专利名称：使用光学纯(－)－福莫司汀抗肿瘤的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及包含(-)—福莫司汀(fotemustine)的药物组合物。另一方面本发明涉及恶性肿瘤的治疗，包括淋巴瘤、黑素瘤、神经胶质瘤和其它脑瘤、肺癌、肝转移瘤以及血液和胃肠道的肿瘤。
本发明的背景在化学文摘中福莫司汀的标准命名是[1-[[[(2-氯乙基)-亚硝基氨基]羰基]氨基]乙基膦酸二乙酯。福莫司汀也已知为1-[N-(2-氯乙基)-N-亚硝基脲基]乙基膦酸二乙酯和二乙基-1-[3-(2-氯乙基)-3-亚硝基脲基]乙基膦酸酯。早期的参考文献把福莫司汀指做S10036。美国专利4,567,169中描述了消旋福莫司汀的制备。该专利提到“本发明也涉及化合物的光学异构体…”，但没有透露这样的异构体。
消旋的福莫司汀被用于临床治疗恶性黑素瘤、原发的和转移的脑瘤、结肠和直肠癌、软组织和骨肉瘤以及血液的恶性肿瘤。[参见Khayat等人，J.Nat’1.CancerInst.80，1407-1408(1988)；Khayat等人，CancerRes.47，6782-6785(1987)；Jacquillat等人，Proc.Am.Assoc.CancerRes.30，A1088(1989)；Rougier等人，Eur.J.Cancer29A(2)，288-9(1993)；Kerbrat等人，Eur.J.Cancer29A(1)，143-144(1993)]。这些临床研究表明消旋的福莫司汀临床上用于治疗这些肿瘤是有效的，但它的使用伴随着迟发累积性骨髓毒性。剂量范围内的毒性常常是导致中性白细胞减少症、白细胞缺乏症和血小板减少症的骨髓抑制作用。观察到的肾、肺和肝毒性的次数较少。消旋的福莫司汀据信也是致突变的[见Ashby等人，Mutation Res.286，101-109(1993)]。在一些情况下恶心也是一个问题。
特别希望发现一种具有消旋福莫司汀的优点而没有上述列举的副作用的化合物。
本发明概述目前已发现光学纯的(-)—福莫司汀异构体是治疗恶性肿瘤的一种有效药物。光学纯的(-)—福莫司汀异构体提供了有效的治疗而且基本上降低了与服用消旋福莫司汀有关的一种或多种副作用，包括但不仅限于中性白细胞减少症、白细胞缺乏症和血小板减少症；肾、肺和肝毒性；致突变性；和恶心。
一方面本发明涉及一种治疗恶性肿瘤的方法，该方法包括向患有恶性肿瘤的哺乳动物给药有效治疗量的基本上不含其(+)—立体异构体的(-)—福莫司汀。
另一方面本发明涉及一种药物组合物，该组合物包括基本上不含其(+)—立体异构体的(-)—福莫司汀，以及药物学上可接受的载体。
本发明详细说明在本发明的方法和组合物中使用的活性化合物是左旋的或光学纯的(-)—福莫司汀异构体。目前不知(-)—异构体的绝对立体化学。式1显示了一种未知绝对立体化学的单一对映异构体，在此任意当作S*
对映异构纯的福莫司汀的图形表示取自MaehrJ.Chem.Ed.62，114-120(1985)。因此该包括楔形图和点或虚线的图式用于绝对构型不确定的对映异构纯的化合物。
本发明包括一种治疗恶性肿瘤的方法，它包括给药有效治疗量的基本上不含其(+)—立体异构体的(-)—福莫司汀。
在此使用的“基本上不含其(+)—立体异构体”这个词意味着组合物至少含有90重量％的(-)—福莫司汀和10重量％或更少的(+)—福莫司汀。在进一步优选的实施方案中“基本上不含其(+)—立体异构体”这个词意味着组合物至少含有99重量％的(-)—福莫司汀和1重量％或更少的(+)—福莫司汀。在最优选的实施方案中，在此使用的“基本上不含其(+)—立体异构体”这个词意味着组合物含有超过99重量％的(-)—福莫司汀。这些百分比是基于组合物中福莫司汀的全部量。上述的量也包括“基本上光学纯的(-)—福莫司汀异构体”或“基本上光学纯的(-)-福莫司汀”和“光学纯的(-)—福莫司汀异构体”和“光学纯的(-)—福莫司汀”等词。
在此使用的“治疗恶性肿瘤”这个词意味着治疗、改善或减轻这样的情况，抑制癌组织的生长并因此延长存活期。
“有效治疗量”这个词是指足以治疗恶性肿瘤的(-)—福莫司汀的量。(-)—福莫司汀对其有活性的恶性肿瘤包括淋巴瘤、黑素瘤、神经胶质瘤和其它脑瘤、肺癌、肝转移瘤和以及血液和胃肠道的恶性肿瘤。
本发明的方法降低与服用消旋的福莫司汀有关的，伴随产生的副作用倾向。“副作用”这个词包括但不仅限于中性白细胞减少症，白细胞缺乏症和血小板减少症；肾、肺和肝毒性；致突变性；和恶心。
在本发明的方法中，有效治疗量可以是以单一剂量给药，或小部分的有效治疗量单独以几个剂量给药。同样地，本发明中的药物组合物可以含有有效治疗量的(-)—福莫司汀或为了达到有效治疗有必要以几个单独的组合物给药。
组成一个有效治疗量的(-)—福莫司汀的量随着被治疗情况的严重程度和性质以及给药方式而变化。剂量大小和次数也可根据年龄、体重和病人的个体反应变化。一般地，对于在此所述的情况，通过静脉或动脉输入给药的(-)—福莫司汀的单一给药剂量范围从大约20mg/kg到150mg/kg。优选的单一剂量范围应从大约20mg/m2到80mg/m2。一般地，在几周的期间里(如，大约2到8周里)定期给药(如，每周)。
治疗病人应以较低剂量开始，可以从大约20mg/m2到40mg/m2，并且根据病人的全身反应增加到40mg/m2或更高。进一步优选的是，那些超过65岁的和有肾功能和肝功能损伤的病人开始接受较低剂量，并且根据个体反应和血液水平进行滴注。在一些情况下有必要使用超出这些范围的剂量，这对本领域的技术人员是显而易见的。而且临床医生和治疗的内科医师会知道根据个别病人的反应如何以及何时中断、调整和结束治疗。上述剂量大小和给药频率包括“足以抑制肿瘤但不足以引起上述副作用的量”这个词。
任何适合的给药方式可以用于给病人提供有效剂量范围的(-)—福莫司汀，但优选胃肠外的(尤其是静脉或动脉输入)给药方式。剂型包括分散液、混悬剂、溶液剂等。
本发明的药物组合物包括作为活性组分的(-)—福莫司汀，并且也可以含有药物学上可接受的载体和可选择的其它辅剂、赋形剂或治疗成分。适于胃肠外给药的组合物可为水溶液形式，还可选择地含有常用的辅剂和赋形剂。这些组合物可以通过那些药学领域的技术人员所熟知的方法来制备。所有的方法都包括使活性组分与组成一种或多种必要的成分的载体相缔合的步骤。
可以通过上述提到的美国专利4,567,169中描述的方法完成福莫司汀消旋混合物的化学合成。然后福莫司汀的(-)—异构体可以通过手性媒质上的层析法拆分。另外，(-)—福莫司汀可以通过使用手性酸非对映异构体酯的分步结晶或层析法拆分福莫司汀的胺前体的对映异构体来得到。本领域技术人员所熟知的其它的标准拆分方法也可被使用。(见例如，E.L.Eliel，Stereochemistry of Carbon Compounds，McGraw Hill(1962)和[Wilen and Lochmuller，“Tables of Resolving Agents”，Journal ofChromatography113，283-302(1975)])作为抗肿瘤药的光学纯福莫司汀和消旋的福莫司汀的相对活性、效力和专一性能通过体内和体外药理学研究进行测定。
根据国立癌症研究所(美国)建立的并且R.I.Geran等人在CancerChemotherapy Reports，part III，Vol.3(2)，1-87(1972)中发表的方案，测试了这些化合物延长通过腹膜内或肌肉注射方式接种肿瘤细胞的小鼠的存活期的能力。
在一次或几次给药本发明化合物的动物中，通过外周血细胞和骨髓以及骨髓中干细胞的数量[Till和McCulloch，Radiation Res.14，213(1961)]评价造血系统的毒性。开始治疗3天后注意到了最低细胞浓度。作为参照用一个剂量的N，N′-二(2-氯乙基)-N-亚硝基脲(“BCNU”)[Tang和Eisenbrand，Arch.Pharm.314，910(1981)]治疗后，测定降低的程度，并与用消旋的福莫司汀和(+)—福莫司汀后的细胞数进行了对比。
按照Wroblewski的方法，通过测定用腹膜内注射消旋的、(+)和(-)—福莫司汀治疗的伊凡斯鼠(Long Evans Rats)的血浆中的丙酮酸和谷氨酸转氨酶的活性评价肝毒性。
通过Tapiero等人，[Anticancer Research9，1617-1622(1989)]的方法如下评价了致突变性得到人肺癌A427、A529细胞和人结肠癌BE、HT29细胞，并如Kohn等人，[Cancer Chemother.Pharmacol 19，291-295(1987)以及Cancer Res.48，3622-3625(1988)]所述的培养。从NCI得到了鼠白血病细胞系P388。细胞在补充了10％胎牛血清、10-5M的2-巯基乙醇和标准抗生素的RPMI 1640培养基中生长和培养。所有培养物在38℃和5％CO2的湿气中生长。对药物持续存在时的指数培养，完成细胞生长抑制的研究。所得到的细胞数在一台Coulter Counter model ZBI，Coulter Electronics，Hialeah，F1.上测定。
使用前将消旋的福莫司汀、(+)—福莫司汀和(-)—福莫司汀分别马上溶解。常用的标准贮存溶液是35mM。对放射性同位素标记和X-照射，2.5×105的P388细胞/毫升生长于或含有0.05微居里/毫升的(14C)—胸腺嘧啶核苷或含有0.5微居里/毫升的(3H)—胸腺嘧啶核苷的培养基里。标记20小时后，除去培养基并用冷的PBS冲洗细胞。用10μM非标记的胸腺嘧啶核苷4小时完成标准的跟踪治疗。氚化的细胞在冰上暴露于300拉德X-照射作为内标。碱性洗脱步骤如Kohn等人，[“Measurements ofstrand breaks and cross links by alkaline elution.”InFriebergE.和Hanawalt P.(eds)，DNA repairA laboratory manual of researchprocedures，New York，Dekker，11981，379-401页]所述。为了测定药物在完全生长培养基的预孵育和失去细胞毒性之间的关系，将药物重新悬浮于含10％胎牛血清的培养基中于37℃下孵育1到500分钟。P388细胞被悬浮于稀释到接近药物浓度的媒质中。在5％的CO2孵育3天后细胞记数。
对比了消旋的、(+)和(-)—福莫司汀引起的P388细胞单链断裂。被(14C)—胸腺嘧啶核苷标记20小时后的细胞(5×105)用不同浓度的福莫司汀处理2小时，并且和数量接近的(3H)—胸腺嘧啶核苷标记的参比细胞混合。这些细胞被收集到孔径为2.0μm的聚碳酸酯过滤器上，并在蛋白酶K存在的情况下用5毫升的2％SDS/0.025M Na4EDTA(pH 9.7)溶解细胞。如Kohn所述在pH 12.1的黑暗情况下进行洗脱。以一级洗脱动力学为基础计算DNA单链断裂的频率。
检查了用消旋的、(+)和(-)—福莫司汀多次处理引起的P388细胞的DNA—蛋白交联。用(14C)—胸腺嘧啶核苷标记并经药物处理的细胞被600拉德的X—射线照射，并且(3H)—胸腺嘧啶核苷标记的参比细胞被300拉德的X—射线照射。这些细胞被收集到孔径为2.0μm的聚碳酸酯过滤器上，并在蛋白酶K存在的情况下于pH 9.7溶解细胞。洗脱如上所述进行。
在多次暴露于消旋的福莫司汀和它的对映异构体后除去P388细胞的DNA单链断裂，也能检查引起的等价DNA损伤。(14C)—胸腺嘧啶核苷标记的细胞最初暴露于药物处理2小时，冲洗并重新悬浮于不含药物的培养基中。在37℃孵育不同时间后，这些细胞与等数量的(3H)—胸腺嘧啶核苷标记的参比细胞混合，并收集到聚碳酸酯过滤器上，然后进行碱性洗脱液分析。
上述实验提供了一个相对活性、效力和选择性的评价。
雪貂的呕吐。实验在成年雄雪貂上完成。首先使这些动物适应穿一件与不锈钢绳相连的尼龙上衣，绳则系在笼顶的铜环上。适应系绳的挽具后，每只动物在它的颈静脉处接受外科植入导管。所述导管每天用肝素化的氯化钠冲洗。外科步骤后进行药物研究一周。系绳后的动物分别饲养。
8到11只动物用于评价每个实验化合物的各个剂量。每只动物每周秤重，并以最大超过48小时的间隔，随机地静脉注射或口服给药单一剂量的消旋的、(+)和(-)—福莫司汀。每个试验化合物至少评价了3个剂量水平。
试验物质给药后观察动物个体30分钟。记录所有排出以及干呕和排粪的频率及潜伏期。由χ2分析检查从剂量—反应曲线得到的数据的统计学显著性。测定每个化合物的ED50值。试验提供对恶心和呕吐之相对倾向的评价。
权利要求
1.一种治疗恶性肿瘤的方法，该方法包括向患有所述肿瘤的哺乳动物给药有效治疗量的基本上不含其(+)—立体异构体的(-)—福莫司汀。
2.如权利要求1的方法，其中，所述的恶性肿瘤是从包括淋巴瘤、黑素瘤、神经胶质瘤和其它脑瘤、肺癌、肝转移瘤以及血液和胃肠道的恶性肿瘤群中选择的。
3.如权利要求1的方法，其中，(-)—福莫司汀通过静脉和动脉输入给药。
4.如权利要求3的方法，其中，(-)—福莫司汀的给药量从大约20mg/m2到大约150mg/m2。
5.如权利要求1的方法，其中，(-)—福莫司汀的量超过或接近全部福莫司汀重量的90重量％。
6.一种药物组合物，该组合物包括基本上不含其(+)—立体异构体的(-)—福莫司汀，以及药物学上可接受的载体。
7.如权利要求6的组合物，其采用非胃肠给药。
全文摘要
本发明公开了使用光学纯(－)－福莫司汀治疗多种恶性肿瘤并基本上降低与福莫司汀消旋体混合物有关之副作用的伴生可能性的方法和组合物。
文档编号A61K31/66GK1207041SQ96199499
公开日1999年2月3日 申请日期1996年11月19日 优先权日1996年11月19日
发明者南希·M·格雷 申请人:塞普拉科公司