专利名称：假单胞菌属外毒素－髓磷脂碱性蛋白嵌合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于自身免疫病，特别是多发性硬化的定向免疫治疗的抗原-毒素嵌合蛋白。
治疗自身免疫病的主要目的之一是开发选择性的免疫抑制剂。在不了解有关具体抗原的性质的前提下，目前为止治疗只能是通过细胞毒性剂非特异性致死迅速分裂的细胞，以及用抗炎剂抑制炎症介体的作用。
最近，由于我们对免疫反应的了解加深，遗传工程的发展和改进了自身免疫病的模型，业已开发出了用于治疗免疫反应疾病的特异性及选择性治疗剂。
业已了解作过全面研究的动物模型实验自身免疫脑脊髓炎(EAE)是由髓磷脂碱性蛋白(MBP)或其免疫原性决定簇引起的，在很多哺乳运动种中，当在适当条件下注射时均是如此。MBP是中枢神经系统(CNS)髓磷脂蛋白的一种主要成分。已提出MBP能刺激T细胞群，使其向中枢神经系统迁移并引发会导致血管周围成套损伤和多发性硬化的脱髓鞘特征的反应。将MBP-特异-T辅助细胞注射到鼠类动物体内也可以诱发上述模式。
已采用过多种方式来抑制EAE模式。已报导对MBP-1a配合物特异的单克隆抗体能抑制H-2S小鼠的EAE(1-2)。
治疗多发性硬化(MS)的其它方法包括施用合成的T-细胞受体肽(3)、MBP的改性肽(4)、共聚物-1-合成的氨基酸无规共聚物(US专利3,849,550)和各种干扰素(5)。
治疗自身免疫病的一种不同方法涉及一种用基因融合技术制成的嵌合细胞毒性分子的使用。这些分子利用了诸如假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素(PE)的毒素部分，同时克服了其非特异性细胞结合的特性。通过毒素部分与识别因子的融合赋予这种截短或修饰过的毒素分子特异性，所述识因子可将该嵌合蛋白引导到表达特异受体的特定靶细胞处。
通过融合编码IL2、IL4、IL6、TGFα、抗Tac和CD4的cDNA和PE已构建出有效的嵌合细胞毒素(6-11)。
已证实所述嵌合蛋白之一IL2-PE40针对并可选择性地消除能表达IL2受体的活化T细胞。在很多免疫反应疾病模型中(其中活化的T细胞起着关键作用)，已证实IL2-PE40是IL2受体定向治疗的有效的、选择性的免疫抑制剂(12-19)。
使用高度纯化的制剂(40)，已证实IL2-PE40(a)延缓并转移在大鼠中由佐剂诱发的关节炎(21)，(b)明显延长血管化心脏同种异体移植小鼠的存活时间(22)，(c)降低大鼠实验自身免疫眼色素层视网膜炎(EAU)的发病率和发病程度(23)，(d)抑制小鼠中T细胞淋巴瘤的生长(24)，(e)明显减轻大鼠正位角膜移植的临床排斥等级和累积排斥速率(25)，和(f)防止在大鼠和小鼠中出现EAE的特有特征(26)。
尽管已证实诸如IL2-PE40的细胞因子-毒素嵌合蛋白是一种有效的选择性免疫抑制剂，但其作用并不局限于特异抗原激活的细胞，而是涉及一切IL2受体阳性细胞(12)。
与目前正采用或推荐的很多治疗EAE或MS患者的方法形成对照的是，仍然需要仅针对病原细胞并保持其它免疫反应完全有效的特异性方法。
Steinberg I.等(Third International Conference On Neuro-immunology，Jerusalem，Israel(1991)，Third InternationalSymposium on Immunotoxins Jerusalem(1992))披露了与编码截短了的或突变的全长PE基因的cDNA融合的编码一种MBP致脑炎部分的寡核苷酸。该DNA在大肠杆菌(E.coli)中表达，而所得到的嵌合蛋白能有效杀伤αMBP T细胞，但对非靶细胞无影响。
本发明的目的之一是提供一种可用于治疗自身免疫疾病的嵌合蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种治疗诸如多发性硬化的自身免疫病的方法。
本发明涉及嵌合分子的构建、鉴定和纯化，该嵌合分子包括一种与毒素部分连接的髓磷脂碱性蛋白部分，这种嵌合分子是能定向并专门杀伤αMBP特异T细胞以及MS患者的外周血细胞的新型制剂。
根据本发明的一个方面，提供了一种嵌合蛋白，它包括一个与髓磷脂碱性蛋白(MBP)部分连接的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素(PE)部分，该MBP部分选自(a)MBP；(b)豚鼠髓磷脂碱性蛋白或其抗原性部分的氨基酸69-88；(c)人髓磷脂碱性蛋白或其抗原性部分的氨基酸84-102；(d)人髓磷脂碱性蛋白或其抗原性部分的氨基酸143-168；和(e)在(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、添加、取代或突变了的氨基酸序列，该修饰过的序列仍保持与未修饰过的氨基酸序列至少有75％的同源性。
对假单胞菌属外毒素进行分析后发现，它包括几个独特的功能域，被称作功能域I(a和b)、II和III。理想的是，该假单胞菌属毒素部分包括完整长度的外毒素或该外毒素的突变的或截短了的衍生物。该外毒素可衍生自外毒素的功能域II和III。另外，该假单胞菌属毒素部分可以由在诸如位置57、246、247和249中的一个或几个上发生了突变的外毒素而形成。这种突变PE被称为PE664Glu。
在另一种实施方案中，本发明涉及一种嵌合蛋白，该蛋白包括与选择性地突变或截短了的假单胞菌属外毒素部分连接的完整长度的髓磷脂碱性蛋白。
在本发明的每一种实施方案中，所述髓磷脂碱性蛋白部分和毒素部分可以直接或间接地连接。如果这两部分是间接连接，则优选由一个接头序列连接。在本文中“接头序列”一词涉及任何包括1-5个氨基酸和可能重复1-3次的氨基酸序列，即该接头可包括由一个重复3次的五肽组成的多达15个氨基酸残基。理想的是，该接头序列是一个包括gly-gly-gly-gly-ser的五肽。
本发明的另一方面涉及含有编码一种本发明分子的DNA序列的质粒，以及能表达该分子的表达载体。合适的质粒包括一个可操纵地与一个编码本发明分子的DNA序列连接的启动子。任何原核启动子均可使用，如PL和Tac等，但优选使用噬菌体T7启动子。在本文中，“可操纵地连接”一词是指启动子序列和待在该启动子的控制下表达的序列彼此之间的空间位置，使得该启动子能诱导表达。因此，可以用间隔序列将所述启动子和待表达的序列隔开。任何适当的表达载体均可使用，但优选使用大肠杆菌作载体。
本发明还包括所述嵌合蛋白的盐。“盐”一词包括羧基盐以及该蛋白分子的氨基的酸加成盐。可以用本领域公知的方法产生羧基盐，包括诸如钠、钙、铵、铁或锌盐之类的无机盐，和与诸如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶和普鲁卡因之类的有机碱形成的盐。例如，酸加成盐包括与诸如盐酸、硫酸之类的无机酸形成的盐或与诸如乙酸或草酸之类的有机酸形成的盐。
本发明还涉及含有至少一种上述嵌合蛋白和一种可以药用的惰性载体的药用组合物。理想的是，该组合物还包括一种诸如氯化铵和莫能菌素之类的菌性营养剂(lysosomotrophic agent)。
可以用本领域已知的施用蛋白的方法施用本发明的蛋白，例如，口服、静脉内、关节内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内、鞘内、真皮内、经皮服施用、吸入或包括经肠途径的任何其它途径施用。
本发明的嵌合蛋白可以用本领域技术人员所熟知的方法制备，例如，化学合成法或生物技术(遗传学)方法。如果用后一种方法，要把一个编码该嵌合蛋白的DNA构建体插入质粒中。合适的载体是经过选择并用上述质粒转化过的。然后刺激所述载体，以产生所需的嵌合蛋白。
通过结合附图对优选实施方案所作的以下详细说明可以更好地理解本发明。其中
图1是构建表达质粒pIS-1，pIS-2和pIS-3的示意图，这些质粒分别编码BPP1-PE664Glu，BPP2-PE664Glu和MBP-PE664Glu，其中，B表示BamHI；H表示Hind III；N表示NdeI；而E表示EcoRI；图2表示构建表达质粒pHL15的示意图，其中B表示Bam HI；N表示NdeI；E表示EcoRI；图3A表示考马斯蓝染色的凝胶，显示含有BPP-PE嵌合蛋白的细菌细胞级分的SDS-PAGE分析结果；图3B表示含有BPP-PE嵌合蛋白的细菌细胞级分的SDS-PAGE分析和与抗PE抗体的免疫印迹；图4表示BPP-PE嵌合蛋白对αMBP T细胞-D9的胞毒活性。以下列各种浓度添加BPP-PE嵌合蛋白；1-4＝分别为250；500；1000；1500ng(总蛋白浓度)不溶性组分-盐酸胍处理过的BPP-PE嵌合蛋白；4*＝有αPE抗血清的BPP-PE嵌合蛋白(总蛋白浓度为1500ng)；5-7＝分别为50；100；500ng高度纯化的IL2-PE40。
测定掺入细胞蛋白的[3H]-亮氨酸。结果以未经BPP-PE嵌合蛋白处理的对照细胞的百分比形式表达；图5表示BPP-PE嵌合蛋白对αMBP-T细胞系Zla的胞毒活性。结果以图4中述的图例形式表示；图6表示BPP-PE嵌合蛋白对αMBP-T细胞系kla的胞毒活性。结果以图4中所述的图例形式表示；图7表示MBP-FE664Glu嵌合蛋白对Z85细胞的胞毒活性。结果以图4中所述的图例形式表示；图8表示BPP-PE嵌合蛋白对非靶T细胞系-A2b的胞毒活性。以下列各种浓度添加BPP-PE嵌合蛋白1-5＝分别为250；500；1000；1500；2000ng(总蛋白浓度)的不溶性级分-盐酸胍处理过的BPP-PE嵌合蛋白；6-8＝分别为50；100；500ng高度纯化的IL2-PE40。
测定掺入细胞蛋白中的[3H]-亮氨酸。结果以未经BPP-PE嵌合蛋白处理的对照细胞的百分比形式表示；图9表示BPP-PE嵌合蛋白对PPD-非靶细胞的胞毒活性。结果以图4中所述的图例形式表示；图10表示BPP2-PE66和BPP1-PE40嵌合蛋白向PAS靶细胞里的内化。将BPP2-PE664Glu或BPP1’-PE40(不溶性级分-盐酸胍处理过的总蛋白浓度为15ug)加入细胞中，保持5小时。洗涤并裂解细胞，用抗PE抗血清对其样品作免疫印迹分析。
1泳道分别为BPP2-PE664G1u/BPP1’-PE40(总蛋白浓度为3ug)2泳道与BPP-PE嵌合蛋白中的任一种一起温育的裂解细胞的不溶性级分；3泳道与BPP-PEs一起温育的裂解细胞的可溶性级分；4、5泳道分别为洗涤步骤1和4的样品。
图11表示BPP1’-PE40对PAS细胞(αMBP T细胞)的胞毒活性。在增殖期的第1天以各种浓度将纯化的BPP1’-PE40(-□-)加入PAS细胞中。结果以图4所述形式表示；图12表示NH4Cl对BPP1’-PE40对αMBP T细胞的胞毒活性的影响。以500ng的恒定量添加BPP1’-PE40。在有遂步加大浓度的NH4Cl的条件下测定BPP1’-PE40对蛋白合成的抑制作用(-O-)。还测定了单独用NH4Cl在不同浓度下的作用(-□-)。结果以图4所述形式表示；图13表示BPP1’-PE40对获自MS患者的PBL的影响。以各种浓度将BPP1’-PE40添加到从以下MS患者体内分离得到的PBL细胞中MSM13(-■-)，MSM14(-△-)，MSM16(-●-)和MSM18(-□-)，按图4所述的方法测定蛋白合成的抑制作用；图14a-d是编码人嵌合蛋白的质粒的示意图；和图15a-c表示表达下列人BPP-PE嵌合蛋白的大肠杆菌细胞级分的SDS-PAGE图a)BPP84-102-PE664Glu；b)BPP143-168-PE664Glu；c)BPP84-102-PE40。A.构建BPP-PE/MBP-PE嵌合基团构建5种肽-毒素嵌合蛋白。3种含有编码豚鼠髓磷脂碱性蛋白19个氨基酸(氨基酸69-88)的BPP序列(29)。合成3种各自含有该豚鼠序列的寡核苷酸(Oligo1、1’和2，表I)，并各自与编码截短形式的PE(PE40)或突变了的完整长度PE序列(PE664Glu)的DNA片段的5’末端融合。对于BPP1-PE664Glu和BPP1’-PE40而言，所述BPP编码序列前面有一个编码Met-Val两个氨基酸的序列，而对于BPP2-PE664Glu而言，，所述BPP编码序列前面有一个编码Met-Ala的序列。
将该BPP/MBP编码序列直接与突变的PE序列触合(嵌合蛋白BPP2-PE664Glu)或通过一个5个氨基酸(gly-gly-gly-gly-ser)的接头连接，该接头插在BPP序列和PE664Glu(表I，Olio 1嵌合蛋白BPP1-PE664Glu)或PE40(表I，Oligo 1’，嵌合蛋白BPP1’-PE40)之间。
在第4种质粒pIS-3中，将一个大鼠MBP序列(30)直接连接在PE664Glu序列上(图1)，而在第5种质粒pBM-8466中，将编码人MBP的氨基酸84-102的序列直接同PE664Glu序列连接。质粒及其内容的概述(构建体(质粒名称))1.BPP1-PE664Glu(pIS-1)-69-88豚鼠MBP和突变PE，有接头2.BPP1’-PE40(pHL15)-69-88豚鼠MBP和截短了的PE，有接头3.BPP2-PE664G1u(pIS-2)-69-88豚鼠MBP和突变了的PE，无接头4.MBP-PE664Glu(pIS3)-大鼠MBP和突变PE，无接头5.BPP84-PE664Glu(pSM-8466)-84-102人MBP和突变PE，无接头。
表I用于合成BPP-PE嵌合蛋白的寡聚物(Oligo’s)Oligo 15′TATGGTAGGCTCCCTGCCCCAGAAGTCGCAGAGGTCTCAAGATGAAAACCCA GTAGTCCACTTCGGTGGCGGAGGATCAGA 3′Oligo 1′5′TATGGTAGGCTCCCTGCCCCAGAAGTCGCAGAGGTCTCAAGATGAAAACCCA GTAGTCCACTTCGGTGGCGGAGGATCACA 3′Oligo 25′TATGGCTGGCTCCCTGCCCCAGAAGTCGCAGAGGTCTCAAGATGAAAACCCAGTAGTCCACTTCGA 3′Oligo 35′TATGGATGAAAATCCAGTAGTTCATTTTTTTAAAAATATTGTAACCCCACGTACCCCACCCGA 3′pMBP-1质粒中编码大鼠MBP的cDNA的PCR引物IS1有义5′AGC TCATATGGCATCACAGGGGAGACC 3′IS2反义5′AGCTAAGCTTCGCGTCTTGCTATGGGAGATC 3′A.1质粒pIS-1、pIS-2和pSM-8466按图1和2所示的方法构建了在噬菌体T7控制下表达所述嵌合蛋白的质粒。用被NdeI和Hind III裂解过的pHL 823构建分别编码BPP1-PE664Glu、BPP2-PE664G1u和BBP84-PE664Glu的质粒pIS-1、pIS-2和pSM-8466。将最大的载体片段(4.4Kb)连接到3个不同的合成寡核苷酸(Oligo1，2或3，表I和图1)中的每一个上。检测所得质粒的大小，并在BL21(λDE3)细胞中检测所编码的嵌合蛋白的表达，见G部分。
A.2编码BPP1’-PE40的质粒pHL15用由NdeI裂解过的pHL906(29b)构建质粒pHL15。将最大的载体片段(4kb)连接到合成的寡核苷酸(Oligo1’，表I和图2)上。按上述方法检测质粒pHL15。
A.3编码MBP-PE664GIu的质粒pIS-3将-个相当于完整大鼠MBP的400bp-PCR片段与用NdeI和HindIII裂解过的pHL823的较大片段(4.4Kb)融合，构建质粒pIS-3。所述PCR片段用IS1和IS2引物(表I)合成，而质粒pMBP-1由L.Hood(California Inst.of Tech，USA)惠赠。用NdeI和Hind III裂解所述PCR产物，并与用相同的酶裂解过的pHL823连接。质粒pMBP-1含有编码大鼠MBP的完整长度的cDNA。
通过DNA序列分析证实了所构建嵌合基因的序列(资料未发表)。
B.蛋白表达用热激方法(32)将编码所述融合基因的质粒转化入大肠杆菌BL-21 DE3菌株中。在氨苄青霉素(100(g/ml)的琼脂板上生长并筛选转化的大肠杆菌菌落。让筛选出的菌落在含有氨苄青霉素(50(g/ml)的SLB培养基上进一步生长，直到OD650达到0.5。然后用异丙基-(-D-半乳糖苷(IPTG)(终浓度1mM)进行90分钟的诱导。
将一团表达过的细胞悬浮于TE缓冲液(50mM Tris，pH8.0，1mMEDTA)中，声波处理(100w，6次，每次冲击30秒)，并以10,000xg离心15分钟。除去上清液(可溶性级分)，并留待分析。在4vol(v/w)的提取缓冲液(7M Gu-HCl，0.1M Tris pH8.0，1mM EDTA，1mM DTT)中使细胞沉淀变性，并用声波处理(100W，冲击6次，每次30秒)。在4℃下搅拌该悬浮液1小时。通过在12,000g下离心15分钟澄清该悬浮液，并弃除沉淀。然后用磷酸缓冲盐水(PBS)将澄清的上清液稀释4倍，并用PBS透析。透析过的材料以12,000g离心10分钟。
所得到的上清液(盐酸胍处理过的不溶性级分)被用作大部分实验的嵌合蛋白来源。
C.BPP-PE嵌合蛋白的鉴定和亚细胞定位通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定新表达的嵌合蛋白。这些蛋白以接近42.9Kd和68.3-68.9Kd的表观分子量迁移，分别相当于预测的BPP1’-PE40、BPP1-PE664Glu/BPP2-PE664Glu/BPP84-PE664Glu的分子量(图3A)。MBP-PE664Glu的分子量为80Kd。免疫印迹显示，该嵌合蛋白能与多克隆抗-PE抗血清反应(图3B)。
如下面的表II所显示的，上述细胞的提取物具有ADP-核糖基化活性(31)。为了查明所表达的嵌合蛋白的亚细胞定位，进行亚细胞分级。用富含延伸因子2的麦胚提取物测定每种亚级分的ADP核糖基化活性。按照其酶促活性，3种不同的嵌合蛋白(BPP1-PE664Glu，BPP2-PE664Glu和BPP1’-PE40)是以类似方式表达并分布在不同亚级分中。
发现其总活性的大约60-70％与可溶性级分相关，而仅有30-40％的活性与不溶性级分相关。不过，发现不溶性级分是最富含所述蛋白的级分，其活性值(比活性)比计算出的可溶性级分的活性高7-16倍(表II)。因此，从不溶性级分中纯化BPP-PE嵌合蛋白(见下文)。应当指出的是，在外周质级分或培养基中仅存在基础水平的BPP-PE蛋白。
表II
D.BPP-PE嵌合蛋白的胞毒活性用MBP-特异的致脑炎的T细胞系检测不同BPP-PE嵌合蛋白的胞毒活性。在培养物中维持所述细胞系(MBP-特异性T细胞系Z85、D9、PAS、Kla和对照细胞系A2b、PPD，可由本发明人提供)，做法是改性特异抗原刺激3天，并再进行为期5-7天的增殖期。MBP特异性致脑炎MBP-1细胞系(3×105细胞/ml)的刺激是在有15μg/ml豚鼠MBP的条件下，用15×106细胞/ml同系照射的胸腺细胞作为抗原呈递细胞(APC)，在补充了1％同系大鼠血清、2mM-L谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5×10-5M β-巯基乙醇、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640中进行的。通过经Ficoll paque梯度(Pharmacia)离心将活化的淋巴母细胞同胸腺细胞和碎片分离。所述母细胞存在于界面中。然后在不含抗原和大鼠血清的同一种培养基中繁殖该母细胞，该培养基中富含10％加热失活的胎牛血清(FCS)和10％ConA激活的脾细胞上清液(含有TGCF的条件培养基)或25个单位/ml的人rlL2。
用稀释在含有0.2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中的不同嵌合蛋白的不溶性级分进行试验。在增殖阶段的第3天(d3)，以不同浓度将其加入96孔板的MBP-T细胞(2-4×104细胞/孔)中，做3次重复。在37℃下在含有5％CO2的空气中将这些细胞培养18-24小时，添加2μci〔3H〕-亮氨酸或1μci〔3H〕-胸苷，再培养12-16小时。收集细胞，并测定掺入的放射性。当用HUT102对照细胞做试验时，仅添加放射性材料培养4小时，然后收集细胞。由未用任何嵌合蛋白处理过的对照细胞计算出蛋白合成抑制的百分比。
如图4-6所示，特异性的αMBP T细胞系(分别为D9、Z85和Kla)对上述BPP-PE嵌合蛋白的胞毒活性敏感，在试验过的最高浓度下，表现出对蛋白合成有60-70％的抑制作用。蛋白合成的抑制作用取决于浓度。
与其它两种嵌合蛋白(BPP2-PE664Glu和BPP1’-PE40)不同的是，嵌合蛋白BPP1-PE664Glu对D9靶细胞无细胞毒性(图4)。当试验BPP-PE嵌合蛋白的细胞毒性作用对DNA合成的影响时，观察到了类似的结果(结果未发表)，表明该嵌合蛋白能不可逆地抑制蛋白的合成，由此导致细胞死亡。由于表达细胞的不溶性级分被用于这些实验中的大部分，我们将仅能表达该嵌合蛋白的毒性部分(PE40)的细胞不溶性级分用作对照，以检测与该不溶性级分制剂相关的非特异性活性。
PE40的不溶性级分对靶细胞(图4)或非靶细胞均无细胞毒性作用。MBP-PE664Glu的不溶性级分对Z85细胞有细胞毒性。在试验过的最高浓度(2,000ng)下，观察到蛋白合成的抑制作用为58％(图7)。
在用一种抗原诱发的T细胞系的激活过程中，出现了白介素2受体分子(IL2R)的从头表达，因此，我们试验了IL2-PE嵌合蛋白对作为正对照的不同抗原特异性T细胞系的胞毒活性。在试验过的不同αMBPT细胞系中，高度纯化的IL2-PE664Glu可导致蛋白合成40-75％的抑制作用(图4-6)。
E.BPP/MBP-PE嵌合蛋白活性的特异性在证实了BPP-PE嵌合蛋白对αMBP T细胞系的细胞毒性作用后，我们评估了对该嵌事蛋白的反应的特异性。如图4所示，过量的多克隆αPE可完全抑制BPP-PE嵌合蛋白对αMBP T细胞系D9的细胞毒性作用，从而证实了其作用的特异性。
还试验了BPP-PE蛋白对非靶细胞系A2b或PPD的作用。对分支杆菌抗原特异的A2b细胞系能与大鼠软骨交叉反应，并参与介异佐剂关节炎。PPD细胞系对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的纯化的蛋白衍生物有特异性。以与αMBP T细胞相同的条件在培养物中维持上述两种T细胞。
如图8和9所示，A2b或PPD对照细胞系不受BPP-PE嵌合蛋白作用的影响，证实其作用是一种高度特异的反应。还在其它非靶细胞-HUT 102细胞上试验了BPP-PE嵌合蛋白的活性，HUT102细胞是一种人HTLV-IT细胞白血病细胞系，它能表达高亲和和低亲和形式的IL2R。在补充了10％FCS的RPMI 1640中维持该细胞。HUT102是由T.A.Waldmann(National Cancer Institutes)惠赠的。未发现BPP-PE嵌合蛋白的细胞毒性作用。
F.嵌合蛋白向靶细胞中的内化作为证实BPP-PE嵌合蛋白向靶细胞中内化的另一种方法，我们在培养之后通过免疫印迹分析寻找该蛋白在细胞内的存在。
通过培养嵌合蛋白BPP2-PE664Glu和BPP1’-PE40(不溶性级分的总蛋白浓度约为5μg，用盐酸胍处理过)和αMBP T细胞(PAS细胞)或A2b非靶细胞5小时来分析嵌合蛋白向靶细胞中的内化。在培养结束时，用HanRs平衡钠盐溶液(HBSS)缓冲液洗涤细胞4次，保留取自每一洗涤步骤的样品。然后用裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA、1％NP40、1％脱氧胆酸、0.1％SDS、1mM PMSF)裂解细胞，并在室温下培养15分钟。以9000g离心细胞裂解液10分钟，并保存裂解细胞的沉淀部分(溶于Tris-HCl pH 7.4，1mMEDTA，TE缓冲液)和上清液部分用于分析。将来自生长培养基、洗涤步骤和裂解细胞的样品用于SDS PAGE分析。将电泳过的样品从凝胶转移到硝酸纤维素上，并用αPE抗血清作免疫印迹分析。当在A2b细胞上分析内化作用时，样品的免疫印迹分析是通过狭线印迹法进行的。
在标准分析条件之后，可以检测到靶细胞裂解液中的BPP2-PE664Glu和BPP1’-PE40(图10)。由于来自最后一个洗涤步骤(在裂解细胞之前，洗涤IV，图10)的样品未表现出任何免疫反应性材料，这些嵌合蛋白是细胞相关性的。在相同分析条件下，在A2b非靶细胞内检测不到内化的嵌合蛋白(图10)。正如所预料的，此情形中只能在生长培养基中和第一次洗涤的样品中检测到嵌合蛋白。
G.BPP-PE嵌合蛋白的生产和纯化在原核系统中表达MBP/BPP-PE嵌合蛋白。其在大肠杆菌中的表达，与所观察到的很多外源真核蛋白的表达一样，会导致不溶性包含体的形成，该包含体含有非天然、非活性构象的重组蛋白。获取这种融合蛋白的其它方法有别于并取决于其组分的性质。
在大肠杆菌BL21菌株(λDE3)的细胞中表达所述嵌合蛋白。在37℃下，在SLB/Amp(50(g/ml)(1L的SLB-5g NaCl，16g色氨酸、10g酵母提取物)培养基中生长细菌细胞，直到OD600达到1.5-2.0。用IPTG诱导(1mM，90分钟，37℃)，导致所述嵌合蛋白表达。以2700rpm的速度离心培养物15分钟。在-70℃下冷冻细胞沉淀。使冷冻的大肠杆菌细胞解冻，并悬浮在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA，0.2mg/ml溶菌酶)(10ml/g细胞)中。
对细胞悬浮液进行脉冲声波处理3×30秒。在4℃下以35,000×g离心裂解的细胞30分钟，以获得不溶性级分，即所述包含体。将该包含体悬浮在变性缓冲液(6M GuHCl，100mM Tris-HCl pH8.6，1mMEDTA，10mm DTT，50mM NaCl)(1ml/g细胞)中。离心收集所述混合物(35,000g，15分钟)。用重折叠缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，0.25M粗氨酸， 5mM DTT，0.25M NaCl)将上清液稀释100倍，并在4℃下搅拌48小时。
通过在4℃，35,000g下离心30分钟澄清所述稀释过的提取物。将重折叠溶液的每一克蛋白吸附到0.7-0.8ml预处理过的(用BSA)羟基磷灰石上。未与吸附剂结合的部分添加0.25M NaCl和100mM精氨酸，并用搅拌室(Nucleopore，膜截断分子量30,000，Sigma)浓缩，直到最终体积为1-2ml。然后将浓缩过的级分上Sephacryl S-200 HR柱(1×120cm)，该柱用50mM磷酸钾缓冲液， pH7.0，和0.25M NaCl预校正过。
收集1ml的级分，在280nm测光吸收，并在SDS-PAGE上检测。收集峰值级分，并用PBS透析，称之为纯化的BPP1’-PE40。以等分试样的形式在-20℃下保存高度纯化的BPP1’-PE40。
在所有的纯化步骤之后都对样品进行SDS-PAGE电泳、蛋白测定、Western印迹分析和ADP-核糖基化活性分析。
根据总活性(通过ADP-核糖基化活性测定)得出原材料的产率为4.5％(表III)。根据嵌合蛋白的比活性，其纯化程度为20.8倍(表III)。
表IIIBPP-PE40的纯化
检验所述高度纯化的嵌合蛋白的非特异活性。其做法是将提高的单一剂量嵌合蛋白注射给小鼠(SJL品系)。对动物至少作2周的观察，不过，毒性剂量的PE可在24-48小时内导致死亡。在50μg的剂量下没有小鼠死亡，在100μg的剂量2/3的小鼠死亡。
在上述纯化方法中，在羟基磷灰石步骤之后使用离子交换柱(取代搅拌室)可以提高最终产物的纯度。用TE缓冲液(TE缓冲液10mMTris HCl pH8.0，1mM EDTA)稀释(1∶5)未与羟基磷灰石支持物结合的级分，加到Q-Sepharose(将5ml湿柱介质混入BPP1-PE40稀溶液的约20mg蛋白)中，并在4℃下搅拌30分钟。然后将该材料装柱，并用TE缓冲液洗涤。洗脱是用溶于TE缓冲液中的1MNaCl进行的。将通过该步骤浓缩的蛋白样品加到Sephacryl柱上。
H.纯化BPP1’-PE40的胞毒活性在增殖期的第1天(d1)，将用量逐渐加大的纯化BPP1’-PE40嵌合蛋白加入PAS细胞中。如图11所示，高度纯化的BPP1’-PE40以取决于剂量的形式导致蛋白合成的抑制。
1.用溶菌性营养剂增强细胞毒性已知NH4Cl是一种溶菌性营养剂，它可以提高溶酶体的pH，从而中和其酶的活性。诸如NH4Cl、能霉素之类的不同溶菌性营养剂可导致所述免疫毒素细胞毒性的增强。
我们检验了NH4Cl对BPP1’-PE40对靶细胞的细胞毒性的影响。如图12所示，5mM NH4Cl可明显提高BPP1’-PE40对PAS细胞的细胞毒性作用。而在无NH4Cl的条件下，500ng BPP1’-PE40仅能对蛋白合成产生4％的抑制作用，加入NH4Cl可将对蛋白合成的抑制作用提高到98％(5mM NH4Cl本身可使蛋白合成减少26％)。
J.BPP-PE对获自MS患者的PBL的细胞毒性从MS患者或对照健康供体采集外周质。将20ml外周血加入Ficoll-isopaque(1.077)中，以分离淋巴细胞。用PHA(5(g/ml)对淋巴细胞进行72小时的活化，或在24小时内趁鲜使用。将激活的淋巴细胞转入补充了10％FCS和10单位/ml rlL2的RPMI 1640中。转移细胞后立刻进行细胞毒性分析(2×104细胞/孔)。在补充了20％加热失活的FCS和10单位/ml rlL2的与用于所述T细胞系的相同培养基中维持新鲜淋巴细胞(105细胞/孔)。
用于蛋白抑制试验而接种的细胞是1)没有任何预激活阶段的新鲜细胞。用对照新鲜血样进行校准实验，以确保在试验阶段该细胞的良好有效性。试验诸如接种细胞的密度、添加特异生长因子/细胞因子等的参数；2)PHA激活2-3天后的细胞。在平行实验中，以类似方式检验采自健康个体的对照血样，检验所用嵌合蛋白的特异性。
对MS患者所做的研究主要是在疾病复发时进行。该研究涉及到18个MS患者。用不同纯化阶段的BPP1’-PE40(随着纯化方法的进程进行)检验获自11个患者的新鲜细胞(未作任何预激活)。来自6个患者(54％)的外周血细胞对由BPP1’-PE40介导的细胞毒性敏感，可抑制蛋白合成的20-92％。图13证实了BPP1’-PE40对少数MS患者的作用，一个患者对该嵌合蛋白十分敏感(MSM-18)，一个未表现出任何反应(MSM-16)，而其它两个患者表现出对由BPP1’-PE40介导的细胞毒性低至中度敏感性(MSM-13，14)。
在用PHA激活3天后检验自12个患者体内采集的样品(部分患者的样品同时做新鲜细胞和激活后的细胞检验)。12个样品中的6个(50％)表现出对所述嵌合蛋白的敏感性。
取自对照供体的细胞对该嵌合蛋白无反应或反应很弱。还对取自患有另一种不相关的神经疾病的患者的细胞进行了试验，并发现其对BPP1’-PE40的细胞毒性作用无反应。
K.用BPP1’-PE40抑制EAE免疫和处理方法用小鼠脊髓匀浆物(0.1mg/小鼠)对8-10周龄的18只雌性SJL小鼠的爪垫接种免疫，所述匀浆物溶解在PBS，pH7.4中，并以1∶1的比例用CFA(5mg/ml结核分枝杆菌)乳化，总体积为100μl/小鼠。另外，静脉注射百日咳毒素(200ng/200μl/小鼠)。在48小时后静脉注射另一剂百日咳毒素(200ng/200μl/小鼠)以加强免疫。
做这样的处理每12小时腹膜内注射溶于0.5ml PBS pH7.4中的5ug/小鼠(基于2.5μl/g动物)BPP1’-PE40，或仅注射0.5ml PBS。在免疫8天后开始处理，并持续处理10天。在处理期间和至少1个月之后每天对EAE严重度进行评级。分级范围可分为以下1-6级1＝中度尾部虚弱；2＝尾部麻痹，3＝尾部麻痹和后腿麻痹，4＝后腿麻痹或中度前肢虚弱，5＝四肢麻痹，6＝死亡。
结果BPP1’-PE40处理的小鼠一点也不会发生EAE(平均重度＝0)，而且无一因此病而死亡。相反，在PBS对照组中，9只小鼠中有6只出现EAE，疾病高峰在第14天。这6只感病小鼠表现出不同的重度，和发病期间，在第14天时的平均重度为3。另外，对照组的6只小鼠中有1只因该病而死亡。
再对处理组做4周的随访，未出现延迟的发病迹象或该病延迟复发。
L.人嵌合蛋白根据人MBP致病序列构建几种其它的嵌合蛋白。该嵌合蛋白上的靶序列是以人MBP的肽84-102和143-168为基础(表IVb)。在一台DNA合成仪上合成所述短肽序列，并用常规方法纯化。用于构建物的Oligo示于表IVa中。
表IVa用于构建人BPP-PE嵌合蛋白的Oligo序列Oligo 1(143-906)5′TATGTTTAAAGGGGTAGATGCTCAAGGGACCCTTTCTAAAAT-TTTTAAATTGGGAGGTAGAGATCA 3′Oligo 2(143-906)5′TATGATCTCTACCTCCCAATTTAAAAATTTTAGAAAGGGTCCCTT-GAGCATCTACCCCTTTAAACA 3′Oligo 3(84-906)5′TATGGATGAAAATCCAGTAGTTCATTTTTTTAAAAATATTGTAA-CCCCACGTACCCCACCCCA 3′Oligo 4(84-906)5′TATGGGGTGGGGTACGTGGGGTTACAATATTTTTAAAAAAATG-AACTACTGGATTTTCATCCA 3′Oligo 5(84-823)5′TATGGATGAAAATCCAGTAGTTCATTTTTTTAAAAATATTGTAAC-CCCACGTACCCCACCCGA 3′Oligo 6(84-823)5′AGCTTCGGGTGGGGTACGTGGGGTTACAATATTTTTAAAAAAAT-GAACTACTGGATTTTCATCCA 3′Oligo 7(143-823)5′TATGTTTAAAGGGGTAGATGCTCAAGGGACCCTTTCTAAAAT-TTTTAAATTGGGAGGTAGAGATGA 3′Oligo 8(143-823)5′AGCTTCATCTCTACCTCCCAATTTAAAAATTTTAGAAAGGGTGC-CTTGAGCATCTACCCCTTTAAACA 3′
表IVb所述人BPP’s的氨基酸序列84-1025′Asn Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val ThrPro Arg Thr Pro Pro 3′143-1685′Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile PheLys Leu Gly Gly Arg Asp 3′用基因融合技术构建新的嵌合蛋白。在图14a-d中示意性地示出了编码所述新的嵌合蛋白的质粒。将靶序列克隆在完整长度的修饰PE(PE664Glu)的5’末端(图14a，b)或PE-cDNA的截短了的形式(PE-40)上(图14c，d)。将以上两种形式的PE-cDNA用于构建IL2-毒素嵌合蛋白，并发现其对人和鼠类新激活的T细胞有不同的活性。将Oligo’s 1-2用于构建BPP143-168-PE40；将Oligo’s 3-4用于构建BPP84-102-PE40；将Oligo’s 5-6用于构建BPP84-102-PE664Glu；和将Oligo’s 7-8用于构建BPP143-168-PE664Glu。
在大肠杆菌表达系统中表达新的嵌合细胞毒素，与前文所述MBP-PE的生产相似。在表达之后通过SDS-PAGE分析细胞提取物(图15a-c)，用抗PE抗体进行Western印迹分析，并测定表达蛋白的ADP-核糖基化活性。所有新的嵌合蛋白均能高度表达，并主要集中在表达细胞的不溶性级分。
用上述人嵌合蛋白对诸如获自MS患者的外周血的靶细胞进行试验。对两个MS患者的细胞(已作过试验，MSM16，18)试验BPP84 -102-PE664Glu，并发现其有细胞毒性(表V)。对基于人序列的新的嵌合蛋白有反应的一个患者(MSM16)以前对由BPP1-PE40(基于豚鼠的序列)介导的细胞毒性无反应。获自另一个SM患者的细胞对BPP84-102-PE664Glu无反应。表VBPP84-102-PE664Glu对获自MS患者的PBL的影响患者蛋白合成抑制，％(在500ng下)MSM-16 52MSM-18 56MSM-22 ＜5参考文献1)Aharoni，R.，Teitelbaum，D.，Arnon，R.& Puri，J.(1991)通过抗原-la复合体的抗体对实验变应性脑脊髓炎进行免疫调节。Nature351147-150。
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本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于以上说明，本发明的范围仅由以下权利要求限定。
权利要求
1.一种含有与髓磷脂碱性蛋白(MBP)部分连接的铜绿假单胞菌外毒素(PE)部分的嵌合蛋白，所述MBP部分选自(a)MBP；(b)豚鼠髓磷脂碱性蛋白或其抗原性部分的氨基酸69-88；(c)人髓磷脂碱性蛋白或其抗原性部分的氨基酸84-102；(d)人髓磷脂碱性蛋白或其抗原性部分的氨基酸143-168；和(e)在(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、添加、取代或突变了的氨基酸序列，该修饰过的序列仍保持与所述氨基酸序列至少有75％的同源性。
2.如权利要求1的蛋白，其中，所述PE部分包括在氨基酸位置57、246、247和249中的一个或几个上发生突变的PE。
3.如权利要求1的蛋白，其中，所述PE部分包括所述外毒素的功能域II和III。
4.如权利要求1的蛋白，其中，所述MBP部分与所述PE部分是直接连接的。
5.如权利要求1的蛋白，其中，所述MBP部分和所述PE部分通过一个重复1-3次的五肽连接。
6.如权利要求5的蛋白，其中，所述五肽包括氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser。
7.一种编码权利要求1-6中任一项所述蛋白的DNA序列。
8.一种质粒，含有一个可操纵地与权利要求7的DNA序列连接的启动子。
9.一种能表达权利要求1-6中任一项所述蛋白的表达载体，它包括权利要求8的质粒。
10.一种药用组合物，含有权利要求1-6中任一项所定义的嵌合蛋白和一种惰性载体。
11.如权利要求10的药用组合物，还包括一种溶菌性营养剂。
12.一种治疗自身免疫病的方法，包括给患有这种病的患者施用权利要求10的药用组合物。
13.一种治疗自身免疫病的方法，包括给患有这种病的患者施用权利要求11的药用组合物。
14.如权利要求12的方法，其中，所述疾病是多发性硬化。
15.如权利要求13的方法，其中，所述疾病是多发性硬化。
全文摘要
披露了一种含有与髓磷脂碱性蛋白(MBP)部分连接的铜绿假单胞菌外毒素(PE)部分的嵌合蛋白。所述MBP部分选自:(a)MBP;(b)豚鼠髓磷脂碱性蛋白或其抗原性部分的氨基酸69—88;(c)人髓磷脂碱性蛋白或其抗原性部分的氨基酸84—102;(d)人髓磷脂碱性蛋白或其抗原性部分的氨基酸143—168;和(e)在(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、添加、取代或突变了的氨基酸序列,修饰过的序列(e)仍保持分别与氨基酸序列(a)、(b)、(c)或(d)至少有75%的同源性。该嵌合蛋白可用于治疗自身免疫病,尤其是多发性硬化。
文档编号A61K38/00GK1207132SQ96199470
公开日1999年2月3日 申请日期1996年11月17日 优先权日1995年11月17日
发明者H·洛伯博姆高斯基, I·斯坦伯格, E·伯劳德, I·玛利亚诺夫斯基, S·雅可尼 申请人:耶路撒冷希伯来语大学依苏姆研究开发公司