专利名称：：制备阿卡波糖的渗透控制的发酵方法阿卡波糖是有效的α-葡糖苷酶抑制剂，用作口服治疗糖尿病的抗糖尿病药物，商品名为Glucobay。该活性化合物通过发酵获得；产生菌为土壤微生物游动放线菌SE50/110或由其衍生的突变体。通常，诸如阿卡波糖之类的活性化合物的发酵制备不通过方法的优化是不经济的。因此通常必需大大提高可以达到的发酵的时空得率。可以用本领域技术人员已知的各种方法提高收率。这些方法包括例如产生菌的诱变处理以及从存活的细胞中选择高产突变体；这些改造的产生菌株可以再经过该步骤。也常常可以加入分子生物学技术来改造菌种。另一重要的途径是优选生产培养基；其组分和定量组成必须使得达到最大产物收率。最后，通过将产生菌暴露于生长和产物生成的最适条件下(氧供应、温度、pH、切应力等)的发酵步骤也可以有助于提高收率。本发明涉及最后提到的优化策略，即改进发酵条件。令人惊讶的是，现已发现发酵溶液的重量克分子渗透压浓度-在微生物发酵中通常不考虑的参数-对阿卡波糖发酵的最终收率具有相当大的作用。由于决定性的重量克分子渗透压浓度的范围根本不在极端范围内，而在例如200-600mosmol/kg的中等重量克分子渗透压浓度范围内，即在培养微生物的营养溶液中通常达到的范围内，因此这更令人惊讶。由于例如人类血液的重量克分子渗透压浓度值为大约400mosmol/kg，因此在该范围内的重量克分子渗透压浓度通常被称作完全生理性重量克分子渗透压浓度。令人吃惊的是，现已发现不仅低营养溶液重量克分子渗透压浓度(例如＜200mosmol/kg)显著降低生产力，而且较高的营养溶液重量克分子渗透压浓度(例如＞600mosmol/kg)也显著降低生产力，在这类条件下通常阿卡波糖培养物甚至没有产物生成。根据阿卡波糖产生菌的生产力显著的对重量克分子渗透压浓度依赖性，研制出用于次级代谢物阿卡波糖发酵的新控制策略，该控制策略迄今尚未用于可比较的微生物发酵中，特别是在工业方面。该控制策略的原理是通过以适当方式加入渗透活性底物，将重量克分子渗透压浓度保持在所需的最佳范围内。可以或者每次分批加入底物，或者连续加入底物进行补料分批发酵中。然而，令人惊讶的是，也可以以完全连续的方法进行次级代谢物发酵，即加入含有一种或多种底物的营养溶液使重量克分子渗透压浓度保持恒定；在该类型的连续发酵中，在培养物中产生稳态重量克分子渗透压浓度。讨论的渗透活性底物最好是促进培养的产生菌生长的物质。这些物质尤其包括C源、N源和盐。或者将各种底物或者将底物混合物加入培养物中，以保持稳定的重量克分子渗透压浓度。因此，本发明包括两个基本方面1.控制策略，其目标是在阿卡波糖发酵的培养液中维持规定范围的重量克分子渗透压浓度。2.维持所需重量克分子渗透压浓度范围的方法，其特征在于，每次加入单一份数的底物或将底物连续加入补料分批发酵中，或在完全连续发酵中加入完全营养溶液。在优化阿卡波糖发酵的努力中，考查不同方法变型对生产力的影响。发现营养溶液组成以及进行发酵的方式两者都影响产物的收率。在野生型菌株以及高产高性能突变体中观察到的结果相同或相似。对于培养基，不同的营养溶液组合物可以成功地用于阿卡波糖发酵(Frommer等人，DE2614393)。通常最好使用含有碳源、维生素和微量元素、盐和缓中物质的营养溶液。其中一个适宜的碳源实例是麦芽糖，它形成阿卡波糖分子的一个结构要素。由于经济原因，最好使用较便宜的碳源，诸如淀粉水解产物，它含有葡萄糖、麦芽糖和高级葡萄糖寡聚物。适宜的氮源是个别的氨基酸，例如谷氨酸或天门冬氨酸、蛋白质水解产物或蛋白质提取物或高蛋白原材料(诸如大豆粉、土豆粉、麸质)或其它含蛋白质或含多肽的复合底物。将磷酸盐和铁盐加入营养溶液以及使用缓冲物质(例如碳酸钙)控制pH证明是有利的。通过复合营养溶液底物和/或通过自来水向营养溶液供应微量元素。如果使用软化水，最好加入微量元素浓缩液。对于发酵步骤，最好将pH保持在生理范围内，即pH5-8、并向培养物提供充足的氧气，以便避免限制培养物的生长。在30℃左右的温度范围内获得最佳生产力。由于阿卡波糖产生菌是丝状菌，另外最好在搅拌式发酵中避免极高的搅拌速度，因此最好避免不再能耐受的剪应力。在优化发酵的过程中，惊讶地发现由营养溶液产生的重量克分子渗透压浓度对阿卡波糖的生产力具有显著的影响。这种影响决不会恰好限制在极端数值，而是完全在生理范围内。还令人惊讶的是，不仅较高的重量克分子渗透压浓度导致生产力的大大降低，而且低重量克分子渗透压浓度也导致生产力的大大降低。图1和图2中该关系变得很清楚。最佳重量克分子渗透压浓度为大约400mosmol/kg。＞500mosmol/kg或＜300mosmol/kg的值都引起可探测的生产力的降低，＞600mosmol/kg或＜200mosmol/kg的值引起生产力的非常显著的降低；在某些情况下，特别是在所述重量克分子渗透压浓度范围的极限或极限之外的情况下，可能根本测量不到阿卡波糖的生产。由于低重量克分子渗透压浓度通常对微生物代谢活性没有消极影响，而微生物通常耐受相当高的重量克分子渗透压浓度，因此微生物的这种关系令人惊讶。重量克分子渗透压浓度对阿卡波糖生产力的影响暗示，如果在发酵期间将重量克分子渗透压浓度保持在合适的范围内，那么应该能够成功地优化发酵。在微生物培养期间，一方面用消耗营养溶液的渗透活性底物，另一方面用在生长期间释放到营养溶液中生成的渗透活性产物，来测定重量克分子渗透压浓度的趋势。在阿卡波糖分批发酵的情况下，图3所示趋势的结果是发酵开始时重量克分子渗透压浓度为500mosmol/kg，即为已经诱导生产力轻微抑制的值。在发酵期间，重量克分子渗透压浓度降低，通过最适范围，然后达到再导致生产力降低的值。现已努力研制能够渗透控制操作模式的控制策略。通常，将营养溶液底物加入微生物培养物中的目的是产生由底物浓度产生的规定的代谢状态。在该过程中作出的努力通常是或者避免底物限制，或者产生规定的底物限制。然而，在本情况下，控制的目标是通过加入渗透活性营养溶液组分维持规定的合适的重量克分子渗透压浓度范围；然而，同时必需小心不要由于加入底物无意中引起的过量底物浓度或过度不平衡的底物浓度引起不利影响。试验渗透控制的操作方法的三个变型1.在发酵期间每次加入少量新鲜的营养溶液；这可以使重量克分子渗透压浓度阶段性地达到需要的最适值。2.在补料分批发酵期间，加入一种或多种底物；用该方法可以将重量克分子渗透压浓度在整个发酵期间保持在合适的范围内。3.连续加入新鲜营养溶液并且连续取出含产物的培养肉汤的完全连续发酵；在这种情况下，重量克分子渗透压浓度同样可以在整个发酵期间保持在合适的范围内，同时在培养物中达到最适于阿卡波糖发酵的稳态。每次加入少量新鲜营养溶液是实施技术简单的方法。然而，该方法的缺点是，重量克分子渗透压浓度只是阶段性地适合，而加入相对大量的新鲜底物，在某些情况下，对生物合成的调控可以具有干扰效应。后一方面尤其在生物合成途径涉及次级代谢物的情况下是重要的。每次加入少量新鲜营养溶液在实验室规模下在摇瓶中进行。令人惊讶的是，通过分批加入单一份数的新鲜营养溶液，将培养肉汤的重量克分子渗透压浓度成功地保持在被认为是最佳范围的350-450mosmol/kg范围内，因此显著提高产物的收率。(图4重量克分子渗透压浓度的趋势，而表1阿卡波糖的最终收率)。这样，可以在几个时间点(例如48小时和96小时后)加入相对大量的营养溶液，或可以以较短的时间间隔加入相对少量的营养溶液，这近似于连续加入。在中试规模下，在发酵期间连续加入营养溶液并进行试验。实施例2描述了该方法。所用的营养底物是例如通常用于营养溶液中的碳源(淀粉水解产物)。其它营养溶液组分(氮源、盐)或多种营养溶液组分的组合物也可以以同样方式使用。培养肉汤的重量克分子渗透压浓度可以保持在大约350-450mosmol/kg的合适范围内(图5)。可以清楚地看出，在发酵开始时通过在发酵中开始连续加入大约40小时，可以防止重量克分子渗透压浓度的降低。相反，对照发酵方法(不在渗透控制下)的重量克分子渗透压浓度在整个发酵期间降低，如图3所示。表2表明，通过在补料分批发酵中连续加入营养溶液组分达到的渗透控制的发酵步骤，使得收率明显提高。表1由控制重量克分子渗透压浓度的发酵引起的收率的提高每次加入少量新鲜的营养溶液</tables>表2由控制重量克分子渗透压浓度的发酵引起的收率的提高连续加入营养溶液底物</tables>实施例3描述了渗透控制的完全连续发酵的步骤。次级代谢物的完全连续发酵在许多情况下原则上是不可能的，因为由于代谢的调控现象，直到生长基本上停止或完全停止后才达到最大生产力。然而，生长与产物生成之间的平行是可行的连续培养的必要的先决条件。因此，在阿卡波糖发酵中，完全连续的操作模式可以成功地进行必定被认为是绝对惊奇的。图6表明，培养肉汤中的重量克分子渗透压浓度通过连续生产步骤保持在合适范围内。图7所示的结果是，通过几次体积的改变，分批发酵的生产力成功地保持在最大值上。对本发明而言，重要的是指出最适重量克分子渗透压浓度是菌株特异性参数。通过菌种改造技术产生的不同高性能菌株的最适重量克分子渗透压浓度可能不同。菌种改造的目标甚至可能是产生最适重量克分子渗透压浓度改变的高性能突变体。因此，本发明说明书中提到的重量克分子渗透压浓度值只是举例说明，可用于所用的生产菌株。对每个新产生的高性能突变体必须测定其最适重量克分子渗透压浓度，必须进行渗透控制的发酵，以便以描述过的方式维持最适重量克分子渗透压浓度。实施例实施例1每次将少量新鲜营养溶液加入阿卡波糖发酵中的重量克分子渗透压浓度的控制在11摇瓶中将阿卡波糖产生菌株培养在90ml以下营养溶液中淀粉水解产物100g/l，酵母膏7g/l，酪蛋白水解产物3g/l，CaCO33g/l，K2HPO43g/l，自来水，pH6.9。营养溶液在高压灭菌器中于121℃灭菌10分钟，然后用种子培养物接种，于30℃、摇床频率为250rpm下培养。在48小时和72小时后或在48小时和96小时后，每次加入20ml浓缩1.5倍的上述特定组分的营养溶液。进料溶液在高压灭菌器中于121℃灭菌10分钟。通过测定冰点降低每天测定一次重量克分子渗透压浓度；用HPLC每天测定一次阿卡波糖含量。实施例2将营养溶液底物连续加入阿卡波糖发酵中的重量克分子渗透压浓度的控制在3000l发酵罐中将阿卡波糖产生菌株培养在1600l以下营养溶液中淀粉水解产物100g/l，酵母膏7g/l，酪蛋白水解产物3g/l，CaCO33g/l，K2HPO43g/l，自来水，pH6.9。营养溶液用连续方法灭菌(150℃，52秒)，装入预先灭菌的发酵罐中，用产生的种子培养物在300l发酵罐中培养，在以下条件下发酵温度31℃，罐压1.0-1.8巴，搅拌150-220rpm，通气速率500-1000l/min。从第48小时开始，将淀粉水解产物溶液以大约3.2l/h的进料速率连续进料；溶液在自来水含有163kg淀粉水解产物(终体积233l)，并且已于121-125℃灭菌20分钟。通过测定冰点降低每天测定一次重量克分子渗透压浓度。用HPLC每天测定一次阿卡波糖含量。实施例3阿卡波糖连续发酵的重量克分子渗透压浓度的控制在3000l发酵罐中将阿卡波糖产生菌株培养在1600l以下营养溶液中淀粉水解产物100g/l，L-天冬酰胺·2H2O20g/l，K2HPO43g/l，MgSO4·7H2O2g/l，FeCl3·6H2O1g/l，Mg3(PO4)2·8H2O2g/l，MnCl2·4H2O0.1g/l，CoCl2·6H2O0.1g/l，ZnCl20.1g/l，自来水，pH6.8。营养溶液用连续方法灭菌(150℃，52秒)，装入预先灭菌的发酵罐中，用产生的种子培养物在300l发酵罐中培养，在以下条件下进行发酵温度31℃，罐压1.0-1.8巴，搅拌150-220rpm，通气速率500-1000l/min。从第48小时开始，将淀粉水解产物溶液以大约3.2l/h的进料速率连续进料；溶液在自来水含有163kg淀粉水解产物(终体积233l)，并且已于121-125℃灭菌20分钟。96小时后，从正运行的发酵中取出一份200l的培养肉汤，在无菌条件下转移至预先灭菌的300l发酵罐中。然后以每天0.33倍发酵罐体积的流速将新鲜营养溶液连续送入该培养物中。从发酵罐中以同样的速率取出含有产物的培养肉汤。按实施例2测定重量克分子渗透压浓度和阿卡波糖。权利要求1.制备阿卡波糖的发酵方法，其特征在于，设定重量克分子渗透压浓度并将其维持在200-600mosmol/kg的范围内。2.按照权利要求1的方法，其特征在于，设定重量克分子渗透压浓度并将其维持在300-500mosmol/kg的范围内。3.制备阿卡波糖的发酵方法，其特征在于，在发酵过程中将一种或多种营养溶液组分加入生成阿卡波糖的培养物中。4.按照权利要求3的方法，其特征在于，加入一种或多种营养溶液组分使得培养物中的重量克分子渗透压浓度保持在200-600mosmol/kg的范围内。5.按照权利要求3的方法，其特征在于，加入一种或多种营养溶液组分使得培养物中的重量克分子渗透压浓度保持在300-500mosmol/kg的范围内。6.按照权利要求3-5的方法，其特征在于，以分批形式每次将一份的该营养溶液组分或几种营养溶液组分加入培养物中。7.按照权利要求3-5的方法，其特征在于，将该营养溶液组分或几种营养溶液组分连续加入培养物中。8.按照权利要求3-5的方法，其特征在于，将该营养溶液组分或几种营养溶液组分连续加入培养物中，并从培养物中连续取出含产物的培养肉汤。9.制备阿卡波糖的发酵方法，其特征在于，分次每次从培养物中取出少量含产物的培养溶液，然后再分次每次将少量新鲜营养溶液加入培养物中。10.制备阿卡波糖的发酵方法，其特征在于以补料分批法进行发酵，分批加入或连续加入进料底物溶液。11.制备阿卡波糖的发酵方法，其特征在于以连续法进行发酵。全文摘要本发明涉及制备阿卡波糖的新发酵方法。通过监测和控制发酵溶液中的重量克分子渗透压浓度可以大幅度地提高发酵的收率。文档编号A61K31/70GK1178837SQ9711862公开日1998年4月15日申请日期1997年9月12日优先权日1996年9月13日发明者J·博宁克,M·施德尔,U·斯特勒尔申请人:拜尔公司