专利名称：截短侧耳素衍生物在兽药中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及截短侧耳素衍生物。本发明涉及式1化合物即14-O-[1-(R)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-2-甲基丙-2-基硫代乙酰基]截短侧耳素(multilin)以游离碱或兽药可接受盐的形式在治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病中的兽药用途，以下简称为“本发明的用途”。
式1化合物的游离碱或兽药可接受盐(Econor)下文简称为“本发明的活性剂”。它优选指化合物的盐尤其是盐酸盐。其盐酸盐的通用名为valnemulin盐酸盐。
术语“治疗”应理解为预防治疗和祛病治疗。
在例如欧洲专利153277和其同族专利例如USP4675330中特别在其实施例12中描述了式1化合物的游离碱或化学治疗或兽药可接受盐。
从其中进一步得知，-在约0.008-25μg/ml浓度时在体外抑制不同细菌的活性；-在约0.008-0.5μg/ml浓度时在体外抑制支原体属和衣原体属细菌的活性；-以约12-50mg/kg体重剂量给药时在小鼠体内抑制不同细菌菌株和在母鸡体内抑制支原体属菌株的活性；-以约20-150mg/kg剂量喂食给药时抗-寄生虫尤其是在家禽体内抗球虫类寄生虫的活性；-以约10-50mg/kg剂量喂食给药时在母鸡和猪体内促进生长的活性，因此此化合物通常可以用作具有抗菌活性的抗生素、兽药用活性剂，尤其是治疗家禽球虫病的化学治疗剂和母鸡、猪的生长促进剂。
现在已经惊奇地发现，本发明的活性剂在治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病方面特别有效，例如由猪肺炎支原体感染引起的猪地方性肺炎、由猪痢疾小蛇菌(从前称为密螺旋体)感染引起的猪痢疾、与Serpulina(小蛇菌属)Pilosicoli感染有关的猪结肠炎(结肠发炎)、与Lawsonia(散末花属)intracellularis感染有关的猪回肠炎(猪增生性肠病；猪肠内腺上皮增生)、与鸡败血支原体感染有关的家禽慢性呼吸疾病和关节炎、与出血败血性巴斯德氏菌、大叶性肺炎嗜血杆菌放线杆菌(嗜血杆菌属)和/或副猪嗜血菌感染有关的猪继发性肺炎、与溶血巴斯德氏菌感染有关羔羊、绵羊和牛肺炎(船热、Transit Fever、小牛呼吸综合征、牛巴斯德氏菌肺炎)和与猪关节液支原体感染有关的猪多关节炎。
更另人惊奇的是，本发明发现细菌对此药物的抗药性非常低。
因此本发明涉及如上面所述的兽药用途。
本发明也涉及本发明的活性剂在制造被用来治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病的药物中的用途。
本发明进一步涉及一种治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病的方法，包括将本发明的活性剂以有效治疗剂量对需要治疗的动物给药。
本发明进一步涉及一种治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病的兽药用制剂，包括式1化合物的游离碱或兽药可接受盐与至少一种兽药可接受载体或稀释剂。
本发明进一步涉及一种制备具有如上所述用途的药物的方法，包括将本发明的活性剂与至少一种兽药可接受载体或稀释剂混合。
患有随着饲养密度加大而更易爆发的兽病的动物可能例如还没有用本发明的活性剂进行抗菌治疗或没有用本发明的活性剂来促进生长。A)猪肺炎支原体感染猪肺炎支原体感染可以用常规方法诊断，例如在兽医手册如Taylor,D.J.，在猪疾病(Pig Diseases),6th Ed.(1995),Publ.D.J.Taylor,Glasgow,U.K.164-165页中所描述的方法。本发明的活性剂对于此用途有益的活性确定如下1．体外活性本试验包括从暴发地方性肺炎的不同兽群中分离到的10个野生株(field strain)和典型菌株“J”。将分离物过滤-克隆，用平板生长抑制试验鉴定，在第7到第10个子代中使用。测定最低抑菌浓度(MIC)的试验在液体培养基(Friis,N.F.等人,Acta Vet.Scand.32425-429)中进行，培养基在1.8ml试管中，含有2倍浓度的valnemulin和硫粘菌素延胡索酸氢盐。将支原体接种在10倍稀释液中，在接种有102-104成色单位的试管中用肉眼读取培养物中细菌的生长。初次读取在2-4天后进行，最后一次读取在10-14天后当进一步的颜色变化不再发生时进行。MIC被确定为试验中的化合物与对照组相比呈现出抑制生长的作用的最低浓度(Friis,N.F.和Szancer,J.,Acta Vet.Scand.35 389-394)。试验结果呈现在表1中
表1MIC(μg/ml)<
>*含有典型菌株ch=盐酸盐hfu=延胡索酸氢盐在最初和最后的读取中，试验中所有的猪肺炎支原体菌株对Valnemulin都高度敏感，MIC值比硫粘菌素低10-40倍，使得此化合物特别适于在受感染兽群中治疗这种兽病。2．体外活性在感染猪地方性肺炎(EPP)的不同兽群中，从猪的肺部取得组织样本。样本放置于干冰中保存。通过在支原体试验琼脂中直接培养而使猪肺炎支原体从新鲜的切开的肺组织中活化。这种从其他能快速生长的支原体菌种例如经常在EPP肺样本中存在的猪鼻支原体中克隆的技术使猪肺炎支原体菌落能被识别并且能被迅速分离。将分离物再次培养并用平板生长抑制试验鉴定，生长抑制试验使用接种过猪肺炎支原体NCTC10110的兔子的特异抗血清。
用来抗菌接种的培养物在支原体试验肉汤中制备，在有氧、36℃条件下培养。
一种商业上可获得的固体介质(支原体试验有限公司)被用来从肺组织中分离猪肺炎支原体。一种含有酚红和葡萄糖的液体介质(支原体试验有限公司)被用来做MIC测定。
试验化合物的储备溶液用去离子水制备成1mg/ml的浓度，通过0.2μ孔径的过滤膜(Sartorius Minisart,N)进行过滤灭菌，-20℃下贮存。在MIC测定试验中，此储备溶液在液体介质中稀释以达到所要求的最终浓度的2倍。MIC测定试验依据Tanner&Wu,Avian Diseases 36(1992)714-717中描述的方法进行。能积极生长的接种培养物从1ml贮存在-70℃的等分试样的肉汤培养基中或从在-70℃贮存在琼脂上的培养基中制备。这种接种培养物被稀释到滴定指标为103-105变色单位/ml。0.1ml等分试样的接种物与0.1ml等分试样的抗菌素稀释液在微滴定孔中混合。每个微滴定板含有pH为6.8的未接种介质(猪肺炎支原体)(终点对照组)和不含有抗菌素的接种对照组。所有的培养皿用胶粘膜密封并在有氧条件、36℃条件下培养。当接种对照组中的颜色改变与终点对照组中pH值相匹配时，记录MICs。MIC是不呈现出任何颜色改变的最低浓度。
Valnemulin和两个参照化合物硫粘菌素和enrofloxacin的试验结果呈现在表2中表2猪肺炎支原体的10个野生株分离物的体外敏感度<
>所有的菌株对Valnemulin都高度敏感。大多数菌株对enrofloxacin表现出了很好的敏感性，但对于个别菌株，valnemulin的MIC至少低5倍，甚至对enrofloxacin敏感性达到0.0025μg/ml的菌株也是如此。这些结果证实了野生株分离物对valnemulin极度敏感。3．抗药性的形成猪肺炎支原体参照菌株NCTC10110(从英国伦敦国家典型培养物保藏中心中得到的，)和一种最近得到的野生株分离物(MEVT G23)在含有酚红的支原体葡萄糖肉汤培养基中在有氧、36℃条件下培养直到酸变色发生为止。加入无菌甘油(5％v/v)后，将培养物分成1ml等分试样，然后在-70℃下冷冻。这些培养物被用来启动进一步的肉汤培养物，这些肉汤培养物培养(36℃)后在微量滴定板中通过滴定来测得变色单位(ccu)的数量。在最低抑制浓度(MIC)测定试验和在第一子代中进行的习惯性研究中，细菌复制使抗菌素稀释液可以用数量已经预先确定的ccu接种。
一种含有葡萄糖和酚红(MEGB)的商业上可获得的介质(支原体试验有限公司)在pH为7.6条件下使用。
试验化合物的储备溶液用去离子水制备成1000μg/ml的浓度。涡动搅拌后，通过0.2μ孔径的过滤膜(Sartorius Minisart,N)进行过滤灭菌。在MIC测定试验中，此储备溶液在液体介质中稀释以达到所要求的最终浓度的2倍。在习惯性试验中，将此储备溶液分成1ml等分试样，然后在-20℃冷冻。它们融化后在5-7天时间间隔内使用以制备在MEGB、1.9ml等分试样中不同浓度的药物(双重系列)，其中覆盖了抑制猪肺炎支原体两个菌株的MIC。在每一次试验中都制备新鲜的土霉素盐酸盐。稀释程度在子代之间逐渐改变以使支原体能形成抗药性。试验过程在进行习惯性研究(如下面所述)之前，依据Tanner&Wu,AvianDiseases 36(1992)714-717中描述的方法进行MIC测定试验，在第10子代后，将0.1ml等分试样的化合物稀释液与0.1ml等分试样的接种物混合，其中含有103-105变色单位(ccu)/ml，在微滴定孔中进行。每个微量滴定板含有pH为6.8的未接种介质(终点对照)和不含有药物的接种对照组。所有的平板被密封并在有氧条件、36℃条件下培养。当接种对照组中的颜色改变与pH6.8对照组(橙黄色)相匹配时，记录MIC。MIC是不呈现出任何颜色改变的最低浓度。习惯性研究在第1子代试验中，将0.1ml含有103-105ccu/ml的肉汤培养物接种入1.9ml抗菌素溶液中，其中抗菌素溶液的浓度覆盖了试验中抑制猪肺炎支原体的MIC。在每一子代试验中包括由不含有药物、接种有猪肺炎支原体的肉汤构成的生长对照组和没有接种的介质对照组。培养(36℃)7天后，将两个表现出酸变色的含有药物的最高浓度的肉汤倾出，用于接种一系列新鲜的在支原体肉汤中的药物稀释物(0.1ml培养物接种入1.9ml含有药物的肉汤中)。这个过程每5-7天重复1次直到第10个子代为止。当支原体菌株对某些特定的抗菌素形成抗药性或在第10个子代时，将每个菌株在含有药物的肉汤中再生长一次并测定MIC。结果猪肺炎支原体“J”菌株和一个野生株分离物在接触抗菌素前和接触抗菌素后的MIC呈现在表3中
表3猪肺炎支原体的两种菌株在体外形成的抗药性
1)体外传代级别2)在含有泰乐菌素的支原体肉汤中8个子代以后的MIC结果发现在与抗菌素接触前两种菌株对valnemulin都高度敏感，其中参照菌株的MIC为0.0025μg/ml，野生株分离物MIC为0.001μg/ml。valnemulin在各级子代细菌中的抑菌活性比泰乐菌素和土霉素要高50-100倍。这些MIC结果被用来在习惯性研究中选择药物的稀释范围。
在10个与valnemulin接触的循环过程以后，猪肺炎支原体的两种菌株形成的抗药性最低，参照菌株的MIC从0.0025μg/ml增加到0.005μg/ml，野生株分离物的MIC从0.001μg/ml增加到0.0025μg/ml。与之相反的是，猪肺炎支原体的两种菌株对泰乐菌素酒石酸盐都形成了明显的抗药性。在含有泰乐菌素的肉汤中，对照菌株在4-5个子代内开始形成抗药性，到第8子代时MIC已经增加到＞500μg/ml，反映出对泰乐菌素的抗药性增加了＞2000倍(表3)。野生株分离物在8个子代内对泰乐菌素形成了明显的抗药性，MIC增加了500倍达到62.5μg/ml。在含有泰乐菌素的肉汤培养基中，经过10-11个子代后，抗药性仍保持这种程度。在与土霉素接触的10个循环过程中，猪肺炎支原体的两种菌株对土霉素的抗药性增加了4倍，MIC从0.25μg/ml增加到1μg/ml。
这些结果表明与泰乐菌素或土霉素相比，valnemulin对猪肺炎支原体的抑菌作用要强很多，并且在猪肺炎支原体菌株中不诱导明显的自身抗药性。4．体内防治实验-诱导的地方性肺炎使用一种地方性肺炎实验模型来评价valnemulin防治这种疾病的潜能，这种实验模型是使用最初从猪肺炎支原体感染的限菌饲养的猪中取得然后进行传代的肺组织。进行3个试验试验1和2是使用猪肺炎支原体的标准接种菌株来进行本发明的化合物的剂量效价研究，试验3是测定此化合物以200ppm剂量对猪喂食给药时化合物抑制二次接种菌株的效力。试验使用没有感染猪肺炎支原体的、大的、6-7星期大小的、白色的Landrace雄猪。接种材料是含有猪肺炎支原体的肺组织，以匀浆形式在鼻内连续接种3天。valnemulin对存在于在试验1和2中使用的接种材料中菌株的最低抑制浓度(MIC)是0.016μg/ml，对从在试验3中使用的接种材料中分离出的菌株的MIC是0.0078μg/ml。接种材料最初从感染有猪肺炎支原体的限菌饲养的猪中取得，然后在SPF(特异的不含有病原体的)猪中传代并且已经在-70℃保存过。试验1将valnemulin盐酸盐通过胃管(管饲法)以0(对照组)、2.5、5、7.5或10mg/kg体重/天的剂量对猪给药，每天给药1次。每组中有6头猪。试验2将valnemulin盐酸盐以0、100、200、300或400ppm的剂量(等于0、5、10、15和20mg/kg/天)通过喂食对猪给药。每组中有6头猪。试验3将valnemulin盐酸盐以0或200ppm的剂量(等于0和10mg/kg/天)通过喂食对猪给药。每组中有8头猪。给药从接种感染猪肺炎支原体的第1天开始直到感染约3周后进行猪死后检查为止。通过定量测定猪肺部的损害[剑桥肺损害比计算方式(Goodwin,R.F.W.和Whittlestone,P.,J.Hyg.69391-397)，其中评分是用肺部受肺炎影响的近似百分比来表示]和估计肺-体重的比例以及从肺中分离的猪肺炎支原体的量来确定疾病的程度。试验结果呈现在表4中表4
1)valnemulin盐酸盐抑制从接种材料中分离的猪肺炎支原体的MIC，以μg/ml表示2)每头猪每天valnemulin盐酸盐的大约给药剂量在试验1中，没有给药治疗的、感染细菌的猪平均肺损害分数是13.2。Valnemulin以7.5和10mg/kg/天剂量给药时，能将肺损害分别降低71％和87％，当以2.5和5mg/kg/天剂量给药时，其对降低肺损害有较小的效果。与以2.5mg/kg剂量给药治疗的猪相比，在以10mg/kg剂量给药治疗的猪中又一次分离出猪肺炎支原体的猪要少(4头猪中有一头)。
在试验2中，没有给药治疗的、感染细菌的猪平均肺损害分数是22.1。在Valnemulin以200、300或400ppm剂量给药治疗的猪中，肺损害分别降低了46％、43％和71％。能反映总体损害与微观损害的肺重量呈现出更明显的效果，在以低至200ppm剂量给药时肺重量明显降低。在以100ppm剂量给药valnemulin的猪中没有发现肺损害降低。在死后检查中，从所有未给药治疗的猪中又一次分离出了猪肺炎支原体，但在以400ppm或300ppm剂量给药的猪中没有分离出猪肺炎支原体。以200ppm或100ppm剂量给药的猪分别有3头和4头又一次分离出猪肺炎支原体。
在试验3中，没有给药治疗的、感染细菌的猪平均肺损害分数是10.8。在以200ppm剂量喂食给药的猪中，肺损害降低了79％。在死后检查中，给药和没有给药的猪中检测到的猪肺炎支原体的水平没有不同。
从各组试验中证明了valnemulin对于防治实验-诱导的猪地方性肺炎是有效的，试验使用的是含有猪肺炎支原体两个不同菌株的接种材料。
因此本发明的活性剂能有效地治疗由猪肺炎支原体感染引起的猪地方性肺炎。在使用时，活性剂的有效剂量当然将依据所使用的特定的盐、给药方式、猪的大小和年龄以及所希望达到的治疗效果的不同而不同；例如对于预防治疗，将以相对较低的剂量长时间给药。然而，当活性剂每天以大约5-15mg/kg动物体重的剂量，适当地分为2-4次/每天或以持续释放的形式给药时通常能得到满意的效果。对于大多数猪每天总的给药剂量约为100mg-1000mg，优选约100mg-500mg，每天给药1次或2次。
此活性剂单独给药治疗可能是有利的。
在饮用水中优选的剂量是0.01-0.05％重量体积比，特别优选0.01-0.025％，在饲料中优选100-400ppm(g/公吨)，特别优选100-200ppm(g/公吨)。B)猪痢疾小蛇菌感染猪痢疾小蛇菌感染可以用常规方法诊断，例如在兽医手册如Taylor,D.J.,在Pig Diseases,6th Ed.(1995),Publ.D.J.Taylor,Glasgow，英国，143-144页中所描述的方法。本发明的活性剂对于此用途有益的活性确定如下1．MIC的测定本试验包括从爆发猪痢疾的猪群中得到猪痢疾小蛇菌的9个野生株分离物，和典型菌株ATCC31212与ATCC29796(无害小蛇菌，族3)(Fellstrom,C.,Res.Vet.Sci.591-4)。鉴定试验是基于在含有5％牛血的TSA(Tryticase大豆琼脂)上的溶血模型与吲哚生成和马尿酸盐水解(Rosco诊断药片，Taastrup,丹麦)的测定。在10μl每种分离物与2倍浓度的valnemulin盐酸盐、硫粘菌素延胡索酸氢盐、二甲唑、林可霉素盐酸盐和泰乐菌素一起接种到琼脂培养皿之前，将细菌从琼脂培养皿中转移到0.9％生理盐水中，用McFarland仪将浊度调到1.0。在缺氧条件下培养4天后记录细菌的生长和溶血，MIC确定为螺旋体不再生长时抗菌素的最低浓度。
猪痢疾小蛇菌的MIC的测定结果如表5所示
表510个猪痢疾小蛇菌株的最低抑制浓度(MIC)
所有的猪痢疾小蛇菌株对valnemulin都高度敏感，其MIC值比硫粘菌素低2-32倍。猪痢疾小蛇菌株对valnemulin的高度敏感性使得此化合物适于在受感染兽群中治疗这种临床病。2．MIC的测定使用琼脂稀释法测定从猪粪便中分离的10个猪痢疾小蛇菌株的最低抑制浓度(MIC)。在所有的MIC测定试验中使用NCTC(国家典型培养物保藏中心)菌株或参照菌株作为对照。猪痢疾小蛇菌的琼脂培养基含BAB2(Unipath CM271)，BAB2中含有7％全部去纤维蛋白的、无菌的绵羊血。所有的抗菌素在两倍稀释液中测定。在将制备的抗菌素稀释液加入到适当体积的MH琼脂中之前，先将稀释液冷却到50℃，混和并倒入20ml。所有的猪痢疾小蛇菌培养都在37℃(+/-0.5℃)、能提供包含80％N2、10％H2和10％CO2的严格的缺氧气体的缺氧工作状态下(Don Whitley Scientific)进行。其他所有培养都在37℃进行。所有菌株在37℃、有氧空气中培养24小时。用MH肉汤作为空白，将细菌数量调节到合适的密度(OD)，该OD等同于1×108菌落形成单位(cfu)/ml。将含有抗菌素的培养皿用多点接种器(Denley仪器)接种一式二份，接种器能接种约1μl的培养皿接种物，对于所有菌株每点接种物中的细菌数量是104-105cfu/斑点(Amon,J.Antimicrob.Chemother.21701-710；Ericsson等人,Acta Pathol.Microbiol.et lmmunol.Scand.217(B)Suppl.,1-90)。对照培养皿与测定培养皿在相同条件下培养。24和48小时后读取MIC，最后读取的MIC是确定值。MIC是不考虑个别的落菌或由接种物引起的微弱模糊的菌落时当细菌不再生长时抗菌素的最低抑制浓度(国家委员会的临床实验标准，抗菌素敏感性测定，NCCLC公布SC3,Villanova,PA，美国)。
抑制猪痢疾小蛇菌的MIC(μl/ml)是valnemulin(0.1)、硫粘菌素(0.3)、林可霉素(50.0)、泰乐菌素(200.0)和二甲唑(30.0)。猪痢疾小蛇菌的所有菌株对valnemulin都敏感，在测定的抗菌素中valnemulin的抑菌能力最强，比其他抗菌素要强3-600倍。3．接种试验进行两个试验比较以不同剂量水平对猪喂食给药的valnemulin与硫粘菌素防治猪痢疾的效果。兽病的严重程度根据其临床表现来评价，临床表现是由对动物的身体状况、粪便的稠度和组成进行临床评分来确定的。粪便中猪痢疾小蛇菌的分泌物、死后检查中身体损伤程度、生长速度和食物转化比例也在试验中测定。
在第一个试验中，比较valnemulin盐酸盐以20、30和40ppm剂量喂食给药的治疗组与硫粘菌素延胡索酸氢盐以30ppm剂量喂食给药的治疗组以及未给药的对照组的治疗效果。5组中每组使用9头(5-6个星期大小)用常规手段饲养的猪。试验猪先用不含有治疗剂的食物喂养14天，然后用标准猪痢疾小蛇菌株(P18A)接种。采用口服途径连续2天接种。含有治疗剂的食物在第二次接种后给与。在第二个试验中，除了使用4组每组约有9头猪以外，其他试验过程与第一个试验一样。比较valnemulin盐酸盐以5、10和20ppm剂量喂食给药的治疗组与未给药的对照组的治疗效果。在此试验中，试验猪取自室外饲养的猪群，用从室外饲养的猪群中分离到的被证明能引起猪痢疾的猪痢疾小蛇菌株接种。在两个试验中，每天测定兽病的临床表现并进行临床评分，每周进行两次直肠拭抹以分离猪痢疾小蛇菌，所有的猪定期称重。食物摄取量也记录下来。接种21天后进行死后检查并检查大肠内的病变。在大肠的4个区域进行粘膜刮除并培养猪痢疾小蛇菌。
在第一个试验中，在没有给药治疗的对照组中接种8天后发现了猪痢疾的临床表现并且9头猪中有8头致病。在valnemulin以30ppm剂量喂食给药的治疗组中9头猪有1头、在硫粘菌素治疗组中9头猪有2头被发现有猪痢疾的临床表现。在valnemulin以20和40ppm剂量喂食给药的治疗组中没有发现猪痢疾的临床表现。在对照组中记录的每头猪的临床评分是36，硫粘菌素治疗组是6。所有的治疗组记录的评分间的差异与对照组之间是有统计学差异的(p＜0.001)。在对照组所有的猪和硫粘菌素治疗组2头致病的猪中进行的直肠拭抹都分离出了猪痢疾小蛇菌。猪痢疾小蛇菌也从valnemulin以30ppm剂量喂食给药的治疗组的2头猪中分离出来，这与本组中偶发感染后观察到的猪痢疾临床症状相符合。在valnemulin以20和40ppm剂量喂食给药的治疗组中没有分离出猪痢疾小蛇菌。在所有以喂食方式给药的治疗组中，体重增长或食物转化比的差异很小。在死后检查中，表现出猪痢疾临床症状的对照组和硫粘菌素治疗组中的猪呈现出猪痢疾典型的病变，包括大肠粘膜表面坏死和粘连的粘液。在先前没有表现出猪痢疾临床症状的硫粘菌素治疗组的一头猪和对照组的一头猪中也发现了猪痢疾病变。在这些所有致病的猪中进行的粘膜刮除术都分离出了猪痢疾小蛇菌。valnemulin以30ppm剂量喂食给药的治疗组中的1头猪也有猪痢疾病变但通过粘膜刮除没有分离出猪痢疾小蛇菌。在valnemulin以20和40ppm剂量喂食给药的治疗组的死后检查中没有发现病变。
在第二个试验中，在没有给药治疗的对照组中接种5天后发现了猪痢疾的临床表现并且随后9头猪都被感染，其中6头猪由于疾病太严重而不得不杀死。在valnemulin以5ppm剂量喂食给药的治疗组中接种8天后发现了猪痢疾的临床表现并且随后10头猪中有5头被感染。然而valnemulin以5ppm剂量喂食给药的治疗组中致病猪的数量比对照组明显要少(p＜0.05)。在valnemulin以10或20ppm剂量喂食给药的治疗组中没有发现猪痢疾的临床症状。valnemulin以5ppm剂量喂食给药的治疗组的平均临床评分11比对照组的平均临床评分77明显要少(p＜0.005)。试验过程中在所有对照组的猪中进行的直肠拭抹都分离出了猪痢疾小蛇菌。然而在valnemulin以5ppm剂量喂食给药的治疗组中5头致病猪中只有2头分离出了猪痢疾小蛇菌。在试验结束时，valnemulin以所有剂量水平喂食给药的治疗组中的猪比对照组中的猪明显要重(分别地，5ppm,p=0.05；10和20ppm,p＜0.05)。在对照组剩下的3头猪的死后检查中，在大肠粘膜上发现了典型的猪痢疾病变。在valnemulin以5ppm剂量喂食给药的治疗组中，5头起初表现出疾病症状的猪中只有2头在死后检查中发现了猪痢疾病变，但是猪痢疾小蛇菌没有从这些猪中分离出来。然而在另外2头没有表现出猪痢疾临床症状但具有猪痢疾病变的猪中，通过粘膜刮除术分离出了猪痢疾小蛇菌。在valnemulin以10或20ppm剂量喂食给药的治疗组的猪中没有发现猪痢疾病变并且也没有分离出猪痢疾小蛇菌。
因此valnemulin以10ppm剂量喂食给药时就能有效防治猪痢疾临床症状的发生、粪便中出现螺旋体和在死后检查中出现猪痢疾病变。以30ppm剂量喂食给药时，一小部分猪确实表现出猪痢疾临床症状，但这是可能与已经影响到抗菌素摄取的偶发感染是相符合的。并发症对抗菌素的摄取和猪痢疾发病率的影响以前已经描述过(Burch,D.G.S.,Vet.Rec.110244-246)。体重数据分析表明在治疗组之间没有差别，这表明抗菌素不影响食物的口感。valnemulin以5ppm剂量喂食给药时不能完全防治疾病的发生或螺旋体的排出，但与对照组相比，临床评分和螺旋体的排出有了显著下降。在本试验中，硫粘菌素以30ppm剂量喂食给药时不能防治猪痢疾但与对照组相比能降低疾病的发病率和临床评分。然而，在防治猪痢疾方面，valnemulin以10ppm剂量明显比硫粘菌素以30ppm剂量喂食给药时更有效。4．进一步接种试验一群60头(3.5-4星期大小)常规方法饲养的猪用不含有治疗剂的食物喂养14天，然后通过口服途径用标准猪痢疾小蛇菌株(P18A)接种。当表现出明显的临床症状时，把猪群分成6个治疗组，每组有8头猪，用含有抗菌素的食物喂养10天，然后再用不含治疗剂的食物喂养14天。比较valnemulin盐酸盐以50、75、100和150ppm剂量喂食给药组与硫粘菌素延胡索酸氢盐以100ppm剂量喂食给药组以及不给药的对照组。每一治疗组都包括表现出一系列疾病临床症状的猪。将致病猪分配到各治疗组后，每天测定兽病的临床证据并进行临床评分，每周进行两次直肠拭抹以分离猪痢疾小蛇菌，所有的猪定期称重。食物摄取量也记录下来。接种24天后进行死后检查并检查每只猪大肠内的病变。在大肠的4个区域进行粘膜刮除以培养猪痢疾小蛇菌。
接种后分配前，感染7天后发现了猪痢疾的临床表现，前2个治疗组(对照组和硫粘菌素组)在接种8天后形成。valnemulin以75、50、100和150ppm剂量喂食给药的治疗组依次在接种后12、15、20、28天后形成其他各组。每组含有粪便中有血和/或粘液的猪，以及具有痢疾轻微临床症状即柔软粪便的猪。在分组后的第4天未给药的对照组中所有的猪都表现出严重的疾病临床症状并且被杀死。在治疗期间，硫粘菌素治疗组中有3头猪或者死亡或者由于猪痢疾太严重而需要实行安乐死。valnemulin治疗组中所有的猪都存活到试验的最后。在valnemulin以所有剂量水平喂食给药的治疗组中，疾病的临床症状都快速的消失，到治疗的第5天时已观察不到疾病的临床表现。治疗8天后在硫粘菌素治疗组存活的猪中也发现疾病有所改善。valnemulin治疗组记录的平均临床评分为4-10，硫粘菌素治疗组为30。将第3-10天的临床评分进行统计学分析，结果表明所有的valnemulin治疗组与硫粘菌素治疗组之间有显著性差异(p＜0.001)。所有valnemulin喂食给药的猪在治疗期间体重继续增加并且每日活畜体重增加(DLWG)都比硫粘菌素治疗组中的猪要大(0.4-0.9∶0.1)。在治疗期间，硫粘菌素治疗组的食物转化比(FCR)(6.4)比valnemulin治疗组(1.9-2.5)要大很多。在分组时，从每个治疗组的大多数猪中都分离出了猪痢疾小蛇菌。分组5天后，在任何一个治疗组的猪中通过直肠拭抹都不能检测到猪痢疾小蛇菌。
在治疗之后的期间内，valnemulin以50ppm剂量喂食给药的治疗组中有1头猪在停止给药治疗4天后表现出疾病的临床症状，在硫粘菌素治疗组中有1头猪在试验的最后一天也表现出临床症状。然而从这些猪的粪便中没有分离出猪痢疾小蛇菌。在治疗之后的期间内，DLWG和FCR在所有的治疗组中没有显著的差异。在试验最后进行的死后检查中，从valnemulin以75、100或150ppm剂量喂食给药的猪中没有发现猪痢疾损伤。在valnemulin以50ppm剂量喂食给药的治疗组中，1头猪有猪痢疾临床表现，同时另一头猪大肠有些变红。从这两头和本组中另外3头没有猪痢疾损伤的猪中通过粘膜刮除术分离出了猪痢疾小蛇菌。在valnemulin以75ppm剂量喂食给药的治疗组中，也从一头猪中通过粘膜刮除术分离出了猪痢疾小蛇菌，尽管在这头猪中没有发现任何猪痢疾临床表现。
因此同硫粘菌素相比，valnemulin以50、75、100和150ppm剂量治疗能降低猪痢疾临床症状痊愈所需要的天数。在这些valnemulin治疗组中猪也没有死亡或需要实行安乐死。valnemulin治疗组的临床评分与硫粘菌素治疗组相比有显著差异(p＜0.001)。停止给药治疗后，在所有valnemulin治疗组中也防止了猪粪便中猪痢疾小蛇菌的排出。然而，在valnemulin以50和75ppm剂量治疗的猪中通过粘膜刮除术分离出了猪痢疾小蛇菌。硫粘菌素以35和40ppm剂量给药治疗已经被证明能消除猪粪便中出现猪痢疾小蛇菌，但不能防止粘膜刮除中猪痢疾小蛇菌的恢复(Taylor,D.J.,Vet.Rec.106526-528)。在实验条件下已经成功地使用硫粘菌素以100ppm剂量治疗患有并不严重的猪痢疾以致于食欲还很好的动物(Taylor,D.J.,Proc.7th IPVSCongress Mexico47)。在本试验中，与对照组相比硫粘菌素以100ppm剂量给药治疗降低了死亡率，但不能防止可能由于实验接种诱导的疾病太严重而导致的死亡。
因此在本试验中，valnemulin以50、75、100和150ppm剂量喂食给药能成功地治疗实验诱导的猪痢疾，能防止猪死亡和消除猪痢疾的临床症状。在治疗期间能防止猪痢疾小蛇菌的排泄，停止治疗后，猪痢疾仅在一头50ppm剂量治疗的猪中复发。valnemulin以50和75ppm剂量给药治疗不能在所有的猪中使猪痢疾小蛇菌完全消除，但以100ppm剂量给药治疗是高度有效的。
因此本发明的活性剂能有效的治疗猪痢疾小蛇菌感染引起的猪痢疾。在使用时，活性剂的有效剂量当然将依据所使用的特定的盐、给药方式、猪的大小和年龄以及所希望达到的治疗效果的不同而不同；例如对于预防治疗，将以相对较低的剂量长时间给药。然而，通常当活性剂每天以约1-15mg/kg体重的剂量给药，给药适当地分为2-4次/每天，或随意地通过添加在食物或水中或以持续释放的形式给药时能得到满意的效果。对于大多数猪每天总的给药剂量约为10mg-400mg，例如约10mg-200mg用于预防或约20-400mg用于治疗，随意地通过添加在食物或水中给药，每天分1或2次给药。
在饮用水中优选的剂量是0.001-0.05％重量体积比，特别优选0.001-0.005％，在食物中优选20-100g/公吨，特别优选20-75g/公吨。C)与小蛇菌属Serpulina pilosicoli感染有关的猪结肠炎猪结肠炎可以用常规方法诊断，例如在兽医手册如Taylor,D.J.,在Pig Diseases,6th Ed.(1995),Publ.D.J.Taylor,Glasgow,英国，148-149页中所描述的方法。本发明的活性剂对于此用途有益的活性确定如下1．MIC值本试验包括从爆发猪痢疾并且有和没有腹泻的兽群中分离到的WBHS的9株野生株分离物和ATCC29796(无害小蛇菌，组3)(Fellstrom,C.,Res.Vet.Sci.591-4)。鉴定试验是基于含有5％牛血的TSA(Tryticase大豆琼脂)上的溶血模型与吲哚生成和马尿酸盐水解(Rosco诊断药片，Taastrup，丹麦)的测定。9株微弱的β-溶血螺旋体，一株分配到组2,4株分配到组3,5株分配到组4(Fellstrom,ibid.)。在10μl每种分离物与2倍浓度的valnemulin盐酸盐、硫粘菌素延胡索酸氢盐、二甲唑、林可霉素盐酸盐或泰乐菌素一起接种到琼脂培养皿之前，将细菌从琼脂培养皿中转移到0.9％生理盐水中，用McFarland仪将浊度调到1.0。在缺氧条件下培养4天后记录细菌的生长和溶血，MIC确定为螺旋体不再生长时抗菌素的最低浓度。
对于WBHS的MIC的测定结果呈现在表6中。通常，WBHS对这5种抗菌素都敏感。对于试验中的任何一种抗菌素，WBHS 3个组之间的敏感性没有差异。在10个菌株中有9个valnemulin的MIC值是最低值，对绝大多数菌株4种对照化合物的MIC值要比valnemulin高很多。
WBHS对valnemulin的高度敏感性使得可以使用此化合物在感染的兽群中治疗有临床表现的兽病。
表610株微弱的β-溶血螺旋体的最低抑制浓度(MIC)值
因此本发明的活性剂能有效治疗与Serpulina pilosicoli感染有关的猪结肠炎。在使用时，活性剂的有效剂量当然将依据所使用的特定的盐、给药方式、猪的大小和年龄以及所希望达到的治疗效果的不同而不同；例如对于预防治疗，将以相对较低的剂量长时间给药。然而，通常当活性剂每天以约1-5mg/kg动物体重的剂量，适当地分为2-4次/每天，或随意地通过添加在食物或水中或以持续释放的形式给药时能得到满意的效果。对于大多数猪每天总的给药剂量约为10mg-400mg，例如约10mg-200mg用于预防或约20-400mg用于治疗，随意地通过添加在食物或水中给药，每天分1或2次给药。
在饮用水中优选的剂量是0.001-0.05％重量体积比，特别优选0.001-0.005％，在食物中优选20-100g/公吨，特别优选20-75g/公吨。D)与Lawsonia intracellularis感染有关的猪回肠炎Lawsonia intracellularis感染可以用常规方法诊断，例如在兽医手册如Taylor,D.J.，在Pig Diseases中，6th Ed.(1995),Publ.D.J.Taylor,Glasgow，英国，154-157页中所描述的方法。本发明的活性剂对于此用途有益的活性确定如下1．体外活性通常使用经过一些改进的Lawson,G.H.K.等人，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)31(1993)1136-1142描述的方法(标准的Kirby-Bauer圆盘法不适用于细胞内细菌)细胞用标准细胞培养法制备并维持单层IEC-18鼠肠囊肿细胞培养物(ATCC CRL 1589)。将分裂的细胞(约30％融合)中的前代单层细胞在第0天在小的培养瓶中的玻璃盖片上(Tracs)准备感染。接种物使用3批Lawsonia intracellularis菌株作为接种物。这些菌株是从患有增生性肠病的猪中取得的，其包括增生出血性肠病(pHE)和肠内腺上皮增生(PIA)型菌株，是从猪的肠中制备并用上面描述的Lawson参考文献中的方法在细胞培养物中传代得到的。两个pHE菌株在猪中在一定程度上测试其致病力，如McOrist,S.等人，感染免疫(Infect.Immun.)61(1993)4286-4292中所描述的那样。经过几个细胞传代后收集接种菌株，在-70℃1ml小瓶中冷冻保存。初步实验是制备解冻菌株合适的稀释液，使稀释的菌株在5天的试验中能产生可被迅速识别的感染细胞。
抗菌素制备成100×储备液。每批抗菌素的活性用标准的Kirby-Bauer圆盘法和实验室大肠杆菌菌株确定。感染在第0天，将试验中的每一菌株解冻，用培养介质稀释1/8-1/32，在组1-4中使用。
在组4(连续治疗)中，接种物在加入细胞前先在含有不同浓度抗菌素的培养介质中在37℃培养1小时。
在组3(细胞外活性)中，接种物先在含有不同浓度抗菌素的培养介质中制备，然后立即加入细胞中。
在组1(对照)和组2(细胞内活性)中，接种物在不含有抗菌素的培养介质中制备并加入细胞中。将含有加入接种物(+/-抗菌素)的、在总共0.5ml介质中的细胞的培养小瓶(Tracs)加入钢瓶中，抽空到40％空气(8％O2)，维持2分钟，再用H2最后用10％CO2充满，将培养小瓶从钢瓶中取出，放置于恒温箱中，恒温箱在37℃提供含有8％O2、8.8％CO2和其余为N2的潮湿空气。
在第1和2天，将所有的小瓶从培养基中移出并再加入新鲜的培养介质，加入组2和4中的介质含有抗菌素，组1和3中不含有，然后再放置于恒温箱中。在第5天，将所有的盖片取出并用含有特定单克隆抗体的免疫过氧化物酶间接染色剂对Lawsonia intracellularis染色。用每个盖片上被Lawsonia intracellularis严重感染(＞30每个细胞，严重感染的细胞=HIC)的细胞的数量作为估量感染的主要指标。观察到的HIC感染灶和总体细胞的数量也记录下来。在一式三份的分析中比较对照组(组1)、抗菌素细胞内活性分析组(组2)、抗菌素细胞外活性分析组(组3)和连续治疗分析组(组4)中的HIC，每组多至3个菌株。对不同浓度的接种进行重复分析。得到对照组平均HIC后计算测试组相对于对照组的百分比。平均对照HIC是对照Tracs中HIC的总数除以被感染的对照Tracs的数量得到的值。将测试Tracs的HIC值除以平均对照HIC后乘以100就得到测试Tracs的百分比。也就是说，抗菌素没有效果的测试Tracs其百分比是100％，抗菌素将细菌生长完全抑制的测试Tracs其百分比是0％。
使用valnemulin盐酸盐处理的结果呈现于表7中，其中表现出治疗后仍未感染的细胞的百分比表7加入valnemulin的细胞培养物中感染Lawsonia intracellularis的细胞的百分比
试验结果表明valnemulin盐酸盐能显著抑制Lawsoniaintracellularis生长(生长＜1％)的最低浓度＜2μg/ml。2．接种试验35头断奶的猪在同一天用Lawsonia intracellularis有毒性的接种物(LR189/5/83菌株)接种，接种物是通过在鼠肠囊肿细胞系IEC-18(ATCC CRL 1589)中用Lawson等人，J.Clin.Microbiol.31(1993)1136-1142描述的方法培养而获得的能引起猪增生性肠病的细菌的分离物。7头对照猪用缓冲液给药。21头接种猪有7头不治疗。这7头猪的体重增长都下降了，在接种3周后尸体剖检中通过检测肠切面发现都有增生性肠病的病变。这7头猪中有6头有很明显的病变，接种2周后有3头猪患有轻度到中度的腹泻。为了试验“预防”医治策略，valnemulin盐酸盐以25ppm和75ppm剂量(即1.25mg/kg和3.7mg/kg)通过口服分别对另两组接种猪给药，经过预混合在接种前2天给药，给药一直持续到实行安乐死。为了试验“治疗”策略，经过预混合在接种后7天将valnemulin盐酸盐以25ppm和75ppm剂量通过口服分别对另两组接种猪给药，给药一直持续到实行安乐死。
在预防组中7头猪有3头，治疗组中7头猪有5头在尸体剖检中进行的肠切面检查中看不见任何增生性肠病的损伤。对照猪保持正常。因此valnemulin甚至在很低的实际治疗剂量时也能预防或治疗大部分接种猪的疾病。
因此本发明的活性剂能有效地治疗与Lawsonia intracellularis感染相关的猪回肠炎。在使用时，活性剂的有效剂量当然将依据所使用的特定的盐、给药方式、猪的大小和年龄以及所希望达到的治疗效果的不同而不同；例如对于预防治疗，将以相对较低的剂量长时间给药。然而，通常当活性剂每天以约1.5-6.5mg/kg动物体重的剂量，随意地通过添加在食物或水中或分成2-4次/天或以持续释放的形式给药时能得到满意的效果。对于大多数猪每天总的给药剂量约为10mg-1000mg，优选约15mg-500mg，每天分1或2次给药。
在饮用水中优选的剂量是0.001-0.05％重量体积比，特别优选0.001-0.005％，在食物中优选20-400g/公吨，特别优选20-200g/公吨。E)与鸡败血支原体感染有关的家禽慢性呼吸病和关节炎感染可以用常规方法诊断，例如诊断鸡败血支原体感染用兽病手册如家禽疾病(Diseases of Poultry),8th Ed.(1984),Ed.Hofstad等人，lowa State University Press,196-198页中描述的方法。本发明的活性剂对于此用途有益的活性确定如下1．体外活性MIC
valnemulin盐酸盐的抗菌效果用标准系列微稀释法与泰乐菌素(可溶Tylan)和硫粘菌素延胡索酸氢盐比较来测定。
将12.8mg试验化合物溶于100ml蒸馏水中以得到储备液，在-20℃下保存备用。使用的鸡败血支原体参照菌株是X95、S6 Holland、S6 Bench(英格兰)、MS-16(日本)和1266以及多种新鲜的野生株分离物。
菌株的抗菌素敏感性用一种改进的微量肉汤稀释操作方法(Stipkovits等人，兽病微生物学(Vet.Microbiol.)15 65-70)测定。试验介质加入(100μl)到微滴定板的所有孔中，使用2倍稀释物的抗菌素。接种物含有105cfu/ml。微滴定板用透明胶带密封，在37℃下培养3天。在第3天读取的抗菌素完全阻止颜色改变时的最低浓度是最低抑制浓度(MIC)。用没有变色范围的孔检查支原体的活力，是通过将支原体铺在琼脂培养基上进行的。所有的支原体都在10ml介质B(Erno,H.和Stipkovits,L.,Acta Vet.Scand.14436-449)中繁殖。在37℃下培养直到生长的对数阶段初期，将1ml等分试样培养物在试管中分散作为接种培养物并在-20℃下保存。将葡萄糖发酵支原体菌株在添加1％葡萄糖的经过修改的Bg介质(pH7.8)中测定，精氨酸水解菌株在含有1％精氨酸的Ba介质(Ern,H.和Stipkovits,L.,supra,450-463)(pH7.3)中测定，葡萄糖-和精氨酸-阴性菌株在含有1％氯化三苯基四唑的B介质中测定。
计算考虑到稀释度的抗菌素对不同菌株的平均MIC值。
参照菌株的MIC值列在表8中，支原体分离物的MIC值列在表9中
表8鸡败血支原体参照菌株的MIC值(μg/ml)
表9小鸡中的鸡败血支原体分离物的MIC值(μg/ml)
<p>鸡败血支原体参照菌株的试验结果表明3种化合物表现出或多或少的相同的活性范围。然而，鸟类野生株分离物的MIC值却反映出试验化合物之间有显著的差异野生株分离物对valnemulin表现出一致的高度敏感性(0.03-0.06μg/ml)，对硫粘菌素的敏感性有点降低(0.06-1μg/ml)，而对泰乐菌素甚至发现了明显的抗药菌株(0.06-32μg/ml)。2．接种试验2.1．预防将几组雄性小鸡用鸡败血支原体(MG)的毒性株感染，每组各自用其中一种下面的化合物给药valnemulin(浓度为0.00312、0.00625、0.0125和0.025％)、硫粘菌素(0.00625、0.0125和0.025％)和泰乐菌素(0.05％)。感染是在第2天通过将0.1ml含有约106cfu有活力的细菌的鸡败血支原体培养物注射到小鸡的每只肺中来实现的(Jordan,F.T.W.,The Veterinary Record 127502)，给药是在感染1小时内开始的并持续3天。试验中还包括感染的未治疗组和未感染组。
所得试验结果表明，在预防临床症状出现和死亡方面，valnemulin以较高剂量(0.0125和0.025％)给药的两个组、硫粘菌素3种剂量给药组和泰乐菌素给药组的满意程度一样。在泰乐菌素、硫粘菌素和两个valnemulin较高剂量(0.0125和0.025％)给药的组中，有少数几只小鸡发现有病变并且病变不严重。valnemulin以较低剂量给药的两个组在这方面效果较差。体重增加最多的是泰乐菌素给药组；其次但已显著减少(p＜0.05)的是未感染组、所有硫粘菌素给药组和valnemulin除了最低剂量的所有给药组。体重增加最少的是valnemulin最低剂量给药组、感染的未给药组，这两组间没有显著差异。从未感染组、硫粘菌素最高剂量给药组和泰乐菌素给药组的小鸡中在生存期间或尸体剖检中没有分离出MG，在valnemulin最高剂量给药组中只从一只小鸡中分离出MG。从其他感染组中分离出较多的MG。泰乐菌素给药组的血清学结果不能完全反映这一点，因为在此组中有较高比例的阳性反应物(reactor)。
因此我们发现在预防小鸡鸡败血支原体感染方面，valnemulin以这两个较高剂量给药与参照化合物一样有效。2.2治疗将几组雄性小鸡用鸡败血支原体(MG)的毒性株感染，每组各自用valnemulin以0.0125％、0.025％和0.05％浓度、硫粘菌素以相同浓度、泰乐菌素以0.05％浓度、林可壮观霉素(lincospectin)与壮观霉素联合(Linco-Spectin)以0.083％浓度给药。试验还包括一个感染未治疗组和一个未感染组。在小鸡在出生2天时通过将3.4×105个支原体注射到每一个肺中来感染。抗菌素在感染24小时后在饮用水中给药，除了Linco-Spectin连续5天给药外其他抗菌素都是连续3天给药治疗。
所得结果表明在死亡率的控制方面，valnemulin以所有3种浓度给药和硫粘菌素以0.05％浓度给药的组效果最好，死亡率不超过5％。在用valnemulin以最高和最低剂量给药治疗的小鸡中没有发现疾病损伤，在用硫粘菌素和泰乐菌素给药治疗的组中只从很少几只小鸡中发现了疾病损伤。小鸡在valnemulin以所有剂量给药的组中的体重增加比硫粘菌素治疗组要多，与泰乐菌素治疗组一样。第23天试验结束时，从3个valnemulin给药组和泰乐菌素给药组的小鸡中没有分离出鸡败血支原体。同时，血清学结果表明在所有的感染组中都有阳性反应物。
考虑到死亡率、体重增加、MG分离物和血清凝集试验结果，valnemulin在饮用水中以两个较高浓度(0.025％和0.05％)给药的治疗效果至少与硫粘菌素以0.05％浓度或泰乐菌素以0.05％浓度给药一样好或更好，比Linco-Spectin要好很多。
因此本发明的活性剂能有效治疗与鸡败血支原体感染有关的家禽慢性呼吸病和关节炎。在使用时，活性剂的有效剂量当然将依据所使用的特定的盐、给药方式、动物的大小和年龄以及所希望达到的治疗效果的不同而不同；例如对于预防治疗，将以相对较低的剂量长时间给药。然而，通常当活性剂在饮用水中以约0.005-0.05％，特别是0.01-0.03％重量体积比剂量，在食物中以20-400g/公吨，特别是20-200g/公吨剂量给药时能得到满意的效果。F)出血败血性巴斯德氏菌、大叶性肺炎放线杆菌(嗜血杆菌)和/或副猪嗜血菌感染的继发感染出血败血性巴斯德氏菌、大叶性肺炎放线杆菌(嗜血杆菌)和/或副猪嗜血菌继发感染可以用常规方法诊断，例如在兽医手册如Taylor,D.J.,在Pig Diseases,6th Ed.(1995),Publ.D.J.Taylor,Glasgow，英国185-187页；188-194；和194-197中所描述的方法。本发明的活性剂对于此用途有益的活性确定如下测定valnemulin盐酸盐与硫粘菌素相比抑制从猪呼吸组织中得到的出血败血性巴斯德氏菌、大叶性肺炎嗜血杆菌和副猪嗜血菌新的分离物的最低抑制浓度(MIC)。使用含有10个出血败血性巴斯德氏菌菌落、10个大叶性肺炎嗜血杆菌菌落和3个副猪嗜血菌菌落的细菌分离物的培养物，菌株是在过去5年内从死后检查发现患病的猪中分离的。巴斯德氏菌株中有3株是出血败血性巴斯德氏菌的产毒菌株。对于大叶性肺炎嗜血杆菌和副猪嗜血菌，在试验前一天，将一铂环量的每种纯培养物接种到10ml含有1％供体小牛血清和2mg/ml烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的Todd&Hewitt肉汤(Unipath CM190)中。对于出血败血性巴斯德氏菌，在试验当天，将一铂环量的每种纯培养物接种到10ml含有1％供体小牛血清的No.2营养肉汤(Unipath CM67)中。每一种制备的肉汤培养物在37℃、10％CO2条件下培养18小时。培养结束的当天，将23个肉汤培养物在无菌生理盐水中调节到每ml含有105-106个细菌以准备MIC培养介质的接种。对于每一种试验化合物，也建立牛津金黄色葡萄球菌NCTC6571的对照培养物以验证MIC测定的结果。在每一项测定中，从对照细菌中建立的培养物与其他细菌培养物是同一的。valnemulin以盐酸盐、硫粘菌素以延胡索酸氢盐的形式使用。在试验过程中，含有3.2mg/ml活性组分的试验化合物的储备液用无菌蒸馏水制备。在无菌蒸馏水中进一步制备9个2倍稀释液，得到了要加入到MIC介质中的浓度范围为320μg-1.25μg/ml的一系列抗菌素溶液。依据制造商建议的方法制备含有溶解的马血(Oxoid SR50)的敏化处理的琼脂(Oxoid CM409)，如果需要的话将pH调节到7.4。在所有制备的用来测定抑制两种嗜血杆菌的MIC的MIC介质中加2mg/ml的NAD以提供所需的生长因子。在90mm陪替氏培养皿中将18ml融化的琼脂(50℃)与2ml(10倍稀释液)制备的试验化合物的每种稀释液混合。每一稀释液制备4个重复的培养皿。在每一个MIC测定中，也制备4个含有18ml琼脂和2ml无菌蒸馏水的重复的培养皿作为生长指标。
将干燥的MIC培养皿用0.2μl制备的试验细菌接种，接种出血败血性巴斯德氏菌的培养基在37℃、空气中培养18小时，接种大叶性肺炎嗜血杆菌和副猪嗜血菌的培养基37℃、10％CO2中培养18小时。接种后先通过肉眼观察测定细菌的生长，然后用立体可变焦摄影的显微镜进行显微镜测定。MIC值是通过显微镜测定在所有4个培养皿中的接种点上检测不到细菌的任何生长时试验化合物的最低浓度。
所得试验结果呈现在表10中表10 MICs(μg/ml)
<p>从中可以看出，同硫粘菌素相比，valnemulin抑制出血败血性巴斯德氏菌的活性要增加2.5倍，抑制大叶性肺炎嗜血杆菌和副猪嗜血菌的活性要增加5.5倍。
因此本发明的活性剂能有效治疗与出血败血性巴斯德氏菌、大叶性肺炎放线杆菌(嗜血杆菌)和/或副猪嗜血菌感染有关的猪继发性肺炎。在使用时，活性剂的有效剂量当然将依据所使用的特定的盐、给药方式、动物的大小和年龄以及所希望达到的治疗效果的不同而不同；例如对于预防治疗，将以相对较低的剂量长时间给药。然而，通常当活性剂每天以约5-15mg/kg动物体重的剂量，随意地通过添加在食物或水中或分成2-4次/天或以持续释放的形式给药时能得到满意的效果。对于大多数猪每天总的给药剂量约为100mg-1000mg，优选约100mg-500mg，每天分1或2次给药。
本发明的活性剂单独给药治疗时可能效果更好。
在饮用水中优选的剂量是0.01-0.05％重量体积比，特别优选0.01-0.025％，在食物中优选100-400ppm(g/公吨)，特别优选100-200ppm。G)与溶血巴斯德氏菌感染有关的羔羊、绵羊和牛肺炎溶血巴斯德氏菌感染可以用常规方法诊断，例如在兽医手册如Veterinary Medicine,8th Ed.(1994),Eds.Radostits,O.M.,Blood,D.C.和Gay,C.C.,Publ.Bailliere Tindall,伦敦，英国，748-770页中描述的方法。本发明的活性剂对于此用途有益的活性在体内确定如下测定两种valnemulin盐酸盐制剂治疗由于用溶血巴斯德氏菌A1进行过对照感染而患有肺炎的小牛的临床效能。
在第-6天，将24头经过鼻部拭抹发现不含溶血巴斯德氏菌A1的小牛称重并分成4个治疗组，每组有6头小牛，各组中小牛的体重和性别分配平衡。在分组前，将小牛以常规饲养装置在其能适应的单独的围栏中饲养33天。在试验前阶段提取两次血样来做白细胞毒素抗体分析以检测在接种溶血巴斯德氏菌A1前症状是否有存在的可能性。
治疗在第-1天开始，约在接种前27小时组1-对照组2-可注射的2.5％valnemulin盐酸盐(2.5mg/kg，每天给药2次)组3-在小牛牛奶代替品中口服的预混合10％的valnemulin盐酸盐(5.0mg/kg，每天给药2次)；在第0天通过用光学纤维支气管镜将30ml溶血巴斯德氏菌A1肉汤培养物(M4/1/3,Moredun Research Institute-1.25×107cfu/ml)沉积在小牛支气管内来对所有的小牛接种。在第-3和-2天每天进行一次临床检查，从第-1到第3天每天进行2次检查。对直肠体温、呼吸频率、呼吸和行为表现这4项参数每一项都进行临床评分。注射位点也检查。出于人道考虑，对任何在第0-3天中的单一检查中躺着的、和/或表现出抑郁的、和/或表现出呼吸困难症状的、或总的临床评分超过5的小牛通过静脉内注射致死剂量的20％w/v戊巴比妥钠BP(兽医用)实行安乐死，在24小时内进行尸体剖检。将接种溶血巴斯德氏菌后存活到第4天的小牛在第4天实行安乐死，然后用与在第0-3天实行安乐死的小牛一样的步骤处理。从所有的小牛中取出肺，肉眼确定实变损伤和胸膜炎粘着物。从8个标准位点切除肺组织样本来检测溶血巴斯德氏菌的存在以确定分离指数值。在急性死亡的小牛中进行心脏血液拭抹来检测溶血巴斯德氏菌的存在。
对于下面所有参数计算各个小牛的值、组的总值、组的平均值和组的中间值总的临床评分、实变损伤评分、分离指数、胸膜炎评分和总评分。对于构成总的临床评分的下面所有类项计算各个小牛的值、组的总值、组的平均值和组的中间值直肠体温、呼吸频率、呼吸和行为表现。Kruskal-Wallis试验(Minitab 9)使用的基本分析是确定各组之间对总的临床评分、实变损伤评分、分离指数、胸膜炎评分和总评分中的每一项参数的分数是否有所不同。Kruskal-Wallis试验有效地证实了各组不完全相同，也不完全不同。为了测试那些组是不同的，Kruskal-Wallis试验(Minitab 9)使用成对的组进行测试。
与未治疗组(组1)相比，发现用10％预混合的valnemulin以5.0mg/kg剂量在小牛牛奶代替品中口服给药治疗的小牛的总的临床评分显著降低(p=0.013)，其中小牛在接种溶血巴斯德氏菌A1前27小时给药，每天给药2次，给药5天。
用可注射的2.5％valnemulin以2.5mg/kg剂量静脉注射给药治疗的小牛的总的临床评分也有所降低，但不明显，其中小牛在接种溶血巴斯德氏菌A1前27小时给药，每天给药2次，，给药5天。
当比较总的临床评分时，各治疗组之间没有显著差异。
因此本发明的活性剂能有效治疗与溶血巴斯德氏菌感染有关的羔羊、绵羊和牛肺炎。在使用时，活性剂的有效剂量当然将依据所使用的特定的盐、给药方式、动物的大小和年龄以及所希望达到的治疗效果的不同而不同；例如对于预防治疗，将以相对较低的剂量长时间给药。然而，通常当活性剂每天以约5-15mg/kg动物体重的剂量，随意地通过添加在食物中或分成2-4次/天或以持续释放的形式给药时能得到满意的效果。对于大多数猪每天总的给药剂量约为250mg-3000mg，优选约250mg-1000mg，每天给药1或2次或随意地添加在食物中给药。H)与猪关节液支原体感染有关的猪多关节病猪关节液支原体感染可以用常规方法诊断，例如在兽医手册如Taylor,D.J.，在Pig Diseases,6th Ed.(1995),Publ.D.J.Taylor,Glasgow，英国，172-173页中所描述的方法。本发明的活性剂对于此用途有益的活性确定如下1．在组织分离物中的体外活性(MIC测定)从患有猪地方性肺炎(EPP)兽群的猪的肺中取得组织样本。样本在干冰中保存以准备培养。，4个从肺样本得到的分离物，最初分离是为了活化猪关节液支原体，当细菌在肺样本中已经活化后(在-70℃再次保存)，在猪关节液支原体培养期间将分离物再次分离，一些样本生长出非常多的具有典型猪关节液支原体形态的菌落。另外3个分离物在提供的其他肺样本中活化。所有的分离物用平板生长抑制试验进行血清学鉴定，抑制试验使用抗猪关节液支原体的特定的兔抗血清。使用一种商业上可获得的固体介质(支原体实验Ltd.)从肺组织中分离猪关节液支原体。使用一种含有酚红和精氨酸的液体介质(支原体实验Ltd.)(pH7.0)来测定MIC。
试验中化合物的储备溶液用去离子水制备成1mg/ml的浓度，通过0.2μ孔径的过滤膜(Sartorius Minisart,N)进行过滤灭菌，-20℃下贮存。在MIC测定试验中，此储备溶液在液体介质中稀释2倍以达到所要求的最终浓度。MIC测定试验依据Tanner&Wu,Avian Diseases36(1992)714-717中描述的方法进行。能积极生长的接种培养物从1ml贮存在-70℃的等分试样的肉汤培养基中或从在-70℃贮存在琼脂上的培养基中制备。这种接种培养物被稀释到滴定指标为103-105变色单位/ml。0.1ml等分试样的接种物与0.1ml等分试样的抗菌素稀释液在微滴定孔中混合。每个微滴定培养皿含有pH为7.6的未接种介质(终点对照组)和不含有抗菌素的接种对照组。所有的培养皿用胶粘膜密封并在有氧条件、36℃条件下培养。当接种对照组中的颜色改变与终点对照组中pH值相当时，记录MICs。MIC是不呈现出任何颜色改变的最低浓度。
所得valnemulin盐酸盐和两个对照化合物硫粘菌素延胡索酸氢盐和enrofloxacin的试验结果呈现在表11中表11猪关节液支原体的7个野生株分离物的体外敏感性<
猪关节液支原体的7个野生株分离物对valnemulin的敏感性比其他两种化合物要高，表明这些最近分离的野生株分离物对valnemulin非常敏感。
因此本发明的活性剂能有效地治疗与猪关节液支原体有关的猪多关节病。在使用时，活性剂的有效剂量当然将依据所使用的特定的盐、给药方式、动物的大小和年龄以及所希望达到的治疗效果的不同而不同；例如对于预防治疗，将以相对较低的剂量长时间给药。然而，通常当活性剂每天以约5-15mg/kg动物体重的剂量、随意地通过添加在水或食物中、或适当地分为2-4次/每天、或以持续释放的形式给药时能得到满意的效果。对于大多数猪每天总的给药剂量约为100mg-1000mg，优选约100mg-500mg，每天分1或2次给药。
本发明的活性剂单独给药治疗时可能效果更好。
在饮用水中优选的剂量是0.01-0.05％重量体积比，特别优选0.01-0.025％，在食物中优选100-400ppm(g/公吨)，特别优选100-200ppm(g/公吨)。
对于所有的这些用途，本化合物可以以游离碱形式或兽药可接受盐形式，例如四价盐或，特别是与酸加成的盐形式来使用。合适的与酸加成的盐的实例有延胡索酸氢盐、延胡索酸盐、萘-1,5-磺酸盐和特别是盐酸盐。
本发明的活性剂可以口服、局部或非肠道给药，与化学治疗可接受稀释剂和载体以及可任选的其他赋形剂混合，以例如片剂、胶囊或注射剂的形式给药。也可以作为优良的添加剂与食物(预混合)或饮用水混合后给药。
优选的兽药可接受载体包括，例如通常使用的药用赋形剂，例如糖、玉米淀粉、乳糖、纤维素，和谷物载体体系和谷物副产品例如磨过的稻壳、小麦中级品和大豆粉，此外还有固体稀释剂例如重质碳酸钙、硫酸钠、碳酸钙和高龄土，或液体稀释剂例如兽药可接受油(植物油和矿物油)、丙二醇和聚乙二醇。这些制剂适当地通过口服给药，优选混合到食物中以含药物的粗粉食物或小丸的形式给药。
在饮用水中给药时，使用含有或不含有溶剂例如乙醇、丙二醇、聚乙二醇、可接受的液体表面活性剂和山梨醇的水溶液。
对例如肌内注射，制剂被制备成典型的可能含有溶剂例如乙醇或丙二醇的水溶液、或兽药可接受油溶液。兽药可接受油的实例有芝麻油、中链甘油三酸酯(例如Miglyol)、肉豆蔻酸异丙酯和油酸乙酯。制剂中可能含有防腐剂、缓冲剂和其他常用的赋形剂。
本发明使用的兽药制剂可以通过将各组分以需要的比例混合来制备。将制剂包装在合适的容器中以备给药。
下面是本发明的一个具体实例
本发明的活性剂可以被很好地接受。将式1化合物的盐酸盐以1000mg/kg和2000mg/kg的单次剂量对每剂量组中的5只雄性和5只雌性大鼠口服给药以测定其在大鼠中的急性毒性。在1-8天内有死亡发生。所得LD50值＞1000mg/kg口服。
权利要求
1．式1化合物以游离碱或兽药可接受盐的形式在治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病中的用途。
2．根据权利要求1的式1化合物以游离碱或兽药可接受盐的形式在治疗由猪肺炎支原体感染引起的猪地方性肺炎中的用途。
3．根据权利要求1的式1化合物以游离碱或兽药可接受盐的形式在治疗与Serpulina pilosicoli感染有关的猪结肠炎中的用途。
4．根据权利要求1的式1化合物以游离碱或兽药可接受盐的形式在治疗与Lawsonia intracellularis感染有关的猪回肠炎中的用途。
5．根据权利要求1的式1化合物以游离碱或兽药可接受盐的形式在治疗与鸡败血支原体感染有关的家禽慢性呼吸疾病和关节炎中的用途。
6．根据权利要求1的式1化合物以游离碱或兽药可接受盐的形式在治疗由出血败血性巴斯德氏菌、大叶性肺炎放线杆菌(嗜血杆菌)和/或副猪嗜血菌感染引起的继发感染中的用途。
7．根据权利要求1的式1化合物以游离碱或兽药可接受盐的形式在治疗与溶血巴斯德氏菌感染有关的羔羊、绵羊和牛肺炎中的用途。
8．根据权利要求1的式1化合物以游离碱或兽药可接受盐的形式在治疗与猪关节液支原体感染有关的猪多关节病中的用途。
9．根据权利要求1-8中的式1化合物以盐酸加成盐的形式使用。
10．根据权利要求1-9中的式1化合物在制造被用来治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病的药物中的用途。
11．一种治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病的方法，包括向需要治疗的猪中给以一定有效治疗剂量的权利要求1-9中定义的式1化合物。
12．一种用来治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病的制剂，其中含有权利要求1-9中定义的式1化合物与至少一种兽药可接受载体或稀释剂。
13．一种制备被用来治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病的药物的方法，包括将权利要求1-9中的式1化合物与至少一种兽药可接受载体或稀释剂混合。
全文摘要
式1化合物在治疗随着饲养密度加大而更易爆发的兽病中的用途。
文档编号A61P31/04GK1223576SQ97196038
公开日1999年7月21日 申请日期1997年7月3日 优先权日1996年7月4日
发明者D·G·S·布克, P·H·里普雷, E·茨斯尔 申请人:生物化学有限公司