专利名称：用噻唑烷酮治疗和预防神经变性疾病的方法
技术领域：
本发明涉及通过给用噻唑烷酮治疗和预防神经变性疾病，如中风、头部创伤、多发性硬化和早老性痴呆的方法。
神经变性疾病在老龄人群中变得日趋普遍。最常见的神经变性疾病包括中风和头部创伤以及慢性疾病，如多发性硬化和早老性痴呆。已推测了导致多种这些疾病的各种原因，但没有确定神经变性本身的直接原因。例如，早老性痴呆，这种折磨上百万人且在老龄人群中变得日趋普遍的疾病在临床、遗传学、病理学和生物化学上为一种复杂的疾病。诊断是基于排除其它可能的痴呆原因，且在疾病的早期更为困难。患有早老性痴呆的病人表现出识别功能的逐渐丧失，开始时为看似良性的失忆最终导致涉及识别功能所有方面的严重痴呆。目前，仅有一种治疗方法被批准用于早老性痴呆的临床治疗，即乙酰胆碱酯酶抑制剂，然而，它们的临床效果多少是有限的。
我们现已发现神经变性疾病，如早老性痴呆、中风、头部创伤和多发性硬化可用噻唑烷酮，特别是已知化合物5-[[3,5-双-(1,1-二甲基乙基)-4-羟基苯基]亚甲基]-2-亚氨基-4-噻唑烷酮或其药物可接受的盐来进行治疗。该化合物描述在美国专利号5,143,928中。它抑制环加氧酶和5-脂氧化酶的活性，且可用作抗炎剂。本发明的一个目的是提供一种使用该化合物治疗和预防神经变性疾病的方法。
本发明提供一种治疗和预防神经变性疾病的方法，包括对需要治疗的病人给药有效量的5-[[3,5-双-(1,1-二甲基乙基)-4-羟基苯基]亚甲基]-2-亚氨基-4-噻唑烷酮或其药物接受的盐。优选的具体实施方案使用它的甲磺酸盐。还优选其Z几何异构体。另一个优选的具体实施方案为早老性痴呆疾病的预防或治疗。在另一个具体实施方案中，预防或治疗的神经变性疾病为多发性硬化，在另一个具体实施方案中，治疗的疾病为中风或头部损伤。
术语“噻唑烷酮”指上述具体化合物，其药物可接受的盐和其各种几何异物体。如被本文引作参考的美国专利号5,143,928所述制备和配制用于本发明方法中的噻唑烷酮。进行本发明方法所需的一切是对患有神经变性疾病或处于发展成这种疾病的危险中的以及需要治疗的个体给药有效量的噻唑烷酮。术语“有效量”指对不产生不可接受的不利副作用而对神经变性疾病产生积极的临床反应或预防该疾病所需的噻唑烷酮的剂量。虽然根据治疗疾病的严重性、各个病人以及医生的决定具体的剂量多少有些变化，但治疗和预防神经变性疾病通常有效的剂量为约0.5-约500mg噻唑烷酮/天治疗。通常使用的剂量范围为约1-50mg，每天给药1至约4次。优选的给药途经为口服，虽然胃肠外和经皮给药也可以考虑。控释制剂，尤其是皮肤贴片等形式尤其极为适用于治疗老年病人。
出于多种原因，用于本发明方法的噻唑烷酮很理想地适用。首先，它对胃肠道和肾相对温合，这使得长期给药成为可能。第二，它具有相对长的半衰期，从而使得能以较少给药次数进行有效治疗，这对于老年病人极其重要。第三，噻唑烷酮容易透过血-脑屏障，从而使得它特别适宜于治疗和预防影响脑功能的疾病。在许多确定其在治疗和预防神经变性疾病中的功效的生物系统中已评价了噻唑烷酮。下面详述的实施例说明一些用于确定噻唑烷酮功效的生物测定法。在下述所有实验中，采用的具体化合物为(Z)-5-[[3,5-双-(1,1-二甲基乙基)-4-羟基苯基]亚甲基]-2-亚氨基-4-噻唑烷酮甲磺酸盐，也称为CI-1004。
实例例1下面的试验证实了噻唑烷酮在改善由纹状体内注射神经毒素N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的动物神经变性中是有效的。
在出生后(PND)7天的雄性、雌性Sprague-Dawley大鼠幼仔(Charles River实验室，Portage，密执安州)中进行NMDA的纹状体内注射(15nmol/0.5μl)。将动物用乙醚麻醉，通过穿透皮肤从中线切割暴露颅盖。将大鼠幼仔放置在固定于小型动物立体定位仪(KopfInstruments)上的熟石膏模具中。将NNDA(Sigma)溶解在用1N NaON调至pH7.4的0.1M磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中。使用26号针Hamilton注射器将NMDA(15nmol/0.5μl)注射在纹状体正后方的中间(相对于Bregma的坐标；AP-2.0mm,ML2.5mm，距硬膜4.0mm的深度)。注射后将注射器原位放置2分钟以减少渗漏。在最后的药物或赋形剂注射后，在设置为35℃-36℃的热稳定控制环境(HovaBator小鸡孵化箱；BFG公司，Savannah，佐治亚州)中，术后将动物温度保持恒定1小时。用PBS配制药物溶液，并在纹状体内注射NMDA后15分钟和2.25小时进行腹膜内注射(0.05ml体积)。对照动物接受等体积的PBS。
手术后，让所有动物回到母亲身边达5天，出生后12天被断头。取出大脑，分离大脑半球，分别测定各半球的湿重。使用公式100×(C-I/C)=损伤百分数，比较各动物的半球重量的差异，其中该值说明相对于未注射的对侧(C)半球，被注射(I)的大脑半球损伤的严重性。保护百分数被用来说明与对照相比较，神经保护化合物的相对保护作用，并如此计算100×[1-(处理组损伤的百分数/对照组损伤的百分数)]。数据以所有组的平均损伤百分数±S.E.M.表示。独立t检验被用于统计比较。以前实验表明半球重量与胆碱乙酰转移酶活性降低和组织学检查的局部截面积的降低密切相关(α2=0.99,p＜0.001，线性回归)。同样的研究也表明纹状体内注射PBS不产生明显的损伤。
结果与给予腹膜内注射PBS的对照动物比较，注射至纹状体后方的NMDA(15nmol/0.5μl)同侧大脑半球湿重降低20.6±1.8％(N=10)。所有对照动物存活至出生后第12天。2×10和2×30mg/kg剂量的噻唑烷酮明显防止NMDA诱导的损伤(分别为28.1±9.2％和49±8.2％,p＜0.04和p＜0.001)。一只给了噻唑烷酮(2×30mg/kg)的动物没有活到出生后第12天。2×30mg/kg剂量的保护可与由2×30mg/kg消炎痛所提供的保护相比。
兴奋性氨基酸神经传递的过度活化，尤其是由NMDA受体所介导的活化，导致大量由大脑局部缺血产生的神经元损伤，如在中风或神经损伤之后发现的那些。因而噻唑烷酮改善NMDA诱导的损伤的发现，证实了它可用于治疗由于大脑局部缺血导致的神经元损伤。
实施例2在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的小鼠模型中评价了噻唑烷酮。将化合物经口服给药至用小鼠髓鞘碱性蛋白片段敏化以诱导EAE的小鼠中。使用相同方法和神经学评价进行两个实验。在第一天敏化之前4小时开始将试验动物给药21天。将噻唑烷酮的效果与同样敏化并仅给赋形剂的对照组小鼠进行比较。在停止药物处理后继续神经学评价。报导在下面表1和2中的值仅包括药物处理期间的反应。
药物制备和处理在玻璃研管和匀化研杆中用温热赋形剂的等分试样(含0.2％Tween80的0.5％羟丙基甲基纤维素的水溶液)手工搅匀噻唑烷酮，将细的药糊逐渐悬浮于赋形剂中。在十只一组(实验1)或二十只一组(实验2)中，以10mg/kg给予小鼠药物和/或赋形剂，从实验第1天至第21天对小鼠进行给药。对假敏化组类似地给药30mg/kg的赋形剂或噻唑烷酮(实验1)。
敏化作用在尾基部用包含等份小鼠髓鞘碱性蛋白(MBP)片段(MBP N末端的氨基酸1-9)的盐溶液和用加热杀死的干燥的结核分枝杆菌(MT)强化的Difco完全弗氏佐剂(CFA)的乳液经皮下敏化(0.05cc×2)来自Jockson实验室的品种为PL/J(F1)×SJL/J的雌性小鼠。每只小鼠接受300μgMBP传段(230μg游离碱)和200μgMT，接着从延髓后(静脉内)注射200μg副百日咳博德特氏菌毒素的0.2cc盐水溶液。48小时后，小鼠接受第二次副百日咳博德特氏菌毒素。实验1中的小鼠为8-9周龄；实验2中的小鼠为11周龄。
神经学评价将动物称重并在敏化之前评定EAE症状，通常为21天。EAE值0.5=尾轻微无力，1=尾无力或翻正慢，1.5=尾轻微无力且翻正慢，2=轻瘫/轻微瘫痪或不能自制，2.5=轻微瘫痪且翻正慢或完全瘫痪(一只后肢)，3=后肢瘫痪(两只)，3.5=后肢瘫痪(两只)和躯干无力，4=附加前肢瘫痪，4.5=仅有头运动，5=半死状态，在前面EAE症状之后死亡。评价者对于药物处理和前述行为记分一无所知。
在各组中比较疾病症状的EAE严重性、发生率、开始时间、累积值、死亡和重量损失。峰EAE值不依赖于症状的持续时间，一组中各小鼠最高值的平均值；EAE发生率显示EAE症状的小鼠的平均数，定义为在任何连续3天中具有总计≥3.0的EAE值。EAE死亡出现过前面EAE值大于0.5的表现的死亡动物；EAE开始第一个3天连续记录总计≥3.0。计算各只动物的累积EAE值。接着确定每天所有动物累积值的平均值。最大重量损失每组中各只动物最低重量的平均值。(注意累积EAE值和最大重量损失可由严重患病动物的死亡来反映。记录动物的天数也影响累积值且仅可“在试验中”进行比较)。从研究中除去死于给药外伤或不具有前面的EAE症状的小鼠。实验组被认为是相似的，并可用双尾t-检验比较统计显著性(p≤0.05)。
结果实验1如每日EAE值和神经学标准图谱所示(表1)，敏化的赋形剂对照组显示出强烈的EAE症状。对照组具有3/10EAE死亡，而用30mg/kg赋形剂或噻唑烷酮处理的假敏化小鼠组表现也很少的疾病症状且没有死亡(表1)。用3或10mg/kg噻唑烷酮处理的敏化小鼠在至第1天时没有显示出显著降低的EAE值(相对于赋形剂对照)(表1)，虽然10mg/kg组显示出每日EAE值的抑制趋势，发生率、累积EAE值和重量损失降低的趋势。
在≤第10天时，用30mg/kg噻唑烷酮处理的敏化小鼠三只死亡。在翻正反射缺陷是它们在以前显示的唯一症状(值=1.0)。用两种方法计算该组的数据，从实验中除去那些小鼠(A)特指EAE的死亡(n=9)和(B)特指非EAE相关的死亡。虽然仅在第15天见到统计学显著降低(p≤0.05)，但两种计算方法显示出从第10天至第21天减少每日EAE值的趋势。使用方法A计算时，虽然见到类似于10mg/kg组的抑制趋势，但在总的EAE症状上没有显著减少(表1)。使用方法B计算时，在峰EAE值及重量损失上有显著降低(表1)。
实验2用三个更大组的用(1)赋形剂(2)10mg/kg噻唑烷酮，或(3)30mg/kg噻唑烷酮处理的敏化小鼠重复前面的实验。虽然按更为严格全面神经学标准，第13天至第19天的每日EAE值稍高，第20天至第52天有较少降低，但敏化的赋形剂对照组中EAE的开始类似于实验1(表1与表2比较)。
噻唑烷酮在10或30mg/kg剂量下对每日EAE值或总的EAE反应(峰值、发生率、开始、死亡、累积值或重量损失)没有影响(表2)。在所有组中的死亡之前有EAE症状。
EAE模型产生相似于在多发性硬化中所见到的综合症。噻唑烷酮产生的数据说明它减轻一些EAE神经学症状并因此可用来治疗患有多发性硬化的病人。
表1．小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)<
>a由于EAE的死亡b由于未知原因的死亡；从计算中除去该值。
表2.小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)
实施例3对噻唑烷酮的其它试验证实它抑制脂多糖刺激的小胶质细胞和混合的皮质细胞培养物中的氧化氮合成酶活性。氧化氮产生的减少是抑制氧化氮合成酶的诱导的结果，是噻唑烷酮减少对脑组织损伤的进一步证据。
让BV-2小胶质细胞生长在6孔组织培养平板中的补充有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中。活化之前，对细胞提供包含各种量的噻唑烷酮的新鲜培养基。药物处理后1小时，将小胶质细胞用脂多糖(LPS,4μg/ml)活化，并置于37℃含5％CO2气氛的培养箱中。16小时后，评价培养物的可诱导的氧化氮合成酶(iNOS)的活性和表达。用格里斯(Griess)反应测定iNOS活性。将无细胞培养基与等体积的格里斯试剂(1体积的1.0％磺胺的5％磷酸溶液与1体积的0.1％萘二胺二盐酸盐的水溶液混合)混合并在室温下保温5分钟。560nm下测定吸光度并使用亚硝酸钠作为标准测定样品中的浓度。通过提取细胞蛋白并使用对iNOS特异性的单克隆抗体进行蛋白质印迹分析来测定iNOS的表达。
结果表明在活化的BV-2小胶质细胞中噻唑烷酮抑制氧化氮的产生，其中IC50为2.4μM。用蛋白质印迹分析进行的iNOS酶的测定表明所观测到的活性的降低与蛋白质表达的降低相关。总之，这些数据证实噻唑烷酮可防止活化的胶质细胞中的iNOS的表达，从而减少由这些细胞释放的神经毒性氧化氮的量。
如上所述进行使用混合皮质细胞培养物的实验。如实施例4所述收集并培养细胞，并将其培养在6孔平板中。在这些实验中，噻唑烷酮(10μM)也防止与培养物中的LPS活化相关的氧化氮合成酶活性的增加。当非LPS活化的培养物用噻唑烷酮处理时，还观察到背景NO产生的显著减少。该NO产生的减少被认为是由于在这些培养物中与正常胶质细胞活化相关的iNOS表达的抑制。这进一步说明了噻唑烷酮在降低与神经炎症相关的神经毒性中的有用性。
实施例4噻唑烷酮也阻断细胞因子IL-1β的产生以及ICAM-1和E-选择蛋白的细胞表面表达。在体外，该化合物还提供抗氧和葡萄糖缺失的保护。
可通过降低皮质神经元培养基中的氧和葡萄糖来建立体外大脑局部缺血模型。对于该实验，在实验的第18天从Sprague-Dawley胎鼠脑中分离大脑神经元。将大脑半球切片，解离并在包含0.1％胰蛋白酶的Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中研磨。通过加入1∶1的补充有热灭活的10％马血清和6％胎牛血清的Dulbecoo氏改进Eagles培养基(DME)和Ham氏营养混合物F-12(F12)将细胞浓度调至620,000细胞/mL。将细胞悬液的100μl等分试样吸至96孔聚乙烯亚胺覆盖的培养平板的各孔中。置于37℃、8％CO2气氛的培养箱中4天后，从各孔中吸出100μl培养基并用100μl含10％马血清的DME/F12替代，其中向DME/F12中加入了30μg/mL5-氟-2-脱氧尿嘧啶和70μg/mL尿嘧啶以防止胶质细胞的进一步分裂。此后每2-3天用DME/F12(10％马血清)替换一半体积(100μl)来对培养物进行研究。
将50μlHBSS中的细胞置于低氧/低糖环境(91％N2/8％CO2/1％O2,1mM葡萄糖，37℃)中不同的时间。接着将培养物返回到含量氧量正常的培养箱中(21％O2/8％CO2,25mM葡萄糖)，24小时后通过测定细胞内乳酸脱氢酶(LDH)进行细胞死亡的定量分析。在低氧/低糖诱导之前，将细胞暴露于噻唑烷酮或其它药物中达1小时。1μM噻唑烷酮的浓度没有影响，但10μM明显提高低氧/低糖致细胞丧失存活力的时间。例如，4小时暴露在低氧/低血糖中杀死对照条件下的约50％的神经元，但在用10μM噻唑烷酮处理的细胞中这种暴露不产生神经元死亡。用100μM消炎痛见到类似效果。这些结果与在该模型系统中用NMDA拮抗剂见到的那些类似。由于在血管阻塞或创伤之后在脑中发生类似情况，因此这些结果证实噻唑烷酮可用于治疗由于大脑局部缺血导致的神经疾病。
实施例5在下面试验中，噻唑烷酮显示出降低狗软脑脊膜平滑肌细胞中的神经变性从新获得的老龄狗脑脊膜中分离狗平滑肌细胞。各狗在前面作为毒理学研究中的赋形剂对照，并用过量的巴比妥人为杀死。老龄狗患有与人类疾病相似的血管病。平滑肌细胞是在荷兰类型的早老性痴呆中发生的大脑血管肌病的位点。对这些细胞的损害最终导致脑血管损伤以及一些人的死亡。
解离来自脑脊膜的细胞并在用于生化研究或转移至未覆盖的显微镜载玻片上以用于形态学研究之前，置于组织培养平板中的含10％胎牛血清和含抗生素的Dulbecco氏最低基本培养基中培养约1周。这些平滑肌细胞代表脑血管细胞且它们可多次传代。为了诱导细胞毒性，在无血清培养基中将细胞用10-20μM的42个氨基酸长的淀粉样β-肽处理。该肽相应于人β-肽序列。使用前即刻将该肽溶于水中。该少量蛋白被认为是在死于早老性痴呆的病人脑的死后尸体解剖样品中观察到的蛋白的大致浓度。
如用双苯并咪唑(bisbenzimide,Hoechst 33258)将细胞核染色所证实，用人蛋白序列处理平滑肌细胞显示出在一周期间凋亡性杀死70％-85％平滑肌细胞。死亡细胞具有凝聚和断裂的细胞核。通过荧光显微镜用五次独立测定计数三个视野中的正常和凋亡核来确定百分数。由于如硫黄素S染色和荧光显微镜所测定，被判定为正常的细胞具有很少的淀粉样蛋白积累，因此注意到一些空间依赖性。建立统计显著性细胞毒性的最早时间为24小时。
将噻唑烷酮(20-30μM,5％DMSO/水中，v/v)加入培养基中并在37℃下将培养基放置24小时。噻唑烷酮表现出明显降低由淀粉样蛋白诱导的细胞死亡。仅用赋形剂处理培养物不改变淀粉样蛋白的细胞毒性。通过降低细胞的淀粉样蛋白的积累这一事实进一步证实了CI-1004的保护作用，因此，说明噻唑烷酮或者减少淀粉样蛋白的细胞受体或导致淀粉样受体的消散。
前面的生物学数据证明噻唑烷酮可用于治疗和预防急性和慢性神经变性疾病。因此，该化合物尤其适宜于治疗和预防中风、头部创伤、多发性硬化和早老性痴呆。
如上所述，由于其长的作用持续时间及基本不具有不希望的副作用，噻唑烷酮尤其适宜于治疗老龄病人。在小鼠和大鼠的单剂口服和静脉(Ⅳ)研究和大鼠和狗的多剂量的口服研究中评价了噻唑烷酮的毒理学性质。在狗和猴中测试了噻唑烷酮的递增剂量的口服毒性以确定最敏感的非啮齿类动物种类。在初始13周的狗试验中观察到脑中血管周围的单核细胞渗液后，在猴中进行多剂量的研究以确定在其它非啮齿类动物种类中是否产生类似效果。重复初始的13周狗试验以评价血管周围效果的可重现性。在怀孕大鼠和兔中进行寻找剂量范围的研究，并在体外和体内评价基因毒性潜力。这些研究结果证实噻唑烷酮的毒理学性质类似于NSAIDS，研究的种类以类似的定性和定量方式相对应。在大鼠和狗中见到与显著的器官毒性不相关的特征性的NSAID类型的肝脏酶的诱导。在确定的13周研究中观察到大鼠和狗中的与非类固醇抗炎药物相关的胃肠作用及大鼠中小的肾脏作用。在处理13周的猴中未观察到典型的NSAID相关变化。在13周的对猴研究中，观察到显微镜证实的表面回盲肠侵蚀，但由于其发生率和严重性与剂量或全身性暴露不相关，因此这些病变不是由药物引起的。根据在规定研究中为无作用剂量的暴露，大鼠看来是最敏感的种类，接着是狗和猴子，虽然种类之间具有小的暴露差异。分别与0.97μg/mL Cmax和16.5μg·小时/mL AUC(0-24)相关，在给予10mg/kg的雄性大鼠中没有观察到效应。10mg/Kg时在雌性大鼠中见到对肾脏的作用，但Cmax和AUC约为在相同剂量的雄性大鼠中的两倍。这些数据证明噻唑烷酮极适宜于治疗各种患者，尤其是患有例如早老性痴呆的神经变性疾病的老年病人。
噻唑烷酮可与用于常规胃肠外、经皮以及口服给药的常规赋形剂一起配制。优选的治疗方法采用口服给药。下面实施例6说明极适宜于对病人给药以预防神经变性疾病的典型胶囊制剂的制备，如治疗中风和头部创伤，以及治疗患有例如早老性痴呆和多发性硬化的神经变性疾病的病人。
实施例6
a用于生产粉末混合物，但在干燥工序中被除去。水不出现在最终产品中。
将各成分混合均匀，干燥并充填至明胶胶囊中，用于每天口服1至4次以有效预防和治疗神经变性疾病。
权利要求
1．一种治疗和预防神经变性疾病的方法，包括对需要治疗的病人给药有效量的5-〔〔3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基苯基〕亚甲基〕-2-亚氨基-4-噻唑烷酮或其药物可接受的盐。
2．权利要求1的方法，其中采用的化合物为甲磺酸盐形式。
3．权利要求2的方法，其中采用的化合物为(Z)-5-〔〔3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基苯基〕亚甲基〕-2-亚氨基-4-噻唑烷酮甲磺酸盐。
4．权利要求1的方法，其中治疗的疾病为早老性痴呆。
5．权利要求1的方法，其中治疗的疾病为多发性硬化。
6．权利要求1的方法，其中治疗的疾病为中风。
7．权利要求1的方法，其中治疗的疾病为头部创伤。
全文摘要
用5－[[3,5－双(1,1－二甲基乙基)－4－羟基苯基]亚甲基]－2－亚氨基－4－噻唑烷酮或其药物可接受的盐治疗和预防神经变性疾病,如早老性痴呆、中风、多发性硬化和头部创伤。
文档编号A61P25/00GK1223582SQ97196042
公开日1999年7月21日 申请日期1997年7月1日 优先权日1996年7月11日
发明者R·T·卡罗尔, R·D·狄尔, L·J·罗比查德, B·D·R·施沃斯 申请人:沃尼尔·朗伯公司