溴代台勾霉素化合物的制作方法

专利名称：溴代台勾霉素化合物的制作方法
技术范围本发明涉及新的溴代台勾霉素(bromotiacumicin)类抗菌素、含有该类化合物的药用组合物及其治疗细菌感染的应用和其制备方法。
本发明的背景已知具有抗广谱革兰氏阳性及其它细菌活性的某些抗菌素是从世界各地土样中分离微生物菌株产生的。然而，继续需要能表现出改善活性、具有提高或专一的抗菌谱效果和/或当对患者给药时表现出更理想的药物动力学性质的新的抗微生物药剂。
特别需要的抗微生物药剂可用于治疗与抗菌有关的结肠炎或常常由难辨梭菌(clostridium difficile)引起的其它医院结肠炎的治疗，尤其是仍可恢复成部分或全部正常菌群的治疗。
美国专利4918174描述了台勾霉素类抗菌素(1990年4月17日授权，在此结合本发明中作具体参考)和包括化合物台勾霉素A、台勾霉素B、台勾霉素C、台勾霉素D、台勾霉素E和台勾霉素F。相关的化合物是里皮尔霉素类抗菌素[参见Arnone等，J.Chem Soc.Perkin Trans.I,1987:1353-1359(1987)和Cavalleri等，J.Antibiotics,41:308-315(1988)]和梭菌霉素类抗菌素[参见Omura等，J.Antibiatics,39:1407-1412(1986)]。
本发明概述现已确定通过改变生产台勾霉素类抗菌素的方法可获得新的溴代台勾霉素类抗微生物药剂，该抗菌剂可从桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis subsp nov.)的发酵培养液及菌丝体中分离出来。已发现本发明的化合物即上述台勾霉素的溴化衍生物具有体外抗各种致病细菌的活性，特别是在缺氧条件下使用Willkins-Chalgren琼脂测定评价时，抗梭状芽孢杆菌属的活性。因此预料这些化合物将用于治疗哺乳动物的细菌感染。
本发明的一个方面是具有式(Ⅰ)的化合物
或其药学上可接受的前体药物，其中R1和R2独立选自氢和C1-C4链烷酰基；R3和R4选自(a)R3是氢和R4是羟基，(b)R3是羟基和R4是氢，和(c)R3和R4一起为=O；R5和R6独立选自氢、溴和氯，但须至少R5和R6之一必须是溴。
本发明的另一方面公开药用组合物，它包含治疗有效用量的本发明化合物与药学上可接受载体的组合。
本发明的另一方面公开了在需要此治疗的患者身上治疗革兰氏阳性细菌感染，特别是由致病难辨梭菌引起的感染的方法，该方法包括给予患者治疗有效用量的本发明化合物。
本发明又一方面公开了制备本发明化合物的方法，它包括步骤(a)从富集溴化物的发酵介质中分离溴代台勾霉素和(b)经沉淀或其它方法纯化溴代台勾霉素。本发明的详述在本发明的一个优选实施方案中是式(Ⅰ)的那些化合物，其中R1和R2中的一个是C1-C4链烷酰基和另一个是氢。
在本发明的另一个优选实施方案中是式(Ⅰ)的那些化合物，其中R5是溴和R6是氢。
在本发明的又一个优选实施方案中是式(Ⅰ)的那些化合物，其中R5是氯和R6是溴。
本发明的代表性化合物如下式(Ⅰ)化合物，其中R1是氢和R2是2-甲基丙酰基，R3是氢，R4是羟基，R5是氯和R6是溴；式(Ⅰ)化合物，其中R1是氢和R2是2-甲基丙酰基，R3和R4一起为=O，R5是氯和R6是溴；式(Ⅰ)化合物，其中R1是氢和R2是2-甲基丙酰基，R3是氢，R4是羟基，R5是溴和R6是氢；和式(Ⅰ)化合物，其中R1是2-甲基丙酰基和R2是氢，R3是氢，R4是羟基，R5是溴和R6是羟基；或其药学上可接受的前体药物。
本发明最优的形式是式(Ⅰ)化舍物，其中R1是氢和R2是2-甲基丙酰基，R3是氢，R4是羟基，R5是氯和R6是溴。
正如本说明书及附带的权利要求书中所用的，下列术语具有特殊意义
在此所用的术语“烷基”指为单键直链或支链的1-12个碳原子的烃基，包括(但不限于此)甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、仲-丁基、异丁基、叔-丁基、戊基、己基、庚基等。
在此所用的术语“链烷酰基”指为式-C(O)R”的单价基团，其中R”是氢或上述定义的烷基，包括(但不限于此)乙酰基、丙酰基、异丁酰基等。
在此所用的术语“C1-C4链烷酰基”指为上述定义的链烷酰基，其中R”是氢或1-3个碳原子的烷基。
在此所用的术语“低级烷基”指为上述定义的具有1-6个碳原子的烷基。
在此所用的术语“药学上可接受的前体药物”指为本发明化合物的那些前体药物，在合理的医学判断范围内，它们适用于与人和低等动物的组织接触，并无过度的毒性、刺激性、过敏反应等，有相应的合理的益处/风险比和有预期应用的作用效果以及若可能为两性离子型的本发明的化合物。术语“前体药物”指在体内迅速转变，例如经血液中水解得到上式的母体化合物。T.Higuchi和V.Stella在Pro-drugs as Novel Delivery Systems,Vo1.14 ofthe A.C.S Symposium Series中和Edward B.Roche等在Bioreversible Carriers in Drug DesignAmerican Pharmaceutical Association and Pergamo Press 1987中提供详细讨论，在此二者均结合本发明中作具体参考。
若合适，通过任何适当方法可以制备本发明衍生化合物的前体药物。对这些化合物而言，其中前体药物部分为氨基酸或肽官能度，根据常规的缩合方法如叠氮化物法、混酸酐法、DCC(二环己基碳二亚胺)法、活性酯法(对-硝基苯酯法、N-羟基-丁二酸亚酰胺酯法、氰甲基酯法等)、WoodWard试剂K法、DCC-HOBT(1-羟基-苯并三唑)法等可以有效地将氨基与氨基酸和肽缩合。M.Bodansky、Y.SKlausner和M.AOndetti在Peptide Synthesis,Second Edition,NY,1976中介绍了氨基酸缩合反应的经典方法。
在本发明化合物中存在不对称中心。除另有说明外，本发明打算包括各种立体异构体和其混合物。因此，一旦一个键被无规立构表示时，打算包括两种取向。
在上述或其它治疗中应用时，可以以纯品形式或以药学上可接受的盐、酯或前体药物形式(若以这样的形式存在的活)使用治疗有效用量的本发明化合物之一。或者，可以将所述化合物作为含有该化合物并与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的药用组合物给药。所谓本发明化合物的“治疗有效用量”是指治疗目标疾病时，在合理的益处/风险比下用于任何医疗中所述化合物的足够用量。然而，可理解的是本发明化合物和组合物的总日剂量应由临床医生在合理的医学判断范围内来决定。对任何特定患者的特定治疗的有效剂量水平将取决于各种因素，包括所治疗的疾病和疾病的严重程度；所应用特定化合物的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食；所用特定化合物给药时间、给药途径和排泄速度；治疗疗程；与该特定化合物一起使用的药物等医学领域中非常熟知的因素。例如，在本领域技术内，恰当的是化合物起始剂量水平低于取得所需治疗效果的需要量，再逐步增加剂量，直到取得所需的效果。
通过口服给药，对人或低等动物给予本发明化合物的总日剂量的范围可以从约0.01-约100mg/kg/天。更优选的剂量的范围可以是从约0.1-约10mg/kg/天。如所需，有效日剂量可分成多次剂量以便给药；因此，单剂量组合物可含有作为构成日剂量的这样的用量或其多个分剂量。
本发明的药用组合物包含本发明化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其可以以口服、直肠、非肠道、脑池内、阴道内、腹膜内、表面(如以粉末、软膏或滴剂)、向颊或以口腔或鼻腔喷雾给药。所谓“药学上可接受的载体”是指无毒性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的配方辅助物。在此所用的术语“非肠道”指为给药的方式，其包括静脉、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内的注射和输注。
本发明非肠道注射的药用组合物包括药学上可接受的无菌非水溶液或含水分散液、悬浮液或乳剂以及使用之前再复制成无菌可注射的溶液或分散液的无菌粉剂。合适的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或溶媒包括水、乙醇、多元醇(如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素和其适合的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散液的情况下保持所需的粒度及通过使用表面活性剂可保持适当的流动性。
这些组合物也可含有辅料如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包括各种抗菌和抗真菌剂，例如，paraben、氯丁醇、苯酚山梨酸等可确保防止微生物作用。也可以根据需要包括等渗剂如糖、氯化钠等可注射药用形式的延长吸收性可由包括延长吸收性的试剂如单硬脂酸铝和明胶所产生的。
在某些情况下，为了延长药物的疗效，希望从皮下和肌内注射中减缓药物的吸收。这可以通过使用水溶性差的晶体或非晶体物质的悬浮液来实施。药物的吸收速率也取决它的溶解速率，依次也取决于晶体大小和晶形。另外，延长非肠道给药形式的吸收将通过使药物溶解或悬浮于油性溶媒中来实施。
通过在生物可降解的聚合物如聚交酯-聚乙交酯中形成微囊基质的药物来制备可注射的储存剂型。根据药物与聚合物的比率和所使用特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其它生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。也可通过在与身体组织相容的脂质体或微浮化液中包封药物来制备储存可注射的制剂。
将可注射制剂进行灭菌，例如，通过除菌过滤器过滤或在无菌固体组合物中加入灭菌剂，在使用前，将其溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射的介质中。
口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或(a)填充剂或补充剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，(b)粘合剂例如像羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)润湿剂如甘油，(d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂如石蜡，(f)加速吸收剂如季铵化合物，(g)湿润剂如像十六烷醇和甘油单硬脂酸酯，(h)吸收剂如高岭土和膨润土和(ⅰ)润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇和月桂基硫酸钠和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型中也包括缓冲剂。
也可应用类似形式的固体组成作为填充剂，在软和硬填充明胶胶囊中使用如乳糖以及高分子量的聚乙二醇等作为填充剂。
用包衣和加外层例如肠溶衣和药用制剂技术中熟知的其它包衣制备片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型。它们可任选包含遮光剂和也可以是仅释放活性成分，或优选于部分肠道中释放，或任选以缓释方式的组合物。所使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
活性化合物也可以是微囊形式，若合适，包含一种或多种上述的赋形剂。
口服的液体剂型包括药学可接受的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如像水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉子油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻子油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯和其混合物。
除惰性稀释剂外，口服组合物也可包含辅料如湿润剂、乳化剂和悬浮剂以及甜味剂、调味剂和香味剂。
除活性化合物外，悬浮液可含有悬浮剂例如像乙氧化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维、aluminummetahydroxide、膨润土、琼脂和黄蓍胶及其混合物。
表面给药包括对皮肤或粘膜给药，包括肺和眼的表面。表面给药的组合物(包括吸入剂)可制备成加压或非加压的干粉剂。在非加压粉剂组合物中，可使用与包含例如具有粒径达100微米的颗粒的大粒径药学上可接受的惰性载体混合的细粉形式的活性成分。合适的惰性载体包括糖如乳糖。活性成分颗粒的至少95％(重量)需要具有在0.01-10微米范围内的有效粒径。
另外，所述组合物可以加压并含有压缩气体如氮气或液化气体抛射剂。优选液化的抛射剂介质，甚至全部组合物为其中活性成分基本上不溶解。加压组合物也可以含有表面活性剂。该表面活性剂可以是液体或固体的非离子表面活性剂或可以是固体阴离子表面活性剂。优选使用以钠盐形式的固体阴离子表面活化剂。
直肠或阴道给药组合物优选栓剂，可通过将本发明的化合物与适合的非刺激赋形剂或载体如可可脂，聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，所述栓剂蜡在室温下为固体，但在体温下为液体，因此在直肠或阴道腔中熔融并释放活性化合物。
本发明化合物也可以脂质体形式给药。如本领域内所知，脂质体一般衍生于磷脂或其它脂质物质。通过单层或多层水化液晶形成的脂质体可分散于含水介质中。可以使用任何无毒、生理上可接受的并可代谢的有形成脂质体能力的脂质。除本发明化合物外，本发明脂质体形式的组合物可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，二者可为天然或合成的。形成脂质体的方法为本领域熟知。如参见Prescott,Ed.,Methods in Cell Biology,VolumeXIV,Academic Press,New York,N.Y.,1976,p33 et seq。制备溴代台勾霉素的方法使用下述一种或多种方法可以制备本发明的化合物。在上述美国专利4918174中介绍了台勾霉素的发酵方法。用溴化钠代替发酵介质中的氯化钠来改变上述的方法可以完成溴代台勾霉素的制备。所述介质中的溴化钠浓度可以在0.25-1.0％，最优选约0.48％。
用与水不混溶或仅部分混溶的常用有机溶剂如乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷或氯仿从发酵液中提取溴代台勾霉素。优选在实施提取之前，加入适当量水混溶溶剂如甲醇或丙酮溶解菌丝体。该步骤确保从菌丝体内提取抗菌素。用层析方法分离同类系的台勾霉素类抗菌素。实验旋光度用Perkin-Elmer Model 241旋光仪在10cm池中测定。快速原子轰击质谱用Kratos MS-50质谱仪测定。紫外光谱用Perkin-ElmerLambda 3B UV-可见分光光度计测定和红外光谱用Nicolet model 60SXFT-IR仪(连接Nicolet计算机)测定。NMR谱用General Electric GN 500或GN 300分光仪测定。NMR谱数据列于表1(下面实施例6后)中。记录的Rf值在Analtech TLC板上，用氯仿甲醇(9∶1，体积∶体积)展开，并使用硫酸高铈喷雾剂目测检验。熔点用Hoover Unimelt测定并未校正。用两倍琼脂稀释液测定最小抑制浓度。需氧菌使用脑心浸液琼脂培养基及厌氧菌用Wilkins-Chalgren琼脂培养基。
实施例1溴代台勾霉素的发酵制备在42升不锈钢发酵罐(LH Fennentation)中，用包含2％葡萄糖一水合物、0.1％大豆油、1％大豆粉、0.3％牛肉膏、0.05％K2HPO4、0.05％MgSO4.7H2O、0.48％KBr和0 3％CaCO3的培养基经深层发酵制备溴化的台勾霉素。该发酵过程类似于上述美国专利4918174中用KBr代替KCl用于制备台勾霉素的发酵过程。在发酵罐中装入30升培养基。在121℃、1.05kg/cm2灭菌1小时。单独灭菌葡萄糖一水合物并在接种前加入发酵罐中。将生产菌桔橙指孢囊菌(Dactylosporangiumaurantiacum subsp.hamdenensis AB 718C-41)在ATCC培养基172琼脂斜面上，在30℃生长10天。将斜面生长物接种于种子培养基中，该培养基包含0.1％的葡萄糖一水合物、2.4％水溶性淀粉、0.5％酵母膏、0.5％胰化胨、0.3％牛肉膏和0.4％CaCO3。分两步制备接种物。第一步，用斜面生长物接种，孵育96小时。按5％使用该营养生长物以便接种2升含600ml种子培养基的锥形瓶。孵育该瓶72小时。两步在30℃，以225rpm(5.08cm冲程)旋转式摇床培养。按5％用量将第二步生长物接种于发酵罐中。发酵温度控制在30℃，搅拌为250rpm，空气流速是0.7vol/vol/分钟并将顶部压力保持在0.35kg/cm2。用硅氧烷防沫剂XFO 371(Ivanhoe Industries)控制泡沫，开始加入0.01％，然后根据需要加入。7天后收获发酵物。将收获点pH7.9调至7.0。
实施例2分离溴代台勾霉素在收获点，将全部发酵液(30升)调到pH7并加入丙酮(15升)。搅拌1小时后，用乙酸乙酯(3×15升)提取丙酮和发酵液的混合物。将合并的提取液浓缩至干，并将残留物分配在氯仿-甲醇-水(各1200ml)中。浓缩该分配液的下层得到浅色非晶体固体物。将该固体物上硅胶柱并用氯仿中含甲醇从1％-50％的梯度液洗脱。基于TLC分析将活性流份合并至3个容器中。将第一容器物置于硅胶柱上并用含甲醇10％、20％和50％的氯仿梯度液依次洗脱。合并该柱的活性流份并浓缩得到白色固体。将该固体物用氯仿-四氯化碳-甲醇-水(7∶3∶7∶3)(下层为固定相)溶剂系统进行Ito多层盘星式离心(coil planet centrifuge)的逆流层析。合并该柱的活性流份并浓缩得到2mg纯品化合物3(见下面实施例5)。第二容器物经类似层析得到纯品台勾霉素B(58mg)和纯品化合物2(3mg)(见下面实施例4)。在相同条件下将第三容器物经逆向层析得到纯品化合物4(45mg)(见下面实施例6)及粗品化合物1，该化合物1经Sephadex LH-20柱层析纯化并用二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱。合并该LH-20柱的活性流份并浓缩得到42mg的纯品化合物1(见下面实施例3)。
实施例3化合物1的鉴定；式(Ⅰ)化合物，其中R1是氢和R2是2-甲基丙酰基，R3是氢，R4是羟基，R5是氯和R6是溴1的快速原子轰击(FAB)阳离子质谱在m/z为1123有最高的分子离子峰。向样品中加入钾，该最高峰位移至m/z=1139，可设想1123是母体化合物钠盐峰，其分子量为1100(Mass-Na)。由1123离子束代表的同位素分布图形与分子式含有一个溴和一个氯原子的同位素分布图形相一致。分子量1100相应于原台勾霉素在分子量上相差44个质量单位(为溴和氯之间的原子量差异)，可解释为在化合物1中一个溴原子取代一个氯原子。在阳离子质谱m/z=437处观察到的明显碎片离子峰显示相应一个溴原子和一个氯原子的同位素分布图形。这类似于在台勾霉素的质谱中观察到的具二氯同位素图形的m/z=393并指定为与芳环连接的糖碎片峰(下面的a,b)。
化合物1的1HNMR谱与关联能谱法(COSY)实验共同提出的基本结构基本上相当台勾霉素B的结构(见表1)。在台勾霉素B和化合物1的PMR谱之间的唯一明显差异在于C-8两个质子信号。在台勾霉素B中，该两个质子信号在d2.95表现为对称复杂的2H多重峰。在化合物1中，相应的质子信号在d3.04和d2.97表现为1H五重峰。这些数据提示化合物1在芳环的C-6上含有溴(6-去氯-6溴代台勾霉素B)。D25=+3°(c=0.33,MeOH)，白色非晶体固体，mp145-151℃,Rf=0.34。MW=1123(钠盐)。UV(MeOH):1max224nm(e9900)、232(肩峰)(9700)、266(肩峰)(5900)、314(2400)；在酸性甲醇中，1max206nm(肩峰)(e9400)、222(11000)、230(肩峰)(10800)、266(6500)；在碱性甲醇中，1max206nm(e13500)、226(肩峰)(10300)、232(10800)、312(10100)。IRumax(CDCl3):3690、3605、3665、3497、2976、2935、2876、1733、1684、1601、1575、1468、1456、1411、1385、1371、1322、1312、1244、1196、1159、1143、1113、1087和1023cm-1。
实施例4化合物2的鉴定；式(Ⅰ)化合物，其中R1是氢和R2是C1-C4链烷酰基，R3和R4一起为=O,R5是氯和R6是溴化合物2的快速原子轰击(FAB)阳离子质谱在m/z=1021具有最高的分子离子峰。加入钾，该峰位移至m/z=1037，因此设想化合物2的分子量为1098或比化合物1少两个质量单位。化合物2的钠加成物的同位素分布图形提示该结构含有一个溴原子和一个氯原子。
比较化合物1和2的PMR和COSY谱显示两个化合物的差异在C-15至C-19部分。在化合物1定义原子C-15-C-19的各组偶合质子信号在化合物2的C-17终止，其中d 5.13质子信号显示仅与C-16上亚甲基质子偶合。另外，在d1.16处化合物1的C-19甲基质子二重峰被在d 2.21处甲基质子单峰取代。这些数据解释为相对化合物1的化合物2中C-18被氧化。因此该结构可描述为6-去氯-6-溴-18-酮基台勾霉素B。D25=+13°(c=0.21,MeOH)，白色非晶体固体，mp 139-144℃,Rf=0.35。MW=1121(钠盐)。UV(MeOH):1max222nm(e 10300)、266(6800)；在酸性甲醇中，1max222nm(e 8800)、230(肩峰)(8500)、240(肩峰)、(8200)、316(肩峰)(5500)；在碱性甲醇中，1max206nm(e13600)、238(10800)、270(眉峰)(6700)、316(4600)。IRumax(CDCl3):3690、3608、2974、2931、2874、1705、1601、1457、1383、1376、1312、1251、1196、1162、1147、1136、1111、1068和1022cm-1。
实施例5化合物3的鉴定；式(Ⅰ)化合物，其中R1是氢和R2是C1-C4链烷酰基，R3是氢，R4是羟基，R5是溴和R6是氢确认化合物3的分子量为1064。在钠加成物质谱中观察的同位素分布图形提示化合物3含有一个溴原子而没有氯原子。在阳离子质谱m/z=403处观察到明显碎片峰表明相应一个溴原子的同位素分布图形。这类似于在台勾霉素质谱中观察到的糖碎片在m/z=393处的二氯同位素图形(下面C)。比较化合物1和3的质子和COSY谱显示两个化合物仅在其结构的芳环部分存在差异。特别是化合物3含有d6.35处的次甲基质子单峰信号，表明在HMQC实验中与d111.5处碳信号的一键偶合。相同的质子信号(d6.35)表明在HMBC实验中与d27.7处的8亚甲基碳信号以及在d98.0(Q)处和d107.6(Q)处的两个芳族碳信号的三键偶合。这些数据表明该质子一定是在化合物3的碳6上并确认结构为4,6-二去氯-4-溴代台勾霉素B。 D25=+3°(c=0.16，MeOH)，白色非晶体固体，mp 138-140℃，Rf=0.42。MW=1087(钠盐)。UV(MeOH):1max226nm(e6000)、266(3800)；在酸性甲醇中，1max226nm(e6700)、266(4200)；在碱性甲醇中，1max206nm(e7700)、236(6300)、278(肩峰)(3800)、304(3600)、312(肩峰)(3500)。IRumax(CDCl3):3690、3606、3501、2987、2935、2875、1731、1692、1653、1603、1570、1469、1456、1423、1386、1323、1312、1295、1256、1233、1187、1162、1116、1069、1022和789cm-1。
实施例6化合物4的鉴定；式(Ⅰ)化合物，其中R1是C1-C4的链烷酰基，R2是氢，R3是氢，R4是羟基，R5是溴和R6是氢化舍物4母体峰的分子量和同位素分布图形与具有分子量1064和一个溴原子作为唯一卤素的化合物3相一致。在化合物4的质谱中观察到具有表明单一溴原子的同位素图形的相同的m/z=403(5c)碎片峰。将化合物4的质子和COSY谱与台勾霉素C比较显示两个化合物仅在其结构的芳环部分存在差异。将化合物4的质子和COSY谱与化合物3比较，显示两个化合物中仅在连接C-11的糖部分存在差异。化合物4含有d6.39处的次甲基质子单峰，表明与d111.8碳信号的一键偶合。相同的质子信号(d6.39)表明与d31.0处8亚甲基碳信号的三键偶合。这些数据证明化合物4的结构为4,6-二去氯-4-溴代台勾霉素C。D25=-5°(c=0.42,MeOH)，白色非晶体固体，mp 143-150℃,Rf=0.30。MW=1087(钠盐)。UV(MeOH):1max226nm(e11500)、266(7600)、306(肩峰)(2300)；在酸性甲醇中，1max226nm(e11800)、266(7800)、306(肩峰)(2000)；在碱性甲醇中，1max204nm(e11500)、226(肩峰)(10400)、238(11800)、270(6500)、306(7200)。IRumax(CDCl3):3619、2976、2935、2895、1733、1700、1652、1646、1603、1447、1388、1371、1323、1311、125、1188、1160、1145、1114、1068和1047cm-1。
表1实施例3-6化合物的1HNMR测定从TMS向低磁场以ppm给出化学位移。偶合常数(J值)单位是Hz。
表1(续)<
<p>表1(续)
<p>实施例7体外测定抗菌素抗需氧和兼性细菌活性对于通过抑制所选需氧微生物初筛本发明化合物而言，经下列琼脂稀释法测定最小抑菌浓度(MICs)将系列稀释2倍的试验化合物加入脑心浸液琼脂中。每种试验菌株用每接种点约104个细菌接种在琼脂平板上。然后将接种的琼脂平板在37℃孵育约20小时。以抑制可见的生长的试验化合物最小浓度(mg/ml)作为测定的MICs。
对于通过抑制厌氧细菌如梭状芽孢杆菌属初筛本发明化合物而言，经下列琼脂稀释方法测定最小抑制浓度(MICs)将系列稀释2倍的试验化合物加入Wilkins-Chalgren琼脂中。每种试验菌株用每接种点约105个细菌接种琼脂平板上。然后将接种的琼脂平板在37℃孵育约48小时。以抑制可见的生长的试验化合物最小浓度(mg/ml)作为测定的MICs。
表2中所示的数据表明溴化的台勾霉素具有良好的抗梭状芽孢杆菌属菌株的活性，但对抗葡萄球菌属(Staphylococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的活性比台勾霉素B小。实施例3化合物6-去氯-6溴代台勾霉素B是本发明最有效的化合物，完全可与台勾霉素B相比。
表2所选菌种的MIC数据(μg/ml)
<p>表2(续)<
可理解的是前面的详细描述和相应的实施例仅仅作为说明并不对本发明范围构成限制，而仅被附带的权利要求书及其相当的内容所定义。对公开的实施方案的各种改化及修正对本领域技术人员而言显而易见，该改变和修正并不背离其意义和范围。
权利要求
1．具有下式的化合物
或其药学上可接受的前体药物，其中R1和R2独立选自氢和C1-C4链烷酰基；R3和R4选自(a)R3是氢和R4是羟基，(b)R3是羟基和R4是氢，(c)R3和R4一起为=O；或选自氢和羟基；和R5和R6独立选自氢、溴和氯，但须至少R5和R6之一必须是溴。
2．根据权利要求1的化合物，其中R1和R2之一是C1-C4链烷酰基，另一个是氢。
3．根据权利要求1的化合物，其中R5是溴和R6是氢。
4．根据权利要求1的化合物，其中R5是氯和R6是溴。
5．根据权利要求1的化合物，它选自具有根据权利要求1的结构的化合物，其中(a)R1是氢和R2是2-甲基丙酰基，R3是氢，R4是羟基，R5是氯和R6是溴；(b)R1是氢和R2是2-甲基丙酰基，R3和R4一起为=O,R5是氯和R6是溴；(c)R1是氢和R2是2-甲基丙酰基，R3是氢，R4是羟基，R5是溴和R6是氢；和(d)R1是2-甲基丙酰基和R2是氢，R3是氢，R4是羟基，R5是溴和R6是氢；或其药学上可接受的前体药物。
6．药用组合物包含治疗有效量的根据权利要求1的化合物与药学上可接受载体的组合。
7．药用组合物包含治疗有效量的根据权利要求5的化合物与药学上可接受载体的组合。
8．治疗需要此治疗的患者的细菌感染的方法，包括给予该患者治疗有效量的根据权利要求1的化合物。
9．治疗需要此治疗的患者的细菌感染的方法，包括给予该患者治疗有效量的根据权利要求5的化合物。
10．生产溴代台勾霉素化合物的方法，它包括培养属于桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum subsp,hamdenensis)种属、在富集溴化物的营养培养基中具有产生溴代台勾霉素化合物的能力并在所述的培养基中积聚溴代台勾霉素化合物的微生物。
11．权利要求10所述的方法，其中所述的微生物是桔橙指孢囊菌NRRL 18085。
12．权利要求11所述的方法，其中所述溴代台勾霉素从所述的培养基中分离出来。
13，权利要求11所述的方法，其中将所述的微生物在25℃-35℃温度下和pH 6-9及0.25-1.0％浓度的溴化物盐中培养。
14．权利要求13所述的方法，其中所述的溴化物盐浓度是0.48％。
全文摘要
具有式(Ⅰ)的抗微生物化合物,其中R
文档编号A61P31/04GK1225096SQ97196253
公开日1999年8月4日 申请日期1997年6月24日 优先权日1996年7月12日
发明者J·E·霍赫罗夫斯基, M·杰克逊, J·B·麦卡尔皮, R·R·拉斯穆森 申请人:艾博特公司