专利名称：青藤碱在制备治疗眼科免疫性疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及青藤碱的新制药用途，具体说是青藤碱在制备治疗眼科免疫性疾病药物中的应用。特别是青藤碱在制备防治自身免疫性视网膜色素膜炎的药剂中的应用，青藤碱在制备防治自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)治疗过程中具有抑制脂类过氧化、减少炎症浸润、保护抗氧化酶活性作用的药剂当中的应用，以及青藤碱在制备治疗内源性葡萄膜炎药剂中的应用。
青藤碱(sinomenine)是从防已科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.)R.et Wils的茎和根中提取的生物碱之一，是一种已知的药用物质。现代药理学研究表明，青藤碱具有多种药理作用。概括起来讲，目前已经知道的青藤碱的主要药理作用如下镇痛、抗炎、降压、抑制中枢、抗心律失常等作用[张士善等，清风藤碱甲的药理作用I.镇痛、消炎作用及急性毒性实验，药学学报1960，8177；凌秀珍，等，药学学报1962，9(7)393；赵德化，等，药学学报，1985，20(11)856；张明发，陕西新医药，1981，10(10)57]；对机体非特异性免疫、细胞的功能有较强的抑制作用，尤其是对T淋巴细胞的功能有较强的抑制作用[彭慧敏，等，青藤碱的免疫抑制作用，中国药理学报1988，9(4)377-380]；青藤碱又是一种组织胺释放剂(冯经义，等，青藤碱的药理作用VII。对胃肠活动的影响及其机制，药学学报1965；12492)；临床上用于治疗类风湿关节炎疗效显著(张欣等，陕西中医，1980，513；湖南省淑浦县中医院科研组，赤脚医生杂志，1975，12612)；有人还对青藤碱治疗类风湿性关节炎的作用机制进行了研究[李嗣英，等，青藤碱对小鼠免疫功能的影响，中草药，1992，23(2)81-83]。到目前为止，还没有有关青藤碱治疗自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)的报道。
色素膜炎是常见多发性眼病，也是世界范围内的主要致盲眼病之一。在我国，色素膜炎占致盲眼病的第2-6位。因此，寻找有效、毒副作用小的治疗药物的色素膜炎研究的重点之一。近年来，对眼的免疫介导的炎症，治疗的注意力集中在免疫调节剂上，其出发点在于找到有效的、特异性的抑制涉及免疫病理的主要环节，而对整体的免疫功能无甚影响之药物。对于自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)而言，理想的治疗药物最好是在自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)的免疫应答期就起作用，因为此时恰恰平行于临床病人的潜伏期。由于中药成分毒副作用小，疗效持久，较适于具有复发特征的色素膜炎的治疗。
鉴于这种情况，本发明人经过大量的实验研究和临床观察，发现青藤碱在治疗自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)方面具有很好的疗效，并将其制成药剂。
本发明的目的是提供青藤碱在制备治疗眼科免疫性疾病的药剂中的应用，具体说是青藤碱在制备防治自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)的药剂中的应用，特别是青藤碱在制备自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)治疗过程中具有抑制脂类过氧化、减少炎症浸润、保护抗氧化酶活性作用的药剂当中的应用。
本发明目的还在于提供青藤碱在制备治疗内源性葡萄膜炎药剂中的应用。
经过我们的实验研究表明，青藤碱，特别是盐酸青藤碱，具有良好的治疗自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)的作用。特别是青藤碱在治疗自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)过程中具有抑制脂类过氧化、减少炎症浸润、保护抗氧化酶活性等方面的作用。
经过我们的临床研究表明，青藤碱及其药学上可接受的盐在治疗内源性葡萄膜炎方面具有良好的医疗效果。
青藤碱作为一种治疗药物，已经有产品出售，例如，湖南黔阳地区制药厂生产的青藤碱(sinomenine，SIN)，武汉市中联制药厂生产的盐酸青藤碱粉剂，等。
因此，青藤碱作为治疗眼科免疫性疾病的药物，按照常规的制剂方法，可以制备成适合于临床上使用的任何药物剂型，例如，片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、口服液、乳剂、混悬剂、注射剂、栓剂、膏剂，等。
除了本发明所说的青藤碱之外，青藤碱的药物学上可接受的盐，例如，盐酸青藤碱，同样具有治疗眼科免疫性疾病的作用，因此，青藤碱及其药物上可接受的盐用于制备治疗眼科免疫性疾病的药物，均属于本发明的保护范围。
青藤碱及其药物学上可接受的盐在用于制备治疗眼科免疫性疾病的药物时，可以添加药物学上常用的赋性剂，如，粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、增溶剂、防腐剂、调味剂、溶剂、乳化剂，等。
青藤碱及其药物学上可接受的盐在用于制备治疗眼科免疫性疾病的药物时，也可以和其他相容的治疗药物一起制成药剂。
实施例1盐酸青藤碱粉剂25000mg，购自武汉市中联制药厂，药用淀粉250mg，酒精适量造粒，干燥，进压片机压片，制成1000片，每片片重为275mg，含盐酸青藤碱25mg。
实施例2盐酸青藤碱粉剂20000mg，淀粉180mg，二者充分混合，装胶囊，制成2000粒胶囊，每粒0.1g重，含盐酸青藤碱10mg。
本发明公开了青藤碱及其药物学上可接受的盐在制备治疗自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)的药物中的应用。根据常规的制剂技术，可以将青藤碱、盐酸青藤碱等制成各种药剂，用于治疗治疗自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)。
图1是用于说明青藤碱以50mg/kg剂量治疗Wistar大鼠EAU21天的疗效对照图。其中图1a是对照组，图1b是治疗组。
图2是用于说明青藤碱以100mg/kg剂量治疗Wistar大鼠EAU21天的疗效对照图，其中图2a是对照组，图2b是治疗组。
图3是用于说明青藤碱以150mg/kg剂量治疗Wistar大鼠EAU21天的疗效对照图，其中图3a是对照组，图3b是治疗组。
实验例1_青藤碱对实验性自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)防治作用的药效学研究。
材料与方法(一)试剂与动物完全福氏佐剂(Complete Freund′s Adjuvant)购于GIBCO公司，百日咳杆菌疫苗(pertussis)90亿个/ml购自北京生物制品研究所，胎牛血清(Fetus Bovin Serum)购于GIBCO公司，RPMI-1640细胞培养基购自Sigma公司，其它试剂为国产分析纯试剂。盐酸青藤碱为本院天然与仿生药物国家重点实验室提供。实验动物系本院实验动物部提供的Wistar大鼠，雄性，体重约150g，健康无眼病。
(二)实验性自身免疫性视网膜色素膜炎大鼠模型的诱发。兔视网膜S抗原100μg(1mg/ml)，与等体积完全福氏佐剂混合乳化，动物双后底皮下注射，同时尾静脉注射百日咳杆菌疫苗0.2ml。
(三)动物模型的分组与治疗经S抗原免疫的动物模型，随机分为三组，分别用50mg/kg，100mg/kg及150mg/kg的盐酸青藤碱腹腔注射治疗(盐酸青藤碱溶液用0.9％灭菌氯化钠溶液新鲜配制，Φ0.25μ微孔滤漠除菌，即刻应用)。对照组用0.9％灭菌氯化钠腹腔注射。正常对照组不做任何治疗，饲养条件与模型动物一致。治疗自抗原免疫后第二天开始，每日注射一次，至第二十一天末。
S抗原免疫后的动物每日用裂隙灯观察。临床分度参考Wacker WB等的标准进行了修改。
0度(-)正常。
I(+)角膜缘血管明显的充血，虹膜明显充血，瞳孔缩小，光反应迟缓，瞳孔区晶体前囊膜表面有细小点状渗出物。
II(++)前房或玻璃体内有明显渗出。
III(+++)前房积脓或浆液性视网膜脱离出现。
(四)酶联免疫吸咐法(ELISA)测定抗体的水平在S抗原免疫后第十四天及二十一天分别经尾静脉采血，分离血清测定S抗原抗体水平。方法采用酶联免疫吸咐法(ELISA)，简之为将2μg/ml的S抗原抗体溶液300μl加入96孔平底培养板内，4℃过夜。将抗原液吸出后，用0.02MoL/L，pH7.4磷酸缓冲液(含0.05％TWeen-20)冲洗三次。每孔加入稀释血清样品300μl(稀释液为上述缓冲液内含0.5％牛血清清蛋白)。37℃保温1小时后，吸出样品，用磷酸缓冲液冲洗三次。加入300μl(HRP-LgG)辣根过氧化物酶lgG(200倍稀释)，于37℃保温1小时。吸出样品，用磷酸缓冲液冲洗三次。加入0.04％邻苯二胺(OPD)溶液0.3ml，室温30分钟，8M硫酸0.05ml终止反应，495nm测定OD值。正常Wistar大鼠血清作为正常对照。
(五)淋巴细胞体外转化测定于S抗原免疫后第14及21天，取大鼠眼眶血，分离淋巴细胞体外培养，用S抗原作为刺激物，培养及测定方法同前。观察指标刺激指数(SI)。计算方法
结果1、青藤碱对S抗原所诱发的EAU的防治作用。
三种剂量的青藤碱均不同程度地降低了实验性自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)的发生比率。从表1-1及图1可以看出，用青藤碱50mg/kg体重治疗后，EAU的发生比率由对照组的90.91％下降至80.56％，下降了10.35％，其中三度病变者下降了约4.3％，二度病变下降了约4.1％，一度病变下降了约1.9％。但统计学上，对照组与治疗组比较，差异尚无显著意义。当青藤碱治疗剂量增加至100mg/kg体重时，EAU的发生比率明显下降，结果见表1-2及图2。治疗后EAU的发生比率由对照组的93.48％下降至68.18％。其中三度病变由对照组的47.8％下降至20.5％，二度病变由21.7％下降至9.1％。以对照组与治疗组比较，统计学上有显著性差异，P＜0.05。从表1-3及图3可以看出当青藤碱的治疗剂量增至150mg/kg体重时，EAU的发生比率同样明显下降。对照组的发生比率是90.48％，治疗组为63.64％，减少了26.84％。其中三度病变由对照组的19.0％下降至治疗组的15.9％，二度病变由对照组的42.9％下降至治疗组的4.5％。对照组与治疗组比较，统计学上有显著差异，P＜0.05。实验结果表明青藤碱治疗可以明显降低S抗原诱的EAU发生比率。
2.青藤碱治疗对EAU大鼠抗S抗原之抗体水平的影响。
用酶联免疫吸附法，对EAU大鼠抗S抗原水平进行测定的结果见表1-4。S抗原免疫后，抗S抗原之抗体水平升高，在第14天时，OD值由正常对照的0.246增加至0.385，升高了约56.5％，到免疫后第21天时OD值增加至0.758，升高了大约3倍，与正常对照组比较，统计学上均有显著性差异，P＜0.05和P＜0.01.经青藤碱治疗后，EAU大鼠抗原之抗体水平虽然仍高于正常对照组，但比未治疗组有不同程度地下降。其中第14天时OD值由对照组的0.385降至治疗组0.291，两者比较的结果，统计学上无显著性差异，P＞0.05；第21天时，由对照组的0.758降至治疗组0.614，两者比较的结果，统计学上有显著性差异，P＜0.05。以上结果表明，青藤碱治疗第三周后对抗S抗原之抗体的产生有明显的抑制作用。
3.青藤碱对EAU大鼠淋巴细胞体外转化的影响见表1-5。在抗原免疫后第14天，对照组的刺激指数为3.94，治疗组刺激指数为2.29，下降约41.9％。第21天后，对照组的刺激指数为4.69和3.21。治疗组刺激指数下降约31.6％。两者比较的结果，统计学上均有显著性差异，P＜0.05。以上结果表明青藤碱治疗二周后，EAU大鼠淋巴细胞体外对S抗原刺激所发生的增殖反应有明显抑制作用。
表1-1用青藤碱(50mg/kg，治疗21天)治疗Wistar大鼠EAU的疗效观察例数发生比率组别 总数pn p n对照组 30 3 3390.91 9.09治疗组 29 7 3680.56 19.44总计 59 106985.51 14.49p阳性(+～+++)n阴性(-)表1-2青碱(100mg/kg，疗程21天)治疗Wistar大鼠EAU的疗效观察例数 发生比率组别 总数pn p n对照组 43 3 46 93.48 6.52治疗组 30 1444 68.11 31.82总计73 1790 81.11 18.88p阳性(+～+++)n阴性(-)表1-3青藤碱(150mg/kg，疗程21天)治疗Wistar大鼠EAU的疗效观察例数发生比率组别 总数pn p n对照组 384 42 90.48 9.52治疗组 281644 63.64 36.36总计 662086 76.74 23.26p阳性(+～+++)n阴性(-)表1-4以ELISA测定的青藤碱治疗EAU Wistar大鼠血清中抗-S抗原的抗体(100mg/kg)OD 492nm (X±SD)组别14天(n) 21天(n)对照组 0.385±0.017(4) 0.758±0.013(4)治疗组 0.291±0.010(4) 0.614±0.056* (4)正常 0.246±0.027(4)* 对照组与治疗组 p＜0.05
表1-5青藤碱治疗的EAU Wistar大鼠中对S-抗原刺激的淋巴细胞增殖反应(100mg/kg)S-抗原(20μg/ml)14天 21天组别 cpm(X±SD)SI(X±SD) cpm(X±SD)SI(X±SD)对照组17232±3310 3.94±1.37 19331±4121 4.69±1.93治疗组11817±3767 2.29±1.01* 11936±3673 3.21±1.21*SI刺激指数每组中的样本数是4*对照组与治疗组P＜0.05讨论本实验的观察结果表明，青藤碱能够有效地抑制S抗原所诱发的大鼠EAU的发生。抗原免疫后，随之给动物腹腔注射青藤碱，其EAU的发生比率及临床病变的严重程度均明显下降(100mg/kg及150mg/kg剂量)，而且在治疗过程中，未发现动物有体重下降等不良反应。以往报道，用青风藤干燥提取物治疗变形性退行性骨疾患，每次300mg口服，每日三次，即使持续用药百天，也未见患者有副作用，尿、血液及血液生化检查均无异常。目前研究较多的治疗EAU的药物如环孢素A及FK506，大剂量时虽能够完全抑制动物EAU的发生，但是其造成的肾脏毒性、体重减轻以及血非蛋白氮升高的毒副作用，是过渡至临床应用所须解决的棘手问题。相比之下，青藤碱为一安全有效的药物，其这一特点可能更适用临床上具有慢性复发过程的患者应用。
仅就本实验的观察尚不能确定青藤碱抑制S抗原诱发的大鼠EAU，是作用于其免疫反应的传入支(afferent arm)，(即感应及反应阶段)，还是作用于其免疫反应的传出支(afferent arm)(即效应阶段)。然而实验结果提示，青藤碱在抑制EAU发生的同时，也抑制了EAU大鼠对S抗原的体液免疫及细胞免疫反应，其中对细胞免疫的明显抑制似乎在时间上先于体液免疫的抑制。目前在寻找治疗EAU的免疫调节剂的研究中，要求理想的药物除了毒副作用小以外，还希望能够特异性抑制细胞免疫功能，对整体免疫无甚影响，而且抑制作用在免疫应答期便产生。从这个观点来看，青藤碱的免疫抑制作用的特异性尚不够满意。从免疫调节的网络理论来看，免疫系统内的各个淋巴细胞克隆通过自我识别，相互刺激或相互制约，构成一个动态平衡的网络结构，其构成网络联系的物质基础就是淋巴细胞表面Ig的独特型及抗独特型结构。该理论说明免疫系统中细胞免疫、体液免疫及巨噬细胞的作用是相互关联的。近年来的研究表明，抗独特型抗体与EAU的免疫负向调节有关。由于抗体能够识别独特型决定簇，因此可与S抗原竞争结合部位，在一定程度上对EAU动物起保护作用。另外独特型免疫能够激活调节通路，产生抗独特型的抑制性T细胞，从而抑制EAU的病变过程。由此我们认为如何调节已失衡的免疫系统，使之恢复动态平衡，仍是一个需要探讨的问题。
讨论我们以视网膜S抗原诱发大鼠实验性自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)模型，采用腹腔注射给药的途径，研究了中药青藤碱对EAU的防治作用。实验结果表明青藤碱可以明显抑制S抗原诱发的大鼠EAU的发生。对动物生长无不良影响。在抑制EAU发生的同时，青藤碱对大鼠的细胞免疫及体液免疫均有明显抑制。根据实验结果我们认为青藤碱可有效的抑制EAU的产生。
实验例2青藤碱对实验性自身免疫性视网膜色素膜炎的视网膜脂类过氧化产物及抗氧化酶类的影响。
材料与方法1.试剂与动物四乙氧基丙烷(1，1，3，3-tetraethoxy propane TEP)购自Fluka公司，邻联二茴香胺(O-dianisidine)购自华美公司；还原型谷胱甘肽(GSH glutathione)、还原型辅酶II(NADPH)，谷胱甘肽还原酶(glutathione reduetase)及叠氮钠(NaN3)均购自Sigma公司。余试剂均为国产分析纯。盐酸青藤碱为北医大仿生与天然药物国家重点实验室纯化提供。
实验动物系本院动物部的Wistar纯系大鼠，雄性，体重约150g，健康无眼病。动物EAU模型的诱发及给药途径同前。大鼠在不同观察时间点，断颈处死后，立即取出眼球，冰浴下剥脱其整个视网膜组织，制备组织匀浆或者置-80℃冰箱内保存待用。
(一)视网膜组织共轭二烯的测定参考Buege等方法稍加改良。在显微镜下仔细分离视网膜组织，用冰冷的0.05mol/L磷酸缓冲液pH7.2(含0.5mmol/L的EDTA)，用玻璃匀浆器制备成10％(W/V)的匀浆，备用。将3ml氯仿甲醇(1∶2V/V)混合液内加入0.2ml匀浆液，振荡2分钟，再加入氯仿甲醇混合液1亳升，振荡1分钟。加入1ml酸化水(双蒸水用0.1N盐酸调至pH2.5)，再振荡1分钟，离心2000转/分，10分钟；将下层液1ml取出，通入氮气吹干，加入1ml乙醇，摇匀后，在233nm处测OD值，磷酸缓冲液做空白对照。
(二)丙二醛含量测定取上述匀浆液0.2ml，加入8.1％SDS溶液0.2ml，20％醋酸溶液1.5ml及0.8％硫代巴比妥酸溶液1.5ml，振荡摇匀5分钟后，置于95℃水浴中，1小时后取出，放入冰浴中终止反应；冷却后离心2000转/分，5分钟，加入正丁醇吡啶5ml，振荡抽提2分钟，离心2000转/分，15分钟分层；吸取正丁醇吡啶层，在萤光光度计上测定萤光强度，激发光波长(Ex)为515nm，发射光波长(Em)为553nm。同时以四乙氧基丙烷1nmoL/L溶液做为标准。计算丙二醛含量。Bradford法则定蛋白含量(下同)。
(三)萤光色脂类(flurescent chromolipid)含量的测定取0.2ml匀浆液，加入甲醇氯仿混合液(1∶2V/V)3.5ml，振荡5分钟，再加入2ml酸化水(同前)。振荡5分钟；离心2000转/分，5分钟。分层后将甲醇水相层取出。测定萤光强度，激发光波长(Ex)为360nm，发射光波长(Em)为430nm。同时用硫酸奎宁溶液(1μg/ml溶于0.1NH2SO4中)做标准计算色脂类含量。
(四)脂类氢过氧化物(lipid hydroperoxides)的测定，参考Peter A.ward等方法。
取0.5ml匀浆液，加入3.5ml甲醇氯仿混合液(1∶2V/V)，振荡2分钟，离心2000转/分，5分钟；分层后吸取下层液2ml，通氮气吹干然后加入醋酸氯仿混合液(3∶2/V/V)1.0ml，避光条件下，加入12.8％碘化钾溶液0.05ml，振荡5分钟后，加入0.5％乙酸镉3.0ml，振荡1分钟；离心1000转/分，5分钟，取上层液，在353nm测定吸光值。
(五)髓过氧化物酶活性的测定用50mmol/L，pH6.0的磷酸钾缓冲液(含0.5％溴化十六烷基三甲铵)，在玻璃匀浆液器中，将视网膜组织制成10％(W/V)的匀浆，冰浴下超声破碎10秒钟。反复冰融3次后，再次超声破碎10秒。离心4000g，4℃，15分钟。取0.2ml上清液，加入2.8ml磷酸缓冲液(含0.167mg/ml邻联茴香胺二盐酸盐及0.005％过氧化氢，摇匀后即在460处连续监测。髓过氧化物酶活性25℃条件下，每分钟消耗1μmoL过氧化氢为1个活性单位)。
(六)超氧化物歧化酶活性的测定参考邓碧玉等的方法。取上述匀浆液，离心4000转/分，20分钟，取上清做提取液，取适量的提取液，加入4.5ml 50mmol/L，pH8.30K2HPO4缓冲液，10μ150mmol/L连苯三酚溶液(用10mmol/L HCl新鲜配制)迅速混匀，连续测量325nm处吸光度的改变。反应以加入连苯三酚溶液开始计时，反应温度25℃，总反应体积4.6ml.1个单位酶活性定义为。在25℃条件下，每毫升反应液每分钟抑制连苯三酚自氧化率达50％的酶量。
(七)过氧化氢分解，过氧化氢酶能催化过氧化氢分解，使体系中过氧化氢含量不断减少，过氧化氢在240nm处吸光值随之逐渐下降，利用此原理可测定过氧化氢酶的活性。样品分析液中含0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.4，加入一定量过氧化氢及适量的酶提取液，反应体积为1ml，以加入提取液为反就时，连续观察240nm处吸光度的变化。1个单位酶活性定义为在37℃条件下，每分钟催化1μmol作用物所需的酶量。
(八)谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定参考Paglia等的偶联谷胱甘肽还原酶的方法。样品分析液中含0.05mol/L磷酸缓冲液(含3mmol/L EDTA)，pH7.2，10mmol/L还原型谷胱甘肽，0.3mmol/L还原型辅酶II，1mmol/L叠氮钠，1单位的谷胱甘肽还原酶及适量酶提取液。混匀后30℃保温，加入过氧化特丁烷至终浓度为1mol/L，反应总体积1ml。反应以加入过氧化特丁烷开始计时，测定340nm处吸收光度的变化。1个单位酶活性定义为在30℃条件下，每分钟氧化1μmol的还原型辅酶II所需的酶量。
结果一、青藤碱治疗EAU大鼠对其视网膜脂类过氧化产物水平的影响1.共轭二烯结果如表2-1所示，经S抗原免疫后第九天，视网膜中共轭二烯水平明显增高，约为正常大鼠的4.2倍，第十四天时约为正常大鼠的4.8倍，到二十一天时，共轭二烯水平增至正常大鼠的6.8倍。由此看出，其水平在观察期内，呈上升趋势，与正常组比较均有极显著性差异，P＜0.01；经青藤碱治疗后，视网膜共轭二烯的水平比对照组有所下降，第九天时下降了约8.9％，统计学上有显著性差异，P＜0.05，以上结果表明，在大鼠EAU病变中，视网膜共轭二烯水平升高，青藤碱治疗可以抑制EAU大鼠视网膜共轭二烯水平的升高。
2.丙二醛从表2-2可以看出，EAU大鼠视网MDA水平变化与共轭二烯相同步，均呈升高趋势。第9天时，为正常组的2.27倍，第14天时，为正常组的3.28倍，到第21天时，升高至正常组的3.39倍。与正常组比较，统计学上均有极显著性差异，P＜0.01。经青藤碱治疗后，视网膜MDA水平较对照组不同程度下降。第9天时，下降了约8.4％，第14天时，下降了约41.2％，第21天时，下降了约45.8％。治疗组与对照组比较的结果，除第9天组外，其它二组均在统计学上有极显著性差异，P均＜0.01，以上结果表明，在大鼠EAU病变中，视网膜丙二醛水平升高，青藤碱治疗能够抑制EAU大鼠视网膜丙二醛水平升高的程度。
3.萤光色脂类萤光色脂类含量变化如表2-3所示，从中可以看出EAU大鼠视网膜萤光色脂类含量的升高，从时间上滞后于共轭二烯及MDA的变化，在第9天和第14天时，对照组虽比正常组有所升高，但统计学无显著性差异，P＜0.05，在EAU的第21天时，其含量明显升高，约为正常组的7.3倍，两者比较的结果，统计学上有极显著性差异，P＜0.01。经青藤碱治疗后，EAU大鼠视网膜萤光色脂类较对照组，不同程度地下降，分别为12％(第9天)、6.3％(第14天)和5.10％(第21天)。两者比较的结果，第9天和第14天组，统计学上无显著性差异，p＞0.05，第21天组在统计学上有极显著差异，p＞0.01。以上结果表明，在大鼠EAU病变中，开始2周视网膜萤光色脂类无明显变化，之后才明显升高，青藤碱治疗可以抑制EAU大鼠视网膜萤光色脂类含量的升高。
4、脂类氢过氧化物脂类氢过氧化物水平的改变，不同于前三种产物。从表2-4中可以看出，第9天时，其水平明显升高，约为正常的2.49倍，在第14天及第21天时，分别为正常组的2.03和1.84倍，两者比较的结果，统计学上均有显著性差异，p＜0.05。经青藤碱治疗后，各时间组的脂类氢过氧化物水平有一定程度下降，分别为19.7％(第9天)、25.2％(第14天)和5.3％(第21天)，但统计学上均无显著性差异，p＞0.05。以上结果表明在大EAU病变中，视网膜脂类氢过氧化物水平升高，青藤碱治疗后EAU大鼠视网膜脂类氢过氧化物水平升高程度减低，但统计学上有无显著性差异。
二、青藤碱治疗EAU大鼠对其视网膜相关酶水平的影响1、髓过氧化酶从表2-5中可以看出，在免疫后14天内，EAU大鼠视网膜髓过氧化物酶活性不断增高，其中第二周内增高最为显著，之后又逐渐下降。经青藤碱治疗后，髓过氧化物酶活性较对照组不同程度下降，其中第9天下降了9.7％，第14天下降了36.5％，第21天下降了17.1％。两者比较的结果，第14天组，统计学上有极显著性差异，p＜0.01，其余两组均未达到统计学上有显著差异的程度，p＞0.05。以上结果表明，在大鼠EAU病变过程中，视网膜髓过氧化物酶活性升高，第14天时为高峰，青藤碱治疗能够减少其酶活性的增高程度。
2、超氧化物歧化酶EAU大鼠视网膜超氧化物歧化酶活性变化见表2-6。在免疫后的第9天，超氧化物歧化酶的活性增高，约为正常的1.29倍。之后下降，在第14天时降低最显著，活性只有正常值的46.2％。第21天时较前略有升高，活性只有正常值的69.5％。经青藤碱治疗后，在第9天时，与对照组比较无明显变化。在第14天及第21天时明显高于对照组，两者比较的结果在统计这上有显著性差异，p均＜0.05。结果表明，在大鼠EAU病变过程中，视网膜超氧化物歧化酶活性先短暂升高，之后下降，青藤碱治疗后2周至3周，其酶活性的下降程度得到抑制。
3、过氧化氢酶结果见表2-7。从中可以看出，EAU大鼠视网膜过氧化氢酶活性随时间呈渐降趋势，与正常组比较，分别下降了22.4％(第9天)、45.6％(第14天)及52.0％(第21天)。各时间点中对照组与治疗组比较的结果，后者的过氧化氢酶活性均高于前者，其中第14天及第21天时，两者比较的结果，统计学上均有显著性差异，p＜0.01及p＜0.05。上述结果表明，在大鼠EAU病变过程中，视网膜过氧化氢酶活性下降。青藤碱治疗能够减少其酶活性下降的程度。
4、谷胱甘肽过氧化物酶EAU大鼠视网膜谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化见表2-8。与过氧化氢酶活性变化不同的是，在观察早期(第9天及第14天)其活性与正常对照组比较变化不大，至第21天时其变化方较明显，比正常对照组下降了约为20.9％，但两者比较的结果，统计学差异尚未达到显著的程度。p＞0.05。青藤碱治疗组的谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化趋势相似于未治疗组。虽然其各时间点的酶活性稍高于未治疗组，统计学上无显著差异，p＞0.05。实验结果表明，EAU大鼠视网膜谷胱甘肽过氧化物酶的活性，在观察早期无明显变化，第三周有所下降。青藤碱治疗组与未治疗组之间无显著差异。
表2-1 青藤碱治疗组和未治疗组中EAU大鼠视网膜中轭二烯(D)的CD X±SD(nmol/mg蛋白)组别n 未治疗组 治疗组9天 86.19±0.525.63±0.9514天87.10±0.406.19±1.2521天810.04±3.10 8.06±1.15*正常组(4)1.47±0.36*p＜0.05表2-2青藤碱治疗组和未治疗组中EAUwistar大鼠视网膜中丙二醛(MDA)的改变MDA X±SD(nmol/mg蛋白)组别n 未治疗组治疗组9天 8 0.427±0.0350.391±0.04214天8 0.617±0.1020.361±0.033*21天8 0.738±0.1050.400±0.065*正常组(4)1.88±0.013*p＜0.01表2-3青藤碱治疗组和未治疗组中EAUwistar大鼠视网膜中荧光色脂类(FL)的变化FL X±SD(μg/mg蛋白)组别n 未治疗组 治疗组9天 8 0.025±0.007 0.022±0.00614天8 0.016±0.005 0.015±0.00521天8 0.102±0.035 0.050±0.013**正常组(4)0.014±0.004*p＜0.01表2-4青藤碱治疗组和未治疗组中EAUwistar大鼠视网膜中脂类氢过氧化物的(LH)变化LH X±SD(nmol/mg蛋白)组别 n未治疗组治疗组9天 4 0.386±0.1000.310±0.12014天 4 0.314±0.1400.235±0.08521天 4 0.285±0.0840.270±0.064正常组(4)0.155±0.046
表2-5青藤碱治疗组和未治疗组中EAUwistar大鼠视网膜中髓过氧化物酶(MPO)的活性髓过氧化物酶活性(u/mg蛋白)(X±SD)组别 n 未治疗组治疗组9天 60.031±0.0060.028±0.00514天 60.115±0.0150.073±0.007**21天 60.041±0.0040.034±0.004*p＜0.01表2-6青藤碱治疗组和未治疗组中EAUwistar大鼠视网膜中SOD活性SOD活性(u/mg蛋白)(X±SD)组别 n 未治疗组 治疗组9天 79.92±0.829.8±0.7414天 73.56±0.934.83±0.77*21天 75.36±1.696.27 ±1.54*正常组(4)7.71±0.25*p＜0.05表2-7青藤碱治疗组和未治疗组中EAUwistar大鼠视网膜中过氧化氢酶活性过氧化氢酶活性(u/mg蛋白)(X±SD)组别 n 未治疗组治疗组9天 8 0.097±0.0270.109±0.01414天 8 0.068±0.0060.099±0.016*21天 8 0.060±0.0060.076±0.006*正常组(4)0.125±0.016*p＜0.05**p＜0.01表2-8青藤碱治疗组和未治疗组中EAUwistar大鼠视网膜中GSH过氧化物酶的活性GSH过氧化物酶活性(u/mg蛋白)(X±SD)组别 n 未治疗组治疗组9天 40.315±0.0310.324±0.03014天 40.307±0.0140.314±0.05021天 40.261±0.0410.274±0.039正常组(4)0.330±0.041讨论在本实验中，我们所观察的共轭二烯、丙二醛、脂类氢过氧化物及萤光色脂类，被认为是脂类过氧化过程中不同阶段的产物。
在脂类过氧化的初始阶段，自由基从不饱和脂肪酸中夺走氢，使之形成共轭二烯(其在233mm处有特征吸收峰)，随之后者与氧发生反应，形成脂类过氧化物，进一步转变为类质内过氧化物。脂类内过氧化物可与多种化合物(包括羟类)反应形成烷基自由基及脂类氢过氧化物，或形成丙醛及丙二醛，后者与磷脂及芳香苯胺的氨基，以及蛋白质的氨基结合可形成共轭席夫碱，该物质具有特殊的萤光另外，氢过氧化物可反应生成丙二醛。
我们的实验结果表明，在S抗原诱发的EAU大鼠视网膜中，多种脂类过氧化产物均不同程度的增高，反映出在EAU的病程中，自由基介导的脂类过氧化的过程加剧，其产生的损伤作用也随之加重。
对EAU的病理损伤机制之研究发现，尽管T细胞是病变的介导因素，但是视网膜的氧化损伤则是多形核白细胞(PMNs)所致。视网膜感光细胞内有比其它任何器官组织含量都高的多不饱和脂肪酸(PUFAs)，因而最易受到自由基介导的脂类过氧化的损伤。在EAU的急性期，PMNs聚积至炎症部位，同时被激活，随之发生以氧消耗增加、戊糖旁路激活及活性氧产物释放为特征的呼吸爆发(Respiratory burst)过程。其中活性氧产物主要是超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基经歧化过程可产生H2O2，随之通过Haber-Weiss反应及Featon反应，产生毒性更强的羟自由基(.OH)。这些活性氧在组织内增多，可造成脂类过氧化、蛋白质及DNA等的损伤。
近年来在EAU动物模型诱发时，普遍应用卡介苗及百日咳杆菌或百日咳杆菌毒素作为双佐剂与抗原一起来免疫动物。实验发现经双佐剂免疫后的动物模型，其PMNs浸润程度增加，视网膜脂类过氧化损伤加剧[159]。利用化学反光的方法发现EAU的高峰期超氧阴离子自由基及羟自由基明显增高。由此认为不论在EAU的初始期，还是持续期，氧自由基在视网膜氧化损伤中起主要作用，并最终导致视网膜变性。
本实验的结果表明，EAU大鼠视网膜共轭二烯及丙二醛水平的增高，在时间上基本同步，百萤光色脂类水平的增高滞后于前两者，在第二周后才显著增高。脂类氢过氧化物水平的增高在第一周末便达高峰，之后虽明显高于正常对照，但却呈不断下降趋势。
从脂类过氧化的过程推测，由于萤光色脂类是由丙二醛与磷脂、芳香苯胺及蛋白质氨基反应后生成的产物，可能该反应的速率相对迟缓，加之组织中对醛类的活性代谢，均可能成为萤光色脂类滞后的原因。
在脂类过氧化的引发阶段所产生脂类氢过氧化物(LHOOH)，可发生裂解(fragmentation)，产生烷氧基自由基(.LHO)及羟自由基(.OH)。在脂类过氧化的扩展阶段，二价铁离子(Fe++)可催化LHOOH反应成烷氧基自由基。由此我们推测，在EAU病变的某一阶段LHOOH的分解大于生成，可能导致其含量在第一周后逐渐下降。
经过青藤碱治疗以后，EAU大鼠视网膜脂类过氧化产物的生成受到不同程度的抑制，同时病理检查证实多形核白细胞的浸润程度也减轻。从我们前面体外实验中发现，青藤碱本身就能清除超氧阴离子自由基及羟自由基，并有抗脂类过氧化的作用。以往的实验业已证明，细胞膜的氧化损伤，可能导致钙离子内流，激活磷脂酶，引起游离的花生四烯酸生成增加，后者可以进一步转化成前列腺素，另外脂类氢过氧化物也能够导致花生四烯酸的氧化，在这两种反应过程中，均可促成炎性细胞趋化因子产生，加重局部炎性浸润程度。因此，我们认为青藤碱减轻EAU炎症反应的作用可能与其清除自由基抗脂类过氧化，从而抑制炎性趋化因子产生有关。
髓过氧化物酶(MPO)在中性白细胞的嗜苯胺颗粒中浓度非常高，一直被作为中性白细胞的标志酶。在本实验的观察中，EAU大鼠的视网膜MPO活性在免疫后第9天便已升高，第14天时达高峰，之后下降，在第21天时仍高于第9天。这种结果相似于Goto.H等的实验观察。
众所周知，在正常眼组织中存在着三种抗氧化损伤的保护机制一是抗氧化酶系统，能够防止活性氧产生；二是自由基清除剂；三是氧化损伤的修复机制。三种机制中，首当其冲的是抗氧化酶系统，它主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶及过氧化物酶系。
SOD被认为是抗氧酶系的首要成份，它能够专一性地清除超氧阴离子自由基(.O2-)。F过氧化氢酶不仅可以清除过氧化氢(H2O2)，而且能够减少羟自由其的生成，谷胱甘肽过氧化物酶是一个含硒酶，可催化谷胱甘肽与过氧化氢及过氧化物起反应，以消除氧化物的毒性作用。
在本实验中，我们观察了SOD、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化。实验结果表明，SOD的活性在动物免疫后第9天首先升高，之后随病程迅速下降，在炎症的高峰期(第14天)活性降至最低点，以后有所回升。有实验证明，视网膜SOD主要定位于感光细胞的内段及视网膜SOD的活性远大于晶状体。因此我们推测，在EAU病变初期，视网膜SOD活性反应升高，以消除不断增多的.O2，当O2的产生超过SOD活性明显下降。另外有研究发现，组织中过多的过氧化氢产生会造成Cu-Zn SOD的重要辅基Cu++的还原，从而抑制SOD的活性。
我们对EAU大鼠视网膜过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性测定的结果表明，二者活性变化不同于SOD，在观察期内一直呈下降趋势，其过氧化氢酶活性下降的更为明显。二者活性的下降，势必导致组织中过多的H2O2及过氧化物不能有效清除。这不仅可以直接带来组织的损伤，而且更重要的是过多的H2O2可反应生成毒性更强的羟自由基，从而活脂类过氧化过程，加重组织损伤。
利用青藤碱治疗以后，反映组织中中性白细胞浸润程度的髓过氧化物酶活性的升高得到了抑制，SOD及过氧化氢酶活性下降程度明显减轻。众所周知，正常机体内氧化与抗氧机制维持着动态平衡。抗氧化系统中，抗氧化酶系具有反应迅速、活性高的特点，因此成为抗氧化机制中主要的成份。从我们前面对EAU大鼠视网膜脂类过氧化产物的观察结果可以看出，在EAU过程中视网膜脂类过氧化过程加剧。这种自由基介导的脂类过氧化是一链式反应，有不断增强的趋势，其损伤作用会不断加重，只有通过抗氧化机制去打断反应链，才能中止或减轻其损伤。因此我们认为在EAU中，保护体内抗氧化酶的活性及从体外给予抗氧化剂或抗氧化酶，是减轻EAU脂类过氧化损伤的有效方法。一些作者也利用具有清除自由基及抗脂类过氧化作用的铁离子络合剂及抗氧化酶(如SOD)治疗EAU，取得明显疗效。
总而言之，在EAU的病程中视网膜脂类过氧化反应增强，同时抗氧化酶系的活性下降。青藤碱治疗，对抑制脂类过氧化、减少炎性浸润、保护抗氧酶活性是有效的。
实验例3 盐酸青藤碱对内源性葡萄膜炎患者的治疗作用一、材料和方法(一)一般临床资料1、观察对象；同仁医院眼科门诊葡萄膜炎患者，初发与复发者不限，患者随机分为三组第一组为单纯青藤碱治疗，第二组为单纯皮质激素治疗组，第三组为青藤碱加皮质激素治疗组，患者主要选择内源性前部葡萄膜炎病人，建立病历档案。
2、治疗方案1)青藤碱组疗程三个月，急性期(发病后二周内，以下同)给予盐酸青藤碱注射液(商品名正清风痛宁注射液，湘卫药准字(1985)第023025，批号960404C)1ml(25mg)结膜下注射，每日1次连续3-7天，同时滴用1％盐酸青藤碱滴眼液(眼研所内部制剂)，每小时1次，口服盐酸青藤碱片(商品名正清风痛宁片，湘卫药准字(92)23-092，批号960404C)；首三日，每次40mg，每日三次，之后80mg/每次，每日三次，症状控制后，停结膜下注射，点眼改为每2-4小时一次，口服药不变，持续二周，点眼改为每日3-4次，口服药改为40mg/每次，每日三次，至疗程完毕。
2)皮质激素组疗程三个月，急性期口服强的松20-30mg，每日一次，FD眼液，强地松龙+0.1％地塞米松(眼研所内部制剂)，或1％QDSL(醋酸强地松悬液)，每小时点眼1次，地塞米松2-3mg结膜下注射，每日一次，连续3-7天，症状控制后强地松改为10mg每日1次，点眼改为每2-3小时一次，持续二周，之后，强地松改为5mg，每日1次，点眼每日2-3次，至疗程完毕。
3)联合治疗组治疗三个月，急性期内口服强地松20-30mg每日一次，盐酸青藤碱片80mg/次，每日三次，局部滴用FD和1％盐酸青藤碱滴眼液，每小时1次，个别严重患者给予地塞米松2-3mg结膜下注射，或盐酸青藤碱结膜下注射1ml(25mg)，每日一次，连续3天，症状控制后，强地松减量10mg，每日一次，青藤碱片口服剂量，滴眼减为2-3小时1次，持续二周，之后，强地松减为5mg，每日一次，青藤碱片口服剂量不变，滴眼改为3-4次/日，巩固一个月后，停强地松口服，滴眼2-3次/日，继续口服青藤碱至疗程完毕。
3、观察指标1)充血程度(睫状充血及混合充血)。
2)角膜水肿混浊程度。
3)KP多少。
4)房闪及渗出(包括积脓)程度。
5)虹膜结节数量。
6)瞳孔粘连程度。
7)强玻璃体浑浊程度。
8)视力部分病人检测HLA-B27，眼B超检查及萤光眼底造影检查。
4、疗效标准1)睫状充血或混合充血消失者为显效，减少++者为有效，减少+者为好转，无减轻者为无变化。
2)Kp消失或全部转为棕色为显效，减少++者为有效，减少+者为好转，无减少者为无变化。
3)房闪或前房纤维性渗出或积脓完全消失或吸收为显效，减少++者为有效，减少+者为好转，无减少者为无变化。
5、各组病人情况1)青藤碱组患者共30例，39只眼。女性14例，20只眼。男性16例，19只眼。年龄9-51岁，平均37岁。其中女性年龄9-51，平均34.0岁。男性20-57岁，平均40.0岁。双眼患者9例，单眼患者21例。30例患者中前葡萄膜炎的25例(其中Reitr’s综合症1例，Fuch’s综合症1例)，全葡萄膜炎5例，随访时间为2周至一年三个月，平均4个月。
2)皮质激素组患者共15例，21只眼。女性9例，14只眼。男性6例，7只眼。年龄14-70岁，平均37.7岁。其中女性14-70岁，平均34.8岁。男性20-70岁，平均42.2岁。双眼患者6例，单眼患者9例。15例患者中前葡萄膜炎的13例，全葡萄膜炎2例。随访时间1周至8周，平均4周。
3)联合治疗组患者共34例，46只眼。女性20例，28只眼。其中女性19-66岁，平均42.1岁，男性11-69岁，平均34.1岁，双眼患病者12例，单眼患者22例。34例患者中前葡萄膜炎27例，全葡萄膜炎7例，随访时间2至28周，平均6.7周。
二、结果(一)总有效率统计结果见表3
表3 青风藤治疗内源性葡萄膜炎患者有效率观察分组 例数 显效例数有效例数 好转例数 无变化例数 总有效青藤碱组 3012(40％)5(16.6％) 3(10％) 10(33.6％) 66.6％皮质激素组 158(53.3％) 0 3(20％) 4(26.6％) 73.3％联合治疗组 3428(82.4％) 4(11.8％) 0 2(5.9％)94.2％合计79注总有效率显效例数+有效例数+好转例数/各组总例数三、讨论从我们的临床验证结果来看，青藤碱对于内源性的葡萄膜炎，尤其是前部葡萄膜炎，确实有治疗作用。单独利用该药总有效率在66.6％。而且该药的局部应用安全性大。在我们的观察中滴用1％青藤碱眼液达一年之久的患者，其角膜透明性，晶体透明性未发现异常改变。在我们观察的病例中有4例患者有不同眼别发病时，分别给予青藤碱和激素治疗都达到显效的结果，其中有一位女性患者同时双眼发病，右眼给予强地松在结膜下注射，FD眼液滴眼；左眼给予青藤碱结膜下注射，青藤碱滴眼，均达到显效的结果。
青藤碱局部治疗没有任何升高眼压的作用，对青藤碱组患者眼压的追测均未发现异常，即便个别患者由于瞳孔闭锁发生继发性青光眼，青藤碱的应用也不升高其眼压，这一点对继发性青光眼的葡萄膜炎患者意义可能较大，这些患者大多病程较长，属慢性过程，需要较长期用药，同时又应避免激发眼压升高，这样有时便限制了激素的应用，而利用青藤碱治疗，或联合用药(减少激素用量)便显示良好的适应症。在联合用药组中，有一名患者，双眼全葡萄膜炎二十余年，激素服用了二十余年，每次试图停用激素均导致双眼炎症复发，自服用青藤碱片后，将激素撤去了，至今已数月，双眼炎症没有复发，经服青藤碱片后患者感皮肤瘙痒和发现背部四肢小丘疹，但未能停用，激素仍然坚持服用。
在青藤碱组，有40％的患者既往有风湿性或类风湿性关节炎史(包括强直性柱炎)，在应用青藤碱治疗后，除眼部炎症控制外关节炎症状亦减轻。因此，我们以为对有较明确的风湿与类风湿史的葡萄膜炎患者，应用青藤碱治疗(单独应用或联合其他药物应用)，在控制全身及局部症状方面有很大益处。
青藤碱治疗组中无变化的有10例，占33.3％。其中慢性肉芽肿型葡萄膜炎占7例，均有激素治疗史，因此我们认为对于慢性肉芽肿型葡萄膜炎应采用青藤碱联合其它药物应用。
青藤碱联合激素治疗比较单纯应用青藤碱或激素者，对于控制葡萄膜炎的炎症，有更好的效果。总有效率达94.2％。其中确切的机制尚不清楚，但其协同作用已在初步观察中显现出来。而且在34例联合治疗的患者中，有25例只在青藤碱治疗方案上加了FD眼液，就可以达到良好的效果而无需激素局部注射，由于内源性葡萄膜炎病因复杂。而且随着病程其病变机理亦不尽相同，故联合用药是治疗内源性葡萄膜炎的方向所在。
权利要求
1.青藤碱及其药学上可接受的盐在制备治疗眼科免疫性疾病的药剂中的应用。
2.青藤碱及其药物学上可接受的盐在制备防治自身免疫性视网膜色素膜炎的药物中的应用。
3.根据权利要求1的用途，其中所述的青藤碱的药物学上可接受的盐是盐酸青藤碱。
4.青藤碱在制备防治自身免疫性视网膜色素膜炎的药物中的应用。
5.青藤碱及其药物学上可接受的盐在制备自身免疫性视网膜色素膜炎治疗过程中具有抑制脂类过氧化、减少炎症浸润、保护抗氧化酶活性作用的药剂当中的应用。
6.青藤碱及其药物学上可接受的盐在制备治疗内源性葡萄膜炎的药剂中的应用。
全文摘要
本发明是关于青藤碱及其药物学上可接受盐的新用途,具体说是青藤碱及其药物学上可接受的盐在制备防治眼科免疫性疾病的药物中的应用。特别是青藤碱及其药物学上可接受的盐在制备自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)治疗过程中具有抑制脂类过氧化、减少炎症浸润、保护抗氧化酶活性作用的药剂当中的应用,以及在制备治疗内源性葡萄膜炎的药剂中的应用。
文档编号A61P27/00GK1199623SQ97104310
公开日1998年11月25日 申请日期1997年5月19日 优先权日1997年5月19日
发明者孙旭光, 仇萍, 黄宇明, 吴飞驰, 詹晶明, 陈志强 申请人:白云山正清制药股份有限公司