小时)均裂兔红细胞在磷酯盐缓冲液(pH7.4)中37℃均裂50%的浓度为11mM。
(对照β-环糊精4mM，6-O-α-D-葡糖基-(1→4)-α-D-葡糖基-β-环糊精8mM)按照如上文所述的同样方法，制备6-O-(2-羧乙基)-β-环糊精钠盐、6，6-二-O-(2-羟乙基)-β-环糊精、6-O-α-D-葡糖醛酸基(1→4)-α-D-葡糖基-α-环糊精/钠盐、6-O-(α-D-葡糖醛酸基)-β-环糊精、6-O-(2-羧基-(1→4)-α-D-葡糖基)-α-环糊精、6-O-[2-羧基-2-羟乙基)-β-环糊精钠盐、6，6’-二-O-(2-羧乙基-2-羟乙基)-β-环糊精钠盐。它们的物理和化学数据如下所述。
化合物6-O-(2-羧乙基)-β-环糊精Na盐和6，6-二-O-(2，-羧乙基)-β-环糊精Na盐(也称为3-O-(6-环麦芽庚糖基)丙酸钠盐)(起始化合物分别是6-O-(3-羟丙基)-β-环糊精和6，6-二-O-(3-羟丙基)-β-环糊精)13C-NMRNa盐D2O(270MHZ)δppm在181.127、181.508和185.076ppm浓度观察到基于羧酸的碳信号。
化合物6-O-D-葡糖醛酸基-(1→4)-α-D-葡糖基-α-环糊精Na盐(也称为6-O-环麦芽己糖基-(6→1)-D-α-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸Na盐)(起始化合物6-O-α-麦芽糖基-α-环糊精)13C-NMRNa盐D2O(270MHz)δppm在177.105ppm时观察到基于羧酸的碳信号。
化合物6-O-α-D-葡糖醛酸基-β-环糊精(也称为6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸)(起始化合物6-O-α-D-葡糖基-β-环糊精)TLC硅凝胶MerckKieselGel60(F154No.5715)洗脱液1-丙醇∶乙酸乙酯∶水∶乙酸(6∶4∶2∶4)
得率64%Rf＝0.2513C-NMR(270MHz，D2O)δppm在178.070ppm时观察到基于羧酸的碳信号。
化合物6-O-[α-D-葡糖醛酸基-(1→4)-α-D-葡糖基]-α-环糊精(也称为6-O-环麦芽己糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸)(起始化合物6-O-麦芽糖基-α-环糊精)HPLC柱NH2P-50迁移相乙腈∶水＝55∶45流速1ml/分钟得率68%温度25℃RT＝7.58化合物6-O-(2-羟基-2-羟乙基)-β-环糊精Na盐(也称为2-羟基-3-O-(6-羟麦芽庚糖基)-丙酸Na盐)和6，6-二-O-(乙羟基-2-羟乙基)-β-环糊精Na盐(也称为7A，7C-二-O-[α-D-葡糖醛酸基-(1→4)-O-α-D-葡糖基]-(1→6)-麦芽庚糖Na盐)(起始化合物分别是6-O-(2，3-二-羟丙基)-β-环糊精和6，6’-二-O-[(2，3-二-羟丙基)]-β-环糊精)
13C-NMR(270MHz，D2O)δppm177.762、177.883和180.068。
化合物6-O-环麦芽己糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸(α-CyD-G1-COOH)13C-NMR(270MHz，D2O)δppm179.611(COOH)[α]D＝+125.4°(C＝0.956，H2O)化合物6-O-环麦芽辛糖基-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸(γ-CyD-G2-COOH)13C-NMR(270MHz，D2O)δppm179.116(COOH)。D＝+155.9°(C＝1.035，H2O)化合物6-O-环麦芽庚糖基-O-α-D-麦芽糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸钙也称作环麦芽庚糖基-(6→1)-O-α-D-吡喃葡糖基-(4→1)-O-α-D-吡喃葡糖基-(4→1)-O-α-D-吡喃葡糖苷酸钙(β-CyD-G3-COOCa)HPLC柱NH2P-50RT＝20.70(分)样品量10mg/ml洗脱液乙腈-水(48∶52)+PICA试剂流速0.81ml/分钟温度25℃检测器RT
权利要求
1.含有非水溶性和微水溶性化合物及支链环糊精-羧酸的组合物。
2.根据权利要求1的组合物，其中支链环糊精-羟酸的量为每摩尔非水溶性式微水溶性化合物0.1至10摩尔。
3.根据权利要求1的组合物，其中支链环糊精-羟酸是在环糊精环的至少一个葡萄糖单位的6-0位置上的有含至少一个，羧基有机基团的环糊精。
4.根据权利要求3的组合物，其中环糊精环有7个葡萄糖单位。
5.根据权利要求3的组合物，其中有机基团有1至3个葡萄糖单位，且有机基团是葡萄糖单位的至少一个羟甲基基团被氧化成羧基基团。
6.根据权利要求3的组合物，其中有机基团是2-羧乙基或2-羰基-2-羟乙基。
7.根据权利要求1的组合物，其中支链环糊精-羧酸是6-O-环麦芽己糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸、6-O-环麦芽庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸、6-O-环麦芽辛糖基-(6→1)-α-D-葡糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸、6-O-环麦芽己糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸、6-O-环麦庚糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸、6-O-环麦芽辛糖基-(6→1)-α-D-葡糖醛酸、2-O-(6-环麦芽己糖基)-乙酸、2-O-(6-环麦芽庚糖基)-乙酸、2-O-(6-环麦芽辛糖基)-乙酸、3-O-(6-环麦芽糖基)-丙酸、2-羟基-3-O-(6-环麦芽庚糖基)-丙酸、6-O-环麦芽庚糖基-O-α-D-麦芽糖基-(4→1)-O-α-D-葡糖醛酸或7A，7C-二-O-[α-D-葡糖醛酸基-(1→4)-O-α-D-葡糖基]-(1→6)-麦芽庚糖。
8.根据权利要求1的组合物，其为医药组合物。
9.根据权利要求8的组合物，其中非水溶性或微水溶性化合物是退热剂、抗炎剂、镇痛剂、安神剂、镇静剂、抗肿瘤剂、抗微生物剂、抗生素、抗脂血剂、镇咳祛痰剂、肌肉松驰剂、抗癫痫剂、抗抑郁剂、抗变态反应剂、强心剂、抗心律失常剂、血管扩张剂、降压利尿剂、抗糖尿剂、抗结核剂、麻醉药拮抗剂、激素制剂或脂溶性维生素。
10.根据权利要求1的组合物，其为化妆品组合物。
11.根据权利要求1的组合物，其为农用组合物。
12.根据权利要求1的组合物，其为食用或饮用组合物。
13.根据权利要求1的组合物，其为兽药组合物。
14.提高非水溶性或微水溶性化合物在水中之溶解度的方法，其包括将非溶性或微水溶性化合物与支链环糊精-羧酸组合。
全文摘要
公开了含有非水溶性或微水溶性化合物与支链环糊精-羧酸的组合物。支链环糊精羧酸可显著地提高化合物的水溶解度。还公开了提高化合物之水溶解度的方法。
文档编号C08B37/16GK1111532SQ94119880
公开日1995年11月15日 申请日期1994年12月3日 优先权日1993年12月6日
发明者宇田良明, 山内贵子, 中山康 申请人:武田药品工业株式会社