专利名称：用于器官的低温储藏和治疗病毒和细菌感染的组合物的制作方法
技术领域：
本发明特别涉及用于器官的低温储藏和治疗病毒和／或微生物感染的物质或组合物，用于器官低温储藏的物质或组合物，用于治疗病毒和／或微生物感染的物质或组合物，制造用于器官低温储藏的低温储藏试剂的方法，制造用于治疗病毒和／或微生物感染的药物或制剂的方法，低温储藏试剂在低温储藏器官中的应用，药物或制剂在治疗病毒和／或微生物感染中的应用，低温储藏试剂在低温储藏试剂的生产中的应用，物质或组合物在用于治疗病毒和／或微生物感染的药物或制剂的制造中的应用，低温储藏器官的方法，解冻器官的方法，治疗病毒和／或微生物感染的方法，剂量形式和疫苗。
根据本发明的一个方面，提供了用于器官低温储藏和治疗病毒和／或微生物感染的物质或组合物，含有选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性剂的物质或组合物，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
至少R1和R2中的一个可以是甲基基团。
或者，至少R1和R2中的一个可以是氟化C1-C3烷基基团。
活性剂可以选自含有甲酰胺，甲基甲酰胺，二甲基甲酰胺，乙酰胺，甲基乙酰胺，二甲基乙酰胺，二乙基乙酰胺，异丙基乙酰胺，二异丙基乙酰胺，N-乙酰基哌啶，N-(β-羟乙基)乙酰胺，N，N-二(β-羟乙基)乙酰胺，N-乙酰基吗啉，丙烯酰胺，丙酰胺，N-氟甲基-N-甲基-甲酰胺和其中任何两种或多种的混合物。
在一个特定的实施方案中，活性剂可以是二甲基甲酰胺C3H7NO(DMF)。在另一个特定的实施方案中，活性剂可以是N-氟甲基-N-甲基-甲酰胺，HCON(CH3)(CH2F)。
DMF通常用作极性试剂，并容易通过皮肤，通过肺或口腔接触吸收。通过皮肤的液体DMF的吸收速率达到每平方厘米每小时9．4毫克。DMF快速代谢，主要的生物转化位点是肝，大部分借助于尿排泄。在大鼠，大鼠，仓鼠和人中的主要代谢物质是N-(羟甲基)-N-甲基甲酰胺(HMMF)，N-(羟甲基)-甲酰胺(HMF)和N-乙酰基-S-(N-甲基-氨基甲酰基)半胱氨酸(AMMC)。未变化的DMF作为小部分剂量在尿中排出。有限的可得数据表明明显量的剂量留下未排出和／或以未鉴定化合物形式排出。
DMF具有低的急性皮肤，口腔和吸入毒性。它被认为具有温和到中等的皮肤和眼刺激剂，并且能容易地渗透进皮肤。没有皮肤敏感特性的指示。
在几个90天的研究中，不能建立NOAEL(未观察到的毒性作用量)。在对狗的28天的吸入研究中，在63毫克／立方米时发现没有效应。在另一个对狗的研究中，在60毫克／立方米时发现可逆的心血管效应。
DMF是致畸形的和可能是胚胎致死的。在口服研究中，发育效应的NOAEL总共达到44毫克／千克体重，在兔的吸入研究中达到150毫克／立方米。
本发明的一个特定特征是通过在暴露于DMF之前预冷器官，低温过程中，DMF的毒性实质性降低或基本消除。作为例子，在室温下，在水或生理溶液中的30％的DMF溶液中，蛋白质变性。但是，在8℃，根据本发明的方法，在30％的DMF浓度水平和低于0℃的温度，器官基本不受影响，40％的DMF浓度也不影响器官。
如下面的实施例所述，在低温过程中，如果温度为8-4℃之间导入10％的DMF溶液，器官通常不受影响，如果导入25％到30％的DMF溶液，器官和溶液的温度应该低于4℃。
在低温储藏过程中，本发明的物质或组合物功能同时为低温储藏试剂和抑制病毒和／或抑制细菌的试剂。所以，如果病毒或细菌感染器官，器官的低温储藏将同时破坏病毒和／或微生物的感染。
为了本说明书的目的，应该将词“器官”广泛地解释为包括心，肝，皮肤，组织，角膜，骨，腺体和心瓣的范围。
本发明提供了低温储藏试剂(CPA)和用CPA处理哺乳动物或其它组织，器官或整个身体，深度冷冻，和基本不定期地储藏直到需要时解冻的方法。通常，非冷冻供体器官的储藏寿命约为4小时，在这之后，细胞破坏开始，从而使供体器官的跨大陆的转移困难或不可能。正如下面将变得清楚，本发明的过程并不复杂，通过在CPA处理后浸入液氮中，器官容易承受的冷冻温度速率为-10℃／秒。所以供体器官的跨大陆转移和供体器官库的建立或用于医疗应用的尸体，肢体和器官的储藏变得可行。
所以，根据本发明的另一个方面，提供了用于器官低温储藏的物质或组合物，含有选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的低温试剂的物质或组合物，其中R1和R2各自选自下列组，包括H，Me，卤代甲基的组，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4，或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
至少R1和R2中的一个可以是甲基基团。
或者，至少R1和R2中的一个可以是氟化C1-C3烷基基团。
酰胺可以如本文前面所述。
在一个特定的实施方案中，低温试剂可以是二甲基甲酰胺，在另一个特定的实施方案中，低温试剂可以是N-氟化甲基-N-甲基甲酰胺。
低温试剂可以与包括选自含有氯化钠，EDTA-二钠，碳酸氢钠，氯化钾，磷酸二氢钾，氯化镁，硫酸镁，氯化钙，葡萄糖，Hespes-氢氧化钠和其中任何两种或多种的混合物的成分的生理溶液结合。
具体地说，生理溶液可以是Tyrode’s溶液(本文称为Tyrode)，威斯康星大学溶液(ViaSpan)，Krebs Henseleit或任何其它适当的生理溶液。
本发明延伸到用于治疗病毒和／或微生物感染的物质或组合物，含有选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性治疗剂的物质或组合物，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团；饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
R1，R2和R3可以如本文上面所述。
酰胺可以如本文上面所述。
在一个特定的实施方案，酰胺可以是二甲基甲酰胺。在另一个特定的实施方案，酰胺可以是N-氟化甲基-N-甲基甲酰胺。
病毒感染可以是逆行的病毒感染，即后天获得性的人免疫缺陷(HIV-1)病毒感染。但是，本发明的化合物，物质或组合物可以用于其它病毒和／或微生物感染如德国麻疹，皮肤粉刺和与免疫系统疾病如HIV- 1相关的随机感染的治疗。具体地说，本发明的物质或组合物可以用于病毒感染的治疗，其中病毒具有外壳保护包衣。
所以，病毒感染可以选自后天获得性的人免疫缺陷病毒感染(HIV- 1)。
物质或组合物可以包括至少一种生理可接受赋型剂或载体。赋型剂或载体可以是胶质二氧化硅。
根据本发明的另一个方面，提供了制造用于器官低温储藏的低温储藏试剂的方法，包括将选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的低温储藏成份和生理溶液合并的步骤的方法，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或
R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
生理溶液可以如本文上面所述。
R1，R2和R3可以如本文上面所述。
酰胺可以如本文上面所述。
根据本发明的另一个方面，提供了制造用于治疗病毒和／或微生物感染的药剂或制剂的方法，包括将选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性治疗剂与至少一种生理学可接受赋型剂或载体合并的步骤，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团，R1，R2和R3可以如本文上面所述。
酰胺可以如本文上面所述。
本发明延伸到包括选自含有通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的冷冻储藏成份的冷冻储藏试剂在冷冻储藏器官中的应用，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
冷冻储藏试剂可以包括冷冻储藏成份和生理溶液。
R1，R2和R3可以如本文所述。
酰胺可以如本文所述。
本发明进一步延伸到包括选自含有通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性治疗剂的药剂或制剂在治疗病毒和／或微生物感染中的应用，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤化甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
R1，R2和R3可以如本文所述。
药剂或制剂可以包括至少一种生理学可接受赋型剂或载体。
生理学可接受赋型剂或载体可以是胶质二氧化硅。
酰胺可以如本文所述。
本发明延伸到在制造冷冻储藏试剂中冷冻储藏成份的使用，该成份选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
R1，R2和R3可以如本文前面所述。
酰胺可以是本文前面所述。
本发明进一步延伸到用于病毒和／或微生物感染的治疗的药剂或制剂的制造中物质或组合物的使用，包括选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性治疗剂的物质或组合物，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，卤化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
R1，R2和R3可以如本文上面所述。
酰胺可以如本文上面所述。
通常，该方法包括起始时用生理溶液如Tyrode[商标名]灌注器官，然后以逐步或连续方式，用含有循序性增高的浓度的冷冻储藏成份的生理溶液灌注器官，同时降低器官的温度。
通过最初冷冻器官，然后在液氮中快速冷冻器官和在液氮温度储藏器官；通过在液氮中冷冻器官和在冷冻器中储藏；通过在液氮中冷冻和储藏的计划；或在冷冻器中冷冻和储藏的计划，可以降低温度。
所以该方法包括前面的用生理溶液灌注器官和冷冻器官到8到5℃之间的温度的步骤，然后用冷冻储藏试剂灌注器官，同时循序性地提高冷冻储藏试剂中冷冻储藏成份的浓度和冷冻器官到储藏温度。
冷冻储藏成份的浓度可以循序性地从10％增加到40％。
通常储藏温度在范围为约-50℃到-196℃的零下温度范围内(液氮温度)。
具体地说，储藏温度可以是约-80℃到-196℃之间。可以利用液体CFC(氯氟烃)或液氮冷冻剂达到该温度。
本发明延伸到解冻已经用冷冻储藏试剂灌注并冷冻到储藏温度的器官的方法，该方法包括下列步骤将器官暴露于包括选自含有通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的冷冻储藏成份的冷冻储藏试剂，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团，直到器官已经达到在上面储藏温度上的预定温度；用含有冷冻储藏成份的冷冻储藏试剂灌注器官，同时循序性地降低冷冻储藏试剂中冷冻储藏成份的浓度并增加器官的温度；
用生理溶液灌注器官。
预定温度约为-4℃到4℃。
R1，R2和R3可以如本文上面所述。
酰胺可以如本文上面所述。
本发明进一步延伸到治疗病毒和／或微生物感染的方法，该方法包括对具有病毒和／或微生物感染的个体施用含有选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性治疗剂的生理有效剂量的药剂或制剂，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
药剂或制剂如本文前面所述可以包括至少一种生理学可接受赋型剂或载体。
R1，R2和R3可以如本文上面所述。
酰胺可以如本文上面所述。
为了提供约2-200ppm，优选地约为50-100ppm的待治疗个体的血液中的活性治疗剂的血液浓度，可以选择剂量。已经发现50-100ppm的DMF血浆峰浓度使带有HIV-1的病人的CD4 T-细胞数在开始治疗的3星期内从312／毫升增加到超过1000／毫升。
剂量可以经皮给药，即通过皮肤转移活性治疗剂，如通过应用已经用活性治疗剂或含有活性治疗剂的组合物浸泡过的皮肤膏药或棉花羊毛垫。用于浸泡皮肤膏药或棉花羊毛垫的组合物中的活性治疗剂的浓度约为10-100％。
然而剂量可以通过选自口服剂量，吸入，通过栓剂，静脉内和其任何两种或多种的联合的方法给药。通常静脉内导入将在一个时期内以控制速度进行。
所以本发明延伸到用于包括局部应用手段如皮肤膏药或垫的应用手段的病毒和／或微生物感染的治疗的剂量形式，该皮肤膏药或垫被吸收或吸收如本文上面所述有效量的活性治疗剂。
局部应用手段可以包括一种活性治疗剂被吸收或吸收的合成聚合体物质的主体如TEFLON(商标)。通常，剂量形式将包括DMF与胶质二氧化硅混合形成用于膏药浸泡的凝胶。膏药可以是Virodene PO58膏药。
本发明延伸到在用病毒感染，然后已经用本发明的方法治疗后的人的身体上收获的抗体制备的疫苗。
病毒可以是逆行转录病毒如HIV-1。
现在参考附图和实施例，通过举例的方式，叙述本发明，其中
图1显示了将大鼠心脏浸泡在液氮中的过程中主动脉套管中温度的变化；图2是显示套管插入术过程和心脏中温差电偶的位置；图3显示了作为用Virodene PO58(DMF)膏药治疗艾滋病人的时间的函数的HIV-1病毒的负载(聚合酶链式反应[PCR])；图4显示了作为根据本发明的方法整个大鼠心脏灌注，低温储藏，冷冻，解冻和再灌注的时间的函数的温度。
图5显示作为温差电偶和瞬时反应的时间的温度；图6显示作为在第一套人毒性试验过程中的时间的函数的血浆DMF浓度；图7显示作为在第二套人毒性试验过程中的时间的函数的血浆DMF浓度；图8是将根据本发明的低温储藏过程之后的冷冻／解冻大鼠心脏放大22500倍的心瓣膜的显微图；图9是将根据本发明低温储藏过程之后的冷冻／解冻大鼠心脏放大36250倍的心瓣膜的显微图；和图10是将根据本发明低温储藏过程之后的冷冻／解冻大鼠心脏放大28500倍的心瓣膜的显微图。
实施例1
低温储藏材料和方法模型分离的经灌注的大鼠心脏利用十二只重量各为250-350克的BD9大鼠。根据可接受的方案，用乙基戊基巴比通钠麻醉大鼠。
Langendorff仪器利用两个连接到两个水浴的标准Langendorff系统，一个在低温，用于冷冻器官到大约4-5℃，另一个维持在37℃。利用冷的Langendorff系统(称为LD2)，用Tyrode-DMF溶液灌注心脏，在缺乏DMF时，即用纯Tyrode，用热的Langendorff系统(称为LD1)灌注心脏。
每升溶液的灌注组合物(Tyrode)NaCl 137．6mMKcl5．4mMMgCl21．0mMCaCl21．8mM葡萄糖 5．0mMHespes-NaOH 11．6mM溶液的pH值 7．45DMF特性(BASF工业化学，二甲基甲酰胺技术印刷品M5351e，1989年10月)N，N-二甲基甲酰胺(DMF)是具有下面特性的细胞分化剂分子式 C3H7ON相对摩尔质量 73，095克／摩尔冰点-61℃DMF是无色的，高沸点，可动的，极性的，具有微弱特性气味的吸水液体。作为具有高二电常数的惰性溶剂，DMF是良好的溶剂，是水和液体可溶的并在23℃具有低的气压。DMF与强氧化剂，烷基化铝和卤化化学品接触可以导致产生火或爆炸。
DMF储藏在低于-5℃的密封容器中。当需要时定量混合灌注液／CPA(OV)溶液并不储藏用于以后使用。
温度测量如图2显示，通过定位于主动脉套管内的小(0．5毫米直径)的T型温度电偶连续地测量温度。选择这一位置作为心脏附近与对心脏运动的最小干涉之间的最好统一。温差电偶能够精确地以超过45℃／秒的速度跟随温度变化。用具有定制的扩增器(掺入冷点温度补偿)的PC-30 12bitA／D卡(Eagle电子公司)实验期间每秒一次对温度取样。以商品Fluke 52K-型温差电偶温度计校正温度测量系统。在-100℃到+100℃范围内的测量证明精确到真正温度的2％。在液氮中快速冷冻的过程中，将心脏淹没在液氮中刚刚超过主动脉(参见图2)。在左心室内和如上面提到的主动脉导管内进行低温储藏实验过程中的温度测量。淹没在液氮中的心脏在20秒内心脏内的温度达到-196℃，相对的主动脉尖的温度为-75℃。左心室在快速冷冻过程中冷冻速度约为10℃／秒，在主动脉尖为7．5℃／秒。
使用的灌注液／CPA(OV)混合物称为(OV1)溶液的Tyrode 90％和DMF 10％称为(OV2)溶液的Tyrode 80％和DMF 20％称为(OV25)溶液的Tyrode 75％和DMF 25％称为(OV3)溶液的Tyrode 70％和DMF 30％所有百分数为体积／体积(v／v)百分数。
技术制备了如上所述的热／冷(37℃／5℃)LD1和冷(5℃)LD2 Langendorff系统。在LD1利用单一纯Tyrode溶液并利用该系统冷冻所有灌注的大鼠心脏。在LD2只在冷温度(5℃)使用纯Tyrode和储藏保护剂的OV混合物。
将DMF保持在-5℃的密封的容器内的冷冻储藏区域。在使用之前立即制造Tyrode溶液中的10％，20％，25％和30％DMF溶液。
在第一套实验中，将大鼠麻醉，切除心脏，浸入冷的Tyrode溶液，通过左心室插入套管，连接到37℃的含有纯的Tyrode溶液的热／冷Langendorff系统(LD1)并灌注8分钟以便固定收缩(图4-注解a)，然后该系统温度降到5℃并维持这一温度10分钟(图4-注解b-c)。
用Mayo剪刀在紧靠肋骨骨架的下面横切腹部，暴露隔膜，然后切除腹部和侧面边缘的隔膜以便暴露心脏和肺。在这时，肺不再起作用，缺血性时钟开始运转。然后切除心脏与肋骨骨架之间的纵隔并将心脏温和地举起并用隔膜剪刀切除。然后将心脏放入冷的Tyrode烧杯中，淹没。然后通过切除主动脉的边缘举起心脏，借助于棉线将主动脉关闭到套管，修剪缝的边缘。
然后将心脏与LD1系统分开，连接到LD2系统(图4-注解c-d)。用纯Tyrode在5℃开始灌注来自LD2系统的心脏，然后将灌注溶液变化为50毫升OV1溶液(LD2)(图4-注解d)。灌注心脏10分钟直到耗尽OV1溶液。然后用30毫升OV1溶液填充系统LD2，连续灌注8分钟。然后用30毫升OV3溶液填充系统LD2，在耗尽OV3之前8分钟后，停止灌注。然后用薄层棉絮覆盖心脏，用OV3溶液在0℃浸没。然后在液氮中完全浸没心脏，直到左心室的温度达到-196℃。以冷冻速度为-10℃／秒时冷冻20秒。在再加热之前将心脏维持在-196℃的温度10秒到45分钟的时间范围。
然后将心脏置于0℃的含有70毫升OV3的100毫升玻璃杯中并保留12分钟进行解冻(图4，注解g-i)。此后，左心室温度在+4℃到-4℃之间。在冷的仍然连接的Langendorff系统(LD2)上，利用20毫升OV3再开始灌注2分钟。然后用20毫升OV2溶液填充LD2系统，继续灌注2分钟，然后用30毫升OV1溶液继续灌注4分钟，然后用100毫升纯Tyrode继续灌注12分钟。总的再灌注时间20分钟。然后移出心脏，再连接到冷／热Langendorff系统LD1(图4-注解j-k)，用纯Tyrode溶液在5℃的温度开始灌注(图4-注解k)并再加热系统到温度37℃(图4-注解k-m)，直到左心室温度为37℃。在温度达到14到30℃时心脏开始在3到6分钟内收缩。将跳动的心脏保持在温热的Langendorff系统中30分钟，然后实验终止。
在第二套实验中，使用了OV1和OV25溶液。在这套实验中，OV25代替了OV2和OV3。
如果在8℃以上开始在液氮中冷冻，通常发生心脏的脆裂。通过在心脏周围形成隔离囊，棉絮包裹材料减慢温度的下降。
通过用95％的氧／5％的CO2气体混合物预吹使所有溶液氧化。在细胞中足够快地扩散DMF，没有观察到渗透膨胀。必须避免进入心脏的灌注液中的气泡因为它们会导致引起缺血并干涉CPA的加入和除去的梗塞。大的气泡是致死的。灌注液的压力头优选地是90-100厘米。37．5厘米的压力头导致不恰当的灌注。
在实验完成时对所有心脏进行亚心内和亚贲门层的转移电子显微术(参见图8-10)。
对100个大鼠心脏重复如上所述的实验。
结果如图1-注解b可以看到用温度冷却速度-75℃／秒达到快速冷冻。将心脏浸没在液氮中，使主动脉套管尖的温度固定在-75℃。与此相关的心脏内的温度为-196℃。在从液氮中取出心脏后，再加热，温度快速达到-7℃(参见图Ⅰ-注解c)。
在这一系列实验中，在Langendorff系统热灌注后开始收缩3到6分钟的心脏，在心肌温度为14到30℃的范围下重新启动。观察活动的，有节律跳动的心脏至少30分钟。冠状流回到预冷速度，心脏速度恢复到预冷值。肉眼没有看到损坏。用电子显微镜在22500，28500和36250的放大倍数下观察细胞内的结构没有可见的损坏(附图8-10)。
在肝的低温储藏的情况中，在导入CPA之前阻止肝功能很重要，因为有功能的肝将分解DMF成毒性化合物(AMCC)。DMF是有肝毒性的。肝功能在约8℃时终止，肝必须冷冻到最小4℃，然后导入DMF。在导入DMF溶液之前，整个身体必须保持或低于4℃。为了冷冻整个身体，将身体置于心肺机器中，用纯生理溶液替代血液，并冷冻到4℃。导入CPA(OV溶液)并循环到整个身体直到所有细胞被CPA饱和。然后用吸足CPA溶液的填塞物覆盖身体并在液氮中冷冻。在再加热时，必须维持最小4℃的温度直到所有CPA溶液从身体细胞中冲洗出。然后用纯生理溶液再加热身体直到11℃，然后再将血液导入身体。
讨论过去通过在达到-196℃的温度冷冻储藏固体器官，同时在冷冻过程后再获得功能状态的尝试没有成功的(Wang T，Banker MC，ClaydenN，Hicks GL Jr，Layne JR Jr，哺乳动物心脏外植体Ⅵ的冷冻储藏。解冻速度对功能恢复的影响，“低温生物学”29期，(470-477)，1992；Wang T，Connery CP，Batty PR，在高的亚零下温度成年哺乳动物心脏的冷冻储藏，“低温生物学”29期(171-176)，1991；Wicomb WN，Hill DJ，Collins GM，兔心脏的24小时冰储藏，“心肺移植杂志”，135，(891-894)，1994。就申请人的了解范围，还没有成功的实验，其中在低于-80℃的温度冷冻固体器官，随后在宏观和微观评价都没有显示可见的器官的损坏。
由结晶，毒性和渗透压引起细胞内的损坏。低温学杂志已经很好地记录了这些问题。以前报道的成功的低温储藏仅限于单个细胞和精子。这些过程通常使用慢的或计划性冷冻，其中，结构的绝对体积非常小(Rall WF，Fahy GM，通过玻璃化作用，在-196℃无冰低温储藏大鼠胚胎，“自然”，313，(573-575)，1985)。在单个细胞中，假定高的温度冷却速度和冷冻具有更小的效应，因为体积变化对单个细胞比对完整器官具有更小的损坏效应。
当淹没在液氮中，正如电解质-水溶液，25％的DMF和Tyrode溶液不表现体积扩展。所以本发明人在一些鼠心脏实验中利用了这一浓度。
在鼠心脏实验中遇到的温度冷却速度并不具有任何毒害效应，没有细胞内的损坏发生。
为了成功地低温储藏整个器官，需要具有下面特性的介质和过程1．该介质必须快速替代细胞内的水分；2．该介质必须同时达到器官中所有细胞(Burrows FA，BissonetteB，在新生儿和婴儿的心脏手术中利用深远的体温过低和低的心肺流动或循环时阻止脑的血液流动速度的方式，“Can Anaesth”，404，(298-307)，1993)；3．该介质必须改变水和介质的混合物的特性以致在冷冻时没有或很少体积变化发生；4．该介质必须是对细胞和组织没有毒性的；5．必须在广泛的温度范围维持介质特性；6．该介质必须在冷冻温度下具有低粘度，通常接近水；7．在亚零下温度呈液态的介质。
本发明人发现二甲基甲酰胺(DMF)符合上面提到的大多数要求。
利用大鼠心脏作模型，因为在实验工作中它容易评价。其中在实验模型中在大鼠心脏中可以测试功能的方式已经很好地建立了，所以比较信息是可得的。兴趣初步集中在进行低温储藏技术后心脏的功能上。但是，在所有情况中进行组织的电子显微术以便研究超级结构变化的可能性。
电子显微术显示细胞内结构没有可见的损坏，尽管经过非常细致的对细胞损坏的信号的研究。
在遭遇了极度温度冷却速度以及非常低的终点温度后，实验中心脏恢复特别好。宏观没有损坏可以看到，正如心脏收缩的运动所表示的，功能性良好。
本发明开创了长期储藏固体器官和组织结构和建立器官库的潜能。实施例2HIV的治疗如对HIV-1阳性病人利用Virodene PO58皮肤膏药的3期临床实验，对人进行毒性研究。同时本发明人也进行了DMF对细胞培养物的体外研究。
通过将用二甲基甲酰胺凝胶浸泡的皮肤膏药用于病人的身体，利用二甲基甲酰胺(Virodene PO58)，治疗感染HIV-1的病人。两块皮肤膏药用于病人身体的不同部分例如前臂。每块皮肤膏药含有7．064克含有DMF(92．5％m／m)和胶质二氧化硅(7．5％m／m)的凝胶。凝胶的作用是防止液体DMF从膏药中漏出。由于DMF快速蒸发，在使用之前不超过12小时制造这些膏药。病人血液中的希望的DMF水平是100ppm。对于重量约为60千克的病人，在12小时的时期生产100ppm的水平需要约14克的量。N-乙酰-半胱氨酸-谷胱甘肽和／或基本磷脂以250毫克到300毫克每天的剂量作为肝加强注射剂量对病人给药。另外，谷氨酸也可以作为肝加强注射剂量对病人给药(口腔或静脉)。根据Marz和Nohova的研究，吸收这一剂量需要的表面面积约为127．2平方厘米。为了获得100ppm的血液水平，每小时必须吸收约1．272克DMF，所以每个张贴物需要约7．064克DMF以传递需要的剂量，表面面积为6．36平方厘米(每个张贴物)。DMF的吸收速度是9．4毫克／平方厘米／小时。在理论上，这一治疗将传递125-135ppm，但由于DMF的蒸发，得到100ppm。根据各种因素如皮肤类型和皮肤厚度吸收能力随不同的病人有变化。为了在病人中获得需要的DMF水平，对每个病人检测血浆DMF的浓度并根据每个病人的DMF水平逐渐调节治疗(参见图6和7，例如在接受同样治疗的病人中各种血浆DMF浓度水平)。
所以每个张贴物加载约7．064克DMF和二氧化硅的凝胶。每块膏药用12小时的时期，每星期一块，12星期一周期，或每星期两块，6星期一周期。
在某些病人中在三星期内(参见图3)，用尽可能少的三次治疗的血液试验表明CD4 T-细胞数量从350增加到1000，PCR(聚合酶链式反应)快速从120000降低(病毒负载)到500／毫升。进行PCR试验的是Roche amplicor HIV检测器。＜500／毫升血浆的病毒负载认为是不可检测的。
一些进行治疗的病人在治疗前具有严重的粉刺或展示德国麻疹症状。当用DMF治疗以致病人血液中的DMF水平为50-100ppm时，德国麻疹症状和严重的粉刺在7天内清除或消失。
在用二甲基甲酰胺治疗前，对病人进行综合的基本临床和心理评估。评估提供了病人的基本生化和血液数据。同时进行详细的病毒血清学试验(HIV-1)以便确定病人整个身体的病毒数，这些试验在每周或每次治疗的进行。
在治疗周期中，每小时确定病人血液中的DMF的浓度。每天早晨导入静脉内细线以便取血样并以20毫升／小时注入普通生理盐水保持开放，同时进行每天监测起源于DMF的活性代谢物AMCC(如通过4小时的尿样)。根据吸收变化性的变化导致的血液水平的DMF的浓度的测定的变化调节随后的DMF的应用并进行每天的整个血液学和生化图谱以便检测肝功能的任何变化。同时进行每天的临床和心理评估。
同时进行确定每天总的身体病毒数和检测病人免疫状态(CD4T-辅助细胞)和预测因素的改善的每天病毒血清学工作。血清学工作是根据p24抗原和定量的PCR或可选择地通过其它方法。同时也进行CD4数和β-2-巨球蛋白的每周特异性测定以便监测病人免疫状态和预测因素的改善。为了缩短治疗以便使临床效果最大和副作用最小，将所有临床和实验室数据装入集中的数据系统以便简化对任何危害变化的快速应答。
试验包括a)血清S-Na，S-K，S-Cl，S-CO2，S-脲，Surate，S-Creat，S-Ca，S-Ca，S-Mg，S-Phos，总血清，S-Conjd；b)红血球HB Det，红细胞，Haematocrit，MCV，MCH，MCHC，RDW；c)蛋白质电泳ST-蛋白质，S-白蛋白，S-总Glob，S-αGlob，S-α2 Glob，S-βGlob，S-γGlob；d)白细胞分化数白细胞数，Neutro绝对值，Lypho绝对值，Mono绝对值，Eosino绝对值，Baso绝对值；e)肝酶S-Alk，Phos，S-γGT，S-Alt(SGPT)，S-AST(SGOT)，S-LD；f)病毒学细胞标记，PCR，β2-微球蛋白，P24抗原，C-反应性蛋白，和CK-MB浓度；g)DMF水平的血液分析；h)AMCC水平的尿分析。
DMF的作用似乎是逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂中的一种。进行的体外试验表明似乎是DMF的可溶特性使病毒颗粒如外壳溶解。
权利要求
1．用于器官的低温储藏和病毒和／或微生物感染的治疗的物质或组合物，含有选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性剂的物质或组合物，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
2．根据权利要求1所述的物质或组合物，其中至少R1和R2中的一个是甲基基团。
3．根据权利要求1所述的物质或组合物，其中至少R1和R2中的一个是氟化C1-C3烷基基团。
4．根据权利要求3所述的物质或组合物，其中活性剂是N-氟化甲基-N-甲基-甲酰胺。
5．根据权利要求1或权利要求2所述的物质或组合物，其中活性剂是二甲基甲酰胺。
6．用于低温储藏器官的物质或组合物，含有选自包括通式R3-CO-NR1R2的组的活性低温试剂的物质或组合物，其中R1和R2各自选自包括H，Me和卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
7．根据权利要求6所述的物质或组合物，其中至少R1和R2中的一个是甲基基团。
8．根据权利要求6所述的物质或组合物，其中至少R1和R2中的一个是氟化C1-C3烷基基团。
9．根据权利要求8所述的物质或组合物，其中活性低温试剂是N-氟化甲基-N-甲基-甲酰胺。
10．根据权利要求6或权利要求7所述的物质或组合物，其中活性低温试剂是二甲基甲酰胺。
11．根据权利要求5到10包括的任何一个所述的物质或组合物，其中低温试剂与包括选自含有氯化钠，EDTA-二钠，碳酸氢钠，氯化钾，磷酸二氢钾，氯化镁，硫酸镁，氯化钙，葡萄糖和Hespes-氢氧化钠和其中任何两种或更多的混合物的组的成份的生理溶液。
12．用于治疗病毒和／或微生物感染的物质或组合物，含有选自包括通式R3-CO-NR1R2的组的活性治疗剂的物质或组合物，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
13．根据权利要求12所述的物质或组合物，其中病毒感染选自获得性人免疫缺陷病毒感染(HIV-1)。
14．根据权利要求12或13所述的物质或组合物，其中至少R1和R2中的一个是甲基基团。
15．根据权利要求12或13所述的物质或组合物，其中至少R1和R2中的一个是氟化C1-C3烷基基团。
16．根据权利要求15所述的物质或组合物，其中活性治疗剂是N-氟化甲基-N-甲基-甲酰胺。
17．根据权利要求12到14包括的任何一种所述的物质或组合物，其中活性治疗剂是二甲基甲酰胺。
18．根据权利要求12到17包括的任何一种所述的物质或组合物，其中包括至少一种生理学可接受赋型剂或载体。
19．根据权利要求18所述的物质或组合物，其中生理学可接受赋型剂或载体是胶质二氧化硅。
20．制造用于低温储藏器官的低温储藏试剂的方法，包括将选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的低温储藏成份与生理学溶液合并的步骤的方法，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
21．制造用于治疗病毒和／或微生物感染的药剂或制剂的方法，包括将选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性治疗剂与至少一种生理学可接受赋型剂或载体合并的步骤的方法，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
22．含有选自包括通式R3-CO-NR1R2的组的低温储藏成份的低温储藏试剂在低温储藏器官中的应用，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
23．含有选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组活性治疗剂的药剂或制剂在治疗病毒和／或微生物感染中的应用，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
24．低温储藏成份在制造低温储藏试剂中的应用，该成份选自包括通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
25．物质或组合物在制造用于治疗病毒和／或微生物感染的药剂或制剂中的应用，该物质或组合物包括选自含有通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性治疗剂，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基的组，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
26．低温储藏器官的方法，该方法包括用含有低温储藏成份的低温储藏试剂灌注器官的步骤，该低温储藏成份选自含有通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基的组，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团；和将灌注器官的温度降低到储藏温度，在该温度至少将器官临时储藏。
27．根据权利要求26所述的方法，包括前面的用生理溶液灌注器官和冷冻器官到5到8℃的步骤，然后用低温储藏试剂灌注器官，同时逐渐增加低温储藏试剂中低温储藏成份的浓度并将器官冷却到储藏温度。
28．根据权利要求27所述的方法，其中低温储藏成份的浓度逐渐增加到25％到40％。
29．根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中低温储藏温度在-4℃和-196℃之间。
30．解冻已经用低温储藏试剂灌注并冷却到低温储藏温度的器官的方法，该方法包括步骤将器官与含有低温储藏成份的低温储藏试剂接触，该低温储藏成份选自通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组，其中；R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团直到器官达到在低温储藏温度之上的预定温度；用含有低温储藏成份的低温储藏试剂灌注器官，同时逐渐降低低温储藏试剂中低温储藏成份的浓度并增加器官的温度；和用生理溶液灌注器官。
31．治疗病毒和／或微生物感染的方法，该方法包括步骤对感染病毒和／或微生物的个体施用含有生理有效剂量的选自含有通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性治疗剂的药剂或制剂，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
32．根据权利要求31所述的方法，其中所选择剂量提供约为50-200ppm的待治疗的个体的血液中活性剂的血液浓度。
33．根据权利要求32所述的方法，其中所选择剂量提供50-500ppm的血液浓度。
34．根据权利要求31到32包括的任何一种所述的方法，其中剂量通过皮下给药。
35．根据权利要求31到34包括的任何一种所述的方法，其中剂量是通过选自口服剂量，吸入，通过栓剂，静脉内给药和其中任何两种或更多的联合的方法给药。
36．用于病毒和／或微生物感染治疗的剂量形式，包括局部应用的工具，其上吸收或被吸收了有效量的选自含有通式R3-CO-NR1R2的酰胺的组的活性治疗剂，其中R1和R2各自选自包括H，Me，卤代甲基，饱和及不饱和C2-C3烷基基团，饱和及不饱和卤化C2-C3烷基基团，羟基化烷基基团的组；或R1和R2一起选自(CH2)n，其中n=4或5，或(CH2)2O(CH2)2；和R3选自H，Me和饱和及不饱和C2-C3烷基基团。
37．从用病毒感染人并已经根据权利要求31到35包括的任何一种所述的方法治疗后的人的身体中收获的抗体制备的疫苗。
38．基本上如本文前面所述和阐明的用于低温储藏器官和治疗病毒和／或微生物感染的物质或组合物。
39．基本上如本文前面所述和阐明的用于器官的低温储藏的物质或组合物。
40．基本上如本文前面所述和阐明的用于治疗病毒和／或微生物感染的物质或组合物。
41．基本上如本文前面所述和阐明的制造的低温储藏试剂的方法。
42．基本上如本文前面所述和阐明的制造药剂或制剂的方法。
43．基本上如本文前面所述和阐明的低温储藏试剂在器官的低温储藏中的应用。
44．基本上如本文前面所述和阐明的药剂或制剂在病毒和／或微生物感染治疗中的具体应用。
45．基本上如本文前面所述和阐明的低温储藏成份在制造低温储藏试剂中的应用。
46．基本上如本文前面所述和阐明的物质或说明在制造药剂或制剂中的应用。
47．基本上如本文前面所述和阐明的低温储藏器官的方法。
48．基本上如本文前面所述和阐明的解冻器官的方法。
49．基本上如本文前面所述和阐明的治疗病毒和／或微生物感染的方法。
50．基本上如本文前面所述和阐明的剂量形式。
51．如本文前面所述和阐明具体的疫苗。
全文摘要
本发明提供了器官的低温储藏和治疗病毒和/或微生物感染的方法,含有选自包括通式R
文档编号A61K31/16GK1204232SQ96199028
公开日1999年1月6日 申请日期1996年12月13日 优先权日1996年12月13日
发明者米歇尔·奥尔加·帕特里夏·吉斯泰拉·维瑟 申请人:低温贮藏技术有限公司